BAB 1.

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Mikroorganisme merupakan makhluk yang berukuran sangat kecil dan
hanya mampu dilihat menggunakan mikroskop. Kehadiran mikroorganisme pada
makanan dapat bersifat menguntungkan atau merugikan. Ada hasil metabolisme
spesies mikroorganisme tertentu pada makanan dibutuhkan dan digemari oleh
manusia. Akan tetapi ada beberapa species yang dapat merusak makanan dengan
pembusukan atau menghasilkan toksin yang berbahaya bagi manusia. Setiap
produk yang dihasilkan oleh mikrobia tergantung jumlah mikrobia yang
terkandung dalam suatu bahan atau lingkungan.
Dalam menghitung jumlah sel mikroba dapat dinyatakan dengan dua cara,
yaitu perhitungan jumlah sel dan massa sel. Untuk hitungan jumlah sel
diantaranya secara mikroskopik, metode cawan dan MPN (Most Probable
Number). Sedangkan untuk hitungan massa sel meliputi caea volumetrik,
gravimetri, dan turbidimetri. Hitungan secara mikroskopik menggunakan alat
pembesar untuk menghitung jumlah sel. Sedangkan hitungan cawan dan MPN
memerlukan media tumbuh tertentu untuk sejumlah cuplikan suspensi mikroba
yang ditumbuhkan dalam 1 sampai 2 hari pada suhu ruang kemudian baru
dihitung jumlah selnya.
Untuk menumbuhkan sejumlah mikroba dengan golongan tertentu dengan
menggunakan suatu media khusus, misalnya untuk penentuan jumlah kapang
dengan PDA, total mikroba dengan PCA, dan untuk khamir/yeast dengan OMEA.
Perlu diperhatikan dalam penentuan jumlah mikroba yang menggunakan media
tumbuh adalah kondisi steril media, peralaan ukur, dan peralatan bantu
(Waluyo,2007).
Perhitungan massa sel menggunakan neraca analitik untuk menimbang
massa sel kering dari sejumlah cuplikan suspensi sel mikroba yang telah
dikeringkan, maka dalam hal ini juga menggunakan alat ukur volumetrik. Untuk
metode pengukuran massa sel tidak diperlukan media tumbuh, kecuali dengan
menggunakan metode spektrofotometer yaitu digunakan untuk menumbuhkan sel
mikroba yang dipakai untuk pembuatan kurva standart. Untuk itu, perlu dilakukan
praktikum untuk mengetahui dan menganalisis secara kulitatif maupun kuantitatif
sel mikroba.

1.2 Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dilakukanya praktikum ini , yaitu :
a. Untuk mengetahui cara memnyiapkan peralatan dan media tumbuh dan
steril untuk digunakan pada penenuan jumlah sel mikroba.
b. Untuk mengetahui cara menghitung jumlah atau massa sel mikroba dari
berbagai golongan .
c. Untuk mengetahui cara menentukan jenis sel mikroba, misalnya bakteri
pembentuk asam orgnik (asam asetat/laktat)
 BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Karakteristik Bahan dan Mikroba Yang Terdapat Dalam Bahan

2.1.1 Tape singkong
Tape adalah hasil fermentasi singkong dengan Saccharomyces pastorianus,
Saccaharomyces heterogenicus, Endomycopsis sp, Chlamydomucor sp, Rhizopus
sp dan Bacillus sp. Tape dihasilkan dengan cara fermentasi ragi yang merupakan
inokulum biakan dari khamir, kapang dan bakteri. Mikroorganisme tersebut akan
menghasilkan panas dalam keadaan anaerob sehingga akan menghasilkan enzim
yang dapat merombak karbohidrat menjadi komponen yang lebih sederhana
sehingga akan lebih mudah untuk dicerna. Selama proses fermentasi akan terjadi
perubahan fisik, kimia dan mikrobiologi. Perubahan fisik terjadi ubi kayu yang
tadinya keras menjadi lembek.Perubahan kimia terjadi disebabkan oleh aktifitas
mikroorganisme yang terdapat pada starter (ragi), dimana aktivitas-aktivitas
mikroorganisme tersebut sangat dibutuhkan untuk dapat memproduksi gula, asam
serta pembentukan alkohol dan aroma dari substrat karbohidrat (Winarno, dkk,
1986).Sedangkan perubahan mikrobiologi yang terjadi adalah adanya perubahan
warna, pembentukan lendir, pembentukan gas, bau asam, bau alkohol, bau busuk
dan berbagai perubahan lainnya. Jika tape dikonsumsi dalam jumlah yang banyak
akan menimbulkan rasa panas dalam perut karena kadar alkohol tinggi
(Hidayat, et al., 2006).
Proses fermentasi tape mengubah rasa, aroma, nilai gizi dan palabilitas yang
mempengaruhi perubahan substrat menjadi komponen lain. Perubahan tersebut
disebabkan oleh aktivitas enzim, komposisi substrat, kondisi lingkungan, tipe dan
jumlah mikroba pada awal atau selama fermentasi. Hal itu juga meningkatkan
aseptibilitas, digestabilitas dan menurunkan kandungan HCN sekitar 83,40%
(Suliantari dan Winiati, 1989).
2.1.2 Tempe
Tempe adalah produk olahan kedelai hasil fermentasi jamur Rhizopus sp.
(Rusmin dan Ko, 1974). Tempe yang sering kita konsumsi memiliki tekstur yang
kompak, kekompakan tekstur tempe juga disebabkan oleh miselia-miselia kapang
yang menghubungkan biji-biji kedelai dan kacang tunggak. Kompak tidaknya
tekstur tempe dapat diketahui dengan melihat lebat tidaknya miselia yang tumbuh
pada permukaan tempe. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa zat gizi tempe
seperti protein dan karbohidrat, lebih mudah dicerna, diserap dan dimanfaatkan
oleh tubuh. Hal ini dikarenakan jamur Rhizopus sp. yang tumbuh pada kedelai
menghidrolisis senyawa - senyawa kompleks menjadi senyawa sederhana yang
mudah dicerna oleh manusia (Kasmidjo, 1990). Bau dinyatakan normal jika tidak
tercium bau asing. Warna normal adalah putih atau keabu-abuan yang dihasilkan
dari proses fermentasi tempe. Rasa yang normal dinyatakan bila tidak terasa rasa
asing (SNI, 2009). Tekstur tempe yang padat jika biji kedelai semuanya
terselimuti oleh hifa Rhizopus sp.
2.1.3 Tape ketan
Tape memiliki rasa yang manis dan sedikit mengandung alkohol, memiliki
aroma yang menyenangkan, bertekstur lunak dan berair. Tape merupakan pangan
fermentasi yang cepat rusak karena adanya fermentasi lanjut setelah kondisi
optimum tercapai, sehingga harus segera dikonsumsi. Hasil fermentasi lanjut dari
tape adalah produk yang asam beralkohol sehingga tidak enak dikonsumsi lagi
(Hidayat et al 2006).
Soemartono (1980) melaporkan bahwa dalam beras ketan hitam (Oryza
sativa glutinosa) terdapat zat warna antosianin yang dapat digunakan sebagai
pewarna alami pada makanan. Warna beras ketan hitam disebabkan oleh sel-sel
pada kulit ari yang mengandung antosianin. Antosianin merupakan pigmen
berwarna merah, ungu dan biru yang biasa terdapat pada tanaman tingkat tinggi.
(Eskin dalam Tensiska et al, 2007). Secara kimiawi antosianin bisa dikelompokan
ke dalam flavonoid dan fenolik (Samsudin dan Khoirudin, 2009). Beberapa fungsi
antosianin, antara lain; sebagai antioksidan di dalam tubuh, melindungi lambung
dari kerusakan, menghambat sel tumor, meningkatkan kemampuan penglihatan
mata, sebagai senyawa anti-inflamasi yang melindungi otak dari kerusakan, serta
mampu mencegah obesitas dan diabetes.
2.2 Karakteristik Kimia, Fisika dan Mikrobiologi Media yang Digunakan
2.2.1 PDA (Potato Dextrose Agar)
PDA (Potato Dextrose Agar) merupakan media komplek dan media
diferensiasi untuk pertumbuhan jamur dan yeast sehingga sering digunakan
sebagai uji untuk menentukan jumlah jamur dan yeast dengan menumbuhkan
mikroba pada permukaan sehingga akan membentuk koloni yang dapat diikat dan
dihitung (Fardiaz, 1993). Selain itu PDA (Potato Dextrose Agar) juga digunakan
untuk pertumbuhan, isolasi dan enumerasi dari kapang serta khamir pada bahan
makanan dan bahan lainnya. Komposisi medianya adalah 20% kentang, agar, 1
liter aquades dan 2% peptone.
Media PDA (Potato Dextrose Agar) digunakan untuk pertumbuhan, isolasi
dan enumerasi dari kapang dan khamir pada bahan makanan dan bahan lainnya.
Karbohidrat dan senyawa yang diambil dari kentang mendukung pertumbuhan
khamir dan kapang dan pada kondosi pH yang diturunkan dapat menghambat
pertumbuhan kontaminan (bakteri yang ikut). Jika medium ini dipakai untuk
perhitungan jamur, pH medium harus diturunkan hingga 3,5 karena jamur akan
tumbuh pada medium ini untuk mengembangkan morfologinya (Thatcher and
Clark, 1987).
Fungsinya sebagai media selektif untuk pertumbuhan jamur dan yeast
hingga sering digunakan sebagai uji untuk menentukan jumlah jamur dan yeast
yang dilakukan dengan menumbuhkan mikroba pada permukaan sehingga akan
membentuk koloni yang dapat diikat atau dihitung (Fardiaz, 1993)
2.2.2 PCA (Plate Count Agar)
PCA (Plate Count Agar) adalah suatu medium yang mengandung 0,5%
tripton, 0,25% ekstrak khamir, dan 0,1 % glukosa sehingga semua mikroba
termasuk bakteri, kapang, dan khamir dapat tumbuh dengan baik pada medium
tersebut (Fardiaz, 1993).
Media plate count agar (PCA) dapat berfungsi sebagai media untuk
menumbuhkan mikroorganisme. Untuk penggunaannya, digunakan PCA instant
sebanyak 22,5 gram untuk 1 Liter aquades. Berdasakan komposisinya, PCA
termasuk ke dalam medium semisintetik, yaitu medium yang komponen dan
takarannya sebagian diketahui dan sebagian lagi tidak diketahui secara pasti. PCA
berwarna putih keabuan, berbentuk granula dan merek yang digunakan adalah
Merck. Sebelum dipanaskan tidak larut sepenuhnya dalam air, tetapi masih
terlihat serbuk-serbuknya, berwarna kuning dan terlihat keruh. Setelah dipanaskan
serbuk media larut seluruhnya dalam air, berwarna kuning. (Fardiaz, S. 1992).
2.2.3 OMEA (Malt Extract Agar)
Karakteristik fisik dari media ini antara lain yaitu memiliki warna coklat
pucat saat sebelum dilakukan pemanasan dan berwarna coklat tua setelah
mengalami pemanasan. Media ini mengandung aquades 50 ml, malt ekstrak 30
g/l, pepton 3 g/l dan agar 15 g/l. MEA pada umumnya digunakan sebagai media
pertumbuhan khamir. Didalam media tersebut mengandung unsur O yang
merupakan salah satu mineral yang dapat menunjang pertumbuhan khamir.
2.2.4 NA-Ca (Nutrient Agar-Calcium)
Nutrien agar adalah medium umum untuk uji air dan produk pangan. NA
juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak
selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media
sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar.
Medium NA sebelum pemanasan adalah berbentuk larutan berwarna kuning keruh
sebelum dipanaskan, dan berwarna kuning bening saat setelah
dipanaskan. Namun, setelah pemanasan didapatkan warna dari medium NA lebih
jernih bila dibandingkan dengan sebelum pemanasan. NA merupakan salah satu
media yang digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air,
produk pangan, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk
mengisolasi organisme dalam kultur murni. Komposisi kimia nutrien agar adalah
eksrak beef 10 g, pepton 10 g, NaCl 5 g, air desitilat 1.000 ml dan 15 g agar/L.
Agar dilarutkan dengan komposisi lain dan disterilisasi dengan autoklaf pada
121C selama 15 menit (Fathir, 2009).
Mineral merupakan bagian dari sel, unsur penyusun sel yaitu C, O, N, H dan
P. Unsur mineral lain yang diperlukan oleh sel yaitu K, Ca, Mg, Ma, S, dan Cl.
Unsur mineral yang digunakan dalam jumlah yang sangat sedikit yaitu Fe, Mn,
Co, Cu, Bo, Zn, Mo, Al, Ni, Va, Sc, Si, Tu dan sebagainya yang tidak dipoerlukan
jasad. Unsur yang digunakan dalam jumlah besar dapat disebut dengan unsur
makro, dalam jumlah sedang disebut dengan unsur oligo, dan jumlah sedikit
disebut unsur mikro. Unsur mikro tersebut sering terdapat sebgai ikutan pada
garam unsur makro, dan dapat masuk dalam medium lewat kontaminan gelas
tempatnya, atau partikel debu. Unsur mineral yang digunakan untuk menunjang
pertumbuhan bakteri, khususnya BAL maka digunakan mineral dengan unsur Ca
dalam media NA sehingga berfungsi untuk membantu menyusun sel, selain itu
juga untuk mengatur osmose, kadar ion H+ (keasaman, Ph) dan potensial oksidasi
reduksi (redoks potensial) medium.
 BAB 3. METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat
a. Cawan petri
b. Inkubator
c. Pipet ukur 1 ml
d. Pipet ukur 5-10 ml
e. Pipet volume 1, 5, 10, dan 25 ml
f. Labu takar 25 atau 50 ml
g. Tabungreaksi dan raknya
h. Kertas perkamen
i. Kuvet spektrofotometer
j. Lampu bunset dan UV
k. Botol semprot
l. Plastik klip
m. Colony counter
n. Neraca analitik
o. spektrofotometer
3.1.2 Bahan
a. Tempe
b. Tape ketan
c. Tape singkong
d. Ayam
e. Sosis ayam
f. Petis
g. Aquades
h. OMEA
i. PDA
j. PCA
k. NA-Ca
 l. Spirtus
m. Alkohol
n. Biakan khamir dalam agar miring

3.2 Skema Kerja

3.2.1 Pembuatan Kurva Standard

4 biakan khamir

Pengenceran 50 ml

Pengenceran awal Pengambilan

beaker glass 50 ml 1.2.3.4.5.6.7.ml

Pengovenan 30 Pengenceran
sampai 10 ml
Eksikator 15

Perhitungan
Penimbangan Pengenceran 20 ml absorbansi
( 600nm)
(a gram )
Pengovenan
70oC 4-5 jam

Eksikator 15

Penimbangan
(b gram )

Pada praktikum pembuatan kurva standar tahapan pertama yang perlu

dilakukan ialah mengencerkan 4 biakan khamir sebanyak 50 ml. Pengenceran
dilakukan dengan menambahkan aquadest pada biakan khamir. Maksud
pengenceran ini dilakukan untuk biakan tersebut larut dalam air kemudian larutan
yang dihasilkan dimasukkan dalam labu takar 50 ml untuk ditera. Pada tahap
preparasi awal, cawan petri yang digunakan dioven terlebih dahulu selama 30
menit. Dalam hal ini dilakukannya pengovenan bermaksud untuk mensterilisasi
alat agar terbebas dari kontaminasi mikroba. Setelah dioven kemudian cawan petri
dimasukkan dalam eksikator selama 15 menit. Pengeksikatoran selama 15 menit
ini berfungsi untuk mendinginkan alat yang sebelumnya dioven dan
mengembalikan ke suhu normal. Setelah dingin cawan petri ditimbang untuk
diketahui beratnya (a gram). Kemudian 4 biakan khamir yang elah diencerkan
sebanyak 50 ml diambil 20 ml dan dimasukkan dalam cawan petri. Kemudian
dilakukan pengovenan dengan suhu 70oc selama 4-5 jam. Tujuan pengovenan ini
yaitu untuk mengetahui berat massa dari mikroba yang digunakan (sel/ml).
Kemudian dieksikator selama 15 menit untuk mendinginkan cawan petri. Setelah
itu ditimbang kembali sebagai (b gram). Setelah itu, dari biakan khamir yang
diencerkan sebanyak 50 ml diambil 1, 2, 3, 4, 5, 6, dan 7 ml. Kemudian
dimasukkan ke dalam tabung reaksi, setelah itu larutan biakan mikroba
diencerkan hingga diperoleh volume total 10 ml. Kemudian dihitung absorbansi
dari larutan biakan mikroba tersebut dengan panjang gelombang 600 nm.
3.2.2 Penyiapan Sampel dalam MEB

2 ose isolat Penambahan

Saccharomyces gula 1,25 g/25
Cerevisiae ml

Shaker suhu
ruang 48 jam

Sentrifuse

Pengendapan

Pencucian endapan dan

penambahan aquades

Vortex

Peneraan dengan
aquades 25 ml

Penghomogenisasi

Perhitungan absorbansi
( 600 nm)

Pada penyiapan ini media yang digunakan yaitu media MEB, gula,
Saccharomyces cerevisiae, dan aquades. Langkah pertama yang harus dilakukan
yaitu siapkan media MEB sebanyak 25 ml yang akan digunakan. Selanjutnya
masukkan biakan khamir sebanyak 2 ose isolat dan gula sebanyak 1,25 g/25ml
kedalam erlenmeyer yang berisi media MEB. Penambaan gula berfungsi sebagai
nutrisi bagi khamir Saccharomyces cerevisiae. Langkah selanjutnya yaitu
erlenmeyer yang berisi mikroba dishaker pada suhu ruang selama 48 jam.
Tujuannya untuk menghomogenkan sehingga dapat tercampur secara merata dan
dapat mengoptimalkan pertumbuhan mikroba. Selanjutnya masukkan ke dalam 3
tabung sentrifuge sebanyak 10ml, 10ml, dan 5 ml. Kemudian tabung di sentrifuge
selama 10 menit untuk memisahkan filtrat dengan endapannya. Setelah itu filtrat
di buang dan endapan yang diperoleh dicuci dengan aquades dan dikocok hingga
homogen, dari 3 tabung yang diperoleh di jadikan menjadi 1 tabung. Langkah
berikutnya yaitu endapan yang diperoleh di tera dengan aquades sebanyak 9 ml
dan dilakukan pemisahan filtrat dan endapan kembali dengan sentrifuge. Proses
pemisahan dan pencucian dilakukan sebanyak 2 kali. Langkah terakhir yaitu
endapan massa sel di cuci dengan aquades dan di pindahkan ke dalam labu takar
25 ml dan di tera dengan aquades hingga volumenya sampai 25 ml. Senjutnya
pengukuran nilai absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang
600 nm.
3.2.3 Perhitungan Jumlah Koloni
0,1 ml 0,1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

1g

9 ml 9,9 ml 9,9 ml 9 ml 9 ml 9 ml

1 ml
1 ml 1 ml
1
ml
PDA
PDA PDA
PCA

OMEA
PCA PCA
Na-Ca

OMEA OMEA

Pada praktikum penghitungan jumlah koloni dalam berbagai sampel bahan

pangan terfermentasi digunakan bahan yaitu tempe, ayam, petis, tape ketan dan
tape ketan. pada praktikum ini, langkah awal yang dilakukan yaitu melarutkan
bahan pada tabung reaksi pertama yang berisi 9 ml aquadest (10-1). Kemudian
dari bahan yang dilarutkan dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml aquadest diambil
kembali sebanyak 0,1 ml dan dimasukkan dalam tabung reaksi kedua yang berisi
9,9 ml aquadest (10-3). Suspensi dari tabung reaksi kedua diambil kembali
sebanyak 0,1 ml dan dimasukkan pada tabung reaksi ketiga yang berisi 9,9 ml
(10-5). Pada suspensi pengenceran 10-5 diambil 1 ml suspensi untuk dimasukkan
dalam media PDA (duplo) dan 1 ml untuk dimasukkan dalam media OMEA
(duplo). Suspensi dari tabung ketiga diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke
dalam tabung reaksi keempat yang berisi 9 ml aquadest (10-6). Pada suspensi
pengenceran 10-6 diambil 1 ml suspensi untuk dimasukkan dalam media PDA
(duplo), 1 ml untuk dimasukkan dalam media PCA (duplo), dan 1 ml untuk
dimasukkan dalam media OMEA (duplo) . Suspensi dari tabung keempat diambil
sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kelima yang berisi 9 ml
aquadest (10-7). Pada suspensi pengenceran 10-7 diambil 1 ml suspensi untuk
dimasukkan dalam media PDA (duplo), 1 ml untuk dimasukkan dalam media
PCA (duplo), dan 1 ml untuk dimasukkan dalam media OMEA (duplo) Suspensi
dari tabung kelima diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung
reaksi yang berisi 9 ml aquadest (10-8). Pada suspensi pengenceran 10-8 diambil
1 ml suspensi untuk dimasukkan dalam media PCA (duplo), dan 1 ml untuk
dimasukkan dalam media Na-Ca (duplo). Setelah suspensi mikroba masuk dalam
masing-masing cawan petri kemudian ditambahkan media sesuai dengan yang
dikehendaki. Teknik penambahan media ini dilakukan dengan teknik pour plate
dimana suspensi mikroba dimasukkan terlebih dahulu dalam cawan petri
kemudian baru ditambahkan dengan media yang dilakukan dengan penuangan.
Kemudian baru dihomogenkan dengan menggoyang-goyangkan kekanan-kiri dan
atas bawah. Kemudian setelah ditambahkan dengan media, cawan petri berisi
biakan mikroba dan media diinkubasi selama 48 jam dengan posisi terbalik.
Inkubasi dengan posisi terbalik bertujuan agar embun yang dihasilkan tidak jatuh
kembali pada media dan mengganggu pertumbuhan mikroba. Setelah 48 jam
diinkubasi, cawan petri dikeluarkan dan langsung dihitung jumlah mikroba yang
tumbuh pada media.
 DAFTAR PUSTAKA

Fardiaz, Srikandi. 1989. Mikrobiologi Pangan I. Jakarta: PT Gramedia Pustaka

Utama.

Hidayat, N., M. C. Padaga dan S. Suhartini. 2006. Mikrobiologi Industri.

Yogyakarta : Andi.

Kasmidjo, R.B. 1990. Tempe : Mikrobiologi dan Biokimia Pengolahan serta

Pemanfaatannya. Yogyakarta: PAU Pangan dan Gizi. UGM.

Rusmin, S and S. D. Ko. 1974. Rice-Grown Rhizopus oligosporus Inoculum for

TempehFermentation. Appl.Microbiol, 28(3): 347-350.

Samsudin, A. M. dan Khoiruddin. 2009. Ekstraksi, Filtrasi dan Uji Stabilitas Zat
Warna dari Kulit Manggis. Semarang: Jurnal Teknik Kimia Fakultas
Teknik Universitas Diponegoro.

Soemartono. 1980. Bercocok Tanam Padi. Yasaguna. Jakarta) dalam Hanum,

Tirza. 2000. Ekstraksi dan Stabilitas Zat Pewarna dari Katul Beras
Ketan Hitam. Buletin Teknologi dan Industri Pangan, Vol.XI,
No.1,Tahun 2000. (Diakses tanggal 10 Desember 2013).

Waluyo, Lud. 2007. Mikrobiologi Umum. Makassar : UMM Press