Anda di halaman 1dari 22

PENAPISAN BAKTERI RIZOSFIR YANG BERPERAN DALAM

MENINGKATKAN PERTUMBUHAN TANAMAN

Disusun oleh:
Nama : Maria Pricilia Gita Permana Putri
NIM : B1A015068
Kelompok :6
Rombongan :I
Asisten : Uho Baihaqi

LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI


UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2017
I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Rhizosfer merupakan daerah yang ideal untuk pertumbuhan dan perkembangan


mikrob antagonis. Nutrisi yang disekresikan tanaman ke dalam rhizosfer banyak
dipengaruhi oleh faktor lingkungan dan selanjutnya mempengaruhi kelimpahan dan
keragaman mikroba di daerah tersebut. Keadaan ini didukung oleh fungsinya, yaitu
sebagai penyedia nutrisi dan juga sebagai tempat tumbuh dan berkembangnya
mikroorganisme (Tarigan, 2011).
Beberapa macam nutrisi disekresikan di dalam rhizosfer, yang sangat dipengaruhi
oleh berbagai faktor lingkungan di dalam tanah. Beberapa bakteri penyedia hara yang
terdapat pada rhizosfer akar disebut sebagai rizobakteri pemacu tanaman atau dikenal
sebagai PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) (Bashan & Holguin, 1998).
Semua PGPR baik secara langsung maupun tidak langsung memfasilitasi atau
mempromosikan pertumbuhan tanaman di bawah kondisi gizi, biotik
(biokontrol-PGPB), atau kondisi stres abiotik. Pertumbuhan tanaman tidak langsung
disebabkan oleh biokontrol-PGPB mencakup berbagai mekanisme, seperti kompetisi
rhizosfer, ketahanan sistemik yang diinduksi (ISR), biosintesis fitohormon yang
berkaitan dengan stres seperti asam jasmonat (JA) atau etilen, dan biosintesis molekul
antimikroba, yang dengannya bakteri mencegah efek buruk dari fitoplankton pada
pertumbuhan tanaman. Mekanisme pertumbuhan langsung yang diinduksi PGPR
meliputi fiksasi nitrogen biologis, produksi fitohormon seperti auksin, gibberelin
(GA), sitokinin (CK), dan oksida nitrat (NO), penyerapan besi oleh siderofor, dan
pelarut fosfat (Cassan et al., 2014).
PGPR atau Plant Growth Promoting Rhizobacteria adalah sejenis bakteri yang
hidup di sekitar perakaran tanaman. Bakteri tersebut hidupnya secara berkoloni
menyelimuti akar tanaman. Bagi tanaman keberadaan mikroorganisme ini akan sangat
baik. Bakteri ini memberi keuntungan dalam proses fisiologi tanaman dan
pertumbuhannya. Fungsi PGPR bagi tanaman yaitu mampu memacu pertumbuhan dan
fisiologi akar serta mampu mengurangi penyakit atau kerusakan oleh serangga. Fungsi
lainnya yaitu sebagai tambahan bagi kompos dan mempercepat proses pengomposan.
Pengurangan pestisida dan rotasi penanaman dapat memacu pertumbuhan populasi
dari bakteribakteri yang menguntungkan seperti PGPR, contoh dari bakteri fiksasi
nitrogen non simbiotik (Azotobacter sp. dan Azospirillum sp.) dan bakteri pelarut
fosfat (Bacillus megaterium dan Bacillus subtilis) (Permatasari & Nurhidayati, 2014).
Selain itu, PGPR memiliki peranan sebagai pengendali biologi melalui kompetisi,
produksi antibiotik, induksi resistensi tanaman, produksi fitohormon, dan peningkatan
ketersediaan hara melalui fiksasi nitrogen (Aryantha et al., 2004).
Nitrogen menyusun sekitar 78% dari keseluruhan gas yang ada di atmosfir.
Meskipun keberadaannya sangat melimpah di atmosfer, nitrogen tidak dapat
digunakan langsung oleh tanaman. Pengolahan kimia atau fiksasi alami nitrogen
diperlukan untuk mengkonversi gas nitrogen menjadi bentuk yang dapat digunakan
oleh tanaman. Fiksasi alami nitrogen dari atmosfer dapat dilakukan oleh bakteri tanah
agar ketersediaan unsur nitrogen bagi tanaman tetap tercukupi meskipun tumbuh di
wilayah marjinal dengan kandungan unsur hara yang sangat rendah, seperti pesisir
pantai. Bakteri rhizosfer merupakan bakteri yang hidup di daerah perakaran (rhizosfer)
tanaman yang memiliki kemampuan mengikat N2 bebas di udara dan mereduksinya
menjadi senyawa ammonia. Kemampuan bakteri tersebut untuk melakukan
penambatan nitrogen disebabkan oleh aktivitas nitrogenase (Bhattacharyya, 2012).
Nitrogenase merupakan enzim kompleks yang terlibat dalam proses fiksasi nitrogen.
Nitrogenase berperan dalam pengubahan bentuk nitrogen bebas (N2) di udara menjadi
bentuk terikat, amonia (NH3). Nitrogenase terdiri atas dua komponen, yaitu komponen
I (dinitrogenase atau protein Fe-Mo) dan komponen II (dinitrogenase reduktase atau
protein Fe) (Patti et al., 2013).
Unsur fosfat (P) adalah unsur esensial kedua setelah N yang berperan penting
dalam fotosintesis dan perkembangan akar. Ketersediaan fosfat dalam tanah jarang
yang melebihi 0,01% dari total P. Sebagian besar bentuk fosfat terikat oleh koloid
tanah sehingga tidak tersedia bagi tanaman (Simanungkalit & Suriadikarta, 2006).
Menurut Wulandari (2001) pada tanah masam, fosfat akan bersenyawa dengan
alumunium membentuk Al-P sedangkan pada tanah alkali, fosfat akan bersenyawa
dengan kalsium membentuk Ca-P yang sukar larut, sehingga diperlukan suatu cara
untuk dapat mengatasi hal tersebut. Salah satu kendala yang menghambat kesuburan
tanah adalah kekurangan fosfat tersedia di dalam tanah, meskipun fosfat yang
tekandung didalam tanah melimpah akan tetapi apabila pada tanah tersebut tidak
terkandung bakteri pelarut fosfat maka hanya sedikit fosfat yang akan bisa diserap
oleh tanah maupun tanaman, sehingga mengakibatkan tanah tersebut menjadi tidak
subur dan hasil dari pertanian menurun. Bakteri rhizosfer dapat meningkatkan
pertumbuhan tanaman oleh berbagai mekanisme seperti solubilisasi fosfat, produksi
siderophore, fiksasi nitrogen biologis, rhizosfer rekayasa, produksi
1-aminocyclopropane-1- deaminase karboksilat (ACC), quorum sensing (QS) sinyal
gangguan dan penghambatan pembentukan biofilm, produksi phytohormone,
menunjukkan aktivitas antijamur, produksi senyawa organik volatil (VOC), induksi
sistemik resistensi, serta gangguan patogen produksi toksin (Bhattacharyya, 2012).
Uji yang dilakukan dalam praktikum ini meliputi uji antagonisme terhadap fungi
dan bakteri patogen, uji produksi HCN, uji produksi IAA, uji bakteri penambat
nitrogen, serta uji bakteri pelarut fosfat. Uji antagonisme terhadap fungi menggunakan
fungi Fusarium sp. dan Sclerotium sp. dengan medium SCN yang diinkubasi selama 5
x 24 jam dalam suhu ruang. Sedangkan uji antagonisme terhadap bakteri
menggunakan E. coli dan S. aureus dengan media NA yang diinkubasi selama 2 x 24
jam pada suhu 37oC. Mikroba yang digunakan sebagai agen pengendali fungi dan
bakteri ialah Actinomycetes. Actinomycetes merupakan salah satu mikroba yang
memiliki potensi sebagai agen pengendali hayati yang diketahui memiliki kemampuan
dalam menghasilkan berbagai antibiotik seperti streptomycin, aureomisin,
oleandomisin, spiramycin, dan eritromisin (Sallytha et al., 2014). Uji antagonisme ini
bertujuan untuk mengetahui kemampuan Actinomycetes dalam menghambat
pertumbuhan fungi dan bakteri patogen. Keberhasilan pengendalian hayati akan
memberikan pengaruh yang baik dengan pembuatan formula dari antagonis. Salah
satu cara untuk meningkatkan daya guna dari antagonis yaitu dengan
memanipulasi unsur hara dalam memproduksi formula mikroba. Formula yang
akan digunakan harus tersusun oleh bahan yang sesuai, terutama fungsinya terhadap
agen pengendali hayati (Agrios, 2005).
Uji HCN. HCN merupakan senyawa beracun yang biasa disebut hidrogen
sianida. Biasanya, mikroba yang menghambat mikroba lain akan menghasilkan
HCN. Intrepretasi positifnya adalah perubahan warna kertas Whatmann yang sudah
ditambahkan dengan picric acid 0,5% dan sodium karbonat 2%, menjadi kuning tua
atau coklat. Uji ini menggunakan medium NA yang ditambahkan glycine sebagai
prekursor (Agrios, 2005).
Uji produksi IAA menggunakan medium TSA (Tryptic Soy Agar) yang telah
ditambahkan dengan triptofan 200 g/ml secara spread plate. Lalu diinkubasi selama
2 x 24 jam dalam suhu ruang. Namun, menurut Sukmadewi et al. (2015), sampel
diinkubasi pada suhu ruang selama tiga hari. Setelah itu ditetesi reagen Salkowsky dan
diikubasi di tempat gelap selama 15 menit. Hal ini sesuai dengan pernyataan
Sukmadewi et al. (2015), yaitu isolat bakteri yang tumbuh pada media TSA diuji
dengan cara ditetesi larutan Salkowsky. Hasil positif setelah ditetesi larutan
Salkowsky ditunjukkan dengan terjadinya perubahan warna menjadi merah muda
setelah diinkubasi di tempat gelap selama 30 menit. Hormon IAA adalah auksin
endogen yang berperan dalam perkembangan akar, menghambat pertumbuhan tunas
samping, merangsang terjadinya absisi, serta berperan dalam pembentukan jaringan
xylem dan floem. Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui potensi bakteri
penghasil hormon IAA (Indole Acetic Acid) dari tanah rhizosfer (Sukmadewi et al.,
2015).
Uji bakteri penambat nitorogen menggunakan medium NfB (Nitrogen Free
Bromothymol Blue), dimana bertujuan mengetahui kemampuan bakteri dalam proses
penambatan nitrogen bebas. Isolat bakteri diinokulasikan ke medum NfB dengan
cara stab inoculation, lalu diikubasi selama 2 x 24 jam dalam suhu ruang. Medium
NfB tidak mengandung unsur nitrogen pada komposisi bahannya sehingga isolat
yang dapat ditumbuhkan dalam media tersebut ialah isolat yang mampu memfiksasi
nitrogen bebas. Keadaan medium NfB (Nitrogen Free Bromthymolblue) dapat
membuat kondisi medium mikroaerofil sehingga dalam lingkungan tersebut
Azospirillum sp. mampu menambat N2 (Okon et al., 1977). Bakteri yang diduga dapat
menambat nitrogen bebas juga memiliki kemampuan untuk mengubah pH media
menjadi lebih basa (Kummar & Pannerselvam, 2013).
Uji kemampuan pelarutan fosfat dilakukan dengan menggunakan media
Pikovskaya Agar (0,25 g ekstrak yeast; 5 g dekstrosa; 2,5 g Ca3(PO4)2; 0,25 g
(NH4)2SO4; 0,1 g KCl; 0,05 g MgSO4.7H2O; 0,005 g MnSO4.2H2O; 0,005 g
FeSO4.7H2O; 10 g agar; 1000 mL air destilata). Isolat Azosprillum sp. diinokulasikan
ke medium PK, diinkubasi selama 2 x 24 jam dan 5 x 24 jam, lalu dilakukan
pewarnaan Gram. Bakteri penambat nitrogen yang telah diremajakan diinokulasi
pada media Pikovskaya, secara aseptis sebanyak 1 ose kemudian diinkubasi pada
suhu 28oC selama 3 hari dan diamati terbentuknya zona bening. Kemampuan
pelarutan dihitung melalui rasio antara diameter zona bening dengan diameter koloni
bakteri, kemampuan pelarutan fosfat dapat diklasifikasikan menjadi aktivitas
pelarutan rendah (low solubilization) dengan (E < 2), aktivitas pelarutan sedang
(average solubilization) dengan (2 < E <3), dan aktivitas pelarutan tinggi (high
solubilization) (E > 3) (Jumadi et al., 2015).
B. Tujuan

Tujuan dari praktikum ini adalah mahasiswa dapat mengetahui cara penapisan
isolat bakteri rizosfir yang mampu menambat nitrogen bebas dari udara, melaruttkan
fosfat organis, memproduksi dan hormon IAA yang berperan dalam meningkatkan
pertumbuhan tanaman.
II. MATERI DAN CARA KERJA

A. Materi

Alat yang digunakan yaitu cawan petri, tabung reaksi, tusuk sate steril, object
glass, jarum ose, pembakar bunsen, pinset, pipet tetes, kertas Whatmann, label dan
tissue.
Bahan yang digunakan yaitu medium semi solid Nitrogen Free
Bromothymolblue (NfB), medium Pikovskaya Agar, medium NA, medium NA +
Glycine, medium SCN, medium isolat Tryptic Soy Agar (TSA), isolat Azospirillum
sp., isolat E. coli, isolat S. aureus, isolat jamur Sclerotium sp., isolat jamur Fusarium
sp., pewarna Gram, akuades steril 9 mL, picric acid 0,5%, sodium karbonat 2%,
reagen Salkowsky, Tryptophan, dan alkohol 70%.

B. Cara Kerja

Uji Antagonisme Actinomycetes Terhadap Jamur Patogen


1. Disiapkan isolat fungi Fusarium sp. dan Sclerotium sp. yang sudah dibor gabus.
2. Isolat fungi diinokulasikan masing-masing satu plug di sisi yang berlawanan ke
dalam medium SCN yang sudah dumbuhkan Actinomycetes pada bagian tengah
medium, lalu diberi label untuk membedakan Fusarium sp. dan Sclerotium sp.
3. Diinkubasi selama 5 x 24 jam pada suhu ruang. Setelah itu, diamati zona hambat
jamurnya.

Uji Antagonisme Actinomycetes Terhadap Bakteri Patogen


1. Disiapkan isolat bakteri E. coli dan S. aureus.
2. Isolat bakteri diinokulasikan masing-masing tiga streak di sisi yang berlawanan
ke dalam medium NA yang sudah dumbuhkan Actinomycetes pada bagian
tengah medium, lalu diberi label untuk membedakan E. coli dan S. aureus.
3. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 37oC. Setelah itu, diamati zona hambat
bakterinya.

Uji Produksi Asam Sianida (HCN)


1. Isolat Azospirillum sp. diinokulasikan secara streak kontinyu pada medium NA +
Glycine.
2. Kertas Whatmann yang sudah dicelupkan pada picric acid 0,5% + sodium
karbonat 2%, diletakkan ke medium NA + Glycine yang sudah diinokulasikan
Azospirillum sp.
3. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu ruang, lalu diamati ada atau tidaknya
perubahan warna pada kertas Whatmann.

Uji Kemampuan Bakteri Menghasilkan IAA Secara Kulitatif


1. Isolat Azospirillum sp. dinokulasi pada medium TSA 50% yang sudah ditambah
Tryptophan 100 ppm secara streak kontinyu memenuhi cawan petri
2. Diikubasi selama 2 x 24 jam pada suhu ruang.
3. Setelah 2 x 24 jam, diteteskan reagen Salkowsky secukupmya, lalu diinkubasi di
ruang gelap selama 15 menit.
4. Pembentukan pelikel di permukaan medium diamati.

Bakteri Penambat N Udara dan Pelarut Fosfat


1. Isolat Azospirillum sp. diinokulasikan dengan cara ditusukkan ke medium semi
solid NfB (stab inoculation) dan secara streak kontinyu memenuhi cawan petri.
2. Biakan dalam medium solid NfB diinkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu ruang.
Lalu, diamati adanya cincin keruh pada bagian subsurface medium NfB sebagai
terduga bakteri penambat N. Sedangkan biakan pada medium Pikovskaya
diinkubasi selama 2 x 24 jam dan 5 x 24 jam. Lalu, diamati adanya zona jernih
di sekeliling koloni sebagai terduga bakteri pelarut fosfat.
3. Isolat yang tumbuh pada medium Pikovskaya karakter mikroskopisnya melalui
pewarnaan Gram.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN

Tabel 3.1. Hasil Uji Bakteri Rizosfir yang Berperan Dalam Meningkatkan
Pertumbuhan Tanaman Rombongan I
Uji Antagonisme Uji BPF
Fusa Scler Uji Uji Uji Pewarnaan
Kel. S. Bentuk Sel
rium otiu E. Gram
aure HCN IAA BPN
sp. m coli 2x24 5x24 2x24 5x24
us
sp. jam jam jam jam
Basil
1 + - - + + - - Basil beng- Gram Gram

kok (-) (-)

Basil
2 + - + + + - + Basil beng- Gram Gram

kok (-) (-)

Gram Gram
3 - - - - + - - Basil Basil
(+) (+)
Basil
Gram Gram
4 + - + + + - + Basil beng-
(+) (+)
kok
Beng-
5 + - - - + + - Basil kok Gram Gram

(V) (-) (-)

Basil
6 + - + + - - - - beng- Gram
-
kok (-)

Coc- Gram Gram


7 + - - - + - - Basil
cus (+) (-)

Tabel 3.1. menunjukkan hasil positif di semua kelompok rombongan I, kecuali


kelompok 3, pada uji antagonisme terhadap jamur patogen Fusarium sp. Sedangkan,
hasil negatif didapatkan pada semua kelompok saat menggunakan jamur patogen
Sclerotium sp. Uji positif antagonisme terhadap bakteri E. coli ditunjukkan oleh
kelompok 1, 3, 5, dan 7, sedangkan kelompok 2, 4, dan 6 menunjukkan hasil negatif.
Hasil uji antagonisme terhadap bakteri S. aureus pada kelompok 1, 2, 4, dan 6
menunjukkan hasil positif, sedangkan kelompok 3, 5, dan 7 menunjukkan hasil
negatif. Uji HCN menunjukkan hasil positif pada semua kelompok, kecuali
kelompok 6. Uji IAA menunjukkan hasil negatif pada semua kelompok, kecuali
kelompok 5 dan 6 yang menunjukkan hasil positif. Uji bakteri penambat nitrogen
(BPN), hanya kelompok 2 dan 4 yang menunjukkan hasil positif, sedangkan
kelompok lain menunjukkan hasil negatif. Hasil dari pengamatan mikroskopis dari
bakteri pelarut fosfat (BPF) dengan menggunakan pewarnaan Gram, didapatkan hasil
bahwa bentuk sel dengan waktu inkubasi 2 x 24 jam adalah basil, kecuali pada
kelompok 6 yang tidak mendapatkan hasil dan hasil kelompok 7 dengan bentuk sel
coccus. Sedangakan bentuk sel yang didapatkan semua kelompok dengan waktu
inkubasi 5 x 24 jam adalah basil, baik yang bengkok maupun tidak. Kelompok 1, 2,
dan 5, mendapatkan bakteri Gram negatif pada waktu inkubasi 2 x 24 jam, kecuali
kelompok 3, 4, dan 7 yang mendapatkan hasil bakteri Gram positif. Sedangkan, hasil
yang didapatkan dengan waktu inkubasi 5 x 24 jam, semua kelompok mendapatkan
hasil bakteri Gram negatif, kecuali kelompok 3 dan 4 yang mendapatkan hasil bakteri
Gram positif. Menurut Holt et al. (1994), bakteri yang mempunyai diameter 1 cm
kemudian diidentifikasi dengan pengamatan morfologinya, yaitu bentuk sel (coccus,
rod, atau short rod), reaksi gram (positif atau negatif), gerakan sel (motil, formasi
spora, tunggal, berpasangan, atau bentuk rantai).

(a) (b)

Gambar 3.1. (a) Hasil Uji Actinomycetes Terhadap


Fusarium sp. dan Sclerotium sp. pada Medium SCN (b)
Pembentukan Antibiotik oleh Actinomycetes

Gambar 3.1. (a) menunjukkan hasil uji Actinomycetes terhadap fungi Fusarium
sp. (di bagian kiri) dan Sclerotium sp. (di bagian kanan) dari kelompok 6 rombongan
I. Actinomycetes merupakan salah satu bakteri Gram positif yang mampu
menghasilkan senyawa antifungi maupun antimikroba. Hasil uji menunjukkan bahwa
Actinomycetes memiliki sifat antagonis terhadap Fusarium sp., tetapi tidak memiliki
sifat antagonis terhadap Sclerotium sp. karena tidak mampu menghambat
pertumbuhannya. Penghambatan pertumbuhan jamur ditandai dengan adanya zona
hambat disekitar daerah tumbuhnya hifa jamur yang menunjukkan adanya aktivitas
hidrolisis (Malinda et al., 2012). Zona hambat yang dihasilkan Actinomycetes
terhadap Fusarium sp. lebih besar daripada terhadap Sclerotium sp. Seperti yang
dapat dilihat pada Gambar 3.1. (a), pertumbuhan miselium Sclerotium sp. Sudah
melewati Actinomycetes dan memebuhi setengah cawan petri. Fusarium merupakan
salah satu jamur yang dapat menyebabkan kelayuan pada tanaman. Menurut pustaka,
Actinomycetes yang mampu menghambat pertumbuhan Fusarium sp., berasal dari
genus Streptomyces. Streptomyces dapat menghasilkan substansi berupa antibiotik
atau enzim yang berfungsi sebagai antifungi. Streptomyces sp. yang diisolasi dari laut
menghasilkan empat senyawa metabolit sekunder, yaitu asam p-hidroksifenilasetat,
asam indole-3-karboksilat, asam indole-3-asetat, dan macrolactin A. Senyawa
metabolit ektraseluler yang dihasilkan Streptomyces yang diduga antibiotik, memiliki
mekanisme kerja yang berbeda terhadap jamur uji (Sari et al., 2012).
Filtrat kultur Streptomyces thermocarboxydus mampu merusak dinding sel dan
plasma membran makrokonida, mikronkonidia, dan klamidiospora dari patogen F.
oxysporum FO2010. Sclerotium merupakan salah satu jamur penyebab penyakit rebah
kecambah pada kedelai. Sclerotium sp. yang ditumbuhkan pada medium SCN
memiliki miselium berwarna putih seperti kapas. Jamur patogen tular tanah ini
membentuk sklerotia yang dapat bertahan di dalam tanah selama 6-7 tahun. Sklerotia
yang dikultur pada SCN dapat berkecambah. Tipe perkecambahan sklerotia bersifat
dispersif, yaitu hifa keluar dari sisi-sisi sklerotia (Malinda et al., 2012).
Menurut Purwantisari et al. (2005), ada beberapa cara penghambatan serangan
jamur patogen oleh bakteri kitinolitik. Pertama, bakteri menghasilkan senyawa
bioaktif yang dapat mendegradasi komponen struktural jamur. Kedua, senyawa
bioaktif juga mempengaruhi permeabilitas membran sel jamur. Ketiga, senyawa yang
dihasilkan bakteri dapat berfungsi sebagai inhibitor terhadap suatu enzim yang
dihasilkan oleh jamur. Mekanisme keempat, yaitu senyawa yang dihasilkan oleh
bakteri mampu menekan sintesis protein pada jamur. Enzim mikolitik (kitinase,
protease, dan glukanase) yang dihasilkan oleh mikroorganisme mampu melisiskan
dinding sel jamur. Oleh karena itu, beberapa mikroorganisme kitinolitik berpotensial
sebagai pengendali patogen tanaman (Gohel et al., 2005).
Seharusnya, Actinomycetes juga harus mampu menghambat pertumbuhan
Sclerotium sp. Perbedaan daya hambat ini dapat disebabkan oleh jenis strain bakteri,
jumlah senyawa antimikroba yang dihasilkan, konsentrasi dan kualitas senyawa
antimikroba serta adanya mekanisme penghambatan yang berbeda dari jamur
patogen (Papuangan, 2009). Antibiotik yang dihasilkan Actinomycetes dapat dilihat
dari pembentukan warna merah kecoklatan, seperti pada Gambar 3.1. (b). Menurut
Pathania & Brown (2008), antibiotik akan menunjukkan aktivitas toksisitas selektif
dan mungkin berbeda pada tiap organisme. Perbedaan daya hambat juga dapat
disebabkan karena antibiotik yang dihasilkan oleh masing-masing isolat memiliki
perbedaan dalam susunan kimia.

Gambar 3.2. Hasil Uji Actinomycetes Terhadap E. coli dan S. aureus


pada Medium NA
Gambar 3.2. menunjukkan bahwa Actinomycetes bersifat antagonis terhadap E.
coli dan S. aureus pada hasil uji kelompok 6 rombongan I. Hal ini sesuai dengan
pernyataan Verma et al. (2013), bahwa Actinomycetes merupakan kelompok bakteri
yang mampu menghasilkan senyawa antimikroba yang sangat baik. Koloni
Actinomycetes tumbuh sangat lambat, meski tumbuh lambat Actinomycetes mampu
membentuk spora tahan didalam tanah dan juga memiliki kemampuan menghasilkan
antibiotik. Hal ini ditunjukkan dengan terbentuknya zona penghambatan, meskipun
terdapat variasi diameter penghambatan pada masing-masing isolat (Sallytha et al.,
2014). Diduga variasi diameter zona hambatan yang terbentuk dikarenakan adanya
perbedaan daya antagonisme dan menghasilkan antibiotik dari masing-masing isolat
Actinomycetes dalam penghambatan pertumbuhan patogen. Actinomycetes
mengeluarkan antibiotik yang peka terhadap bakteri gram negatif antara lain
streptomicin, dan neomicin (Anugrahwati, 2011).

Gambar 3.3. Hasil Uji Produksi Asam Sianida (HCN)


pada Medium NA + Glycine
Hasil dari uji ini berdasarkan Gambar 3.3., menunjukkan hasil positif karena
adanya perubahan kertas Whatmann menjadi kuning kecoklatan. Hal tersebut
menunjukkan bahwa isolat Azosprillum sp. memiliki kemampuan untuk
menghasilkan HCN. HCN yang dihasilkan oleh merupakan senyawa antifungal yang
mempunyai korelasi dengan aktifitas antagonis secara in vivo. Selain itu, senyawa
HCN merupakan senyawa beracun terhadap mikroorganisme seperti cendawan,
bakteri dan virus, bahkan terhadap mahluk hidup lainnya, yang dihasilkan oleh
mikroorganisme. Beberapa bakteri dapat meningkatkan ketahanan terhadap penyakit
karena memproduksi antibiotik dapat memproduksi asam sianida, siderofor, serta
enzim ekstraseluler yaitu kitinase, selulase, dan protease yang melisis sel bakteri atau
jamur patogen (Santhini et al., 2005). Jadi, semakin tinggi senyawa HCN yang
dihasilkan diduga akan semakin baik dipergunakan sebagai agensia antagonis
(Salamiah, 2015).
Gambar 3.4. Hasil Uji Produksi IAA Secara Kualitatif

Gambar 3.4. menunjukkan hasil negatif pada uji produksi IAA secara kualitatif
oleh isolat bakteri Azospirillum sp. dari kelompok 6 rombongan I. Hal ini tidak sesuai
dengan pernyataan Rao (1994), yang menyatakan bahwa Azospirillum sp. mampu
menghasilkan zat pengatur tumbuh seperti IAA (Indole Acetic Acid), giberelin,
auksin, serta senyawa yang menyerupai sitokinin. Hasil positif setelah ditetesi larutan
Salkowsky ditunjukkan dengan terjadinya perubahan warna menjadi merah muda
pada medium TSA setelah diinkubasi di tempat gelap selama 30 menit. Hormon IAA
yang dihasilkan oleh bakteri melimpah pada fase stasioner. Produksi IAA akan
meningkat pada kondisi pertumbuhan menurun, ketersediaan karbon yang terbatas dan
dalam kondisi lingkungan pH asam. Kondisi tersebut terjadi pada saat bakteri
memasuki fase stasioner. Bakteri yang mampu menghasilkan IAA akan berwarna
merah saat ditetesi Salkowsky, karena adanya interaksi antara IAA dan Fe membentuk
senyawa kompleks [Fe2(OH)2(IA)4]. Warna merah muda yang semakin pekat
menunjukkan konsentrasi IAA yang dihasilkan oleh bakteri semakin tinggi. Hormon
tumbuh IAA berfungsi sebagai sinyal molekul penting dalam regulasi perkembangan
tanaman, memacu perkembangan perakaran tanaman inang, meningkatkan ketahanan
terhadap patogen dan memacu pertumbuhan tanaman (Sukmadewi et al., 2015).
Faktor lingkungan yang mempengaruhi biosintesis IAA di Azospirillum sp.,
beragam dan luas. Azospirillum sp. memiliki kemampuan untuk melihat sinyal
fisiologis yang dihasilkan (dan dirasakan) oleh tanaman atau mikroorganisme di
bawah kondisi stres lingkungan dan memodifikasi metabolisme mereka untuk
mengkoordinasikan respons unik bersamaan dengan tanaman (Cassan et al., 2014).
Hormon IAA yang disintesis dari triptofan dapat terjadi melalui tiga jalur alternatif
yaitu, jalur pertama, triptofan-2-monooxygenase (IaaM) mengoksidasi triptofan
menjadi indole-3-acetamide, kemudian indole-3-acetamide dihidrolisasi oleh
indoleacetamide hydrolase. Jalur kedua triptofan diubah menjadi tryptamine oleh
enzim triptofan dekarboksilase. Tryptamine diubah menjadi indole-3-acetaldehyde
oleh enzim amin oksidase, yang kemudian diubah lagi menjadi Indole-acetid acid oleh
enzim indol acetaldehid dehidrogenasae. Jalur ketiga, triptofan diubah menjadi asam
indol piruvat oleh enzim triptofan transaminase, kemudian diubah menjadi
indol-3-acetaldehid oleh indole acetid acid (IAA) (Sukmadewi et al., 2015).

Gambar 3.5. Hasil Uji Bakteri Penambat Nitrogen

Gambar 3.5. merupakan hasil uji bakteri penambat nitrogen dari kelompok 6
rombongan I. Hasilnya menunjukkan bahwa Azospirillum sp. tidak dapat menambat
nitrogen. Hal ini tidak sesuai dengan pernyataan Rao (1994), yaitu Azospirillum
merupakan bakteri penambat nitrogen nonsimbiotik yang hidup bebas didalam tanah,
baik disekitar maupun dekat dengan perakaran. Azospirillum digunakan sebagai
biofertilizer karena mampu menambat nitrogen (N2) 40-80% dari total nitrogen
dalam rotan dan 30% nitrogen dalam tanaman jagung. Selain itu, Azospirillum
memiliki sifat mikroaerofilik sehingga dapat dipisahkan dalam medium setengah
padat yang mengandung malat melalui prosedur pengayaan. Karakteristik dari
Azospirillum yaitu berkembangnya pelikel tipis berwarna putih, padat dan beralun
pada medium setengah padat yang mengandung malat (Rao, 1994). Keadaan medium
NfB (Nitrogen Free Bromthymolblue) dapat membuat kondisi medium mikroaerofil
sehingga dalam lingkungan tersebut Azospirillum sp. mampu menambat N2.
Pertumbuhan Azospirillum ditandai dengan terbentuknya pelikel di permukaan
medium. Hasil praktikum menunjukkan hasil negatif. Hal ini dikarenakan medium
belum padat sehingga pelikel yang seharusnya bersifat mikroaerofilik tidak dapat
terbentuk (Okon et al., 1977).
Mekanisme bakteri dalam menambat nitrogen bebas menurut Prayudiningsih &
Nursyamsi (2015) yaitu :
1. Proses Amonifikasi
Saat oksigen berkurang, nitrat (NO3-) akan diubah kembali menjadi
gas nitrogen (N2) oleh bakteri, sehingga terjadi pelepasan gas oksigen (O2).
Proses ini dinamakan denitrifikasi yang pada umumnya dilakukan oleh
bakteri Pseudomonas, Paracoccus denitrificans, Escherichia coli. Nitrogen yang
dihasilkan dari proses denitrifikasi ini selanjutnya dilepaskan ke udara. Dengan
cara inilah siklus nitrogen akan berulang dalam ekosistem. Produk fikasai
nitrogen adalah NH3 (amonia) yang diperoleh dari hasil penguraian jaringan
yang mati oleh bakteri. Amonia ini berbentuk gas, sehingga dapat menguap
kembali ke atmosfer atau masuk ke dalam tanah dan bergabung dengan ion
hidrogen menjadi amonium (NH4+). Dalam bentuk amonium, nitrogen dapat
langsung digunakan oleh tumbuhan. Proses yang terjadi : NH3 + H+ NH4+
2. Mengubah Amonia menjadi Nitrit
Amonia (NH3) dalam tanah juga digunakan oleh bakteri aerob sebagai sumber
energi melalui proses nitrifikasi, yaitu tahap oksidasi amonium menjadi nitrit
(NO2-) dan kemudian menjadi nitrat (NO3-). Bakteri aerob yang terlibat dalam
nitrifikasi antara lain Nitrosomonas dan Nitrosococcus. Proses yang terjadi :
2NH3 + 3O2 2HNO2 + 2H2O
3. Mengubah Nitrit menjadi Nitrat
Nitrat yang dihasilkan selanjutnya akan diserap oleh akar tumbuhan. Proses yang
terjadi : 2HNO2+ O2 2HNO3

(a) (b)
(c)

Gambar 3.6. (a) Hasil Uji Bakteri Pelarut Fosfat pada Medium
Pikovskaya dengan Inkubasi 2x24 Jam (b) Hasil Uji Bakteri Pelarut
Fosfat pada Medium Pikovskaya dengan Inkubasi 5x24 Jam (c) Hasil
Pewarnaan Gram Azospirillum sp. Perbesaran 4x10
Bakteri pelarut fosfat merupakan bakteri yang berperan dalam penyuburan tanah
karena bakteri tipe ini mampu melakukan mekanisme pelarutan fosfat dengan
mengekskresikan sejumlah asam organik berbobot molekul rendah seperti oksalat,
suksinat, fumarat, malat (Simanungkalit & Suriadikarta, 2006). Bakteri pelarut fosfat
mampu mensekresikan enzim fosfatase yang berperan dalam proses hidrolisis P
organik menjadi P anorganik dan juga bakteri pelarut fosfat dapat menghasilkan zat
pengatur tumbuh. Hal ini sesuai dengan pernyataan Maryanti (2006) tanda-tanda
bahwa suatu bakteri dapat melarutkan fosfat yaitu dengan adanya zona bening pada
sekitaran koloni bakteri dan penambahan ukuran koloni bakteri pada media
Pikovskaya, hal ini disebabkan karena bakteri tersebut dapat melarutkan fosfat
(Ca(PO4)2) yang terdapat pada formulasi medium Pikovskaya. Gambar 3.6. (a) dan
(b) menunjukkan bahwa tidak ada zona jernih yang terbentuk pada medium
Pikovskaya, sehingga dapat disimpulkan bahwa bakteri Azospirillum yang
diinokulasi tidak dapat melarutkan fosfat. George et al. (2002), menyatakan bahwa
bakteri pelarut fosfat akan melarutkan fosfat dalam bentuk PO4 menggunakan enzim
fosfotase, sehingga terbentuk zona bening disekitaran koloni bakteri pelarut fosfat.
Mekanisme pelarutan fosfat secara kimia merupakan mekanisme pelarutan
fosfat utama yang dilakukan oleh mikroorganisme. Mikroorganisme tersebut
mengekskresikan sejumlah asam organik berbobot molekul rendah seperti oksalat,
suksinat, tartrat, sitrat, laktat, -ketoglutarat, asetat, formiat, propionat, glikolat,
glutamat, glioksilat, malat, fumarat. Meningkatnya asam-asam organik tersebut
diikuti dengan penurunan pH. Penurunan pH juga dapat disebabkan karena
terbebasnya asam sulfat dan nitrat pada oksidasi kemoautotrofik sulfur dan amonium,
berturut-turut oleh bakteri Thiobacillus dan Nitrosomonas (Alexander, 1977).
Perubahan pH berperanan penting dalam peningkatan kelarutan fosfat. Selanjutnya
asam-asam organik ini akan bereaksi dengan bahan pengikat fosfat seperti Al3+, Fe3+,
Ca2+, atau Mg2+ membentuk khelat organik yang stabil sehingga mampu
membebaskan ion fosfat terikat dan oleh karena itu dapat diserap oleh tanaman (Asea
et al., 1988).
Pewarnaan Gram dilakukan dengan mengambil langsung isolat Azospirillum sp.
dari kontrol. Hasil menunjukkan bahwa bentuk sel Azospirillum sp. adalah basil
bengkok dan merupakan Gram negatif, seperti yang ditujukkan oleh Gambar 3.6.
(c). Hal ini sesuai dengan pernyataan Erfin et al. (2016), yaitu Azospirillum memiliki
bentuk koloni lengkung atau setengah spiral dan vibrinoid dan termasuk bakteri
Gram negatif. Selain itu, Azospirillum mempunyai ciri berupa sel yang berbentuk
setengah spiral yang padat dan bergetar dengan sebuah flagel polar sehingga
bergerak secara berputar. Bakteri ini adalah gram negatif dan mengandung butir-butir
poli-- hidroksibutirat (Erfin et al., 2016).

IV. KESIMPULAN DAN SARAN


A. Kesimpulan

Kesimpulan yang dapat ditarik dari hasil dan pembahasan, yaitu :


1. Penapisan isolat Azospirillum sp. Sebagai bakteri rizosfir, menunjukkan hasil
negatif dalam praktikum ini. Hal ini dikarenakan medium mediun NfB (Nitrogen
Free Bromothymol blue). belum padat sehingga pelikel yang seharusnya bersifat
mikroaerofilik tidak dapat terbentuk, sehingga Azospirillum sp. Tidak dapat
menambat nitrogen. Azospirillum sp. juga tidak dapat melarutkan fosfat pada
medium Pikovskaya karena tidak menghasilkan zona jernih di sekitar koloni.
Actinomycetes bersifat antagonis terhadap Fusarium sp., E. coli, dan S. aureus.
Hasil pewarnaan Gram menunjukkan bahwa Azospirillum sp. Merupakan
bakteri Gram negatif dengan bentuk basil bengkok.

B. Saran

Sebaiknya, uji yang dilkukan lebih teliti dan tepat agar memperoleh hasil yang
maksimal. Sehingga, meminimalisir kontaminasi dan perolehan data yang kurang
akurat.
DAFTAR REFERENSI

Agrios, G. 2005. Ilmu Penyakit Tumbuhan. Yogyakarta: Gadjah Mada University


Press.
Alexander, M. 1977. Ecology of Nitrogen-Fixing organisms. Biological Nitrogen
Fixation in Farming Systems of the Tropics. New York: John Wiley and Sons.
Anugrahwati, D.R. 2011. Aktifitas Actinomycetes Endofit Sebagai Bionematisida
Terhadap Meloidogyne javanica. Crop Agro, 1(2): pp.114-126.
Aryantha, I.N.Y.P., Dian, P.L. & Nurmi, P.D.P. 2004. Potensi Isolat Bakteri
Penghasil IAA dalam Peningkatan Pertumbuhan Kecambah Kacang Hijau Pada
Kondisi Hidroponik. Mikrobiologi Indonesia, 9: pp.43-46.
Asea, P.E.A., Kucey, R.M.N. & Stewart, J.W.B. 1988. Inorganic Phosphate
Solubilization by Two Penicillium Species in Solution Culture and Soil. Soil
Biology and Biochemistry, 20: pp.459-464.
Bashan, Y. & Holguin, G. 1998. Proposal for The Division of Plant Growth
Promoting Rhizobacteria into Two Classifications Biocontrol PGPB (Plant
Growth-Promoting Bacteria) and PGPB. Soil Biol Biochem, 30: pp.1225-1228.
Bhattacharyya, P.N.DK. 2012. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR)
Emergence in Agriculture. World Journal of Microbial Biotechnology, 28:
pp.13271350.
Cassan, F., Vanderleyden, J. & Spaepen, S. 2014. Physiological and Agronomical
Aspects of Phytohormone Production by Model Plant-Growth-Promoting
Rhizobacteria (PGPR) Belonging to the Genus Azospirillum. Journal of Plant
Growth Regulation, 33(2): pp.440-459.
Erfin, Sandiah, N. & Malesi, L. 2016. Identifikasi Bakteri Azospirillum dan
Azotobacter Pada Rhizosfer Asal Komba-Komba (Chromolaena odorata). Jitro,
3(2): pp.31-38.
George, T.S., Gregori, P.J., Wood, M., Read, J. & Buresh, R.J. 2002. Phosphatase
Activity and Organic Acids in The Rhizosphere of Potential Agroforestry
Species and Maize. Soil Biology and Biochemistry, 34: pp.1487-1494.
Gohel, V., Singh, A., Vimal, M., Ashwini, P. & Chhatpar, H.S. 2006. Bioprospecting
and Antifungal Potential of Chitinolytic Microorganisms. Afr J Biotechnol, 5(2):
pp.54-72.
Holt, J.G., Krig, N.R., Sneath, P., Staley, J. & William, S. 1994. Bergeys Manual of
Determinative Bacteriology. Pennsylvania: Lipincott Williams and Wilkins
Company.
Jumadi, O., Liawati & Hartono. 2015. Produksi Zat Pengatur Tumbuh IAA (Indole
Acetic Acid) dan Kemampuan Pelarutan Posfat Pada Isolat Bakteri Penambat
Nitrogen Asal Kabupaten Takalar. Jurnal Bionature, 16(1): pp.43-48.
Kumar, S. & Pannerselvam, A. 2013. Studies on Azospirillum isolated from the soils
of Thiruvarur Dt., Tamilnadu, India. Adv Appl Sci Res, 4(1): pp.86-93.
Malinda, N., Suryanto, D. & Nurtjahja, K. 2012. Penghambatan Serangan Sclerotium
rolfsii Penyebab Rebah Kecambah Pada Kedelai dengan Bakteri Kitinolitik.
Saintia Biologi, 1(1): pp.52-58.
Maryanti, D. 2006. Isolasi dan Uji Kemampuan Bakteri Pelarut Fosfat dari Rhizosfir
Tanaman Pangan dan Semak. Skripsi. Fakultas Pertanian Universitas Andalas.
Okon, Y., Albrecht, S.L. & Burris, R.H. 1977. Methods for growing Spirillum
lipoferum and for counting it in pure culture and in association with plants. Appl
Environ Microbiol, 33(1): pp.85-88.
Papuangan, N. 2009. Aktivitas Penghambatan Senyawa Antimikroba Streptomyces
spp. Terhadap Mikroba Patogen Tular Tanah Secara In vitro dan In Planta. Tesis.
Program Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor.
Pathania, R. & Brown, E.D. 2008. Small and Lethal: Searching For New Antibacterial
Compound with Novel Model Of Action. Minireview Biochem Cell Biol, 86:
pp.111-115.
Patti, P.S., Kaya, E. & Silahooy, C. 2013. Analisis Status Nitrogen Tanah dalam
Kaitannya dengan Serapan N oleh Tanaman Padi Sawah di Desa Waimital,
Kecamatan Kairatu, Kabupaten Seram Bagian Barat. Agrologia, 2(1): pp.51-58.
Permatasari, A. & Nurhidayati, T. 2014. Pengaruh Inokulan Bakteri Penambat
Nitrogen, Bakteri Pelarut Fosfat dan Mikoriza Asal Desa Condro, Lumajang,
Jawa Timur terhadap Pertumbuhan Tanaman Cabai Rawit. Jurnal Sains dan
Seni Pomits, 3(2): pp.2337-3520.
Prayudiningsih, R. & Nursyamsi, S.R. 2015. Mikroorganisme tanah bermanfaat pada
rhizosfer tanaman umbi di bawah tegakan hutan rakyat Sulawesi Selatan. Pros
Sem Nas Masy Biodiv Indon, 1(4): pp.954-959.
Purwantisari, S., Pujiyanto, S. & Ferniah, R. 2005. Uji Efektivitas Bakteri Kitinolitik
sebagai Pengendali Pertumbuhan Kapang Patogen Penyebab Penyakit Utama
Tanaman Sayuran dan Potensinya sebagai Bahan Biofungisida ramah
Lingkungan. Laporan Penelitian FMIPA UNDIP. Semarang.
Rao, N.S. 1994. Mikrobiologi Tanah dan Pertumbuhan Tanaman. Jakarta: UI Press.
Salamiah, R.W. 2015. Pemanfaatan Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR)
dalam pengendalian penyakit tungro pada padi lokal Kalimantan Selatan. Pros
Semnas Masy Biodiv Indo, 1(6): pp.1448-1456.
Sallytha, A.A.M., Addy, H.S. & Mihardjo, P.A. 2014. Penghambatan Actinomycetes
Terhadap Erwinia Carotovora Subsp. Carotovora Secara In Vitro. Berkala
Ilmiah Pertanian, 1(4): pp.70-72.
Santhini, E., Pradeepa, D., Angayarkanni, T. & Kamalakannan, A. 2005.
Identification of Biochemical Markers for the Selection of Effective Strains of
Pseudomonas fluorescens against Phythium spp. Advanced Botany, 1(2):
pp.295-303.
Sari, N.M., Kawuri, R. & Khalimi, K. 2012. Streptomyces sp. Sebagai Biofungisida
Patogen Fusarium oxysporum (Schlecht.) f.sp. lycopersici (Sacc.) Snyd. et Hans.
Penyebab Penyakit Layu Pada Tanaman Tomat (Solanum lycopersicum L.).
Agrotop, 2(2): pp.161-169.
Simanungkalit, R.D.M. & Suriadikarta, D.A. 2006. Pupuk Organik dan Pupuk
Hayati. Bogor: Balai Besar Litbang Sumberdaya Lahan Pertanian.
Sukmadewi, D.K.T., Suharjono, Antonius, S. 2015. Uji Potensi Bakteri Penghasil
Hormon IAA (Indole Acetic Acid) dari Tanah Rhizosfer Cengkeh (Syzigium
aromaticum L.). Jurnal Biotropika, 3(2): pp.91-94.
Tarigan, R.S., Jamilah, I. & Elimasni. 2011. Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen dan
Penghasil Hormon IAA (Indole Acetic Acid) dari Rhizosfer Tanah Perkebunan
Kedelai (Glycine max L.). Jurnal Ilmu Tanah Lingkungan,10: pp.42-48.
Verma, S.K., Gond, S.K., Mishra, A., Sharma, V.K., Kumar, J., Singh, D.K., Kumar,
A., Goutam, J. & Kharwar R.N. 2013. Impact of environmental variables on the
isolation, diversity and antibacterial activity of endophytic fungal communities
from Madhuca indica Gmel. at different locations in India. Ann. Microbiology,
1: pp.1-11.
Wulandari, S. 2001. Efektifitas Bakteri Pelarut Fosfat Pseudomonas sp. Terhadap
Pertumbuhan Tanaman Kedelai (Glycine max L.) pada Tanah Podsolik Merah
Kuning. Jurnal Natur Indonesia, 4(1): pp.21-25.