BAB II

METODE KERJA
(Pengamatan mikroskopik yeast dan sediaan hidup bakteri)

2.1 Pembuatan Preparat Ragi Hidup

a. Setets air atau larutan NaCl 0,9% diambil secara aseptis menggunakan pipet tetes
steril atau jarum ose. Dengan cara kapas penutup tabung atau wadah dijepit
dengan sela-sela jari tangan kanan, mulut tabung dilewatkan di api sebentar.
Larutan NaCl 0,9% diambil dengan ose yg telah dipijar sebelumnya dan
diletakkan ditengah-tengah kaca obyek hingga kurang lebih satu tetes. Mulut
tabung NaCl 0,9% dilewatkan lagi di api dan ditutup lagi dengan kapas penutup.
Kemudian Jarum ose dipijarkan lagi di api.
b. Biakan ragi diambil dengan jarum ose secara aseptis. Kapas penutup tabung
biakan saccharomyces cerevisiae dijepit di sela-sela jari dan kemudian diambil
dengan jarum ose yang sebelumnya sudah dipijar. Mulut tabung dilewatkan
kembali ke api kemudian ditutup kembali dengan kapas penutup. Sel-sel yang
berada di ujung jarum ose disuspensikan kedalam larutan NaCl 0,9% yang ada
pada objek glass dan jarum ose dipijarkan kembali.
c. Disiapkan Kaca penutup yang tepi-tepinya telah diolesi vaselin, kemudian
ditutupkan pada suspensi sel ragi tersebut (bagian yang bervaselin menghadap
kaca obyek)
d. Preparat di mikroskop diamati pada pembesaran 1000X

2.2 Pembuatan Preparat Bakteri Hidup

2.2.1 Preparat Bakteri Hidup dari Biakan Padat Escherichia coli
a. Diambil 4-5 ose NaCl 0,9% pada obyek gelas secara aseptis, dengan cara seperti
2.1.a.
b. Biakan padat diambil 1 ose dan disuspensikan (tanpa perataan) pada obyek gelas
pada 2.2.2.a.
c. Disiapkan kaca penutup yang tepi-tepinya telah diolesi vaselin, kemudian kaca
penutup ditutupkan seperti cara 2.1.c.
d. Preparat diamati dengan mikroskop pada perbesaran 100X, 400X, dan 1000X.
Sel digambar pada perbesaran 1000X.
e. Diamati sifat pergerakan atau motilitas bakteri.
2.2.2 Preparat Bakteri Hidup dari Biakan Padat Staphylococcus aureus.
a. Diambil 4-5 ose NaCl 0,9% pada obyek gelas secara aseptis, dengan cara seperti
2.1.a.
b. Biakan padat diambil 1 ose dan disuspensikan (tanpa perataan) pada obyek gelas
pada 2.2.2.a.
c. Disiapkan kaca penutup yang tepi-tepinya telah diolesi vaselin, kemudian kaca
penutup ditutupkan seperti cara 2.1.c.
d. Preparat diamati dengan mikroskop pada perbesaran 100X, 400X, dan 1000X.
Sel digambar pada perbesaran 1000X.
e. Diamati sifat pergerakan atau motilitas bakteri.

2.3 Persiapan Pewarnaan Gram Bakteri

2.3.1 Pembuatan Preparat Olesan Bakteri Untuk Pewarnaan
a. Disiapkan kaca obyek bebas lemak. Ambil 4-5 ose larutan NaCl 0,9% pada obyek
gelas secara aseptis, kemudian biakkan sel Staphylococcus aureus diambil dari
media agar untuk disuspensikan dalam larutan NaCl 0,9% pada obyek glass.
Kemudian suspensi bakteri disebarkan dengan ose kearah luas (posisi jarum ose
horisontal)
b. Suspensi bakteri dibiarkan kering di udara dan jangan dikeringkan dengan
pemanasan. Bila perlu pengeringan cepat, preparat dilewatkan di atas api spiritus
pada ketinggian 33 cm.
c. Dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan olesan yang telah kering terebut di
atas api spiritus beberapa kali (bagian yang ada olesan bakteri menghadap ke
atas)

2.3.2 Pewarnaan Gram (Bakteri Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus)
a. Preparat olesan bakteri yang telah difiksasi ditetesi dengan karbolgentian violet
(Gram I), dibiarkan selama 3 menit. Lalu dibiarkan selama 3 menit kemudian
dibilas dengan air sampai tidak ada warna yang telunturkan.
b. Preparat ditetesi dengan larutan lugol (Gram II) beberapa tetes. Dibiarkan selama
1 menit kemudian dibilas dengan air.
c. Cuci preparat dengan larutan Gram III (alkohol 96%) dengan cara memiringkan
preparat kemudian ditetesi perlahan dengan Gram III hingga tidak ada warna
yang terlunturkan
 d. Preparat dibilas dengan air secara hati-hati.
e. Preparat ditetesi dengan larutan Fuchsin (Gram IV) beberapa tetes. Didiamkan
selama 2 menit.
f. Preparat dibilas dengan air. Kemudian dikeringkan di udara atau dengan cara
menyerap kelebihan air dengan tissue.
g. Gambar sel-sel dan reaksi gram yang terlihat pada mikroskop perbesaran 1000 X.

2.4 Pewarnaan Zn
2.4.1 Pembuatan Preparat Olesan Bakteri Untuk Pewarnaan
a. Disiapkan kaca obyek bebas lemak. Ambil 4-5 ose larutan NaCl 0,9% pada obyek
gelas secara aseptis, kemudian biakkan sel Staphylococcus aureus diambil dari
media agar untuk disuspensikan dalam larutan NaCl 0,9% pada obyek glass.
Kemudian suspensi bakteri disebarkan dengan ose kearah luas (posisi jarum ose
horisontal)
b. Suspensi bakteri dibiarkan kering di udara dan jangan dikeringkan dengan
pemanasan. Bila perlu pengeringan cepat, preparat dilewatkan di atas api spiritus
pada ketinggian 33 cm.
c. Dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan olesan yang telah kering terebut di
atas api spiritus beberapa kali (bagian yang ada olesan bakteri menghadap ke
atas)
2.4.2 Prosedur Kerja
a. Disiapkan preparat olesan Staphylococcus aureus yang telah difiksasi.
b. Obyek glass olesan bakteri ditetesi dengan carbol-fuchsin (ZN-1). Dipanaskan
diatas api spirtus hingga timbul uap lalu disisihkan dari api hingga uap hilang.
Kemudian dipanaskan lagi hingga timbul uap lagi dan melakukannya lagi seperti
diatas 2-3 kali (selama4-5menit). Larutan pewarna dijaga jangan sampai
mendidih atau mengering, lalu ditambahkan ZN I bila pewarna mulai berkurang
atau mengering.
c. Preparat didinginkan. Dibilas dengan air , lalu ditetesi dengan ZN II (larutan
alkohol-HCl) hingga tidak ada pewarna yang terlunturkan.
d. Dibilas dengan air secara hati-hati.
e. Diwarnai dengan pewarna tandingan (ZN III), yaitu larutan biru metilen selama
30 detik.
 f. Dibilas dengan air. Kemudian dikering-udarakan atau dikeringkan dengan cara
menyerap kelebihan air dengan kertas saring atau tissue.
g. Preparat diamati dengan mikroskop pada perbesaran 100X, 400X, dan 1000X.
Digambar bentuk sel dan reaksi pewarnaan tahan asam pada perbesaran 1000X.

2.5 Pewarnaan Spora

2.5.1 Pembuatan Preparat Olesan Bakteri Untuk Pewarnaan
a. Disiapkan kaca obyek bebas lemak. Ambil 4-5 ose larutan NaCl 0,9% pada obyek
gelas secara aseptis, kemudian biakkan sel Staphylococcus aureus diambil dari
media agar untuk disuspensikan dalam larutan NaCl 0,9% pada obyek glass.
Kemudian suspensi bakteri disebarkan dengan ose kearah luas (posisi jarum ose
horisontal)
b. Suspensi bakteri dibiarkan kering di udara dan jangan dikeringkan dengan
pemanasan. Bila perlu pengeringan cepat, preparat dilewatkan di atas api spiritus
pada ketinggian 33 cm.
c. Dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan olesan yang telah kering terebut di
atas api spiritus beberapa kali (bagian yang ada olesan bakteri menghadap ke
atas)

2.5.2 Prosedur Kerja

a. Disiapkan preparat olesan Bacillus subtilis yang telah difiksasi.
b. Obyek glass olesan bakteri ditetesi dengan malachite-green (SF-1). Dipanaskan
diatas api spirtus hingga timbul uap lalu disisihkan dari api hingga uap hilang.
Kemudian dipanaskan lagi hingga timbul uap lagi dan melakukannya lagi seperti
diatas 2-3 kali (selama4-5menit). Larutan pewarna dijaga jangan sampai
mendidih atau mengering, lalu ditambahkan SF-I bila pewarna mulai berkurang
atau mengering.
c. Preparat didinginkan lalu dibilas dengan air samapi tidak ada pewarna yang
terlunturkan.
d. Ditetesi dengan larutan fuchsin basa selama 1 menit.
e. Dibilas dengan air. Kemudian dikering-udarakan atau dikeringkan dengan cara
menyerap kelebihan air dengan kertas saring atau tissue.
f. Preparat diamati dengan mikroskop pada perbesaran 100X, 400X, dan 1000X.
Digambar bentuk sel dan reaksi pewarnaan tahan asam pada perbesaran 1000X
 g. Pengamatan dilakukan juga pada preparat Escherichia coli yang telah disiapkan
petugas.

2.6 Pengamatan Jamur

2.6.1 Prosedur kerja
a. Diambil setetes larutan lactophenol cotton-blue atau air steril secara aseptis
menggunakan pipet tetes steril atau jarum ise, diletakkan di tengah-tengah kaca
obyek.
b. Biakan jamur diambil sedikit secara aseptis menggunakan jarum ose/ent dan
dimasukkan kedalam larutan lactophenol cotton-blue atau air.
c. Campuran diatas ditutup dengan kaca penutup.
d. Preparat diamati dengan mikroskop pada perbesaran 100X, 400X, dan 1000X.
Digambar struktur jamur pada perbesaran 400X atau 1000X dan diberi
keterangan bagian-bagian yang terlihat.