Anda di halaman 1dari 25

KARAKTERISASI BAKTERI ENTERON

Disusun oleh:
Nama : Maria Pricilia Gita Permana Putri
NIM : B1A015068
Kelompok :6
Rombongan :I
Asisten : Uho Baihaqi

LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI


UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2017
I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Karakterisasi merupakan salah satu kegiatan yang dilakukan untuk


mengobservasi mikroorganisme hasil isolasi (isolat). Kegiatan karakterisasi dapat
dilakukan berdasarkan sifat sitologi (bentuk sel, gerak atau motilitas, sifat Gram dan
endospora), sifat morfologi, dan sifat fisiologi. Uji sifat morfologi mencakup
sifat-sifat koloni, seperti ukuran, bentuk, warna dan tepian, sedangkan uji sifat
fisiologi diantaranya uji hidrolisis pati, hidrolisis lemak, hidrolisis protein dan uji
katalase. Karakterisasi terbagi dalam dua tahap yaitu klasifikasi dan identifikasi.
Selain itu, untuk dapat mengidentifikasi dan mengkasifikasi suatu mikroorganisme,
maka kita harus mempelajari karakteristik mikroorganisme tersebut terlebih dahulu.
Klasifikasi merupakan pengelompokan mikroba ke dalam suatu kelompok taksonomi
tertentu. Teori identifikasi mikroba merupakan perbandingan antara yang tidak
diketahui dan yang diketahui. Tingkat keakuratan dari identifikasi bergantung pada
ketelitian kerja preparasi seperti pembuatan media, pembuatan reagen dan pewarnaan,
dan ketelitian dalam melakukan, mengamati, dan mencatat berbagai uji (Pelczar &
Chan, 2007).
Anggota dari famili Enterobacteriaceae adalah bakteri Gram negatif fakultatif
anaerobik berbentuk batang yang dapat bersifat motil atau non motil; strain bakteri
motil mempunyai flagella peritrik. Panjangnya dapat mencapai 1-5 m. Semua spesies
berkembang biak pada media buatan dan mengubah glukosa, dimana mereka
membentuk asam atau asam dan gas. Bakteri-bakteri tersebut juga memproduksi
enzim katalase. Pengecualian pada genus Erwinia, anggota dari Enterobacteriaceae,
yang mereduksi nitrat menjadi nitrit. Komposisi antigeniknya tendiri dari sebuah
mozaik hubungan serologik yang saling mengisi diantara beberapa genus. Famili ini
termasuk saprofit, parasit hewan dan beberapa parasit tanaman (Farmer, 2003).
Apabila Enterobacteriaceae diuji dengan tes katalase maka hasilnya positif, hal
tersebut menunjukkan bahwa Enterobacteriaceae mengandung enzim katalase.
Namun, apabila diuji dengan tes oksidase, maka hasilnya negatif. Enterobacteriaceae
merupakan bakteri non-spora dan membentuk reaksi katalase yang bervariasi.
Sebagian besar strainnya memiliki fimbria adhesif. Saat pertumbuhannya,
Enterobacteriaceae kurang atau sedikit memerlukan NaCl (Brooks et al., 2008).
Berdasarkan sifat fermentasinya, Enterobacteriaceae digolongkan menjadi dua
kelompok yaitu Enterobactericaceae Laktosa Fermenter dan Enterobacteriaceae Non
Laktosa Fermenter. Laktosa digunakan sebagai sumber karbohidrat dalam proses
pertumbuhannya. Media selekif yang digunakan untuk membedakan bakteri ini adalah
media MacConkey Agar. Media MacConkey Agar membedakan bakteri yang
memfermentasi laktosa, (berkoloni merah muda) dengan yang nonfermentasi (tidak
berwarna). NaCl yang terkandung dapat menghambat koloni bakteri Proteus. Koloni
Salmonella halus dan tak berwarna, mempunyai keistimewaan memilah bakteri
enterik Gram negatif yang memfermentasi laktosa, karena media ini mengandung
laktosa, Crystal Violet, dan Neutral Red Bile Salt. Kemampuan E. coli memfermentasi
laktosa menyebabkan penurunan pH, sehingga mempermudah absorpsi Neutral Red
untuk mengubah koloni menjadi merah bata. Koloni lain (S. aureus, P. aeruginosa,
dan Salmonella), bila tumbuh tidak akan berwarna karena tidak mampu
memfermentasi laktosa. Mikroba lain yang dapat tumbuh pada media ini antara lain
Enterobacter, Proteus, Salmonella, Shigella, Aerobacter, dan Enterococcus.
Jenis-jenis Enterobacteriaceae Laktosa Fermenter diantaraya adalah E. coli, Klebsiella
pneumoniae, dan Enterobacter (Jyothi et al., 2012). Enterobacteriaceae adalah bakteri
menjadi flora di usus besar manusia dan hewan, tanah, air dan dapat pula ditemukan
pada komposisi material. Enterobacteriaceae adalah keluarga bakteri yang
bertanggung jawab pada sekitar 50% infeksi nosokomial misalnya sebagai penyebab
infeksi saluran kemih dan infeksi pada luka (Holt et al., 1994). Sebagian bakteri ini
tidak menimbulkan penyakit pada inangnya jika tetap berada di dalam usus besar
inang, tetapi dapat menimbulkan penyakit jika terdapat di bagian lain tubuh inang.
Golongan bakteri kelompok Enterobacteriaceae adalah sekelompok genus bakteri
Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Hafnia, Klebsiella, Proteus,
Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, dan Yersinia (Downes & Ito, 2000).
Klasifikasi ilmiah Enterobacteriaceae menurut Clayton et al. (1986) yaitu :
Kingdom : Bacteria
Phylum : Proteobacteria
Classis : Gammaproteobacteria
Ordo : Enterobacteriales
Familia : Enterobacteriaceae
Uji yang dilakukan dalam praktikum ini, antara lain :
1. Karakterisasi morfologi bertujuan untuk mengamati baik morfologi koloni,
maupun morfologi sel bakteri pada isolat bakteri yang telah lolos seleksi. Isolat
bakteri yang diperoleh diamati morfologi koloni dengan melihat bentuk koloni,
warna, tepian dan elevasi pada medium agar lempeng, agar tegak dan agar miring.
Sedangkan morfologi sel ditentukan dengan melihat olesan biakan yang sudah
diwarnai dibawah mikroskop dan melihat bagaimana bentuk sel, sifat gram dan
kemampuan membentuk spora dari bakteri tersebut (Cappuccino & Sherman,
1992).
2. Pewarnaan Gram dan spora dapat dilakukan dalam uji sifat sitologi suatu bakteri.
Prinsip pewarnaan Gram adalah kemampuan dinding sel terhadap zat warna dasar
(Crystal Violet) setelah pencucian alkohol 96%. Bakteri Gram positif terlihat
berwarna ungu karena dinding selnya mengikat kristal violet lebih kuat,
sedangkan sel Gram negatif mengandung lebih banyak lipid sehingga pori-pori
mudah membesar dan kristal violet mudah larut saat pencucian alkohol (Pelczar
& Chan 2007).
3. Uji proteolitik adalah uji untuk mengetahui kemampuan menghasilkan protease
untuk menghidrolisis protein menjadi asam amino. Proes hidrolisis protein
berlangsung secara bertahap sebelum akhirnya menjadi asam amino. Reaksi
hidrolisis protein akan memutuskan ikatan peptida. Aktivitas proteolitik
dikatakan berhasil apabila terbentuk zona bening disekitar koloni yang tumbuh
pada media protease agar (Susanto, 2003).
6. Uji katalase merupakan suatu pengujian untuk mengetahui apakah bakteri yang
diuji merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau anaerob. Bakteri tersebut
dikatakan positif aerob atau dapat menghidrolisis H2O2 apabila setelah diberi
reagen katalase (H2O2) terbentuk gelembung gas (Hadioetomo, 1993).
7. Uji oksidase. Enzim oksidase memegang peranan penting dalam transport
elektron selama respirasi aerobik. Sitokrom oksidase mengkatalisis oksidasi dan
reduksi sitokrom oleh molekul oksigen. Enzim oksidase dihasilkan oleh bakteri
aerob, fakultatif anaerob dan mikroaerofilik. Mikroorganisme ini menggunakan
oksigen sebagai akseptor elektron terakhir selama penguraian karbohidrat
menjadi energi. Kemampuan bakteri memproduksi sitokrom oksidase dapat
diketahui dari reaksi yang ditimbulkan setelah pemberian reagen oksidase pada
koloni. Reagen yang biasa digunakan adalah tetramethylDphenylenediamine
dihidrocloride (Cappucino & Sherman, 1992).
8. Uji Indole bertujuan mengidentifikasi kemampuan bakteri menghasilkan indol
dengan menggunakan enzim tryptophanase (Leboffe & Burton, 2011). Produksi
indol di dalam media dimungkinkan karena adanya tryptophan. Bakteri yang
memiliki enzim tryptophanase menghidrolisis tryptophan. menjadi indol, piruvat
dan amonia. Hal ini digunakan sebagai bagian dari prosedur IMVIC, sebuah tes
yang dirancang untuk membedakan antara anggota keluarga Enterobacteriaceae
(Hemraj, 2013).
9. Uji Methyl Red bertujuan untuk mendeteksi kemampuan organisme dalam
memproduksi dan mempertahankan produk akhir asam stabil dari fermentasi
glukosa. Beberapa bakteri menghasilkan sejumlah besar asam dari fermentasi.
Methyl Red adalah indikator pH, yang tetap berwarna merah pada pH 4,4 atau
kurang (Sridhar et al., 2006).
10. Uji VP (Voges Proskauer) adalah tes yang digunakan untuk mendeteksi acetoin
dalam kultur cair bakteri. Pengujian ini dilakukan dengan menambahkan
-napthole dan kalium hidroksida dengan kaldu Voges Proskauer yang telah
diinokulasi dengan bakteri. Warna merah cherry menunjukkan hasil yang positif,
sedangkan warna kuning-coklat menunjukkan hasil negatif (Iwade et al., 2006).
11. Uji Citrate bertujuan mendeteksi kemampuan suatu organisme untuk
memanfaatkan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Bakteri
diinokulasi pada medium yang mengandung natrium sitrat dan indikator pH
bromothymol biru. Media juga mengandung garam amonium anorganik, yang
digunakan sebagai satu-satunya sumber nitrogen (Hemraj, 2013).
12. Uji Urease berguna untuk mengidentifikasi organisme yang mampu
menghidrolisis urea yang dapat menghasilkan amonia dan karbon dioksida
terutama untuk mengetahui mikroorganisme tersebut mempunyai enzim urease
atau tidak. Urease merupakan enzim konstitutif yang menghidrolisis urea menjadi
karbon dioksida dan ammonia (Brink et al., 2012). Hidrolisis urea akan
melepaskan amonia yang akan menurunkan pH pada media dan akan terjadi
perubahan warna dari kuning ke merah muda pekat (deep pink) (Danish &
Mishra, 2014).
13. Uji H2S. Uji ini menggunakan medium Triple Sugar Iron Agar (TSIA) . TSIA
adalah media deferensial yang digunakan dalam menentukan fermentasi
karbohidrat dan produksi H2S. Selain itu, uji TSIA ini juga dapat mendeteksi
adanya gas hasil dari metabolisme karbohidrat. TSIA membedakan bakteri
berdasarkan fermentasi mereka laktosa, glukosa, dan sukrosa dan produksi
hidrogen sulfida. TSIA yang paling sering digunakan dalam identifikasi
Enterobacteriaceae, meskipun berguna untuk bakteri Gram negatif lainnya (Holt
et al., 1994).
14. Uji gula-gula digunakan untuk mengetahui apakah bakteri dapat memfermentasi
masing-masing gula membentuk asam. Sebagian besar mikroorganisme
memperoleh energi dari substrat berupa karbohidrat yang selanjutnya di
fermentasi menghasilkan asam-asam organik (seperti asam laktat, format, asetat),
dengan disertai atau tidak disertai pembentukan gas. Organisme-organisme yang
berbeda akan menggunakan karbohidrat atau gula-gula yang berbeda tergantung
dari komponen enzim yang dimilikinya (McNeil & Harvey, 2008)

B. Tujuan

Tujuan dari praktikum ini adalah mahasiswa dapat mengetahui langkah-langkah


atau tahapan dalam karakterisasi bakteri, yaitu secara morfologi, biokimia, dan
enzimatis.
II. MATERI DAN CARA KERJA

A. Materi

Alat yang digunakan yaitu cawan petri, tabung reaksi, tusuk sate steril, object
glass, jarum ose, pembakar bunsen, pipet ukur, filler, pipet tetes, wrapper, mikroskop,
label, dan tissue.
Bahan yang digunakan yaitu sampel bakteri enteron, medium Protease Agar
(PA), medium Sulfide, Indole, Motility Agar (SIM A), medium Tryptone Broth (TB),
medium Protease Broth (PB), medium Simmons Citrate, medium Urease Broth
(UB), medium Triple Sugar Iron Agar (TSIA), dan berbagai gula (manosa, xylosa,
arabinosa, dan maltosa). Bahan lainnya adalah reagen H2O2, reagen oksidase, reagen
Kovacks Indole, reagen Methyl Red, KOH 40%, -naphtole, dan pewarna Gram
(Gram A, B, C, D). Pewarna Gram A adalah Crystal Violet, pewarna Gram B Lugols
Iodine, pewarna Gram C Ethanol 96%, dan pewarna Gram D Safranin.

B. Cara Kerja

Uji Morfologi
1

1. Uji Makromofologi
Isolat bakteri Enterobacteriaceae diamati bentuk, ukuran, elevasi, tepi,
permukaan, dan warna koloninya.
2. Uji Motilitas
Isolat diinokulasikan ke medium SIM A dengan stab inoculation, lalu
diinkubasi 2 x 24 jam dalam suhu 37oC. Interpretasi positif (+) jika terjadi
pertumbuhan koloni yang menyebar, dan negatif (-) jika tidak terjadi
pertumbuhan koloni.
3. Uji Mikromorfologi
a. Isolat diulas di atas object glass, lalu ditetesi akuades secukupnya, dan
difiksasi 2-3 kali di atas api bunsen.
b. Isolat ditetesi dengan Gram A (Crystal Violet) dan didiamkan selama 60
detik, kemudian dicuci-kering-angin-kan.
c. Isolat ditetesi dengan Gram B (Lugols Iodine) dan didiamkan selama 60
detik, kemudian dicuci-kering-angin-kan.
d. Isolat dibilas dengan Gram C (Ethanol 96%) sampai bersih, kemudian
dicuci-kering-angin-kan.
e. Isolat ditetesi dengan Gram D (Safranin) dan didiamkan selama 45 detik,
kemudian dicuci-kering-angin-kan.
f. Setelah pewarnaan, isolat diamati di bawah mikroskop untuk mengetahui
bentuk sel dan jenis gramnya.

Uji Enzimatis
1. Uji Katalase
Isolat bakteri Enterobacteriaceae diulas di atas object glass, kemudian ditetesi
dengan reagen katalase (H2O2), lalu diamati. Interpretasi positif (+) jika terdapat
gelembung, dan negatif (-) jika tidak terdapat gelembung.
2. Uji Oksidase
Isolat bakteri Enterobacteriaceae diulas di atas object glass yang telah diberi
kertas merang, kemudian ditetesi dengan reagen oksidase
(tetramethyl-p-phenylenediaminedihidrochloride), lalu diamati. Interpretasi
positif (+) jika kertas merang berwarna biru gelap, dan negatif (-) jika tidak ada
perubahan warna.
3. Uji Proteolitik
Isolat bakteri Enterobacteriaceae ditanam ke dalam medium PA dengan
metode streak kontinyu setengah cawan, lalu diinkubasi 2 x 24 jam dalam suhu
37oC. Interpretasi positif (+) jika terdapat zona jernih di sekitar koloni, sementara
negatif (-) jika tidak terdapat zona jernih.
4. Uji Urease
Sebanyak 0,1 ml isolat cair bakteri Enterobacteriaceae diambil, dimasukkan
ke dalam medium UB, lalu diinkubasi selama 2 x 24 jam dalam suhu 37oC.
Interpretasi positif (+) jika medium berubah warna menjadi merah muda, dan
negatif (-) jika tidak ada perubahan.

Uji Biokimiawi
1. Uji IMVIC:
- Indole: isolat cair diambil sebanyak 0,1 ml ke dalam medium TB, kemudian
diinkubasi selama 2 x 24 jam dalam suhu 37oC. Setelah inkubasi, medium
ditetesi dengan reagen Kovacks Indole sebanyak 3 tetes. Interpretasi positif (+)
jika terbentuk cincin merah di permukaan koloni, dan negatif (-) jika tidak
terbentuk cincin merah.
- Methyl Red dan Voges Proskauer: isolat cair diambil sebanyak 0,1 ml ke dalam
medium PB, kemudian diinkubasi selama 2 x 24 jam dalam suhu 37oC. Setelah
inkubasi, medium ditetesi dengan reagen Methyl Red (untuk uji Methyl Red)
dan reagen KOH 40% + -naphtole (untuk uji Voges Proskauer). Interpretasi
positif (+) jika medium berubah warna menjadi merah, dan negatif (-) jika tidak
ada perubahan.
- Simmons Citrate: isolat cair diinokulasikan sebanyak satu ose ke dalam
medium SC, lalu diinkubasi selama 2 x 24 jam dalam suhu 37oC. Interpretasi
positif (+) jika medium berubah warna menjadi hijau, dan negatif (-) jika tidak
ada perubahan warna.
2. Uji Gula-Gula
Isolat cair diambil sebanyak 0,1 ml dan masing-masing dimasukkan ke dalam
medium berisi jenis-jenis gula (manosa, xylosa, arabinosa, dan maltosa),
kemudian diinkubasi selama 2 x 24 jam dalam suhu 37oC. Interpretasi positif (+)
terjadi jika terdapat gelembung gas pada tabung Durham dan media berubah
menjadi kuning, dan negatif (-) jika tidak terjadi perubahan.
3. Uji H2S
Tusuk sate (bambu) steril dicelupkan ke dalam isolat cair, kemudian
dilakukan stab dan sland inoculation ke dalam medium TSIA, lalu diinkubasi
selama 2 x 24 jam dalam suhu 37oC. Ada tiga interpretasi positif (+), yaitu (a) jika
dasar medium berubah warna menjadi kehitaman; (b) glukosa, laktosa, dan
sukrosa medium miring dan tegak berubah warna menjadi kuning; (c) glukosa
bagian medium tegak berubah warna menjadi kuning.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN

Tabel 3.1. Hasil Pengamatan Karakter Makroskopis Isolat Bakteri


Enterobacteriaceae Kelompok 6 Rombongan I

Karakter Kenampakan
Permukaan Mengkilap
Elevasi Raised (menonjol)
Tepi Rata
Bentuk Sirkuler
Ukuran Small
Warna Putih susu

Tabel 3.1. menunjukkan karakter makroskopis dari isolat bakteri


Enterobacteriaceae kelompok 6 rombongan I. Permukaan koloni tampak mengkilap,
elevasinya menonjol (raised), tepi koloni rata dengan bentuk yang sirkuler,
ukurannya small, dan warnanya tampak seperti putih susu. Pengamatan makroskopis
belum cukup untuk menentukan spesies dari isolat bakteri enteron yang digunakan.
Sehingga, dibutuhkan uji-uji lain untuk mengidentifikasi spesies bakteri tersebut.
Karakterisasi morfologi bertujuan untuk mengamati baik morfologi koloni maupun
morfologi sel bakteri pada isolat bakteri yang telah lolos seleksi. Ketika ditumbuhkan
dalam media yang bervariasi, mikroorganisme akan menunjukkan penampakan
makroskopis yang berbeda-beda pada pertumbuhannya. Perbedaan ini disebut
dengan karakteristik kultur, yang digunakan sebagai dasar untuk memisahkan
mikroorganisme dalam kelompok taksonomik. Isolat bakteri yang diperoleh diamati
morfologi koloni dengan melihat bentuk koloni, warna, tepian dan elevasi pada
medium agar lempeng, agar tegak dan agar miring. Sedangkan morfologi sel
ditentukan dengan melihat olesan biakan yang sudah diwarnai dibawah mikroskop
dan melihat bagaimana bentuk sel, sifat gram dan kemampuan membentuk spora dari
bakteri tersebut (Cappuccino & Sherman, 1992).
Koloni bakteri memiliki sifat-sifat khusus dalam media padat. Media dalam
bentuk agar lempengan, terbentuk koloni sebagai titik-titik, bulat, berbenang, tak
teratur, serupa akar dan kumparan. Permukaan koloni dapat rata, timbul datar,
melengkung, mencembung, membukit, dan serupa kawah. Sedangkan tepian koloni
dapat berbentuk utuh, berombak, berbelah, bergerigi, berbenang, dan keriting. Pada
warna, koloni bakteri sebagian besar berwarna keputihan atau kekuningan, akan
tetapi dapat juga berwarna lain seperti kemerahan, coklat, jingga, biru, hijau, dan
ungu (Dwidjoseputro, 2005).

Gambar 3.1. Hasil Pewarnaan Gram Isolat


Bakteri Enterobacteriaceae Kelompok 6
Rombongan I Perbesaran 40 x 10
Gambar 3.1. menunjukkan, bahwa isolat bakteri Enterobacteriaceae yang
digunakan merupakan bakteri Gram negatif. Hal ini dapat diketahui dengan melihat
hasil uji yang berwarna kemerahan dan berbentuk batang. Bakteri Gram negatif
memiliki kandungan lipid yang tinggi dan dinding sel yang tipis sehingga ketika
mendapat perlakuan alkohol pada proses pewarnaan gram menyebabkan
terekstraksinya lipid sehingga memperbesar daya resap (permeabilitas) dinding sel.
Hal ini menyebabkan warna Ungu Kristal-Yodium (UK-Y) terekstraksi sehingga
organisme gram negatif kehilangan warna tersebut. Warna merah pada sel bakteri
Gram negatif juga disebabkan oleh sedikitnya kandungan peptidoglikan pada dinding
sel. Peptidoglikan bakteri Gram negatif mempunyai ikatan silang yang jauh kurang
ekstensif dibandingkan dengan yang dijumpai pada dinding bakteri gram positif. Hal
ini menyebabkan pori-pori pada peptidoglikan bakteri Gram negatif tetap cukup
besar sekalipun setelah perlakuan Ethanol sehingga memungkinkan terjadi ekstraksi
UK-Y (Pelczar & Chan, 2007). Menurut Jumawita et al. (2014), bakteri Gram negatif
adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode
pewarnaan Gram.
Gambar 3.2. Hasil Uji Motiltas Isolat Bakteri
Enterobacteriaceae Kelompok 6 Rombongan I

Hasil dari kelompok 6, menunjukkan bahwa isolat bakteri Enterobacteriaceae


bersifat motil karena adanya pertumbuhan yang menyebar, seperti yang ditunjukkan
pada Gambar 3.2. Isolat bakteri ditusukkan ke dalam media SIM semi padat pada
tabung reaksi menggunakan jarum ose tusuk steril. Kemudian diinkubasi selama 24
jam pada suhu 37C. Uji positif ditandai dengan pertumbuhan bakteri yang
menyebar, maka bakteri tersebut bergerak (motil) dan bila pertumbuhan bakteri tidak
menyebar hanya berupa satu garis, maka bakteri tersebut tidak bergerak (non motil)
(Yulvizar, 2013).

Gambar 3.3. Hasil Uji Oksidase Isolat Bakteri


Enterobacteriaceae Kelompok 6 Rombongan I

Enzim oksidase memegang peranan penting dalam transport elektron selama


respirasi aerobik. Uji ini dilakukan untuk mengetahui bakteri yang dapat
memproduksi sitokrom oksidase. Sitokrom oksidase mengkatalisis oksidasi dan
reduksi sitokrom oleh molekul oksigen. Enzim oksidase dihasilkan oleh bakteri
aerob, fakultatif anaerob dan mikroaerofilik. Mikroorganisme ini menggunakan
oksigen sebagai akseptor elektron terakhir selama penguraian karbohidrat menjadi
energi. Kemampuan bakteri memproduksi sitokrom oksidase dapat diketahui dari
reaksi yang ditimbulkan setelah pemberian reagen oksidase pada koloni. Reagen
yang biasa digunakan adalah tetramethylpphenylenediamine dihidrocloride.
Reagen ini mendonorkan elektron pada enzim untuk dioksidasi membentuk
kompleks warna biru marun. Berdasarkan Gambar 3.3., isolat bakteri
Enterobacteriaceae dapat membentuk kompleks biru marun, sehingga uji oksidase
dinyatakan positif. Reaksi yang terjadi adalah 4H+ + O2 2H2O (Cappucino &
Sherman, 1992).

Gambar 3.4. Hasil Uji Katalase Isolat Bakteri


Enterobacteriaceae Kelompok 6 Rombongan I
Uji katalase merupakan suatu pengujian untuk mengetahui apakah bakteri yang
diuji merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau anaerob. Bakteri aerob akan
menghasilkan hasil metabolik sekunder yang sebenarnya merupakan zat toksik bagi
bakteri itu sendiri, yaitu gas hidrogen peroksida (H2O2). Selain itu, uji ini juga dapat
membuktikan bahwa bakteri aerob tersebut masih tetap dapat bertahan hidup karena
dapat menghidrolisis hidrogen peroksida dengan bantuan enzim katalase. Reaksi
yang terjadi adalah : H2O2 2H2O + O2. Gambar 3.4. menunjukkan, bahwa
isolat Enterobacteriaceae tida mampu menghidrolisis H2O2 karena tidak membentuk
gelembung gas. Hasil ini sesuai dengan referensi yang menyebutkan, bahwa bakteri
tersebut dikatakan positif aerob atau dapat menghidrolisis H2O2 apabila setelah diberi
reagen katalase (H2O2) terbentuk gelembung gas (Hadioetomo, 1993). Menurut
Pollet et al. (2014), Enterobacteriaceae adalah bakteri Gram negatif fakultatif
anaerobik berbentuk batang yang dapat bersifat motil atau non motil, strain bakteri
motil mempunyai flagella peritrik. Bakteri-bakteri tersebut juga memproduksi enzim
katalase.

Gambar 3.5. Hasil Uji Proteolitik Isolat Bakteri


Enterobacteriaceae Kelompok 6 Rombongan I
Uji proteolitik adalah uji untuk mengetahui kemampuan menghasilkan protease
untuk menghidrolisis protein menjadi asam amino. Proes hidrolisis protein
berlangsung secara bertahap sebelum akhirnya menjadi asam amino. Reaksi
hidrolisis protein akan memutuskan ikatan peptida (Susanto, 2003). Berdasarkan
Gambar 3.5., hasil menunjukkan bahwa uji yang dilakukan negatif karena tidak
terbentuknya zona bening. Hal ini sesuai dengan pernyataan Pelczar & Chan (2007)
yang menyatakan, bahwa aktivitas proteolitik dikatakan berhasil apabila terbentuk
zona bening disekitar koloni yang tumbuh pada media Protease Agar. Pembentukan
zona bening dikarenakan isolat bakteri mikroorganisme dapat memecah sebagian
kasein yang terdapat pada media menjadi molekul yang lebih sederhana untuk
kemudian dapat diserap (Pelczar & Chan, 2007).
Gambar 3.6. Hasil Uji Urease Isolat Bakteri
Enterobacteriaceae Kelompok 6 Rombongan I
Uji Urease seperti yang terlihat pada Gambar 3.6., menunjukkan bahwa isolat
Enterobacteriaceae memiliki hasil positif. Hal ini ditunjukkan dengan adanya
perubahan warna mediun Urease Broth menjadi warna merah muda pekat (deep
pink). Uji Urease berguna untuk mengidentifikasi organisme yang mampu
menghidrolisis urea yang dapat menghasilkan amonia dan karbondioksida terutama
untuk mengetahui mikrooeganisme tersebut mempunyai enzim urease atau tidak.
Urease merupakan enzim konstitutif yang menghidrolisis urea menjadi
karbondioksida dan ammonia (Brink et al., 2012). Hidrolisis urea akan melepaskan
amonia yang akan menurunkan pH pada media dan akan terjadi perubahan warna
dari kuning ke merah muda pekat (deep pink) (Danish & Mishra, 2014).

Reaksi Kimia Uji Urease


Gambar 3.7. Hasil Uji Indole Isolat Bakteri
Enterobacteriaceae Kelompok 6 Rombongan I
Gambar 3.7. menunjukkan bahwa isolat bakteri Enterobacteriaceae
menunjukkan hasil positif dari uji Indole. Hasil tersebut dinyatakan positif karena
saat ditambahkan reagen Kovacks akan menghasilkan cincin merah (Hemraj, 2013).
Menurut Odonker & Joseph (2013), bakteri E.coli akan memberikan hasil positif
pada uji Indole dan Methyl Red.
Uji Indole bertujuan untuk mengidentifikasi kemampuan bakteri menghasilkan
Indole dengan menggunakan enzim tryptophanase. Bakteri yang memiliki enzim
tryptophanase menghidrolisis tryptophan menjadi Indole, piruvat, dan amonia.
Reaksinya sebagai berikut :
H2O + Tryptophan Indole + Pyruvate + NH4
Tryptophanase (Amonium)

Gambar 3.8. Hasil Uji Methyl Red Isolat


Bakteri Enterobacteriaceae Kelompok 6
Rombongan I
Uji Methyl Red yang dilakukan terhadap isolat bakteri Enterobacteriaceae
menunjukkan hasil positif, seperti yang ditunjukkan Gambar 3.8. Menurut Hemraj
(2013), hasil positif ditunjukkan dengan perubahan warna larutan menjadi merah
setelah ditambakan reagen Methyl Red. Hasil dari kelompok kami menunjukkan
adanya perubahan warna menjadi merah walaupun tidak terlalu pekat. Uji ini
bertujuan untuk mendeteksi kemampuan organisme dalam memproduksi dan
mempertahankan produk akhir asam stabil dari fermentasi glukosa. Methyl Red
adalah indikator pH. Methyl Red berwarna merah pada pH di bawah 4,4
(menunjukkan hasil positif) dan kuning pada pH diantara 6 dan warna orange
menunjukkan pH menengah dan dianggap hasil negatif. Reaksi yang terjadi sebagai
berikut :

Blycolisis Lactate
CO2
H2
Glucose Pnosphoenol pyruvate Pyruvate Ethanol
CO2 Succinate CH3COO
Formate

Gambar 3.9. Hasil Uji Voges Proskauer Isolat


Bakteri Enterobacteriaceae Kelompok 6
Rombongan I
Hasil uji Voges Proskauer isolat bakteri Enterobacteriaceae kelompok kami,
menunjukkan hasil negatif karena menunjukkan perubahan warna menjadi kuning,
seperti yang ditunjukkan oleh Gambar 3.9. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya
perubahan warna menjadi warna merah cherry, sedangkan hasil negatif ditunjukkan
dengan warna kuning kecoklatan (Hemraj, 2013). Uji VP adalah uji yang dilakukan
untuk mendeteksi acetoin yang dilakukan dengan menambahkan -napthole dan
KOH. Uji ini tergantung pada pemecahan glukosa menjadi acetylmethylcarbinol.
Reaksinya sebagai berikut :
Glucose Acetoin
KOH
Acetoin Diacetyl + H2O
O2 Atmosphere
-napthole
Diacetyl + Guanidine Component of Peptone Pink color

Gambar 3.10. Hasil Uji Simmons Citrate


Isolat Bakteri Enterobacteriaceae Kelompok 6
Rombongan I
Uji IMVIC yang terakhir adalah uji Citrate. Uji ini bertujuan untuk mendeteksi
kemampuan organisme memanfaatkan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan
energi. Bakteri diinokulasi pada media yang mengandung medium sitrat dan
indikator pH bromothymol blue. Media juga mengandung garam amonium anorganik
yang digunakan sebagai satu-satunya sumber nitrogen. Pemanfaatan sitrat melibatkan
enzim citrat permease yang memecah sitrat menjadi oksaloasetat dan asetat.
Oksaloasetat lebih lanjut dipecah menjadi piruvat dan CO2. Produksi Na2CO3 serta
NH3 dari pemanfaatan natrium sitrat dan garam amonium masing-masing
menghasilkan pH basa (Suardana et al., 2016). Reaksinya sebagai berikut :
Citrate Oxaloacetate + Acetate

Oxaloacetate Pyrurate + CO2

CO2 + Na + H2O Na2CO3

Isolat bakteri Enterobacteriaceae menunjukkan hasil negatif karena tidak terjadi


perubahan warna menjadi biru pada medium, seperti pada Gambar 3.10.
Bromothymol blue digunakan sebagai indikator saat asam sitrat di metabolisme,
menghasilkan karbondioksida yang menggabungkan natrium karbonat yang
merupakan produk alkalin. Sehingga, bila hasil positif ditandai dengan perubahan
warna dari biru menjadi hijau (Sridhar et al., 2006).

(a) (b) (c) (d)

Gambar 3.11. Hasil Uji Gula-Gula Isolat


Enterobacteriaceae Kelompok 6 Rombongan I
Hasil yang didapatkan dari uji gula (a) manosa, (b) xylosa, (c) arabinosa, (d)
maltosa yaitu negatif. Hal ini ditunjukan dengan adanya perubahan warna menjadi
kuning, namun tidak terbentuk gelembung gas, seperti pada Gambar 3.11. Hasil
tersebut menunjukkan bahwa bakteri tumbuh dalam medium tersebut. Menurut
Downes & Ito (2000), Enterobacteriaceae dapat memfermentasi gula menjadi asam
laktat dan produk lainnya. Fermentasi merupakan salah satu aktivitas biokimia yang
dilakukan oleh mikroba. Fermentasi adalah proses pengunahan senyawa
makromolekul organik menjadi senyawa yang lebih sederhana oleh aktivitas mikroba
pada kondisi anaerob. Fermentasi dapat menghasilkan berbagai senyawa akhir,
contohnya fermentasi karbohidrat yang dapat menghasilkan berbagai senyawa asam
seperti asam laktat dan propionet, ester-ester, keton dengan disertai atau tidak disertai
pembentukan gas (Pelczar & Chan, 2007).
Gambar 3.12. Hasil Uji H2S Isolat
Enterobacteriaceae Kelompok 6 Rombongan I

Pengujian H2S digunakan untuk melihat kemampuan setiap isolat dalam


menghasilkan senyawa H2S. Interpretasi positif ditandai dengan adanya perubahan
warna medium menjadi kehitaman (Ammiruddin et al., 2017). Berdasarkan hasil
pengamatan uji H2S pada Gambar 3.12., didapatkan hasil negatif karena pada
medium TSIA yang terdapat isolat bakteri Enterobacteriaceae, tidak menunjukan
perubahan warna medium menjadi kehitaman, seperti yang terlihat pada Gambar
3.12. TSIA adalah medium deferensial yang digunakan dalam menentukan
fermentasi karbohidrat dan produksi H2S. TSIA membedakan bakteri berdasarkan
fermentasi laktosa, glukosa, dan sukrosa serta produksi hidrogen sulfida. TSIA
paling sering digunakan dalam identifikasi Enterobacteriaceae, meskipun berguna
untuk bakteri Gram negatif lainnya (Hassan et al., 2002).
Media TSIA mengandung tiga macam gula yaitu glukosa, laktosa, atau sukrosa.
Uji TSIA ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan dari suatu bakteri dalam
memfermentasi gula untuk menghasilkan asam atau gas. Warna merah pada agar
menunjukkan reaksi basa, sedangkan warna kuning menunjukkan reaksi asam.
Warna merah pada permukaan agar dan kuning di bagian bawah agar menunjukkan
bahwa terjadinya fermentasi glukosa. Warna kuning pada bagian permukaan dan
bawah tabung menunjukkan terjadinya fermentasi laktosa dan sukrosa. Sebagian
kecil koloni bakteri dengan menggunakan ose dan diinokulasikan pada media TSIA,
kemudian dilakukan dengan cara menusuk tegak lurus pada bagian butt (tusuk) dan
cara zig zag pada bagian slant (miring). Diinkubasi pada temperatur 37C selama 24
jam. Diamati perubahan warna medium yang terjadi. Apabila bagian slant berwarna
merah dan butt berwarna kuning maka bakteri mampu memfermentasi glukosa,
sedangkan apabila bagian slant dan butt keduanya berwarna kuning maka bakteri
mampu memfermentasi sukrosa dan laktosa (Yulvizar, 2013).
Berdasarkan hasil uji yang dilakukan, kelompok 6 rombongan I mendapatkan
bakteri Escherichia coli. Escherichia coli adalah anggota famili Enterobacteriaceae
yang merupakan bakteri batang Gram negatif, tidak berkapsul, umumnya mempunyai
fimbria, dan bersifat motil. Bakteri E. coli mempunyai ukuran panjang 2,0-6,0 m,
lebar 1,1-1,5 m, diameter 0,7 m; tersusun tunggal; berpasangan, dengan flagella
peritikus (Supardi & Sukamto, 1999). E. coli membentuk koloni yang bundar,
cembung, dan halus dengan tepi yang nyata (Smith-Keary, 1988). Suhu optimum E.
coli untuk tumbuh adalah 37C, sedangkan interval suhu untuk pertumbuhan adalah
10oC-40oC. Nilai pH maksimum 8,5. Bakteri ini relatif sensitif terhadap panas dan
dapat diinaktifkan pada suhu pasteurisasi makanan atau selama pemasakan makanan
(Maloha, 2002). Hasil IMVIC pada E. coli yaitu positif pada uji Indole dan Methyl
Red, serta negatif pada uji Voges Proskauer dan Citrate (Engelkirk et al., 2007).
E. coli secara khas menunjukkan hasil positif pada tes Indole, lisin
dekarboksilase, dan fermentasi manitol, serta menghasilkan gas dari glukosa. E. coli
dapat segera diidentifikasi dengan melihat hemolisisnya pada agar darah, morfologi
koloni yang khas dengan warna pelangi yang berkilau atau mengilap seperti logam
(metallic sheen) pada medium differensial seperti agar Eosin Methylene Blue (EMB),
dan tes bercak Indole yang positif (Engelkirk et al., 2007). Bakteri E.coli juga
merupakan bakteri fakultatif anaaerob, yaitu bakteri yang tumbuh dalam udara
atmosfer dan dapat juga tumbuh secara anaerob. E.coli tidak butuh oksigen untuk
pertumbuhan, meskipun menggunakan energi sebagai hasil reaksi kimia. Dibawah
kondisi anaerob, E.coli mendapat energi melalui proses metabolisme yang disebut
fermentasi (Maloha, 2002). Bakteri ini dapat meragi laktosa dengan cepat sehingga
pada MacConkey Agar dan Eosin Methylene Blue (EMB) membentuk koloni merah
muda sampai tua dengan kilatan logam yang spesifik, dan permukaan halus.Beberapa
strain membentuk daerah hemolisis disekeliling koloni pada agar darah (Supardi &
Sukamto, 1999).
ETEC (Enterotoxigenic Escherichia coli) merupakan salah satu penyebab
penyakit diare yang dapat mematikan. Penyakit yang dimediasi ETEC merupakan
serangkaian epdemi global yang saling tumpah tindih dari garis keturunan ETEC,
yang telah stabil selama periode waktu yang substansial di daerah endemik.
Selanjutnya, garis keturunan terdistribusi secara global dengan faktor kolonisasi yang
konsisten yang dapat menyebabkan penyakit pada anak-anak dan orang dewasa di
daerah endemik pada tingkat yang sama. Plasmid adalah kendaraan utama yang
mendorong munculnya berbagai cluster ETEC. Hal ini menunjukkan bahwa
pengembangan pengembangan vaksin berdasarkan faktor kolonisasi yang paling
umum dapat menjadi perlindungan terhadap sebagian besar kasus diare ETEC.
Vaksin ETEC sedang dikembangkan berdasarkan faktor kolonisasi utama yang
diidentifikasi dalam ETEC yang menyebabkan diare (Mentzer et al., 2014).
Faktor kolonisasi dan gen toksin cukup untuk kemunculan isolat patogen ETEC
patogen. Penelitian sebelumnya menunjukkan frekuensi yang rendah terhadap
pengelompokkan filogenetik isolat ETEC, dan gen yang terkait virulensi terjadi
berulang kali, dan tidak ada garis keturunan klonal yang umum dengan virulensi
yang berbeda telah diidentifikasi. ETEC memiliki garis keturunan yang dapat
diidentifikasi, dengan mayoritas yang memiliki sifat virulensi yang konsisten dan
pasti. Namun, sebuah penelitian menujukkan, bahwa populasi ETEC mengandung
sejumlah klon stabil dengan virulensi tertentu (Mentzer et al., 2014).
IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Kesimpulan yang dapat ditarik dari hasil dan pembahasan, yaitu :


1. Tahapan yang dilakukan untuk mengidentifikasi bakteri enteron yaitu melalui uji
biokimiawi, enzimatis, dan pengamatan morfologi. Hasil positif ditunjukkan
oleh uji motilitas, Indole, Methyl Red, urease, dan oksidase. Sedangkan
hasil negatif ditunjukkan oleh uji Voges Proskauer, Simmons Citrate, H2S,
katalase, proteolitik, dan gula-gula. Hasil yang diperoleh berdasarkan uji-uji yang
dilakukan menunjukan isolat dari kelompok 6 rombongan I merupakan
Escherichia coli.

B. Saran

Sebaiknya, uji yang dilkukan lebih teliti dan tepat agar memperoleh hasil yang
maksimal.
DAFTAR REFERENSI

Amiruddin, R.R., Darniati & Ismail. 2017. Isolasi dan Identifikasi Salmonella sp. pada
Ayam Bakar di Rumah Makan Kecamatan Syah Kuala Konta Banda Aceh. JIMVET,
1(3): pp.265-274.
Brink, A., Coetzee, J. & Clay C. 2012. The spread of carbapenem-resistant
Enterobacteriaceae in South Africa: Risk factors for acquisition and prevention. J
Med, 10(2): pp.599-601.
Brooks, G.F., Butel, J.S. & Morse, S.A. 2008. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta: Salemba
Medika.
Capuccino, J.G. & Sherman, N. 1992. Microbiology a Laboratory Mannual. USA: The
Benjamin/Cummings Publish.
Clayton, P., Feltham, R.K.A., Mitchell, C.J. & Sneath, P.H.A. 1986. Constructing A Data
Base For Low Cost Identification Gram Negative Rods in Clinical Laboratories.
Journal of Clinical Pathology, 39: pp.798-802.
Danish, M.S. & Mishra, R.P. 2014. Age and Gender Wise Distribution Pattern Of
Typhoid Causing Bacteria Salmonella serovars In Mahakaushal Region. World
Journal of Pharmaceutical Research, 3(4): pp.1183-1203.
Downes, F.P. & Ito, K. 2000. Compendium of Methods for the Microbiological
Examination of Foods 4th Edition. USA: American Public Health Association.
Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi Cetakan ke-13. Jakarta: Percetakan
Imagraph.
Engelkirk, D., Paul, G. & Janel, L. 2007. Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases:
Essentials of Diagnostic. Pennsylvania: Lippincott Williams and Wilkins Company.
Farmer, J.J. 2003. Enterobacteriaceae Introduction and Identification. New York: ASM
Press.
Hassan, D.M., Ibrahim, G.M. & Ibrahim, D.G. 2002. A Novel Single Tube Method for
Biochemical Identification of Escherichia coli. Life Science Journal, 13(8): pp.8-12.
Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: Gramedia.
Hemraj, V. 2013. A Review on Commonly Used Biochemical Test for Bacteria.
Innovare Journal of Life Science, 1(1): pp.1-7.
Holt, J.G., Krig, N.R., Sneath, P., Staley, J. & William, S. 1994. Bergeys Manual of
Determinative Bacteriology. Pennsylvania: Lippincott Williams and Wilkins
Company.
Iwade, Y., Tamura, K., Yamauchi, A., Kumazawa, N.H., Ito, Y. & Sugiyama. 2006. A
(Characterization of the outbreak-derived Salmonella enterica serovars enteritidis
strains with atypical triple sugar iron and Simmons citrate Reactions) Japanese.
Journal of Infectious Diseases, (59): pp.512-513.
Jyothi, K., Babu, S.K., Clara, N.K. & Kashyap, A. 2012. Identification and Isolation of
Hydrocarbon Degrading Bacteria by Molecular Characterization. Bio Axis DNA
Research Centre (P) Ltd, Hyderabad, Helix, 2: pp.105-111.
Jumawita, Anthoni, A. & Hong, T.D. 2014. Karakterisasi Bakteri Amilo Termofilik
Obligat dari Sumber Air Panas Semurup, Sungai Penuh. Jurnal Biologi Universitas
Andalas, 3(3): pp.249-253.
Leboffe, M.J. & Burton, E.P. 2011. A Photographic Atlas for the Microbiology
Laboratory Fourth Edition. Englewood: Morton Publishing Company.
Maloha, M.M 2012. Pemeriksaan Angka Kuman Escherichia Coli dengan Usap Alat
pada Restoran, Rumah Makan, dan Lokalisasi Makanan Jajanan di Kota Jambi.
Jambi: Fakultas Kesehatan Masyarakat Universitas Sumatera Utara.
McNeil, B. & Harvey, L. 2008. Practical Fermentation Technology. England: John Wiley
& Sons Ltd.
Mentzer, A.V., Connor, T.R., Wieler, L.H., Semmler, T., Iguchi, A., Thomson, N.R.,
Rasko, D.A., Joffre, E., Corander, J., Pickard, D., Wiklund, G., Svennerholm, A.M.,
Sjling, A. & Dougan, G. 2014. Identification of enterotoxigenic Escherichia coli
(ETEC) clades with long-term global distribution. Nature Genetics, 46:
pp.1321-1326.
Odonker, S.T. & Joseph, K.A. 2013. Escherichia coli as an Indicator of Bacteriological
Quality of Water. Microbiology Research, 4(2): pp.5-11.
Pelczar, M.J. & Chan, E.S.S. 2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi 1. Jakarta: UI Press.
Pollet, S., Miller, S., Hindller, J. & Uslan, D. 2014. Phenotypic and Molecular
Characteristics of Carbapenem Resistant Enterobacteriaceae in a Los Angeles
Healthcare System, 2011 to 2013. Journal Clinical Microbiological. 52(11), pp.
4003-4009.
SmithKeary, P.F. 1988. Genetic Elaments In Escherichia coli. London: MacMillan
Molecular Biology Series.
Sridhar, V.R., Smeianov, V.V. & Steele, J.L. 2006. Construction and evaluation of
food-grade vectors for Lactococcus lactis using aspartate aminotransferase and
-galactosidase as selectable markers. Journal of Applied Microbiology, 101(1):
pp.161-171.
Suardana, I.W., Putu, J.R., Apsari, P. & Nengah, K.B. 2016. Isolasi dan Identifikasi
Escherichia coli O157:H7 pada Feses Sapi di Kecamatan Petang, Kabupaten
Badung-Bali. Buletin Veteriner Udayana. 8(1), pp. 31-35.
Supardi, I. & Sukamto. 1999. Mikrobiologi dalam Pengolahan dan Keamanan Pangan.
Bandung: Penerbit Alumni.
Susanto, J. 2003. Pengaruh Logam dan Konsentrasi Substrat Terhadap Pertumbuhan Dan
Aktivitas Bakteri Proteolitik Pada Proses Deproteinasi Cangkang Rajungan. Jurnal
Teknologi Lingkungan, 4(1): pp.1-12.
Yulvizar, C. 2013. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik pada Rastrelliger sp.
Biospecies, 6(2): pp.1-7.