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Approches moleculaires de la diversite microbienne de
deux environnements extremes : les sources

hydrothermales profondes et les reservoirs petroliers
Erwan Corre
To cite this version:

Erwan Corre. Approches moleculaires de la diversite microbienne de deux environnements
extremes : les sources hydrothermales profondes et les reservoirs petroliers. Molecular biology.
Universite de Bretagne Occidentale, 2000. French. <tel-01115381>
HAL Id: tel-01115381

http://hal.upmc.fr/tel-01115381
Submitted on 12 Feb 2015
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Avertissement
Au vu de la lgislation sur les droits d'auteur, ce travail de thse demeure la

proprit de son auteur, et toute reproduction de cette oeuvre doit faire l'objet
d'une autorisation de l'auteur. (cf Loi n92-597; 1/07/1992. Journal Officiel,
2/07/1992)
THESE
prsente pour l'obtention
du grade de Docteur
de l'Universit de Bretagne Occidentale
(Mention Microbiologie)
Erwan CORRE
Approches molculaires de la diversit

microbienne de deux environnements extrmes :
les sources hydrothermales profondes et les
rservoirs ptroliers
Soutenue le Mercredi 2 Fvrier 2000 devant le jury compos de :
MM. P. CAUMETTE, Professeur, Universit de Pau Examinateur

M. MAGOT, Responsable de Laboratoire, Sanofi, Labge Rapporteur
P. NORMAND, Directeur de Recherche CNRS, Universit Lyon I Rapporteur
B. PICARD, Professeur, Universit de Bretagne Occidentale Prsident
D. PRIEUR, Professeur, Universit de Bretagne Occidentale Examinateur
A.L. REYSENBACH, Professeur, Universit de Portland, USA Examinatrice
Remerciements
Le travail prsent dans ce mmoire a t ralis avec le soutien financier de la Communaut Urbaine de Brest
Je remercie tout d'abord Daniel Prieur pour m'avoir accueilli dans son quipe de recherche, d'abords en DEA puis en thse et
de m'avoir fait confiance tout au long de ces annes.
Mes remerciements s'adressent tout particulirement Christian Jeanthon pour son soutien, sa patience et sa disponibilit.
Je tiens lui exprimer ici ma reconnaissance pour toutes les discussions enrichissantes, les conseils aviss et les directives salutaires
qu'il a su m'indiquer tout au long de ce travail. Merci profondment pour le temps consacr la correction des articles.
Je remercie galement Anna-Louise Reysenbach pour m'avoir accueilli dans son laboratoire Rutgers et de m'avoir permis
de travailler sur les chantillons de Vent Cap. Son exprience en biologie molculaire, ses conseils en phylognie m'ont t
grandement utiles. Je la remercie galement de m'avoir fait partager durant mon sjour Rutgers sa passion pour les chevaux et
pour le trafic de fromages et de vins franais.
Je remercie galement les membres du jury : Pierre Caumette, Philippe Normand, Michel Magot et Bertrand Picard d'avoir
accept de juger mon travail de thse.
Je tiens adresser mes plus profonds remerciements l'ensemble des tudiants avec qui j'ai eu la joie de travailler : Cdric
Hobel (qui a essuy les pltres), la brillante Anne Postec, l'innarrable mais nanmoins charmante Catherine Charpentier et enfin
le prcieux Laurent Toffin avec qui j'ai pass une anne de travail formidable. Une grande partie des rsultats prsents dans ce
manuscrit sont le fruit de leur acharnement et de leur persvrance.
J'adresse un remerciement tout particulier Tristan Barbeyron pour m'avoir form aux techniques molculaires, pour sa
disponibilit et son savoir intemporel sur tout ce qui trait la biologie molculaire, la microbiologie, la radioactivit, Serge Lama et
les 24 heures du Mans. Merci galement Hermie Harmsen pour ses conseils aviss la paillasse comme l'e-mail.
Je remercie tout particulirement Olivier Collin, Stphan Jouannic et Jean Ranc pour les heures qu'ils ont accept de passer
lire et corriger ce manuscrit. Spciale ddicace Stphane et Olivier pour leur travail de pionniers dans la jungle des fautes
d'orthographes et les marais fangeux des accords mal propos.
Je remercie galement tous les membres du laboratoire. En particulier Stphane et Edmond pour leur amiti, les foules et la
sueur que nous avons partag (enfin surtout eux) sur de nombreux kilomtres. Jenny pour m'avoir support et pour nous tre
paul mutuellement dans la dernire (longue, trs longue) ligne droite. Marc, Patrick, Olivier, Jean-Louis, Laurent, Viggo, Soizick
et Valrie pour avoir survcu dans les bureaux que nous avons partags. Enfin je remercie les membres de la Station Biologique de
Roscoff pour leur accueil, leurs comptences et la formidable ambiance qu'ils savent entretenir dans leur laboratoire et dans les
couloirs de la station.
Merci Odile, Claire, Catherine's, Jeff's, Didier, Vincent et Lolo, la famille Collin 2 jambes ou 4 pattes pour leur soutient
moral et vliplanchesque ainsi que pour leur accueil tout au long de mon travail.
Merci l'ensemble de ma famille, Juliette de m'avoir aiguill vers la Station Biologique, mes parents, "beaux"-parents et
grands-parents de leur soutien.
Merci enfin Anne d'avoir su supporter au quotidien mes sautes d'humeurs, mes absences et d'avoir finalement, plus qu'aucune
autre personne, contribu ce que je mne bien ce travail.
Introduction gnrale
La microbiologie de l'environnement est une discipline jeune, qui a pour vocation d'tudier les
relations qu'entretiennent les micro-organismes avec leur biotope. Si l'adage populaire n'accorde que
peu d'influence ce qui est invisible l'oeil et si la prsence de micro-organismes est souvent
associe une nuisance plutt qu' un bienfait, le rle des micro-organismes est pourtant
prpondrant dans le fonctionnement de nombreux cosystmes naturels et anthropiques. L'tude
des micro-organismes a longtemps t lie la capacit des microbiologistes recrer in vitro des
conditions favorables la croissance des communauts microbiennes. Or, des cosystmes
complexes, soumis des contraintes physico-chimiques extrmes telles que, de fortes tempratures,
de fortes pressions ou l'absence d'oxygne, ou des fluctuations de sources de nutriments ou
d'nergie, sont particulirement difficiles simuler au laboratoire. Aussi, dans ces cosystmes
,comme dans d'autres tudis dj depuis fort longtemps tels que le sol o l'eau de mer, un grand
nombre de micro-organismes ont chapp toute mthode de culture. Le dveloppement des
techniques de biologie molculaire et l'utilisation de la molcule d'ARN ribosomique comme marqueur
volutif a permis de s'affranchir des tapes de culture et a permis d'asseoir sur des bases
phylogntiques les relations taxinomiques s'tablissant entre les diffrents organismes vivants.
Le travail prsent dans ce mmoire a pour objet l'tude de la diversit microbienne de deux
cosystmes considrs comme extrmes : les sources hydrothermales profondes et les rservoirs
ptroliers. Les techniques mises en oeuvre sont fondes soit sur l'analyse des ARN ribosomiques
(ARNr) sans tape pralable de culture, par squenage ou hybridation in situ, soit sur le
positionnement phylogntique de souches isoles de ces environnements.
Avant de prsenter les rsultats de ce travail sous la forme d'articles en prparation, soumis ou
publis, je me propose :
- de prsenter une revue des techniques d'cologie microbienne classiques et molculaires

couramment utilises pour accder la diversit des cosystmes microbiens, de prsenter des
moyens d'accder la diversit fonctionnelle de ces cosystmes et d'insister sur les biais inhrents
chacune de ces techniques,
- d'effectuer un tour d'horizon des diffrents habitats microbiens qui ont t tudis ces dernires
annes et de prsenter pour chacun de ces habitats les apports des techniques molculaires dans la
description de la diversit et la dcouverte de nouveaux groupes phylogntiques,
et enfin
- de prsenter et de discuter les diffrentes techniques que nous avons mises en oeuvre pour tudier
la diversit microbienne d'un cosystme ptrolier continental et d'un site hydrothermal profond.
ii
Abrviations IPTG : isopropylthio--D-galactoside
ISRT : In Situ Reverse Transcription

A : Adnosine
Knuc : distance phylogntique
ADN: Acide dsoxyribonuclique
Kpb : Kilo paires de bases
ADNc : ADN clon
LB (milieu liquide ou glose) : Luria-Bertani
ADNr 16S : ADN codant pour la sous unit 16S de l'ARN
ribosomal LFRFA : Low Frequency Restriction Fragment Analysis
ADNr : ADN codant pout l'ARN ribosomal LMW RNA: ARN de faible poids molculaire
AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism LPS : Lipopolysaccharides
APS : Ammonium Persulfate LUCA : Last Unversal Common Ancestor
ARDRA : Amplified rDNA Restriction Analysis. MAR : Middle Atlantic Ride
ARN : Acide ribonuclique MPN : Most probable number
ARNm : ARN messag NPP : Nombre le plus probable
ARNr 16S : sous unit 16S de l'ARN ribosomal OTU : Operational Taxonomic Unit
ARNr : ARN ribosomale p/v : (masse volume)
ATP : Adnosine tri-phosphate pb : paire de base
BrdU : bromodoxyuridine. PCB : PolyChlorinated Biphenyl
BSA : Bovine Serum Albumin PCR : Polymerase Chain Reaction
BSR: Bactries sulfato-rductrices PFLA : analyse des profils lipidiques
C : Cytosine PGFE : Pulsed-Field Gel Electrophoresis
C.F.B. : Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides RAPD : Randomly Amplified Polymorphic DNA
CDGE : Constant Denaturant Gel electrophoresis RDP : Ribosomal Database Project
CMF : Cytomtrie en flux RFLP : Restriction Length Fragment Polymorphism
comm. pers. : communication personelle RPM : Rotation par minute
CTAB : Hexadecyltrimethyl ammonium bromide RT-PCR : Reverse Transcriptase-PCR
CTC : 5-cyano-2,3-dotolyl tetrazolium chloride S : Svedberg
Da : Dalton SDS : Sodium dodecyl sulfate
DAPI: Acide diamino-pimlique SET (tampon) : Sucrose/EDTA/Tris
DGGE : Denaturing Gradient Gel Electrophoresis ssADN : ADN simple brin (single strand)
DH : Deshydrognases T : Thymine
DMSO : Di methyl sulfoxyde T-RFLP : Terminal Restriction Length Fragment

Polymorphism
dNTP : deoxynuclotide triphosphate
TAE (tampon) : Tris/Amonium/EDTA
dsADN : ADN double brin (double strand)
TBE (tampon) : Tris/Borate/EDTA
EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid
Td : Temprature de dissociation
EPR : East Pacific Ride
TE (tampon) : Tris/EDTA
FAME : Fatty acid Methyl Ester
TEMED : N,N,N',N' Ttramthylthylnediamine
FISH : Fluorescent In Situ Hybridization
TGGE : Temperature Gradient Gel Electrophoresis
G : Guanidine
Tm : Temprature de fusion
GES (tampon) : GIT/EDTA/SDS
TNE (tampon) : Tris/NaCl/EDTA
GIT : Guanosine isothiocyanate
UFC : Unit formant colonie
GNS : Bactries vertes non sulfureuses
v/v : volume volume
HPLC : High Presure Liquid Chromatography
X-Gal : 5-bromo-4-chloro-3 indolyl--D-galactopyranoside
INT : 2 (p-iodo-pheny)-3-(p-nitropheny)-5-phenyl tetrazolium
chloride
iii
Sommaire
Remerciements i
Introduction gnrale ii
Abrviations iii
Sommaire iv
Partie 1 : Les techniques d'cologie microbienne
I Notions d'cologie microbienne 1
II Les mthodes classiques d'cologie microbienne 3
2.1 Les cultures d'enrichissement et l'isolement 3
2.1.1 L'enrichissement 3
2.1.2 L'isolement et la taxinomie 4
2.2 Quantification et mesure d'activit microbienne 7
2.2.1 Quantification 7
2.2.2 Mesure d'activit microbienne 12
2.3 Une vue restreinte de la diversit 14
III Les acides nucliques en cologie microbienne 15
3.1 Le dveloppement des techniques molculaires 15
3.1.1 La phylognie molculaire 16
3.1.2 L'ARN ribosomique 16
3.1.3 Le choix de l'ARN 16S 17
3.2 L'analyse phylogntique 18
3.2.1 Les mthodes de phylognie 18
3.2.2 L'informatique au service de la phylognie 23
3.3 Les mthodes molculaires 27
3.3.1 Le clonage et le squenage des ARNr 27
3.3.2 Les sondes nucliques 32
3.3.3 La DGGE 34
3.3.4 Les autres techniques 36
3.4 De la diversit phylogntique la diversit physiologique 37
3.5 Les biais des techniques molculaires 39
3.5.1 Echantillonnage et conservation des chantillons 40
3.5.2 Les techniques de PCR 40
3.5.3 Les techniques d'hybridation 42
3.5.4 Les techniques de DGGE 43
3.5.5 Une solution : l'approche pluridisciplinaire 43
Partie 2 : Les habitats microbiens
I Les origines de la vie 45
1.1 Les premires traces de vie 45
iv
1.2 Une origine de la vie controverse 46
II. L'atmosphre 49
III. Les habitats terrestres 49
3.1 Les couches superficielles de la lithosphre 49
3.1.1 Description de l'habitat 49
3.1.2 La rhizosphre 50
3.1.3 L'apport des techniques molculaires 50
3.2 La biosphre souterraine 52
3.2.1 Description de l'habitat 52
3.2.2 Le concept de biosphre souterraine 53
3.2.3 La communaut microbienne souterraine 54
3.2.4 Des profondeurs aux astres 55
3.3 Les rservoirs ptroliers 56
3.3.1. Formation et production du ptrole 56
3.3.2. Composition physico-chimique du biotope 57
3.3.3. La diversit microbienne des puits de ptrole 58
3.3.4 Activit microbienne lie aux hydrocarbures 62
IV. Habitats aquatiques 63
4.1 L'habitat d'eau douce 64
4.2 L'habitat maritime 65
4.2.1 Les micro-organismes marins isols 65
4.2.2 L'utilisation des techniques molculaires 65
4.2.3 Les Fosses ocaniques 69
4.3 Les zones sdimentaires marines et lacustres 69
4.3.1 Description du biotope 69
4.3.2 Les techniques molculaires 70
4.4 Les sources hydrothermales ocaniques profondes 72
4.4.1 Nature et structure des missions hydrothermales profondes 73
4.4.2 Faune associe l'cosystme hydrothermal 76
4.4.3 Les micro-organismes des sources hydrothermales 78
4.5 Les sites hydrothermaux continentaux et ctiers 89
4.5.1 Description des biotopes 89
4.5.2 Les micro-organismes des sites ctiers et continentaux 91
V La flore microbienne lie l'Homme, aux animaux et l'activit humaine 97
5.1 L'Homme comme cosystme microbien 97
5.1.1. La flore de la cavit buccale 97
5.1.2. Les micro-organismes du tractus digestif 98
5.1.3 L'apport des techniques molculaires en microbiologie humaine 99
5.2 La flore microbienne associe aux autres animaux 100
v
5.3 Les micro-organismes associs aux activits humaines 103
5.3.1 L'extraction de minerai 103
5.3.2. Les boues de stations d'puration 104
5.3.3 Les autres milieux 105
VI Conclusion et prsentation du projet d'tude 106
Partie 3 : Matriels et mthodes
I Echantillonnage et conservation de l'chantillon 109
1.1 Echantillonnage des puits de ptrole 109
1.2 Echantillonnage des sources hydrothermales profondes 109
1.2.1 Echantillons de chemine 110
1.2.2 Echantillons de fluides 111
1.3 Echantillonnage des sources chaudes terrestres 111
II Analyse de l'ADNr 16S 111
2.1 Extraction d'ADN 111
2.1.1 Extraction de l'ADN sur filtre ou sur culot de centrifugation 112
2.1.2 Extraction de l'ADN chromosomique par la mthode de Sambrook et al. (1989) 112
2.1.3 Mthode d'extraction au micro-ondes 113
2.1.4 Extraction de l'ADN chromosomique par la mthode de Pitcher et al. (1989) 113
2.1.5 Extraction de l'ADN au "Bead-Beater" 113
2.2 Amplification de l'ADNr 16S 114
2.2.1 Ractions d'amplification classiques 114
2.2.2 Techniques d'optimisation de la raction 114
2.2.3 Choix des amorces d'amplification 115
2.3 Clonage des produits de PCR 116
2.3.1 Utilisation du kit TOPO TA Cloning 116
2.3.2 Transformation des cellules par lectroporation 117
2.4 Analyse des clones par RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism 117
2.5 Squenage 118
2.5.1 Ractions de squence 118
2.5.2 Amorces de squenage 118
2.5.3 Migration des ractions de squences 119
2.6 Analyse des squences 120
III Hybridation in situ 120
3.1 Construction des sondes 120
3.2 Mise au point des sondes - Test de spcificit 121
3.2.1 Hybridation sur membrane 121
3.2.2 Hybridation sur culture pure 123
3.3 Hybridation in situ 123
3.3.1 L'enrobage des lames d'observation 123
vi
3.3.2 Fixation des cellules 123
3.3.3 Extraction des cellules de l'chantillon 124
3.3.4 Hybridation in situ 124
IV Observation et quantification des cellules 125
Partie 4 : Articles
Article 1 129
Article 2 154
Article 3 174
Article 4 193
Article 5 202
Article 6 206
Conclusion gnrale 209
Rferences bibliographiques 214
Annexes
Structure secodaire de l'ADNr 16S de E. coli
Arbre phylogntique des Bacteria et des Archaea
vii
Les techniques d'cologie microbienne
La microbiologie est fonde depuis le 19 me sicle sur l'observation et la culture des micro-
organismes. Or on s'est rendu compte que les techniques de mise en culture donnent une image
fausse, puisque obligatoirement slective, du rle et de l'importance des micro-organismes dans la
nature. Aussi, aux techniques classiques de microbiologie (techniques de culture, de comptage,
microscopie lectronique, utilisation de marqueurs radioactifs) se sont ajoutes des techniques de
biologie molculaire (analyses du gnome, sondes nucliques, squenage) qui permettent
dornavant d'obtenir une image plus prcise des relations des micro-organismes avec leur
environnement. Dans ce chapitre je me propose, aprs un bref rappel de notions d'cologie
microbienne, de prsenter les techniques classiquement utilises en cologie puis, plus
spcifiquement, les techniques fondes sur l'utilisation des acides nucliques. Une attention
particulire sera porte aux biais inhrents ces technologies.
I Notions d'cologie microbienne
Dfinitions
Un cosystme est un ensemble dynamique au sein duquel interagissent divers degrs des
facteurs biotiques (individu, population, communaut) et abiotiques (facteurs physico-chimiques) (cf.
figure 1.1) (Begon et al., 1996).
Complexit de l'interaction croissante
Guilde
Individu
Individu Population
Population Communaut
Communaut Ecosystme
Individu
Individu Population
Population Communaut
Individu
Individu Population
Individu
Effet des facteurs abiotiques (environnement)

pH, T, 0 2, NaCl, Lumire, H20, Nutriments
Figure1.1. Reprsentation schmatique des relations au sein d'un cosystme
Individu : Unit distincte qui volue sparment des autres, qui se reproduit dans un groupe et a un rle (une
niche) dfini.
Population : Groupe d'individus qui vivent sur une zone dfinie.
Guilde : Plusieurs populations distinctes ralisant des tches similaires ou exploitant les mmes ressources
environnementales dans un but similaire.
Communaut : Assemblage de populations dans un mme espace et sur une mme priode de temps.
Environnement : Se rfre tout ce qui entoure un organisme vivant. Correspond aussi bien des facteurs
physiques, chimiques ou biologiques qu'aux forces qui agissent sur l'organisme.
1
Les interactions entre les composants de l'cosystme
La structure d'une communaut microbienne va donc tre soumise des fluctuations

temporelles et spatiales qui vont correspondre des phases de colonisation de nouveaux milieux ou
de remplacement d'une communaut par une autre plus adapte (comme c'est le cas dans le tractus
digestif au cours de la croissance d'un individu). Nous savons qu'un grand nombre de facteurs
peuvent modifier la composition de la communaut microbienne : la disponibilit en sources de
carbone, d'nergie et en accepteurs d'lectrons, la temprature, le pH, l'O 2, la teneur en eau ou
encore la lumire. Aussi pour survivre et se dvelopper les micro-organismes ont dvelopp des
adaptations structurales et nutritionnelles qui correspondent diffrentes stratgies en fonction des
conditions physico-chimiques auxquelles ils sont exposs (par exemple stratgies r et K, cf. tableau
1.1).
Tableau 1.1. Comparaison des stratgies r et K d'aprs Mac Arthur (1962)
stratgies r stratgies K
Taux de reproduction lev Taux de reproduction faible
La forte teneur en nutriments permet une croissance importante au La faible teneur en nutriments limite la croissance de tous
dtriment de cellules moins bien adaptes les organismes.
Trs forte population microbienne Population plus rduite
Grosses variations de population lorsque la teneur en nutriments Communaut prenne et stable
varie
Ex: "Blooms" cyanobactriens dus un apport de phosphates, ou Ex: Spirillum et Vibrio dans l'eau de mer, bactries dans les
"blooms"" de Pseudomonas dus a un apport de sources carbones lac oligotrophiques
D'autres part, aux facteurs extrieurs s'ajoutent de fortes interactions qui peuvent se produire au
sein d'une population (coopration ou comptition) ou entre populations (synergie, symbiose et
antagonisme).
L'habitat naturel
L'tendue de l'habitat microbien est mettre en rapport avec la taille du micro-organisme1. Mme
si les cellules seules n'existent pas ou trs peu dans la nature (on parle plutt de micro-colonies) des
micro-environnements de l'ordre du millimtre peuvent tre le sige de trs fortes variations physico-
chimiques (c'est le cas notamment dans les particules de sol). De plus les cellules colonisent souvent
les surfaces sous la forme d'un biofilm. Cette structure complexe permet aux micro-organismes
d'accder plus facilement aux nutriments ncessaires leur croissance et de les stocker.
L'tude des populations microbiennes dans leur environnement devra donc rpondre aux
questions de la composition, de la structure et de la fonction de cette population. Pour rpondre ces
questions les premiers microbiologistes disposaient de mthodes fondes sur leur capacit recrer
le plus fidlement possible les conditions de croissance in situ. Par la suite, le dveloppement des
techniques molculaires a permis de s'affranchir partiellement des tapes de mise en culture.
1
Pour une cellule de 3m une distance de 3 mm correspond l'quivalent d'une distance de 2 km pour l'homme.
2
II Les mthodes classiques d'cologie microbienne
2.1 Les cultures d'enrichissement et l'isolement
2.1.1 L'enrichissement
La plupart de nos connaissances sur les micro-organismes proviennent d'tudes ralises sur
des cultures pures isoles de l'environnement. Cet isolement est prcd par une phase
d'enrichissement qui va favoriser la croissance d'un type donn de micro-organisme, slectionn en
fonction des conditions physiques et nutritionnelles du milieu.
On distingue deux grands types de milieux, les milieux lectifs o les souches les plus adaptes
aux conditions de culture vont se dvelopper et les milieux slectifs o on intervient physiquement ou
chimiquement pour favoriser la croissance d'un type donn de micro-organismes2. On favorise dans
tous les cas les micro-organismes ayant les vitesses de croissance des plus leves dans des
conditions donnes.
Il existe plusieurs moyens classiques de modifier la slectivit d'un milieu :
Ajouter un compos utilis par un organisme comme source nutritive.
Supprimer un compos utilis uniquement par les organismes que l'on ne souhaite pas isoler
(supprimer toutes les sources d'azote autres que l'azote gazeux (N2) pour isoler les bactries
fixatrices d'azote).
Ajouter des antibiotiques (pnicilline pour inhiber les bactries Gram + et certaines bactries
Gram -, nomycine et streptomycine pour inhiber les bactries en gnral, actidone et nystatine
pour inhiber les champignons).
Modifier les proprits physico-chimiques du milieu (pH, potentiel redox, etc.).
Modifier les conditions d'incubation (temprature, teneur en eau, pression osmotique, lumire,
etc.).
Un panel de milieux d'enrichissement, prsentant l'ensemble des conditions physico-chimiques
rencontres dans le biotope d'tude, devra tre choisi pour permettre la croissance du plus grand
nombre possible de types mtaboliques.
Compte tenu de la complexit de certains cosystmes, il est parfois ncessaire de mettre en
oeuvre des systmes labors de culture afin de pouvoir assurer le dveloppement de certains
organismes.
C'est le cas notamment des milieux fort gradient (physico-chimiques, nutritionnels, etc.) pour
lesquels les systmes suivants ont t mis au point :
La colonne de Winogradsky (cf. figure 1.2).
la chambre de culture en flux continu de Huber et al. (1998b) pour isoler Thermocrinis ruber, une
bactrie hyperthermophile plomorphe formant, une fois fixe, de longs filaments roses dans les
2
Les milieux lectifs sont en fait des milieux peu slectifs.
3
sources chaudes d'Octopus Spring Yellowstone (USA). Les systmes de culture en continu
permettent de slectionner des micro-organismes ayant de fortes affinits avec des substrats en
faibles concentrations. Les micro-organismes n'ayant pas d'affinit suffisante sont lessivs du milieu.
La "Benthic Gradient Chamber" mise au point pour reproduire les gradients sdimentaires et tudier
les phnomnes de comptitions entre bactries pourpres et vertes (Caumette et al., 1998).
Les chmostats pour maintenir en culture les bactries formant des enchevtrements ("mats")
filamenteux de soufre (Taylor et al., 1999).
Les co-cultures pour la croissance de bactries syntrophes : Syntrophomonas avec des bactries
sulfato-rductrices (BSR) (Harmsen et al., 1993) ou de Proteobacteria epsilon soufre oxydantes avec
des BSR (Thiovulum sp. pour Wirsen et Jannasch, 1978 ou Arcobacter sp. pour Teske et al., 1996b).
Dans ce cas le dveloppement du micro-organisme est conditionn par la consommation d'un
des produits de son mtabolisme par un second micro-organisme.
Couvercle
Algues et cyanobactries
Eau de lac
ou de Figure 1.2. Principe de fonctionnement d'une colonne de
marais Bactries soufres Winogradsky. La phase suprieure reproduit les
pourpres
conditions retrouves dans le milieu liquide (luminosit,
Bactries soufres aration) alors que la phase infrieure reproduit les
vertes
Boues conditions des premiers centimtres de sdiments
enrichies en (obscurit, augmentation du potentiel rducteur). Au cours
matires Dcomposition
du temps, l'tablissement de la flore microbienne
organiques et anarobie et sulfato-
en CaSO4 rduction s'effectue en fonction de leur prfrendum au sein des
gradients (d'aprs Madigan, 1996).
2.1.2 L'isolement et la taxinomie

A partir de l'enrichissement il est possible d'isoler des espces pures. Pour ce faire on dispose
de trois grands types de techniques : l'isolement sur boite, la dilution successive en milieu liquide ou
dans l'agar. Pour chacune des mthodes plusieurs repiquages successifs des souches isoles seront
ncessaires pour s'assurer de la puret de l'isolat.
Une fois la souche isole il convient de la caractriser, c'est dire de dfinir les caractres
phnotypiques et gnotypiques qui permettront de la comparer avec d'autres micro-organismes
pralablement isols. On ralise alors une taxinomie. Une partie de ces caractres est regroupe dans
le tableau 1.2.
La taxinomie microbienne a longtemps t considre comme une discipline ingrate. A l'instar
de la taxinomie des organismes suprieurs elle tait essentiellement fonde sur l'utilisation de cls
dichotomiques successives. Or ces cls n'taient pas d'un emploi simple et taient de plus sources
4
d'erreurs. Le dveloppement de la taxinomie numrique3 et des approches polyphasiques dans les

annes 70 (Colwell, 1970; Sneath et Sokal, 1973; Vandamme et al., 1996) mais surtout l'apparition de
la taxinomie molculaire (en particulier l'analyse de l'ARN ribosomique ou des gnes codant pour
l'ARNr (ADNr)) ont permis de redonner un vritable lan cette discipline.
Tableau 1.2. Liste non -exhaustive des caractres phnotypiques et gnotypiques dtermins pour une souche isole.
Morphologie : Physiologie :
Forme de la cellule Milieu de culture
Taille de la cellule (diamtre, longueur) Optimum et gamme de temprature
Mobilit Optimum et gamme de pH
Flagelle Croissance phototrophique ou lithotrophique
Type de division cellulaire Besoins en vitamines
Diffrenciation cellulaire Sources de carbone ncessaire la croissance
Structures internes et externes (endospores, vsicules Sources dazote ncessaire la croissance
gazeuses, etc.). Relation vis vis de loxygne
Coloration de Gram Modes de production dnergie :
Ultrastructure - donneurs dlectrons : organiques ou inorganiques
Composition chimique et analyse molculaire : - accepteurs dlectrons : oxygne, nitrate, sulfate, CO2,
Couleur des suspensions de cellules oxydes de fer, etc.
Pigments Enzymes extracellulaires :
Composition en base de lADN - amylases, lipases, glatinases, cellulases, xylanases
Squence de lARNr 16S Autres enzymes :
Rassociation ADN/ADN entre espces proches - oxydase, catalase
Acides gras totaux. Fermentation du glucose
Dnitrification
La notion d'espce est le concept cl et l'unit de base de la taxinomie. Elle rsulte des
premiers travaux de hirarchisation du monde vivant au 18me sicle par le naturaliste sudois Carl Von
Linn. Selon la dfinition devenue classique propose par Ernst Mayr (1982), une espce est un
ensemble d'individus fconds entre eux et seulement entre eux, donc isols des autres groupes
d'tres vivants. Or le concept de sexualit chez les procaryotes est trs diffrent de celui des
eucaryotes puisque la reproduction est vgtative et asexue. De plus on sait que des phnomnes
de parasexualit existent chez les procaryotes (conjugaison, transformation et transduction) et que
ceux-ci passent la barrire des espces (cf. revue de Taddei et al., 1996). A la diffrence des
eucaryotes, les caractres morphologiques des procaryotes considrs seuls n'ont toujours qu'une
faible signification dans la classification des bactries car la grande majorit des micro-organismes ont
des formes trop simples pour que l'on puisse les utiliser pour la taxinomie. Le dveloppement des
techniques molculaires a permis de donner une dfinition trs rigoureuse de l'espce.
Cette dfinition est fonde sur les proprits de dnaturation et de renaturation du double brin
de l'ADN gnomique bactrien en fonction de la temprature. Elle permet de dfinir une espce
3
Des caractres phnotypiques (tels que ceux prsents dans le tableau 1.2) peuvent servir de base la comparaison de plusieurs
souches. Il faut s'assurer que les caractres compars sont informatifs et notamment qu'ils ne correspondent pas un caractre
driv. Il convient dans un premier temps de discrtiser ces caractres (sous forme de 0 et de 1) puis de les prsenter sous la forme
d'une matrice. Les similitudes entre organismes vont tre exprimes sous forme de dendrogrammes. Des valeurs d'hybridations
ADN-ADN ou ARN-ADN pourront tre aussi utilises comme caractres dans une taxinomie. Toutefois les hybridations ADN-ADN ne
vont tre informatives que dans le cas d'espces proches et ne pourront tre utilises entre des espces loignes.
5
procaryotique comme constitue de souches qui prsentent des valeurs d'hybridation ADN-ADN
suprieures ou gales 70% et une valeur Tm4 infrieure ou gale 5C (Wayne et al., 1987). Par la
suite la gnralisation de l'analyse de l'ADNr a incit les auteurs corrler les pourcentages d'identit
entre ARNr 16S et les pourcentages de rassociation ADN/ADN (Stackebrandt et Gebel, 1994). Ainsi
les squences d'ADNr ayant des identits infrieures 97% correspondent gnralement des
espces diffrentes. Amann et al. (1995) abaissent par prcaution cette limite 95%. Selon certains
auteurs les critres d'hybridation ADN-ADN et de similarit d'ADNr 16S ne suffisent pas pour distinguer
des populations cologiquement distinctes. Il faut leur associer des mesures de similarit de gnes
codants pour des protines du mtabolisme (plus impliques dans les mcanismes cologiques)
(Palys et al., 1997).
Le positionnement taxonomique d'une souche ne saurait toutefois se faire uniquement sur des
critres gntiques et l'utilisation de l'ensemble des caractres phntiques et gntiques
permettent d'ancrer plus solidement l'organisme au sein d'une famille, d'un genre ou d'une espce
dfinie (cf. tableau 1.3).
Tableau 1.3. Rsolution taxonomique des techniques d'analyse (d'aprs Vandamme et al., 1996)
Techniques Niveau rsolutif
Famille Genre Espce Souche
RFLP
PGFE, LFRFA
Ribotypage
Amplifications d'ADN (RAPD, AFLP, ARDRA)
Typage de phages et de bactriocines
Techniques srologiques (monoclonales, polyclonales)
Zymogrammes
Analyse des profils protiques
Hybridations ADN-ADN
G+C %
Marqueurs chemotaxiques (quinones, polyamines)
FAME
Constituants des parois
Phnotype (classique, API, Biolog, ...)
Squenage ARNr
Sondes nucliques
Squenage du gnome
Abrviations : RFLP : Restriction Length Fragment Polymorphism; PGFE : Pulsed-Field Gel Electrophoresis; LFRFA : Low
Frequency Restriction Fragment Analysis; RAPD : Randomly Amplified Polymorphic DNA; AFLP : Amplified Fragment Length
Polymorphism; ARDRA : Amplified rDNA Restriction Analysis.
2.2 Quantification et mesure d'activit microbienne

L'isolement des souches permet de dfinir le type mtabolique des micro-organismes mais il
peut tre intressant :
de suivre l'volution du micro-organisme dans le temps au sein de son environnement,
4
Tm , Temperature melting, est la valeur mdiane du profil thermique de dnaturation d'un duplex ADN/ADN ou ADN/ARNr, le Tm
tant la diffrence de Tm entre l'hybride homologue et htrologue.
6
de dfinir sur quelle distance s'tend sa niche cologique et sa zone de densit optimum,
de connatre la vitesse laquelle il dgrade les nutriments qu'il utilise,
de comprendre comment les lments qu'il mtabolise s'insrent dans les grands cycles
gochimiques et comment ils sont ventuellement incorpors dans le mtabolisme d'autres
populations de micro-organismes.
2.2.1 Quantification
Les mthodes pour quantifier les micro-organismes prsents dans un chantillon naturel
drivent de celles utilises pour quantifier les micro-organismes en culture pure. On distingue trois
grand types de mthodes : les techniques de mise en culture, les techniques de comptage direct et
les techniques d'analyse chimique de composants cellulaires.
2.2.1.1 Les techniques culturales
A l'aide de dilutions successives sur milieu liquide ou solide on dtermine la dilution maximale
laquelle il est possible d'obtenir une croissance de micro-organismes (technique du NPP: Nombre le
Plus Probable sur milieu liquide et de UFC : Unit Formant Colonie sur milieu solide). Ces techniques
sont grandement dpendantes du milieu et des conditions de culture utiliss. Elles ne permettent
d'accder qu' un nombre restreint de micro-organismes prsents dans l'chantillon (cf. . 2.3)
Ces techniques peuvent toutefois tre utilises conjointement avec d'autres mthodes pour dtecter
des populations au type mtabolique dfini (par exemple les BSR, les mthanognes, les autotrophes
soufre rducteur).
2.2.1.2 Les techniques de comptage direct
Cellules de comptage
L'chantillon sous une forme liquide est dispos dans des cellules de comptage (cellules de
Mallassez et de Petroff-Hausser). Les cellules sont comptes sous le microscope dans un volume bien
dtermin. Cette technique n'est malheureusement applicable que dans des chantillons o les
cellules sont individualises. Or dans la nature les cellules sont trs frquemment associes de
manire trs cohsive ou associes des surfaces. Pour simplifier le comptage et pour ne compter
que des cellules viables il est parfois possible de faire crotre les cellules dans un milieu contenant un
inhibiteur de la synthse d'ADN comme l'acide nalidixique et de l'extrait de levure avant de les
dnombrer (Kogura et Simidu, 1979). Les cellules viables vont alors former des cellules gantes (la
croissance de paroi n'tant pas stoppe). Toutefois la limite de dtection de cette technique est de
l'ordre de 5.10 6 10 7 cellules par ml, et cette valeur est bien suprieure la teneur en micro-
organismes que l'on peut retrouver dans l'eau de mer de surface (5.105 cellules/ml) ou de profondeur
(5.104 cellules/ml) par exemple.
7
Comptage par pifluorescence
Pour ce type de comptage on utilise la proprit qu'ont certains chromophores lorsqu'ils sont
excits une longueur d'onde ( 1), de rmettre l'nergie fournie sous forme lumineuse une
longueur d'onde suprieure ( 2) (Zimmermann et Meyer-Reil, 1974). La fluorescence rmise a une
dure de vie plus ou moins longue (fading). Selon les colorations c'est le chromophore qui va se fixer
directement sur la cible (DAPI, SYBR Green) alors que dans d'autres cas il sera reli une molcule
non fluorescente qui jouera le rle d'agent de spcificit (anticorps, sondes nucliques). La coloration
va tre ralise directement sur les cellules. Pour des environnements pauvres en micro-organismes il
est souvent ncessaire de concentrer les chantillons par filtration. On utilise couramment un filtre
noirci (Hobbie et al., 1977) sur lequel il est possible de colorer les cellules avec des marqueurs
fluorescents tels que :
le DAPI (diaminodino-phenylindole) colorant l'ADN,
l'acridine orange qui colore l'ADN et l'ARN,
la fluorescine isothiocianate (FITC fluorescence verte) et la rhodamine (fluorescence
rouge) qui colorent les protines en ragissant avec les groupes sulfydryles,
le SYPRO qui colore les protines et qui a t utilis rcemment pour quantifier la biomasse
planctonique (Zubkov et al., 1999),
le Calcofluor qui ragit avec la cellulose, la chitine et les polysaccharides similaires,
le DANSYL chloride et le "8-anilino-1-naphthalene sulfonic acid salts" (Mg-ANS et Na-
ANS) qui ragissent (fluorescent) en entrant en contact avec les lipides microbiens.
Les deux premiers colorants ont une forte propension se fixer sur des particules non
biologiques et sont souvent inutilisables dans des chantillons naturels. Il est donc ncessaire de
prvoir une extraction spcifique des cellules avant leur coloration. Il est aussi possible d'utiliser des
colorants beaucoup plus spcifiques des acides nucliques tels que le SYBR Green I et II, le YOYO-1,
le POPO-1 ou le YO-PRO-1 (cf. tableau 1.4) (Noble et Fuhrman, 1998; Weinbauer et al., 1998; Marie et
al., 1999).
Certains colorants vont permettre de distinguer les cellules mortes des cellules vivantes soit en
ne pntrant que dans les cellules vivantes (on parle de colorants mtaboliques), soit en ne pntrant
que dans les cellules mortes. De plus les colorants mtaboliques permettent de dtecter le niveau
d'activit des cellules (par exemple mesure du potentiel d'oxydo-rduction, Rodriguez et al., 1992).
Enfin il est aussi possible d'utiliser des anticorps fluorescents la spcificit plus ou moins large
pour compter certaines populations de micro-organismes (en particulier dans le domaine mdical et
dans l'alimentaire pour la dtection et le comptage de certains srotypes de souches pathognes).
8
Tableau 1.4. Liste non-exhaustive des fluorochromes spcifiques des acides nucliques et utilisables pour le comptage cellulaire
(d'aprs le site MolecularProbes http://www.molecularprobes.com).
Colorants des acides nucliques Ex/Em Proprits et usages

4',6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 358/461 Semi-permable
Slectif des bases AT
Etude du cycle cellulaire, dtection des mycoplasmes
Colorant cellulaire et chromosomique
7-Aminoactinomycin D (7-AAD) 546/647 Peu permanent
Slectif des bases GC
CMF (cytomtrie en flux)
Acridine orange 500/526 (ADN) Permable
460/650 (ARN) Mesures du taux ADN/ARN
Marquage des lysozomes, CMF
Bromure d'thidium 518/605 Impermable
Intercalant du dsADN (double brin)
Coloration des cellules mortes
Colorant chromosomique
Electrophorses, CMF
Excitable par un laser Argon
Hoechst 33342 350/461 Permable
Slectif des bases AT
Coloration des cellules vivantes
Etude du cycle cellulaire
POPO-1 434/456 Impermable
Forte affinit avec l'ADN
Pr-colorant d'lectrophorse
SYBR Green I 494/521 Forte sensibilit l'ADN et aux oligonuclotides
Colorant post lectrophorse
Colorant cellulaire
SYBR Green II 492/513 Forte sensibilit l'ARN et aux ssADN (simple brin)
Colorant post lectrophorse
Colorant cellulaire
YO-PRO-1 491/509 Impermable
Electrophorses
Excitable par un laser Argon
YOYO-1 491/509 Impermable
Forte sensibilit l'ADN
Coloration chromosomique
Pr-colorant d'lectrophorse
Longueur d'onde d'excitation et d'mission (nm/nm)
Des tentatives d'automatisation des comptages ont t entreprises pour faciliter certaines
tudes comparatives. L'analyse d'image assiste par ordinateur permet de reconnatre diffrents
paramtres morphomtriques (longueur, largeur, surface, primtre), de quantifier les cellules et de
dterminer le volume cellulaire (Van Wambeke, 1995). Mise au point sur des cultures pures, cette
technologie n'est encore pas applicable pour le comptage d'chantillons environnementaux; en effet
la diversit des morphotypes, la taille des cellules (moins importante que pour les cultures pures), le
bruit de fond important li aux particules (sdiments, sol, matire organique) rendent l'analyse trs
fastidieuse et trs alatoire. L'amlioration des technologies d'acquisition d'image (microscopie
9
confocale, camra CCD), l'acclration de l'acquisition et du traitement des donnes (cartes

d'acquisition et microprocesseur) devraient permettre dans les annes venir de gnraliser l'analyse
d'image associe l'pifluorescence. Rcemment Blackburn et al., (1998) proposaient d'utiliser des
algorithmes de calcul fonds sur les rseaux neuronaux pour faciliter la quantification et l'analyse de
l'activit bactrienne d'chantillons de bactrioplancton prlevs en mer Baltique.
La cytomtrie en flux (CMF)
Cette technique apparue dans les annes 1980 pour dtecter des anomalies dans les cellules
animales et analyser le cycle cellulaire est dornavant couramment utilise pour quantifier les micro-
organismes en particulier dans les environnements liquides comme l'eau de mer (Joux et Lebaron,
1995; Monfort et al., 1995). Diffrents signaux optiques permettent de mesurer diffrents paramtres
cellulaires (cf. tableau 1.5) :
Tableau 1.5. Paramtres mesurs en CMF en fonction des signaux optiques analyss
Signaux optiques Paramtre mesur

Diffusion petit angle Taille cellulaire
Diffusion grand angle Rfringence cellulaire
Fluorescence Contenu en ADN, flux ioniques, potentiel
transmembranaire
La taille des cellules, le contenu en ADN, l'emploi de colorants particuliers ou plus rcemment
l'utilisation de sondes nuclaires ou d'anticorps spcifiques permettent de distinguer et de sparer les
diffrentes populations contenues dans l'chantillon. Utilise pour le comptage direct des cellules,
cette technique trs puissante et trs rapide (une fois mise au point) est applicable pour suivre le
mtabolisme cellulaire (potentiel membranaire, activit respiratoire, activit enzymatique par exemple)
et effectuer un tri cellulaire (et donc un isolement puisque la technique n'est pas destructive). La CMF
atteint toutefois ses limites pour des chantillons o la rpartition des cellules n'est pas homogne, o
on retrouve des morphotypes non rguliers tels que des filaments ou des structures en chanettes, o
de nombreuses particules (que l'on peut confondre avec des cellules) sont prsentes et o les
cellules sont associes fortement aux particules (particules de sols ou de chemine).
2.2.1.3 Les mesures de constituants cellulaires
Ces techniques ont pour objectif la quantification d'un constituant cellulaire et permettent
d'extrapoler la biomasse microbienne en fonction de la biomasse de ce constituant (Servais, 1995). Si
certaines de ces techniques sont trs prcises en terme de mesure (par exemple mesure de l'ATP),
elles sont par contre extrmement dpendantes de la qualit de l'extrapolation.
La mesure de l'ATP
L'adnosine-triphosphate peut tre utilise comme marqueur de biomasse active en cologie

microbienne et peut tre dtecte avec une trs forte sensibilit l'aide de techniques enzymatiques
10
de bioluminescence (Holm-Hansen et Booth, 1966; Hodson et al., 1976). Cette technique est
toutefois sujette des sources d'erreur lies : au stress de la cellule lors du prlvement et du
traitement de l'chantillon, la mthode d'extraction (rendement plus ou moins grand selon les
solvants utiliss), la destruction de l'ATP lors de l'extraction, l'inactivation des ractifs de dosages
par l'chantillon (notamment dans le cas des sdiments) ou la prsence d'ATP sous une forme libre
dans l'chantillon (par exemple lie aux argiles). De plus le taux d'ATP n'est pas directement corrl
aux cellules vivantes et l'extrapolation "biomasse d'ATP biomasse cellulaire" est trs dpendante de
l'tat physiologique des cellules (Poulicek et Danckers, 1995).
Mesure de l'Azote et du Carbone cellulaires
Par spectromtrie de masse il est possible de dfinir la quantit de N et C prsents dans

l'chantillon et d'extrapoler cette quantit celle contenue dans les cellules. Cette technique est trs
approximative et ncessite de travailler sur des chantillons trs propres.
Mesure des constituants de la paroi microbienne
Les acides muramiques contenus dans la paroi bactrienne peuvent tre extraits d'chantillons
environnementaux et analyss par HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) (Moriarty, 1977). La
quantit d'acide muramique dans la cellule est fonction du type de paroi (Gram ngative ou Gram
positive : 12 g.mg -1 en moyenne chez les Gram- et 44 g.mg-1 chez les Gram+). Cette technique n'est
pas applicable si on ne connat pas la proportion de Gram- et de Gram+ dans l'chantillon. Il faut de plus
tenir compte du fait que les spores contiennent 4 fois plus d'acide muramique que les cellules
vgtatives.
Lipopolysaccharides (LPS)
Les LPS protobactriens agissant comme endotoxines peuvent tre dtects de trs faibles
doses (10-20 pg/mL) en analysant leur effet sur les amaebocytes de Limule (Limulus polyphemus)
(Watson et al., 1977). Ce test est utilis en pharmacologie ou en microbiologie clinique pour dtecter
les micro-organismes prsents dans les fluides crbro-spinaux, le srum ou l'eau potable. Toutefois
la sensibilit de la mthode la rend trs dpendante des contaminants et sa spcificit la limite aux
milieux coloniss par des entrobactries.
2.2.1.4 L'analyse lipidique et les autres marqueurs molculaires
La technique FAME (Fatty Acid Methyl Ester) est fonde sur l'analyse des profils d'acides gras
obtenus par chromatographie en phase gazeuse. Chaque profil est spcifique d'une souche et peut-
tre compar avec d'autres profils contenus dans une banque de donnes (Drucker et Owen, 1971;
Moss et al., 1974; Guezennec, 1995; Bttiger, 1996). En plus de l'tablissement de profils lipidiques,
il est possible de rechercher un ou des lipides marqueurs spcifiques dont la prsence sera
caractristique d'un groupe de micro-organismes (par exemple tude des micro-organismes colonisant
11
diffrents coupons en milieu hydrothermal, Guezennec et al., 1998). Les rapports entre certains
marqueurs spcifiques pourront donner une indication sur l'tat physiologique de la communaut.
Cette technique peut donc tre utilise sur des souches isoles ou sur des environnements peu
diversifis afin de suivre l'volution d'une souche particulire. Par exemple la recherche des Nocardia
dans les boues actives (Cha et al., 1999) ou l'tude de souches isoles d'environnements naturels
(des sols (Ka et al., 1994) ou des sdiments pollus (Wagner-Dbler et al., 1998)). Lanalyse des
profils lipidiques est toutefois limite par un manque de banques de donnes uniformises, par un
nombre relativement faible de micro-organismes type tudis et par linfluence de ltat physiologique
cellulaire sur les profils observables.
En dehors des lipides, d'autres marqueurs molculaires peuvent tre utiliss pour accder la
diversit microbienne d'un chantillon (cf. tableau 1.6).
Tableau 1.6. Principaux marqueurs bactriens (d'aprs Guezennec, 1995)

Biomarqueurs Micro-organismes Remarques ou Exemples de molcules
Phospholipides (Acides Gras) Toutes cellules Mesure de la biomasse viable
Acides Hydroxyls (LPS) Bactries Gram - OH C14:0
Acides Gras Toutes cellules C16:17, C16:0
Sulfato-rductrices iC17: 17c, 10MEC16:0
Thio-oxydantes OH monoinsaturs, 10-11MeOC18:0
Plasmalognes Bactries anarobies essentiellement
Quinones Bactries arobies Ubiquinones
Bactries anarobies Mnaquinones
Anarobies facultatives Ubiquinones et Mnaquinones
Ethers de Glycrol Archaea
Acide Muramique Bacteria
Acide diaminopimlique Bactries Gram - et quelques Gram +
Acides amins (D) Bacteria D-alanine, D-glutamine
Hopanes Quelques Bacteria
Phytopigments Phototrophes
2.2.2 Mesure d'activit microbienne
2.2.2.1 Incorporation des radio-isotopes
Ils permettent de suivre la dgradation, la production ou la transformation d'un compos, d'en

estimer la vitesse ou la localisation. Pour ce faire on va suivre l'incorporation d'isotopes radioactifs 14C,
3 35 14
H, S. L'incorporation du CO2 permettra de suivre les mcanismes de photosynthse, ou la
14
production de CH4 permettra de suivre les mcanismes de mthanogense. La sulfato-rduction
35
pourra tre suivie par mesure de la conversion de SO 42- en H235S, alors que la mthylotrophie ou la
mthanogense actoclastique pourra tre suivie en mesurant la conversion du mthanol ou de
14 14
l'actate marqu au C en CH4 (Zehnder et al., 1979). Les mcanismes de chimioorganotrophie
14
pourront tre suivis par mesure de l'incorporation de sucres et d'acides amins marqus au C. La
3
synthse de l'ARN ou de l'ADN peut tre suivie par mesure de l'incorporation de la H-adnine (Karl,
1979, 1981). L'activit des cellules bactriennes peut tre suivie en mesurant l'incorporation de la 3H-
12
thymidine dans l'ADN chez la majeure partie des htrotrophes (Fuhrman et Azam, 1980, 1982;
35
Pollard, 1998), du SO 42- (Monheimer, 1972) ou de la 3H-leucine (Kirchman et al., 1985) dans les
protines pour l'ensemble du monde bactrien. Enfin les bactries nitrifiantes ou dnitrifiantes sont
15
analyses par mesure de l'isotope N (Goering et Dungale, 1966). Ces mesures peuvent tre
effectues dans la nature ou sur cultures isoles. On parle alors de microautoradiographie.
2.2.2.2 Mesure des ratios isotopiques
Dans la nature chaque lment chimique existe sous la forme de plusieurs isotopes de stabilit
variable. Les ratios entre ces isotopes sont fixes (par exemple le ratio 12C/13C=19/1), or les mcanismes
de transformation cellulaire vont favoriser l'incorporation d'un isotope (en gnral le plus lger) et les
composants synthtiss vont donc avoir un ratio isotopique diffrent du ratio naturel. De plus les
mcanismes mtaboliques vont incorporer diffremment chaque isotope et pour une molcule
donne un ratio isotopique pourra tre attribu chaque mtabolisme.
2.2.2.3 Mesures d'activits spcifiques
L'emploi d'analogues structuraux fluorescents permet de dtecter des activits enzymatiques

extra-cellulaires spcifiques comme celles des lipases, des phosphatases, des aminopeptidases.
L'incorporation de bromodoxyuridine (BrdU), un analogue de la thymine chez les bactries actives
(synthtisant de l'ADN) peut tre suivie par mthode immunochimique. L'ADN ainsi marqu peut tre
extrait et tudi (Urbach et al., 1999)
L'emploi du CTC (5-cyano-2,3-dotolyl tetrazolium chloride) ou de l'INT (2 (p-iodo-phenyl)-3-(p-
nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium chloride) permet de suivre l'activit respiratoire par l'apparition
(CTCCTC-formazan) ou la disparition (INT INT-formazan) d'un cristal fluorescent.
L'emploi du systme Biolog directement partir d'chantillon environnemental a t propos
par Garland (1997) puis par Smalla et al. (1998) en conjonction avec une tude en TGGE. Le
mtabolisme du carbone dans l'chantillon peut tre ainsi apprhend mais sans identifier les micro-
organismes qui en sont responsables.
2.2.2.4 Les microlectrodes
Si l'utilisation des microlectrodes tait une chose commune en neurophysiologie et en biologie

animale, ce n'est que trs rcemment (ces 15 dernires annes) que sous l'impulsion de Jrgensen et
de Revsbech elles ont t utilises en cologie microbienne (de Wit , 1995; Amann et Kuhl, 1998;
Cooper, 1999). On dispose actuellement de microlectrodes qui permettent de mesurer O2, pH, S2-,
NO2, CO 2, NO 3-, NH 4+ et potentiels redox. D'un diamtre de 2 100 m, voire 2 3 m pour les
lectrodes O2, elles ont une trs forte rsolution spatiale qui permet de suivre des microvariations
dans des environnements o de nombreuses populations microbiennes se succdent comme par
exemple: les sdiments ou les biofilms (Santegoeds et al., 1998 a, b; Okabe et al., 1999).
13
2.3 Une vue restreinte de la diversit

L'ensemble des techniques pralablement dcrites pour analyser la diversit microbiologique
d'un chantillon prsente l'inconvnient de ne donner qu'une vue restreinte ou une approximation
grossire de la diversit naturelle. Les techniques qui permettent d'accder individuellement chaque
organisme sont notamment entaches d'erreurs inhrentes aux mthodes culturales. Celles ci sont
connues depuis fort longtemps et ont t dcrites sous le terme de "la grande anomalie du comptage
sur boite" (Staley et Konopka, 1985).
Selon les auteurs entre 0,001% et 15% des bactries prsentes dans un chantillon sont
cultivables l'aide des techniques classiques (cf. tableau 1.7)
Tableau 1.7. Cultivabilit dtermine comme le pourcentage des bactries cultivables par rapport aux cellules totales dtermines par
comptage direct. (D'aprs Amann et al., 1995)
Habitat Cultivabilit (%) a

Eau de mer 0,001-0,1
Eau douce 0,25
Lac msotrophique 0,1-1
Eaux d'estuaires non pollues 0,1-3
Boues actives 1-15
Sdiments 0,25
Sol 0,3
a
Bactries cultivables mesures en tant qu'units formant des colonies (UFC)
Ce dcalage est attribuer diffrentes causes (Amann et al., 1995; Joux et Lebaron, 1995;
Ward et al., 1997):
Le milieu de culture choisi ne peut tre universel et l'ensemble des conditions de
l'environnement ne peuvent tre reproduites sur un seul et mme milieu de culture en
particulier pour les environnements forts gradients physico-chimiques.
Certaines cellules hors de leur environnement peuvent entrer dans un tat viable mais non-
cultivable (cf. tableau 1.8 pour des tudes ralises sur le milieu aquatique). Cet tat cellulaire
correspond une adaptation aux conditions de stress, notamment nutritionnel. Il
s'accompagne de modifications physiologiques et structurales dont le rtablissement n'est
pas simplement possible sur milieu synthtique. Cet tat peut tre maintenu de plusieurs jours
plusieurs annes.
Des populations infrieures numriquement peuvent supplanter des populations majoritaires
moins adaptes au milieu de culture.
Des populations enrichies en liquide peuvent ne pas se dvelopper sur milieu solide.
La quantit d'inoculum choisie pour l'enrichissement influence le type de cellules enrichies.
Des micro-organismes diffrents ayant des conditions de croissance similaires seront
difficilement distinguables.
14
Certaines cellules sont impossibles obtenir en culture pure comme c'est le cas des micro-
organismes symbiotes et syntrophes.
Tableau 1.8. Pourcentages de bactries actives par rapport au nombre total de bactries (comptes en pifluorescence), cit
dans Servais (1995)
Mthodes Environnements Pourcentages

Autoradiographies
3
H acides amins Marin (Kiel Bay) 41%
Marin (Chesapeake Bay) 45 76 %; 17 82 %
3
H glucose Marin (Kiel Bay) 2,3 56,2 %
3
H actate Marin (Chesapeake Bay) 49 59 %; 6 51 %
3
H thymidine Marin (Chesapeake Bay) 15 94 %
Marin (S. California Bight) 28 50 %
Marin (Cte du Danemark) 20 80 %
Rduction d'INT Marin (mer Baltique) 8 97%

Marin (Chesapeake Bay) 61 %; 25 94 %
Eau potable (France) 10 20 %
Lac Lman 0,6 26 %
Acide nalidixique Marin (Chesapeake Bay) 7 15 %

Marin (Porto Rico) 0,5 6 %
Des techniques permettant d'accder individuellement aux micro-organismes prsents dans un

chantillon en s'affranchissant des techniques culturales ont t proposes la fin des annes 1980.
Ces techniques sont fondes essentiellement sur l'analyse, non plus de la cellule, mais des acides
nucliques qu'elle contient sous la forme d'ADN gnomique ou d'ARN ribosomaux. Dans le chapitre
suivant je me propose de dcrire ces techniques aprs avoir prsent les molcules analyses (les
ARN ribosomaux) et les principes de phylognie. Les apports des techniques molculaires dans
l'analyse de diffrents habitats microbiens seront abords dans la seconde partie de mon introduction.
III Les acides nucliques en cologie microbienne
3.1 Le dveloppement des techniques molculaires

L'mergence des technologies molculaires en cologie microbienne est lie au
dveloppement de la phylognie molculaire la fin des annes soixante (Zuckerland et Pauling,
1965) ainsi qu'au choix de l'ARN ribosomique comme marqueur volutif la fin des annes soixante-
dix (Woese et Fox, 1977). Les premiers travaux d'cologie microbienne molculaire provinrent de
l'quipe de Pace qui utilisa les rsultats de Woese pour accder la diversit d'chantillons
environnementaux (Olsen et al., 1986; Pace et al., 1986a et b).
Un grand nombre de publications se sont proposes de dcrire sous forme de revue les
techniques molculaires employes en cologie microbienne. Parmi les plus anciennes on peut citer,
en plus des deux publications prcdentes : Turner et al., 1989; Olson, 1991; Pickup, 1991; Atlas et
15
al., 1992; Liesack et Stackebrandt, 1992; Olson et Tsai, 1992; Ward et al., 1992. Si nombre de ces
revues dcrivent avec enthousiasme les apports de ces techniques certains auteurs s'interrogent dj
sur les nouvelles limitations qu'elles impliquent.
3.1.1 La phylognie molculaire

Le concept de phylognie molculaire est n des travaux de Zuckerland et Pauling (1965) qui
les premiers considrrent les molcules comme des marqueurs de l'histoire volutive et
dvelopprent le concept d'horloge molculaire. Cette notion est lie la thorie neutraliste de
l'volution (Kimura, 1968). Les mutations s'accumulent au cours du temps dans le gnome et chez
des organismes diffrents. Le taux d'accumulation est dict par l'intensit de la pression de slection
et il est du mme ordre de grandeur dans des domaines homologues du gnome (rgion soumise la
mme pression de slection). Ainsi les gnes mutations rapides vont pouvoir reflter des
vnements volutifs rcents alors que les gnes trs conservs seront les tmoins d'un pass trs
loign. Sans pour autant remettre en cause la validit de la phylognie molculaire, la thorie
neutraliste de l'volution est fortement conteste (Goodman, 1981) voire nie (Li, 1993). La
diffrence de taux d'volution est alors attribue soit aux diffrences de temps de gnration soit aux
diffrences d'activit du mtabolisme (Li, 1993).
Prs de dix ans aprs les travaux de Zuckerland et Pauling, Woese et ses collaborateurs (Fox et
al., 1977; Woese et Fox, 1977) appliquent cette thorie l'tude de la phylognie bactrienne en
utilisant l'ARN ribosomique comme marqueur de l'volution. Les premires tudes portent sur
l'analyse de fragments de squences et dfinissent des signatures spcifiques qui scindent le monde
du vivant en trois grands domaines. La dichotomie du monde vivant en terme de Procaryote et
Eucaryote tait abandonne au profit d'une division tripartite constitue d'Eucarya, de Bacteria et
d'Archaea. Les tudes menes par la suite sur des squences entires confirmrent ces rsultats
(Woese, 1987; Woese et al., 1990).
3.1.2 L'ARN ribosomique

Les ARN ribosomiques (ARNr) sont forms de sous units pouvant se grouper en polysomes.
Ces lments sont caractriss par leur constante de sdimentation exprime en Svedberg (S). Chez
les organismes procaryotes, il existe des ribosomes 70S (de poids molculaire 2,5.106 Da (1 Dalton= 1
g/mol)) forms de 2 sous-units. La petite unit 30S de poids molculaire 0,93.106 Da est compose
de 21 protines et d'ARNr 16S (1541 nuclotides chez E. coli; 0,56.10 6 Da) (Moore, 1998). Lorsque
des rgions sur sa squence sont complmentaires (appariement AU et GC), le brin d'ARN se replie
sur lui mme pour former une structure en "pingle cheveux". Dans le ribosome les molcules
d'ARNr, replies en une structure secondaire, peuvent tre reprsentes partir d'tudes
comparatives des squences primaires (Gutell et al., 1994; Noller, 1984; Noller et Woese, 1981;
Woese et al., 1975). Une modification de la squence primaire de l'ARNr va influencer directement sa
16
structure secondaire. Pour maintenir la fonctionnalit de la molcule, la structure secondaire de l'ARNr

doit tre conserve dans l'ensemble du monde vivant par le biais de mutations compensatoires
(Hancock et al., 1988; Wheeler et Honeycutt, 1988; Otsuka et al., 1999).
3.1.3 Le choix de l'ARN 16S

Le choix de Woese et de ses collaborateurs s'est port sur la petite sous-unit de l'ARNr (16S
chez les Procaryotes et 18S chez les Eucaryotes) pour plusieurs raisons (Pace et al., 1985; Ludwig et
Schleifer, 1994; Ludwig et al., 1998) :
Sa prsence est universelle et il y accomplit le mme rle chez tous les organismes.
Sa squence est une alternance de domaines dont les vitesses d'volution varient, permettant
de comparer des espces trs proches sur des domaines hypervariables et des espces trs
loignes sur des domaines trs conservs.
Il a volu lentement.
Il n'est pas le rsultat de transferts latraux5.
Il est relativement facile isoler en raison de son abondance dans les cellules
Sa squence est facilement obtenue par des mthodes standard d'extraction et de
squenage. Les techniques d'extraction (Dorsch et Stackebrandt, 1992) et de squenage ont
t simplifies et optimises au fil des ans par l'introduction du squenage des ADNr (Bttger,
1989) plutt que des ARNr (Lane et al., 1985c), et l'utilisation du "cycle-sequencing" l'aide
d'amorces fluorescentes (Hiraishi, 1992; Ruano et al., 1993)
Il est prfr au 5S et au 23S en raison de sa taille moyenne et de sa structure secondaire moins
marque. Sa squence est suffisamment longue pour raliser des comparaisons statistiquement
cohrentes (cf. 3.2.2.2 calcul de la dviation standard).
L'ADN codant pour l'ARNr (ADNr) est organis en opron. Au sein d'une souche, cet opron
peut tre en copies multiples (de 1 14 selon les souches) et ces copies sont gnralement
identiques ou trs proches en raison des fortes pressions volutives gouvernant le maintien de la
structure secondaire de l'ARNr (Hillis et al., 1991). Il a toutefois t observ au sein d'un mme
organisme d'importantes variations entre les diffrentes copies de l'ADNr 16S (Clayton et al., 1995).
D'autre part des squences d'ADNr 16S correspondant des souches phnotypiquement trs
distinctes pouvaient s'avrer quasiment identiques (Fox et al., 1992). Rcemment Ueda et al. (1999)
attribuent ces diffrences entre copies d'un mme opron deux mcanismes : d'une part une
mauvaise incorporation durant la rplication de l'ADN et d'autre part des transferts horizontaux.
Le choix de l'ARNr 16S est parfois contest (cf. Partie 2 1.2), il serait donc prfrable d'tablir
les phylognies sur plusieurs gnes afin de ne conserver que l'arbre consensus toutes ces
phylognies. Des tentatives ont t entreprises (Gupta, 1998a; Huang, 1996). Mais le travail est
actuellement trs laborieux. Gageons que les amliorations des techniques de squenage :
5
Une tude rcente de complmentation de E. coli (dont l'ensemble des oprons rrn (7) avaient t inactivs) par des ARNr d'une
autre espce semble indiquer que la possibilit de transferts horizontaux de l'ARNr n'est pas exclure (Asai et al., 1999a et b).
17
augmentation du nombre d'chantillons traits simultanment, acclration des migrations dans des
microcapillaires, utilisation de puces de squenage ou de squenage par spectromtrie de masse,
permettront d'ici quelques annes d'accder l'ensemble du gnome des micro-organismes comme
nous accdons actuellement l'ARNr 16S.
3.2 L'analyse phylogntique

Une tude de diversit microbienne est fonde sur l'identification des micro-organismes
prsents dans un chantillon et donc sur la comparaison de ces micro-organismes avec d'autres
pralablement isols. Selon que l'on dispose uniquement de squences (ADNr ou gnes du
mtabolismes clons) ou de souches isoles, les comparaisons porteront uniquement sur ces
squences ou sur l'ensemble de l'ADN gnomique et sur des caractres phnotypiques. Dans tous
les cas il convient de dfinir des homologies entre les organismes comparer puis de raliser une
phylognie partir des caractres homologues.
On dfinit par homologues des caractres drivant d'un mme caractre ancestral. Ces caractres
sont orthologues s'ils ont conserv la mme fonction et paralogues si la fonction est diffrente.
Les caractres analyss lors d'une phylognie molculaire sont des squences d'acides amins
ou des squences d'acides nucliques. Ce sont des caractres discontinus qui peuvent donc tre
tudis comme des caractres discrets (absence ou prsence). L'extrmit des branches d'arbres
phylogntiques correspond aux taxons. Ces taxons constitueront des OTU (Unit Taxinomique
Oprationnelle) sur la base de caractres phntiques (Sokal et Sneath, 1963). C'est cette unit que
choisit Moyer et al. (1994) pour dfinir la structure et la diversit de la communaut d'un tapis microbien
hydrothermal sur un site du Pacifique. D'autres auteurs leur prfrent la dfinition de phylotype (ou
type phylogntique) qui s'applique plus une analyse fonde sur des caractres molculaire
(Haddad et al., 1994; Poltz and Cavanaugh, 1995).
3.2.1 Les mthodes de phylognie

Il n'existe pas de techniques qui permettent de raliser l'arbre phylogntique vrai. On ne
dispose que de moyens statistiques pour construire l'arbre "le moins faux possible".
Trois mthodes permettent de construire les arbres : l'analyse des distances (Fitch et
Margoliash, 1967), l'analyse de la parcimonie (Fitch, 1971), l'analyse du maximum de vraisemblance
(Felsenstein, 1981).
La premire est une mthode phntique c'est dire fonde non pas sur un critre
gnalogique mais sur un critre de similarit : on utilise alors des distances et il n'y a pas de tentative
pour tablir des relations d'ancestralit entre des squences diffrentes. Les deux autres mthodes
sont des mthodes cladistiques reposant sur des caractres discrets; on cherche par ces mthodes
tablir des relations gnalogiques entre les individus tudis. On dtermine alors le nuclotide le
plus probable pour une position donne sur la squence ancestrale. La mthode de parcimonie est
18
fonde sur un nombre minimal de mutations pour tablir les relations entre les espces et la mthode
du maximum de vraisemblance est une mthode statistique.
On considre qu'une phylognie est solide lorsque les arbres obtenus par les trois mthodes
sont concordants.
Toutefois diffrentes sources d'erreurs doivent tre prises en compte :
Dans les zones hypervariables, l'alignement de certains nuclotides est hasardeux car la
prsence d'une mme base sur deux squences diffrentes n'est pas lie obligatoirement une
homologie mais une homoplasie (cf. dfinition 3.2.1.1).
Les diffrences entre deux squences sont censes reprsenter un vnement dans une
ligne, or un mme site peut avoir chang plusieurs fois dans une ligne ou avoir chang une fois
dans deux lignes diffrentes.
Des "gaps" doivent parfois tre introduits dans des squences qui correspondent soit des
insertions soit des dltions. Ces modifications peuvent correspondre un ou plusieurs
vnements.
3.2.1.1 L'alignement
L'alignement est l'tape cruciale de l'analyse phylogntique. Il consiste mettre en regard des
nuclotides des positions homologues. Au sein de zones trs conserves, les zones homologues
sont facilement dtectables mais lorsque des vnements d'insertion et de dltion (frquents dans
l'ARNr 16S) surviennent, il convient de les rpercuter sur les alignements.
Au sein de zones hypervariables, des nuclotides peuvent s'avrer identiques alors que ceux-ci
ne sont pas homologues6 mais ont subi des phnomnes de rversion, de paralllisme ou de
convergence. Il convient alors, si ces squences sont impliques dans une structure secondaire, de
vrifier la prsence de mutation compensatoire assurant le maintien de cette structure. Des banques
de structures secondaires d'ARNr ainsi que des logiciels de dtermination de structures secondaires
d'ARN sont disponibles cet effet sur le Web (Neefs et al., 1993; Van de Peer et al., 1997, 1999).
Une fois l'alignement obtenu il faut choisir quelles positions sur la squence seront informatives
pour l'tude. Ce choix va tre dict par la proximit des squences prises en compte durant l'tude. Il
n'est par exemple pas informatif de choisir des portions de squences hypervariables sur un ensemble
de souches correspondant plusieurs genres voire plusieurs familles. Toutefois ces zones
hypervariables pourront n'tre que faiblement variables voire partiellement conserves si l'tude est
restreinte aux individus d'un mme genre (les zones deviennent homologues). Il va donc falloir crer
des masques qui spcifieront pour les programmes de phylognie les zones analyser.
6
Homoplasie : similarit qui ne drive pas d'un caractre ancestral.
Il existe trois sortes de phnomnes qui conduisent une homoplasie: rversion : changement dans une squence annul par un
second changement (A C A), paralllisme : changements parallles dans deux squences. convergence : des bases diffrentes
dans deux squences ancestrales peuvent tre semblables dans des squences contemporaines.
19
3.2.1.2 L'analyse des distances
Ce sont des mthodes rapides fondes sur le nombre de nuclotides diffrents entre deux
squences. Les mthodes diffreront en fonction de la faon dont les nuclotides seront pondrs,
dont les changements de bases (transition, transversion)7 seront traits, et des algorithmes utiliss
pour construire les arbres.
Le nombre de diffrences observes entre deux squences est toujours infrieur au vritable
nombre de diffrences en raison de phnomnes de mutation rverses et de mutations
multiples. Cette diffrence vritable ou distance volutive peut tre estime par une loi de
Poisson. Si P est la proportion calcule de nuclotides diffrents entre deux squences, alors
le taux de substitution selon Jukes et Cantor (1969) :
3
Ln1 P
4
Knuc =
4 3
Cette mthode sous-entend que toutes les positions sur une molcule changent la mme
vitesse, que les transitions et les transversions7 ont la mme probabilit et que chaque site
volue de manire indpendante. Ce qui n'est pas ncessairement le cas.
Selon Kimura (1980) le poids des transversions7 (proportion Q) est double par rapport celui des
transitions (proportion P). Alors le taux de substitution
1
Ln (1 2P Q)(1 2Q) 2
1
Knuc =
2
Van de Peer et al. (1994) proposent quant eux de tenir compte des "gaps" qui peuvent tre
introduits au cours de l'alignement. Pour P : proportion calcule de nuclotides diffrents entre
deux squences, G : nombre de "gaps" dans une squence par rapport une autre, T : nombre
total de nuclotides pris en compte dans l'analyse. Une srie de "gaps" adjacents, quel que soit
le nombre de "gap", est traite comme un "gap". Alors
3 4 G
Knuc = Ln1 P 1 +
G
4 3 T T
Les valeurs Knuc sont alors soumises des algorithmes produisant des arbres dont la longueur
des branches est minimise en fonction de la proximit des squences. Les mthodes principalement
utilises sont celles :
de UPGMA. Mthode agglomrative rapide mais peu prcise. On groupe les deux espces
les plus proches puis on construit une nouvelle matrice avec ce doublet, etc. (Sneath et Sokal, 1973).
Dveloppe l'origine pour raliser de la taxinomie numrique, cette mthode a tendance raccourcir
les branches des arbres lorsque l'on ralise une phylognie (distances gales des branches de
chaque cots du noeud).
de Fitch et Margoliash (1967) fonde sur le principe d'additivit (la distance entre deux
taxons est gale la somme des longueurs de branche les reliant). C'est une mthode prcise mais
7
Transition : passage d'une purine une purine (A G) ou d'une pyrimidine une pyrimidine (T C)
Transversion : passage d'une purine une pyrimidine et inversement.
20
qui ncessite un temps de calcul lev. Elle permet de corriger l'effet "d'crasement" obtenu par la
mthode UPGMA en acceptant des longueurs de branches ingales de chaque cot d'un noeud.
de Neighbor-joining (Saitou et Nei, 1987) la plus couramment utilise car elle permet
d'attnuer la mthode d'additivit en tenant compte des phnomnes d'homoplasie. Cette mthode
est rapide et prcise.
Dans une analyse de squence il faut aussi tenir compte du nombre de nuclotides analyss.
Plus celui ci sera important plus l'erreur ou la dviation standard sera faible. Cette dviation standard
dpend du nombre de rsidus (N), de la proportion de nuclotides diffrents (P), de la proportion de
nuclotides semblables (Q=1-P).
P.Q
Alors = 3 . L.
4 1
Q
4
Par exemple pour 50% de diffrence sur 1000 nuclotides =0,05 soit 10% et pour 100 nuc.
=0,15 soit 30%.
On considre que les mthodes de distance sont faciles et rapides raliser. Elles conviennent
une comparaison de squences proches, ayant un haut score de similarit. Toutefois ces mthodes
perdent de l'information (les squences sont rduites des distances) et ne conviennent pas la
comparaison de squences loignes.
3.2.1.3 Le maximum de parcimonie
Cette mthode est fonde sur le principe de l'conomie : l'arbre le plus parcimonieux sera celui
prsentant le moins de mutations pour passer d'une squence une autre. Le noeud qui relie deux
squences est une squence commune ou ancestrale (Fitch, 1971).
A partir de l'alignement total, un nombre rduit de sites informatifs est utilis pour construire des
arbres. On limine les sites qui ne varient pas (et parfois les sites qui diffrent par transition dans le cas
d'une parcimonie de transversion). En effet on ne considre comme informatifs que les sites qui
favorisent une topologie d'arbre parmi toutes celles possibles. Les diffrentes topologies d'arbres
sont testes et l'arbre le plus parcimonieux est conserv. Pour des comparaisons s'appliquant plus
de 8 squences les techniques de choix d'arbres par des recherches exhaustives peuvent tre
difficiles et trs longues, aussi on utilise une technique dite heuristique (plus rapide mais moins
prcise, par exemple le "branch swaping") afin de dfinir l'arbre le plus parcimonieux. Cette mthode
suppose que l'horloge volutive est constante or ce n'est pas toujours le cas et les rsultats obtenus
peuvent parfois tre errons. De plus il est frquent de gnrer des arbres aussi parcimonieux les uns
que les autres et le choix de l'arbre consensus est alors difficile.
3.2.1.4 Le maximum de vraisemblance
C'est une mthode statistique o les changements volutifs dans la squence nuclique
suivent des modles probabilistes. On recherche l'arbre possdant la plus forte probabilit pour qu'un
21
ensemble de donnes soit le rsultat de l'volution dcrite par cet arbre. Les ventualits de
mutations sont calcules pour chaque site en suivant le modle de Kimura dans le programme DNAML
dvelopp par Felsenstein (1973, 1981). D'une manire similaire la parcimonie la vraisemblance
assigne une squence ancestrale chaque noeud, mais elle ne suppose pas que l'volution ait t
parcimonieuse. Pour chaque site et chaque noeud tous les nuclotides possibles sont tests en
calculant dans tous les cas la probabilit pour que la squence observe soit produite avec une
longueur de branche donne. La premire version du programme DNAML ne permettait pas de traiter
beaucoup de squences la fois, aussi Olsen a amlior la technique en rendant possible le
traitement de plusieurs squences (FastDNAML) (Olsen et al., 1994a).
Pour mmoire on peut citer une quatrime mthode de phylognie qui tient compte de taux
d'volution variables au sein des diffrentes branches d'un arbre. Il s'agit de la mthode des invariants
dveloppe par Lake (1987).
3.2.1.5 Estimation de la robustesse des arbres
Des mthodes diffrentes de phylognie peuvent donner des arbres de topologies

diffrentes, aussi ne sont conservs, pour la construction de l'arbre final, que les branchements
retrouvs dans chacune des trois mthodes (Huelsenbeck et Hillis, 1993; Kim, 1993).
Mais il existe aussi des mthodes statistiques qui permettent de vrifier la stabilit
(robustesse) des arbres : le "jackknife" et le "bootstrap". Cette dernire mthode est la plus
couramment utilise. Elle consiste en la construction d'une nouvelle matrice de mme taille que la
matrice initiale en ralisant des tirages avec remise des diffrentes colonnes de la premire matrice
(Felsenstein, 1985). Aussi certaines colonnes de l'alignement pourront tre utilises plusieurs fois
alors que d'autres ne seront pas du tout utilises pour construire la nouvelle matrice. Un arbre
phylogntique est construit et cette opration est reproduite 50, 100 ou 1000 fois. Un arbre
consensus est calcul, portant sur chaque noeud de branches le pourcentage d'arbres o ce noeud
est retrouv. Plus le pourcentage est lev plus le noeud est considr comme robuste. Dans la
pratique un noeud est considr comme robuste lorsque le pourcentage est suprieur ou gal 90%.
Les noeuds ayant un pourcentage infrieur 50% ne sont pas pris en considration.
Les squences incluses dans une analyse peuvent influer sur la topologie d'un arbre. On
valide donc une topologie en incluant de nouvelles squences et en supprimant d'anciennes.
Enfin il est possible de vrifier la topologie en comparant les associations entre les squences
sur la base de signatures spcifiques comme des nuclotides spcifiques une position donne ou la
prsence (ou l'absence) de structures secondaires (par exemple des boucles, la longueur de structure
en pingle) une position donne.
Il reste toutefois difficile de dfinir " coup sr" si l'on est parvenu raliser une bonne
phylognie et il est souvent ncessaire de vrifier la congruence de la phylognie obtenue avec des
phylognies obtenues au cours d'autres tudes ou l'aide d'autres caractres.
22
Packages gnraux Construction, dessin, manipulation Calcul des distances Arbre consensus et comparaison d'arbres
d'arbres
- PHYLIP - PHYLIP - PAUP* - COMPONENT
- PAUP* - PHYLIP - RAPDistance - MULTICOMP - TREEMAP
- MEGA - PAUP* - MARKOV - RSVP - NTSYSpc
- VOSTORG - TreeTool - Microsat - DIPLOMO - PHYLIP
- Fitch programs - TreeView - OSA - DISPAN - PAUP*
- Phylo_win - Fitch programs - RESTSITE - NTSYSpc - REDCON
- Zharkikh Unix programs - NJplot - PUZZLE - Hadtree, Prepare and - TAXEQ2
- ARB - DendroMaker Trees - TreeCons
- DAMBE - Tree Draw Deck - Wisconsin Sequence Analysis Package (GCG)
- Phylodendron - AMP - DISTREE Manipulation et soumission des squences
- ARB - GCUA - DERANGE2
- unrooted - calcdist - POPGENE - PARBOOT
- DAMBE - TFPGA - REAP - Random Cladistics
- MacClade - MVSP - SOTA - Tree Gardener
- ClaDOS - RSTCALC - Genetix - GDE
- PDAP - BIOSYS-2 - RAPD-PCR package - MUST
- TreeTool - DISTANCE - Darwin - DNA Stacks
- sendbs - K2WuLi - SeqPup
- GeneStrut - Arlequin - Tonex
- DAMBE - DnaSP - ARB
- PAML - puzzleboot - MATRIX
Maximum de vraisemblance et Maximum de Parcimonie Mthodes des matrices de distance Bootstrap et autres tests de validation
mthodes associes
- PAUP* - PHYLIP - PAUP* - PHYLIP
- PHYLIP - Hennig86 - MEGA - MacT - PAUP*
- PAUP* - MEGA - ODEN - Fitch programs - Zharkikh bootstrapping programs
- fastDNAml - Tree Gardener - SINCAIDEN - ABLE - PARBOOT
- MOLPHY - RA - TREECON - DISPAN - ABLE
- PAML - Pee-Wee and Noname - RESTSITE - Random Cladistics
- Spectrum - PHYLIP - NTSYSpc - AutoDecay
- SplitsTree - PHYSYS - METREE - TreeRot
- PLATO - TurboTree - TreePack - RASA
- SPOT - Freqpars - TreeTree - DNA Stacks
- PUZZLE - Fitch programs - GDA - OSA
- Hadtree, Prepare and Trees - CAFCA - Hadtree, Prepare and Trees - DISPAN
- SeqPup - Phylo_win - Wisconsin Sequence Analysis Package (GCG) - TreeTree
- Phylo_win - sog - SeqPup - PHYLTEST
- PASSML - gmaes - PHYLTEST - Lintre
- ARB - LVB - Lintre - sog
- Darwin - GeneTree - WET - njbafd
- BAMBE - TAAR - Phylo_win - PICA95
- DAMBE - ARB - njbafd - TAXEQ2
- Modeltest - DAMBE - gmaes - BIOSYS-2
- TreeCons - GTREE, ADDTREE, and EXTREE - RAPD-PCR package
- VeryfastDNAml - DENDRON - TreeCons
- Molecular Analyst Fingerprinting - BAMBE
- DAMBE
- puzzleboot
Tableau 1.9. Logiciels ddis aux diffrentes mthodes de phylognie

L'essor de l'cologie molculaire bactrienne est indubitablement associ l'essor des outils
d'analyse phylogntique et des banques de donnes. La gnralisation de l'outil informatique dans
les laboratoires a permis de dmocratiser l'emploi de programmes de phylognie longtemps confins
dans des quipes disposant de centres de calculs surpuissants. Je me propose dans le chapitre
suivant de prsenter diffrents logiciels et sites internet ddis aux analyses de diversit.
3.2.2 L'informatique au service de la phylognie

Les ordinateurs le plus souvent utiliss pour raliser des calculs de phylognie sont des stations
de travail fonctionnant sous environnement UNIX. En complment ces machines il est dsormais
possible tout utilisateur disposant d'un ordinateur personnel de type PC ou Macintosh de faire
fonctionner sous le systme dexploitation Linux8 (http://www.linux.org) des logiciels rservs
jusqu'alors une station de travail UNIX.
D'autre part un grand nombre de programmes de phylognie ont t dvelopps pour
fonctionner sur Macintosh ou sur PC sous les environnements Mac Os, DOS ou Windows.
3.2.2.1 Les programmes de phylognie
Un grand nombre de logiciels sont disponibles pour raliser des phylognies partir
d'alignements d'acides nucliques ou d'acides amins (cf. tableau 1.9). Je m'appliquerai ici raliser
une liste non exhaustive des logiciels disponibles sur Macintosh et sur Station SUN. Une liste plus
complte est disponible sur le site de l'institut Pasteur (http://www.pasteur.fr/outils.html).
Les logiciels d'alignements
La premire tape d'une tude phylogntique est celle de l'alignement. Ce travail peut tre
effectu " la main" ou l'aide d'algorithmes regroups dans des programmes [Clustal V ou clustal W
(GDE), Fast align sequence, aligner v1.0 ou v2.0 (ARB), pileup (GCG)]. Les rsultats obtenus par ces
algorithmes ne sont malheureusement pas suffisamment fiables. Ils ncessitent toujours une
vrification de la part de l'utilisateur notamment dans le cas de l'ADNr afin de tenir compte des
structures secondaires de la molcule.
Sous environnement de type UNIX l'un des logiciels les plus ergonomiques est GDE (Genetic
Data Environment par Steven Smith). Il ncessite cependant une mmoire vive et vido importante
pour tre utilis sans trop de dsagrments. Ce logiciel peut tre utilis seul ou dans le package ARB
(voir plus loin).
8
LINUX est un environnement gratuit de type UNIX qui a t dvelopp l'origine par Linus Torvalds puis qui a t amlior par des
programmeurs du monde entier. C'est un environnement ouvert dont les sources sont disponibles gratuitement dans le cadre du projet
GNU General Public License (http://www.linux.org/info/gnu.html).
23
Seaview dvelopp par Manolo Gouy (Galtier et al., 1996) est un logiciel d'alignement multiple
trs convivial. Il traite aussi bien les squences d'acides nucliques que les squences d'acides
amins (http://pbil.univ-lyon1.fr/software/seaview.html). Dvelopp rcemment, il intgre les
principales formes d'acquisitions de fichiers et un alignement manuel ou automatique sur la base des
algorithmes Clustal et de Dot Plot. Ce programme est destin fonctionner en aval du logiciel
d'analyse de squences Phylo_Win (Galtier et al., 1996).
Le package ARB (voir plus loin) propose lui seul 4 logiciels d'alignement : GDE2.2., ALE,
ARB4 et ABRNT. Certains de ces logiciels (ARB4 et ABRNT) permettent de raliser lalignement en
tenant compte de la structure secondaire propre lADNr 16S.
Pour finir sur UNIX, TkDCSE est la version pour X-Window de DCSE (Dedicated Comparative
sequence editor)(http://indigo2.uia.ac.be/~peter/dcse).
Sur Macintosh il est aussi possible de raliser des alignements de squences grce au logiciel
S e q p u p . Il n'existe pas de mise jour rcente du logiciel.
Les Packages
PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 3.57c est historiquement l'un des premiers
ensembles de logiciels dvelopps pour l'analyse phylogntique des squences. Mis au point en
1986 par Joseph Felsenstein et ses collaborateurs de l'universit de Washington, ce package a
volu avec la mise au point de nouvelles techniques de phylognie (Felsenstein, 1989). Toutefois
son interface uniquement en mode texte n'est pas conviviale et on lui prfrera des programmes
comme ARB (voir plus loin) ayant intgr l'ensemble des mthodes de calcul de Phylip au sein d'une
interface beaucoup plus ergonomique.
GCG (Genetic Computer Group) (http://www.gcg.com) est un ensemble de logiciels trs
complet mais aussi trs coteux. L'ensemble des programmes peut tourner en mode texte, mais il est
aussi possible de les faire fonctionner sous une interface graphique (SeqLab) partir d'un Terminal X,
d'une station de travail ou partir de n'importe quel ordinateur grce une "interface www" nomme
SeqWeb. L'intrt de ce package rside dans la mise jour rgulire des logiciels et des banques de
donnes fournies avec ce programme. Toutefois cette dernire possibilit a t rendue caduque par
la disponibilit des banques sur le rseau.
Phylo_Win est un logiciel d'analyse phylogntique de squences (http://pbil.univ-
lyon1.fr/software/phylowin.html) (Galtier et al., 1996). Il accepte des alignements au format MASE
produits par Seaview. Il permet de raliser des analyses par les mthodes du "Neighbor-joining", du
maximum de parcimonie et du maximum de vraisemblance en permettant de raliser des
rechantillonages sur chacune de ces mthodes. Un grand nombre de facteurs de distance sont
disponibles (Jukes et Cantor, Kimura, Tajima et Nei, HKY, Galtier et Gouy (Galtier et Gouy, 1995),
LogDet pour les squences nucliques, la correction de Poisson pour les squences protiques). La
gestion des masques est trs facilement effectue la souris et les arbres construits sont aisment
exploitables par d'autres logiciels.
24
ARB est un package dvelopp par Olivier Strunk et Wolfgang Ludwig au sein de l'universit
technique de Munich (TUM) et qui est avant tout destin lanalyse de lARN ribosomique 16S. Il
fonctionne sous environnement UNIX mais une version a t rcemment dveloppe pour LINUX. Il
intgre un grand nombre de programmes dj existants tant en alignement (GDE) quen phylognie
(Phylip). ARB possde sa propre base de donnes de squences. Il s'agit dADNr 16S pralablement
aligns par les membres de la TUM. Cette base de donnes contient de plus toutes les informations
disponibles sous le format GenBank (dpositaire de la squence, publication de rfrence, groupe
phylogntique de la squence, etc.). Elle nest malheureusement pas mise jour suffisamment
rgulirement (dernire mise jour en mars 1997). Il est donc pralablement ncessaire lors de la
construction darbres de vrifier le dpt de nouvelles squences au prs du RDP ou auprs de
GenBank. Il est possible grce ce logiciel de raliser des arbres laide des trois mthodes
phntique et cladistiques. Larbre consensus peut tre par la suite dit laide du logiciel Xfig fourni
avec le package puis import sur Macintosh ou PC sous un format poscript (type PS ou EPS).
Mais lun des atouts majeurs de ce logiciel est le programme trs ergonomique de construction
de sondes nucliques. En choisissant dans la banque de donnes dARB les squences cibles, il est
possible de construire puis de vrifier la validit des sondes. Lorientation "procaryotes-ADNr 16S" fait
d'ARB un outil idal pour les microbiologistes.
3.2.2.3 Les outils danalyse en ligne et les bases de donnes
Les outils d'analyse en ligne et les banques de donnes se sont considrablement dvelopps
ces 5 dernires annes avec la gnralisation de l'accs Internet9 au sein des laboratoires.
Dans un premier temps cantonnes un change de donnes uniquement en mode texte via
le courrier lectronique (e-mail) ou ftp (file transfer protocol), les analyses sont dsormais possibles via
des sites http (hypertext transfert protocol) avec une interface beaucoup plus ergonomique base sur
le html (hypertext markup language). L'information tant disponible tous il devient alors possible de
centraliser la source d'information, de mettre jour plus facilement les banques, de stocker les
donnes sur une seule machine (The Integration of Microbial Databases (site web), 1995; Burks,
1999; FitzGerald et Blacke, 1998; Nierlich, 1996).
En France le site de l'institut Pasteur (http://www.pasteur.fr) fournit une liste des logiciels
disponibles pour la comparaison et l'alignement de squences, les analyses phylogntiques, la
recherche de gnes et de rgions codantes, la recherche et l'extraction de motifs, les HMM (Hidden
Markov Model), les analyses de structures secondaires et tertiaires des acides nucliques et des
acides amins (par exemple pour l'ARNr la Mfold home page (Zuker et Jacobson, 1998)). Le
9
Internet est n il y a un peu plus de 20 ans de la volont du dpartement de la dfense amricaine de mettre en rseau l'ensemble de
ses services de recherche militaire afin de rpondre le plus rapidement possible d'ventuelles attaques nuclaires, ce premier rseau
s'appelait ARPAnet. Un protocole de communication est alors dvelopp afin de permettre la communication entre les ordinateurs
(quelle que soit leur marque) : le protocole IP (Internet Protocol). Dix ans plus tard le dveloppement des rseaux internes (Ethernet
local area network, ou LAN) et la pression du march (de la part des universit amricaines notamment) permettent l'accs de
n'importe quel utilisateur quip d'un ordinateur et d'un modem ce rseau devenu un rseau de rseaux ou World Wide Web.
25
BioCatalog de l'EBI (European Bioinformatics Institute) rfrence quant lui la plus grande partie des
logiciels pour la biologie (UNIX, Macintosh, PC) (http://www.ebi.ac.uk/biocat).
Dans le cadre d'une analyse de squence d'ARN ribosomique deux sites sont indiqus :
Le site du NCBI (National Center for Biotechnology Information) va permettre d'accder
l'ensemble des squences publiques dposes dans GenBank (Benson et al., 1999) et dans l'EMBL
(Stoesser et al., 1999). En dcembre 1999 plus de 4,9.10 6 squences et 3,8.10 9 bases taient
disponibles dans cette banque de donnes (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Il est possible via ce site de
rcuprer des squences (Entrez), de soumettre de nouvelles squences (BankIt et Seqin) ou de
comparer des squences avec celles prsentes dans GenBank (BLAST Basic Local Alignment Search
Tool, Altshul et al., 1997; Tatusova et Madden, 1999). Ce site permet de plus d'avoir accs au projet
PubMed grant la banque de donnes dveloppe par la NLM (National Library of Medecine)
regroupant les 9.106 rfrences bibiographiques MEDLINE et PreMEDLINE.
Le site du RDP ou Ribosomal Database Project (http://www.cme.msu.edu/RDP/html/
index.html) (Maidak et al., 1999) est une base de donnes et un ensemble de logiciels d'analyse en
ligne essentiellement destins l'analyse de l'ADNr 16 et 18S. Cette banque, gre par le CME
(Center for Microbial Ecology) est rgulirement mise jour partir des squences soumises
GenBank mais aussi par des squences (trs souvent des clones environnementaux) soumises
directement par les utilisateurs. En plus de la banque de squences d'ARNr, le RDP met la
disposition des scientifiques un ensemble de programmes permettant :
de comparer une ou plusieurs squences avec celles de la banque de donnes,
de raliser un premier alignement sommaire,
de placer des squences dans un arbre phylogntique rudimentaire,
de vrifier la nature chimrique des squences analyses,
de vrifier la validit d'une sonde
d'accder aux banques de donnes de squences d'ADNr 16S et 23S10.
Il existe aussi des banques de donnes concernant les micro-organismes cultivs. Ces banques
sont disponibles sur le site de l'ATCC (http://www.atcc.org) et de DSMZ (http://www.dsmz.de/). Le site
du Bergey's Manual Trust (http://www.cme.msu.edu/bergeys) donne aussi accs la liste des
souches disponibles, aux espces, genres, familles reconnus ou incertains, ainsi qu' un arbre
phylogntique type regroupant les souches isoles et les squences provenant d'ARNr clons
partir d'chantillons environnementaux. Un projet de normalisation de cette liste sous la forme d'une
base de donnes plus aboutie est en cours sous le nom du PDP Phenotypic Database Project.
10
En complment du site du RDP deux banques inventorient les structures secondaires des petites sous-units de l'ARNr (Van de
Peer et al., 1999) et des grandes sous-units de l'ARNr (de Rijk et al., 1999)
26
Figure 1.3. Utilisation des techniques molculaires
danalyse de lADNr 16S pour ltude de la
diversit microbienne.
Dessin daprs Amann et al., 1995
Environnement
Hybridation in-situ Echantillon
Enrichissement
Hybridation sur cellule totale cellulaire
Acides nucliques extraits

Dot Blot quantitatifs ADN ARNr ADN
ADNr
Southern amplifis PCR c ADNr
Sondes nucliques Dot Blot Clones contenant ADNr

/colonies
Squenage
Squences dADNr
+ + Analyse comparative
Banques de donnes
HYBRIDATION SEQUENCAGE
Aprs m'tre intress au choix des acides nucliques comme marqueurs de la diversit
microbienne et l'analyse des squences d'acides nucliques, je me propose de dcrire les
diffrentes mthodes molculaires couramment utilises en cologie microbienne.
3.3 Les mthodes molculaires

Les techniques molculaires peuvent en principe s'appliquer tous les gnes pour peu que
ceux-ci rpondent aux principes d'universalit et d'volution que nous avons voqus
prcdemment. Toutefois nous nous attacherons dans cette partie dcrire les principales
techniques mettant en jeu l'ARNr 16S. Les hybridations ADN/ADN et la mesure du G+C% d'un ADN
gnomique sont elles aussi des mthodes molculaires, mais elles s'appliqueront plus la
caractrisation d'une souche isole qu' l'tude directe d'un environnement ( l'exception de
l'approche prsente dans le 3.3.4.1).
3.3.1 Le clonage et le squenage des ARNr

Cette technique est l'une des premires avoir t employe pour s'affranchir de toute tape
de culture. Les diffrentes tapes de cette technique sont regroupes dans la partie droite de la figure
1.3. Elles consistent : extraire l'ADN ou l'ARN total de l'chantillon environnemental, amplifier
spcifiquement les gnes codant pour l'ARN ribosomique, puis cloner le produit d'amplification et
enfin, squencer et analyser les clones de la banque.
3.3.1.1 Historique de la mthodologie
Le rsultat des premires tudes portant sur l'analyse de l'ARN ribosomique est report dans la
seconde partie de ce manuscrit. Ces tudes consistaient analyser la communaut microbienne
d'chantillons naturels par squenage des ARNr 5S directement extraits de l'chantillon. Elle
portaient sur l'analyse : de la communaut symbiotique de vers hydrothermaux considrs comme
chmo-autotrophiques (Stahl et al., 1984), de bactries colonisant une source chaude terrestre (Stahl
et al., 1985) et des micro-organismes colonisant les bassins de biolixiviation du cuivre (Lane et al.,
1985b). Le manque de pouvoir rsolutif de l'ARNr 5S (seulement 120 pb) incita les chercheurs
analyser les ARNr 16S.
La premire stratgie a t d'extraire l'ADN gnomique total et de le cloner dans une banque
phagique. Les phages contenant des fragments d'ARNr ont t par la suite cribls l'aide d'une sonde
spcifique et les clones ont t squencs. Il a t possible l'aide de cette technique d'analyser une
communaut picoplanctonique marine (Schmidt et al., 1991). Cette technique a t reprise par Stein
et al. (1996) pour accder des gnes du mtabolisme partir du mme type de banque phagique.
Afin de rduire l'tape de criblage Giovannoni et al. (1990b), proposrent l'aide d'amorces
spcifiques d'amplifier les gnes codant pour l'ARNr 16S (ADNr 16S) puis de cloner le produit
d'amplification. Afin d'accder la population rellement active de l'chantillon Weller et Ward (1989)
27
proposrent de travailler sur les ADNc transcrits l'aide d'une rverse transcriptase partir du pool
d'ARNr 16S. Amann et al. (1992a) modifirent cette technique en ajoutant une tape de PCR aprs
l'utilisation de la reverse transcriptase afin de travailler directement sur des ADNr (cf. figure 1.3).
L'approche propose par Giovannoni et al. (1990b) est actuellement la plus utilise. Les
modifications qui y ont t apportes s'attachent rduire les biais inhrents cette mthodologie en
optimisant les techniques d'extraction d'ADN, d'amplification (jeu d'amorces, cycle, etc..) et d'analyse
de la banque (RFLP, squenage total).
Nous reviendrons en dtail dans la troisime partie de ce manuscrit sur les diffrentes tapes de
cette mthode et le chapitre 3.4 s'attachera dcrire les biais qui peuvent entacher une tude de
diversit.
3.3.1.2 L'chantillonnage et l'extraction d'ADN
Il faut considrer que l'tude refltera la diversit de l'chantillon avant de reflter, par
extrapolation, celle de l'environnement tout entier. Aussi l'chantillon devra reprsenter le plus
fidlement possible l'environnement tudi.
Un grand nombre de dispositifs d'chantillonnage sont disponibles selon que l'on travaille sur
des chantillons solides ou liquides, profonds ou de surface. L'accessibilit du site d'chantillonnage
est la premire donne du problme. Les sources hydrothermales profondes ne sont par exemple
accessibles qu' un nombre rduit de submersibles scientifiques. Pour les chantillons des sols, il est
possible d'effectuer des prlvements par carottage partir de la surface ou d'utiliser des puits pour
accder des chantillons profonds (Pedersen, 1996). Pour des chantillons liquides il est possible
de raliser des prlvements ponctuels (seringue titane, bouteille NIO, bouteille Niskin) ou de travailler
sur de grands volumes pour accder une diversit plus importante, notamment aux souches rares. Il
est alors ncessaire de concentrer par filtration les chantillons (Bej et al., 1991; Giovannoni et al.,
1990a; Sommerville et al., 1989).
Le mode de conservation de l'chantillon pourra lui aussi influer sur la diversit observe. Il
faudra conserver les cellules intactes, c'est dire les fixer si on souhaite raliser des hybridations in situ
ou les maintenir dans des conditions proches de celles o elles se dveloppent (pH, potentiel redox).
Afin de limiter la dgradation des acides nucliques durant le stockage, il faudra limiter l'action des
DNAses ou des RNAses qui sont libres dans le milieu ds que les cellules sont altres. Pour ce
faire il faudra conserver les cellules au froid, dans l'thanol ou dans des tampons bloquant les DNAses
et les RNAses (comme le Guanidide Iso Thiocyanate). La solution idale reste de pouvoir extraire l'ADN
des chantillons ds que ceux ci sont collects afin de rduire au minimum le temps de stockage de
l'chantillon.
La mthode d'extraction des acides nucliques devra lyser de manire efficace l'ensemble des
parois microbiennes, sachant que la paroi des Gram + est plus rsistante que celle des Gram- et que les
Archaea ne possdent pas de peptidoglycane et sont donc insensibles l'action du lysozyme. De
plus, des composants prsents dans l'chantillon peuvent rduire l'efficacit de l'extraction (matire
organique, mtaux, etc.) en se fixant sur l'ADN libr des cellules. Il est souvent ncessaire de
28
combiner des mthodes de lyse physique (pilon et mortier, cycles de conglation-dconglation,

etc.), de lyse chimique (dtergents, phnol, etc.) et de lyse enzymatique (lysozyme, protinase K,
etc.) afin d'extraire le plus efficacement possible l'ADN contenu dans l'chantillon.
Une technique particulire de purification des ADN bactriens a t propose par Neimark et al.
(1998) dans le cadre de l'tude de l'agent (non cultivable) du poumon gris (GLA: Grey Lung Agent).
Aprs extraction des ADN, ceux-ci sont spars par lectrophorse en champ puls. Il est ainsi
possible de travailler sur des chromosomes entiers.
Deux autres techniques ont t proposes dans le cas d'tudes de milieux peu complexes pour
isoler spcifiquement les micro-organismes sans utiliser de mthodes culturales. Ces techniques
reposent sur la micromanipulation des micro-organismes ou sur leur extraction du milieu d'tude. Dans
le cadre de l'tude des bactries symbiotes du poisson chirurgien (famille des Acanthuridae), Angert
et al. (1993) ont isol le symbiote par micromanipulation. La taille de la bactrie (80 x 600 nm) a permis
d'utiliser cette technique habituellement applique aux Eucarya. Hubert et al. (1995) ont utilis quant
eux les pinces optiques pour isoler une Archaea hyperthermophile pralablement dtecte par
extraction et squenage des ADNr 16S partir d'chantillons de la source chaude d'Obsidian Pool
(Barns et al., 1994). Le micro-organisme tait minoritaire dans les cultures d'enrichissement et
chappait toutes les tentatives d'isolement (Hubert et al., 1995). La technique d'isolement utilise
est fonde sur la dtection du morphotype l'aide de sondes nuclotidiques spcifiques, puis sur la
recherche du morphotype dans des cultures d'enrichissement. Les cellules sont alors prleves dans
le milieux l'aide d'un LASER (Ashkin et Dziedzic, 1987)11. La seconde mthode, employe pour
tudier les symbiotes des vers hydrothermaux, consistait isoler les cellules bactriennes des cellules
htes sur un gradient de Ficoll aprs centrifugation (Lane et al., 1985a).
3.3.1.3 L'amplification et le clonage
Chaque tape de la PCR devra tre prise en compte afin d'optimiser les conditions
d'amplification (voir pour revue Arnheim et Erlich, 1992; Steffan et Atlas, 1991).
L'utilisation de l'ADNr 16S permet de concevoir des amorces de PCR aux extrmits 5' et 3' de la
molcule avec des spcificits plus ou moins importantes (Brunk et al., 1996; Marchesi et al., 1998).
On utilise gnralement plusieurs jeux d'amorces universelles afin de raliser des banques de
squences de Bacteria, d'Archaea et parfois d'Eucarya (Hugenholtz et al., 1998a par exemple). Dans
certaines tudes il a t possible d'amplifier spcifiquement des squences d'ADNr 16S
correspondant un type mtabolique dfini (les BSR, Devereux et Mundfrom, 1994; Devereux et al.,
1996). En jouant sur les conditions de PCR (enzyme, nombre de cycles, temprature, etc.) il est
possible par la suite de modifier la spcificit de la raction et de diminuer les risques de cration de
11
L'utilisation des pinces optiques touche de nombreux domaines de la biologie. Ces pinces sont utilises pour travailler notamment
sur les chromosomes (sparation des chromosomes lors de la division cellulaire), les mitochondries ou les microfilaments. Il est
galement possible d'utiliser le LASER la fois comme pince (maintien de la cellule) et comme ciseaux (dcoupage prcis de la
cellule) (Berns, 1998). Rcemment Arai et al. (1999) sont parvenus l'aide de pinces optiques faire des noeuds dans des filaments
d'actine et d'ADN et ont prouv que l'ADN tait plus solide que l'actine.
29
chimres (voir 3.4.2.2). Les biais inhrents la PCR rendent difficile une approche quantitative mme
si de nombreuses techniques ont t proposes (Ferr et al., 1994 pour revue; Lee et al., 1996; Poltz
et Cavanaugh, 1997). Le dveloppement des techniques de PCR quantitative en temps rel permet
dsormais de suivre l'volution des produits d'amplification l'aide d'amorces marques12 (Patel et al.,
1998; Pahl et al., 1999).
Le clonage des produits de PCR est l'tape pralable au tri. Dans la mesure o les fragments
amplifis sont de petite taille (1,5 Kpb pour l'ADNr 16S) il est possible de les cloner dans des vecteurs
plasmidiques (gnralement drivs du plasmide pBluescript). Il est par contre ncessaire de raliser
des banques phagiques lorsque l'on souhaite cloner l'ensemble de l'ADN gnomique d'un chantillon
pour accder des gnes du mtabolisme.
Le clonage peut tre ralis directement sur produits de PCR en utilisant le principe du TA-
cloning (Mead et al., 1991) ou aprs digestion du produit de PCR et d'un vecteur afin de raliser des
clonages en bouts francs et ou en bouts cohsifs. L'avantage de la dernire mthode est de connatre
l'orientation du fragment insr, mais le traitement du produit de PCR par des enzymes peut entraner
une digestion partielle de ce dernier. Il n'est alors pas possible d'accder la squence du gne dans
son intgrit.
3.3.1.5 Le criblage et le squenage
Une fois les fragments clons il est ncessaire de vrifier la nature de l'insert et sa taille. Il est
alors possible d'hybrider directement les colonies l'aide de sondes spcifiques des ARN
ribosomiques ou plus simplement extraire le plasmide ou de ramplifier directement sur colonies
l'insert l'aide d'amorces spcifiques du plasmide flanquant le site de clonage (T3, T7, M13, reverse,
universelle par exemple).
Afin de rduire le cot de squenage de l'tude il peut tre intressant de raliser un premier
tri parmi les clones de la banque. Des classes, ou OTU (Moyer et al., 1994), ou phylotypes (Ward et al.,
1998) peuvent tre dfinis par comparaison des profils de restriction des inserts coups l'aide
d'enzymes ttramriques (RFLP, AFLP, ARDRA). Le choix des enzymes de restriction va conditionner
la qualit du tri (Moyer et al., 1996). Il est possible de coupler la RFLP un marquage fluorescent. On
observe la migration des fragments de restriction marqus sur un gel de squenage: T-RFLP (Liu et
al., 1997; Pukall et al., 1998; Chin et al., 1999; Marsh, 1999). On peut aussi analyser les profils
obtenus aprs squenage des diffrents clones sur une seule base (Ward et al., 1990b). Suzuki et
al. (1998) analysent quant eux le polymorphisme de taille de fragments d'ADNr 16S amplifis.
Rcemment la diminution des cots ainsi que la simplification des techniques de squenage a
permis de gnraliser l'analyse de la totalit de la banque par squenage. On squence alors les
12
Les entreprises BioRad et Perkin Elmer proposent par exemple des systmes de PCR quantitative cl en main (iCycler et Gene
Amp, TaqMan respectivement).
30
clones l'aide d'une seule amorce dans un sens (par exemple l'amorce 515F (nos tudes) ou l'amorce
533F (Hugenholtz et al., 1998a).
L'utilisation de squenceurs automatiques ou le recours des entreprises ralisant le
squenage " faon" a permis de grandement faciliter l'tape de squenage dans une analyse de
diversit. L'utilisation de jeu d'amorces marques rparties sur l'ensemble de l'ADNr 16S tous les 200
400 pb (cf. figure 1.4) permet de couvrir l'ensemble de la molcule en lecture double ou triple
(Edwards et al., 1989).
Figure 1.4. Exemple de jeu d'amorces permettant de couvrir l'ensemble du gne de l'ADNr 16S
L'analyse de la squence est ralise l'aide des techniques de phylognie classique

(mthodes de distance, de maximum de vraisemblance et de maximum de parcimonie) en comparant la
squence du clone avec les squences des micro-organismes dposes dans les banques de
donnes (Maidak et al., 1999).
3.3.2 Les sondes nucliques

A la diffrence des techniques d'analyse par extraction et squenage de l'ADNr 16S,
l'utilisation des sondes nucliques permet d'accder individuellement chaque cellule. Cette
technique implique la formation d'un duplex entre une sonde nuclique et un ARNr cible. Comme
l'indique la figure 1.3, les sondes peuvent tre utilises aussi bien sur de l'ADN fix sur membrane (Dot
ou Slot Blot aprs Southern), directement sur les colonies de clones (Grunstein et Hogness, 1975),
sur des cultures d'enrichissement ou sur souche pure (Whole-cell hybridation) ou sur des chantillons
naturels (hybridation in situ). Pour marquer la sonde on utilise soit des radiolments (ATP-35S ou ATP-
32
P) (Giovannoni et al., 1988) soit des enzymes (Amann et al., 1992b) soit des marqueurs fluorescents
(fluorescine, rhodamine, CY3, etc.); on parle alors de FISH (Fluorescent In-Situ Hybridization) (Delong
et al., 1989; Amann et al., 1990 a et b; Stahl et Amann, 1991). On retiendra deux publications
dcrivant en dtail les principes et les procdures d'hybridation sur membranes et cellules (Stahl et
Amann, 1991; Johansson, 1996).
3.3.2.1 La construction des sondes nucliques
La succession de domaines, de conservs trs variables, sur la molcule d'ADNr 16S permet
de disposer de sondes au spectre plus ou moins large (de l'espce au domaine cf. tableau 1.10). La
spcificit de la sonde s'accrot mesure qu'elle s'hybride dans un domaine de plus en plus variable.
31
Tableau 1.10. Exemple de diffrentes sondes ayant des niveaux de spcificit diffrents.
Nom de la sonde Spcificit Rfrence

S-*-Univ-1390-a-A-18 universelle Zheng et al., 1996
S-D-Bact-0338-a-A-18 domaine: Bacteria Amann et al., 1990a
S-D-Arch-0915-a-A-20 domaine: Archaea Amann et al., 1990b
S-K-Cren-0499-a-A-18 royaume: Crenarchaeota Burgraff et al., 1994
S-Sc-aProt-0019-a-A-17 sous classe: Proteobacteria Manz et al., 1992.
S-G-Dsbb-0660-a-A-20 genre: Desulfobulbus Deveureux et al., 1992
S-S-Thip-0829-a-A-21 espces: Thioplaca araucae, T. chileae Teske et al., 1995
Une grande partie des sondes ont t dessines pour tre spcifiques de l'ARNr 16S et un
grand nombre de publications dcrivent la construction de ces sondes 13, par exemple : sondes
gnrales (Amann et al., 1990b), sondes pour mthanognes (Raskin et al., 1994a), sondes pour les
diffrentes sous-classes des Proteobacteria (Manz et al., 1992) ou pour les Proteobacteria sulfato-
rductrices (Devereux et al., 1992). Des auteurs ont cibl d'une manire similaire l'ARNr 23S (Ludwig
et al., 1994; Trebesius et al., 1994) ou les gnes codant pour des activits mtaboliques spcifiques
(Ogram et Sayler, 1988). Une technique alternative de construction de sondes a t propose par
Fani et al. (1993). Ces derniers ont utilis comme sondes des fragments spcifiques produits par
RAPD. Ces fragments pouvaient alors cibler l'ensemble du gnome. Une technique de construction
de sondes par hybridation soustractive a t propose par Mau et Timmis (1998) pour obtenir des
sondes trs spcifiques (d'un clone par exemple) en limitant ainsi le nombre de squences identiques
analyser.
L'accessibilit de la sonde l'ARN est le second facteur qui va influer sur la qualit de la sonde.
La forte structure secondaire de la molcule d'ARNr (Gutell et al., 1994) impose des contraintes
structurales d'hybridation qui peuvent rduire considrablement l'intensit du signal (Fuchs et al.,
1998).
L'un des paramtres importants de l'hybridation est la temprature de fusion (Tm). Cette dernire
dfinit pour un oligonuclotide la temprature d'quilibre laquelle la moiti du duplex sonde-cible est
dissocie. La Tm est dpendante de la concentration en oligonuclotides mais est indpendante du
temps (situation d'quilibre). La Td ou temprature de dissociation est la temprature pour laquelle
50% du duplex reste intact pour une dure de lavage dfinie dans des conditions de non-quilibre
(donc Td peut tre diffrent de T m). La Td est la variable exprimentale de rfrence, elle dfinit la
temprature de lavage de posthybridation pour laquelle 100% des hybridations non spcifiques sont
dissocies (cf. tableau 1.11).
Une fois la sonde construite il est ncessaire de la valider en vrifiant sa spcificit dans un
premier temps sur Dot blot contre des ARN ou des ADN de souches s'hybridant ou non avec la sonde
13
Une banque de squence de sondes (OPD: Oligonucleotide Probe Database) a t cre et est disponible sur le rseau
(http://www.cme.msu.edu/opd/). Elle n'a malheureusement pas t remise jour rcemment (Alm et al., 1996).
32
puis en testant la sonde sur culture pure ou mlange de culture pure (voir par exemple Harmsen et al.,
1997b).
Tableau 1.11. Caractristiques de la temprature de dissociation (Td)
La Td est dtermine par : La Td est dpendante de :

le nombre de liaisons hydrogne entre bases la structure du duplex,
complmentaires, la squence de la chane,
le degr de "stacking" (change d'lectrons) des la longueur de la chane,
bases adjacentes sur une mme chane, le nombre, le type et la position des msappariements,
les interactions entre les phosphates (chargs la prsence de bases dsapparies en fin de chane,
ngativement) les cations en solution.
des conditions de lavage et d'hybridation.
3.3.2.2 L'utilisation des sondes en dot blot
Les sondes marques peuvent tre utilises en dot blot pour qualifier voire quantifier un type
de micro-organismes (s'hybridant avec la sonde) par rapport une population totale dont l'ADN serait
fix sur membrane. La prsence ou l'absence du micro-organisme sera lie l'hybridation ou non de la
sonde. L'intensit de l'hybridation par rapport une sonde plus gnrale (par exemple une sonde
universelle ou domaine spcifique) pourra reflter la quantit de micro-organismes prsents dans
l'chantillon. Cette intensit est toutefois fortement lie au nombre de ribosomes dans la cellule
(variant de 103 105 selon les organismes et l'tat cellulaire) et la qualit d'extraction d'ADN.
3.3.2.3 Les sondes en hybridation in situ
A la diffrence des hybridations sur colonies ou sur membrane, les hybridations sur cellules
entires permettent d'accder directement l'ARNr sans endommager la structure paritale de la
cellule et donc d'accder en plus du caractre phylogntique ou mtabolique li la sonde un
caractre morphologique. Olsen et al., (1986) proposent les premiers d'utiliser les sondes marques
pour identifier et compter les cellules dans des chantillons environnementaux. Le premier essai est
ralis l'aide de sondes radioactives (Giovannoni et al., 1988). L'hybridation consiste en une
premire phase de permabilisation de la cellule et de fixation des acides nucliques l'aide de
paraformaldehyde le plus souvent. Puis les cellules sont fixes sur une lame enduite de glatine. Elles
sont incubes sur lame en prsence de la sonde marque dans des conditions de stringence qui sont
dfinies par la temprature d'hybridation ou la quantit de formamide prsente dans le tampon. Aprs
lavage, les cellules peuvent tre observes sous microscope pifluorescence. Il est possible de
combiner l'hybridation de plusieurs sondes (ayant des spcificits diffrentes) au sein d'un mme
chantillon par l'utilisation de diffrents fluorochromes (Amann et Kuhl, 1998). Il est aussi possible
d'utiliser plusieurs sondes ayant la mme spcificit mais des sites d'hybridation diffrents afin de
dtecter des micro-organismes en trs faible quantit (Lee et Kemp, 1994).
Des comparaisons des diffrentes mthodes de quantification des cellules ont t entreprises
par Karner et Furhman (1997). Les techniques les mieux corrles sont les sondes nucliques et les
33
techniques d'autoradiographie. Ces deux techniques dtectent toutefois moins de cellules que le
comptage par DAPI.
Une technique de transcription reverse in situ (ISRT) a t dveloppe afin de pouvoir dtecter
plus facilement les bactries actives d'un chantillon (Chen et al., 1997). Les hybridations, sur des
ADNc, l'aide de sondes spcifiques des ARNr ou de certains ARNm, permettent d'obtenir des
signaux plus puissants (sur les bactries actives) que par simple FISH.
3.3.3 La DGGE
3.3.3.1 Principe
Le principe de la DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) est fond sur la sparation
d'un double brin d'ADN sous l'action de la chaleur ou d'un dnaturant (Fischer et Lerman, 1979). La
temprature laquelle le duplex est dtruit est conditionne par deux facteurs :
Le nombre de liaisons hydrogne entre les bases complmentaires. Ainsi une liaison GC (3
liaisons hydrogne) est dtruite une temprature plus leve qu'une liaison AT (2 liaisons
hydrogne)
L'attraction entre des bases voisines sur un mme brin ou "stacking".
La molcule d'ADN aura donc une Tm (ou temprature de fusion) qui variera selon les domaines
et qui sera fonction de sa squence nuclique. Deux molcules d'ADN proches, diffrant d'un seul
nuclotide dans une zone faible temprature de fusion, auront deux tempratures de fusion
diffrentes. Lors d'une migration lectrophortique dans un gradient croissant de dnaturant
(habituellement formamide ou ure), la mobilit de la molcule d'ADN dcrot alors que les zones
faible temprature de fusion se dissocient. La structure de l'ADN, alors en simple brin, stoppe la
migration de la molcule. Pour viter la dnaturation totale du double brin, une structure trs haute
temprature en fusion (trs riche en GC) est associe lors de l'amplification. Une PCR est alors ralise
l'aide d'une amorce portant en 5' une succession de 40 GC : le GC clamp.
La mise au point de la technique rside essentiellement (Michaelides et al., 1995; Cotton, 1997) :
dans le choix des amorces. Elles permettent d'amplifier de 100 400 pb dans une zone faible
point de fusion. Le "GC clamp" doit tre proche de l'extrmit amplifie ayant le plus fort point de
fusion. Il est donc ncessaire de connatre avant l'amplification les zones qui auront une
temprature de fusion plus ou moins leve. Dans le cas de l'ADNr 16S ces zones peuvent tre
connues en raison de la forte stabilit de la structure secondaire de la molcule.
dans la prparation du gel (nature et tablissement du gradient, tension et dure
d'lectrophorse).
Dans les deux cas des outils informatiques permettent d'assister le scientifique pour dterminer
le type de gradient raliser dans le gel et la dure de migration estime de l'chantillon.
En rsum les avantages et les dsavantages de la mthode peuvent tre prsents dans le
tableau 1.12.
34
Tableau 1.12. Avantages et dsavantages de la technique de DGGE
A VANTAGES DESAVANTAGES
1. Mthode trs sensible 1. La phase de mise au point peut tre longue
2. En routine, la mise en oeuvre est simple et ne requiert 2. Il est prfrable d'acheter un appareillage spcifique
pas l'emploi de radio lments. 3. Le squenage des fragments est limit 400 pb.
3. Les fragments de PCR aprs migration peuvent tre Problmatique pour raliser des phylognies par la suite
rcuprs et squencs. 4. Les gnes ou rgions trs riches en GC sont
difficilement analysables par DGGE.14
3.3.3.2 La DGGE en cologie microbienne
Initialement dveloppe dans le domaine mdical pour dtecter des mutations impliques dans
des maladies gntiques, cette technique a t utilise pour distinguer les diffrentes populations de
micro-organismes dans des chantillons naturels aprs amplification de leur ADNr 16S (Muyzer et al.,
1993; Muyzer, 1999).
Cette technique permet :
la comparaison d'chantillons diffrents : volution d'une communaut dans le temps (Santegoeds
et al., 1998b), action de diffrents nutriments et de l'inoculum dans des cultures en "batch" (Jackson
et al., 1998a) ou action des facteurs environnementaux dans un milieu dfini (Santegoeds et al., 1996;
Ward et al. 1997),
une identification des souches prsentes dans un chantillon par comparaison du profil de migration
avec des profils obtenus sur des cultures pures, par squenage des bandes aprs excision (Ferris et
al., 1996a) ou par hybridation sur le gel d'lectrophorse l'aide de sondes spcifiques (Muyzer et al.,
1995).
3.3.3.3 Les variantes de la DGGE
Il existe diffrentes variantes de la DGGE selon le type de gradient utilis (TGGE ou CDGE).
D'autres techniques (SSCP, HMA) sont elles aussi fondes sur les migrations de structures
secondaires d'ADNr diffrents.
TGGE : Temperature Gradient Gel Electrophoresis. Le gradient dnaturant chimique est remplac
par un gradient de temprature qui augmente au cours de la migration. (Zoetendal et al., 1998; Eichner
et al., 1999)
CDGE : Constant Denaturant Gel Electrophoresis. La concentration d'agent dnaturant est
constante dans le gel et quivalente la temprature de la plus base zone de fusion. Cette technique
utilise lorsque l'on ne connat pas la localisation des zones de mutations requiert l'utilisation de
plusieurs gels reproduisant chacun diffrentes conditions de dnaturation.
La technique de SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) est fonde sur la diffrence de
structure secondaire et donc de migration au sein d'un gel non dnaturant entre deux fragments
14
Wu et al. (1999) ont propos une mthode combinant la CDGE et la DGGE pour l'analyse des rgions trs riche en GC.
35
d'ADN simples brins ayant des squences diffrentes (Lee et al., 1996; Schwieger et Tebbe, 1998).
Plus facile mettre en oeuvre que la DGGE, la SSCP ncessite l'utilisation d'ADN tmoin pour identifier
les micro-organismes auxquels correspondent les bandes (Widjojoatmodjo et al., 1994). Elle peut
aussi tre utilise pour distinguer des espces entre elles (Borin et al., 1997).
La technique HMA (Heteroduplex Mobility Assay) consiste elle aussi faire migrer des fragments
d'ADNr 16S dnaturs puis renaturs de diffrentes espces. Au cours de la renaturation des
htroduplex se forment dont la mobilit est fonction des structures secondaires recres dans les
rgions non-apparies. La migration a lieu sur gel de polyacrylamide mais elle permet surtout de
distinguer des populations peu complexes (Espejo et al., 1998) 15.
3.3.4 Les autres techniques
3.3.4.1 Les renaturations d'ADN totaux
La technique propose par Torsvik et al. (1990a) repose sur la mesure de la vitesse de
renaturation d'un mlange d'ADN pralablement dnatur. Plus l'chantillon est constitu d'une
population complexe plus il mettra de temps se renaturer. Il ne s'agit pas d'une identification des
micro-organismes impliqus dans la diversit de la population mais de la mesure d'un indice de
diversit.
3.3.4.2 L'analyse des fragments de restriction.
Des endonuclases de restriction sont utilises pour gnrer des fragments de diffrentes
tailles sur de l'ADN gnomique ou sur de l'ADNr 16S amplifi. La comparaison des profils de restriction
sur gel de polyacrylamide permet d'accder simplement et d'une manire peu onreuse la diversit
de l'chantillon (Moyer et al., 1994; Martinez-Murcia et al., 1995). Moyer et al. (1996), sur la base d'une
simulation ralise l'aide de diffrentes enzymes ttramriques et des squences disponibles sur le
RDP, a propos une liste d'enzymes particulirement rsolutives pour des RFLP sur ADNr 16S. S'il est
possible de comparer les communauts entre elles par cette technique, il n'est pas possible
d'identifier les lments de ces communauts. Une tape de squenage est alors indispensable.
3.4 De la diversit phylogntique la diversit physiologique

Si les techniques d'cologie microbienne molculaire fondes sur l'tude de l'ADNr 16S
permettent d'accder et de quantifier la diversit phylogntique associe un milieu, ces techniques
ne permettent malheureusement pas d'accder la diversit mtabolique. En effet l'exception de
quelques grands groupes phylogntiques correspondant une type mtabolique donn, tels que
les Archaea mthanognes ou les cyanobactries, le rle fonctionnel d'un micro-organisme dtect
15
Les mmes auteurs proposent de corrler les profils de migration aux pourcentages de similitudes sur l'ADNr 16S entre souches.
36
"molculairement" reste dans bien des cas non dfini. De plus l'isolement et la caractrisation des
micro-organismes ne nous informent que sur leur capacit mtabolique dans des conditions dfinies.
Aussi pour accder aux diverses contributions mtaboliques au sein de l'environnement diffrentes
approches ont t proposes, elles consistent soit tudier les gnes du mtabolisme, soit tudier
les ARNm.
Comme nous l'voquerons dans la partie suivante (les habitats microbiens), l'instar des tudes
ralises sur les gnes codants pour l'ARNr 16S, des stratgies fondes sur l'emploi de sondes
nucliques et sur l'amplification des gnes du mtabolisme l'aide d'amorces spcifiques ont dj t
employes. Bien que le degr de conservation des gnes codants pour des fonctions mtaboliques
soit moins important que celui des gnes d'ARNr, un certains nombre de gnes sont suffisamment
conservs pour pouvoir dterminer des sondes ou des amorces spcifiques. Ainsi il est possible
d'amplifier la bisulfite rductase, l'APS rductase ou l'hydrognase impliques dans des mcanismes
de sulfato-rduction, la mthane monooxygnase soluble (sMMO) ou particulaire (pMMO ou pmoA)
impliques dans les phnomnes de mthanotrophie, l'ammoniaque monooxygnase (amoA)
implique dans la nitrification, les gnes de fixation de l'azote atmosphrique (opron nif), la sous-
unit alpha de la mthyle coenzyme-M rductase (mer) implique dans la mthanognse ainsi que
des gnes impliqus dans des rsistances aux mtaux (cf. chapitre 2 3.1.3 et 5.3.2). L'utilisation de
sondes pour des hybridations in situ est rendue alatoire par le fait qu' la diffrence des ARNr, les
gnes codant pour des fonctions mtaboliques sont prsents en bien moins grande quantit. Pour
circonvenir cette limitation une technique d'amplification in situ a t mise au point (Hodson et al.,
1995). Cette technique permettrait d'amplifier des gnes, des ARNm et des ARNr, mais elle n'a jusqu'
prsent t utilise que pour tudier des cellules isoles ou des communauts peu complexes
(Tolker-Nielsen et al., 1997; Holmstrm et al., 1999; Tani et al., 1998). L'approche la plus utilise
consiste amplifier directement les gnes partir d'un pool d'ADN gnomique directement extrait de
l'chantillon, puis d'une manire analogue l'ADNr 16S, raliser des phylognies en comparant les
squences des gnes clons avec celles de micro-organismes isols. Les biais inhrents aux
techniques d'extraction de l'ADN, d'amplification et d'analyse phylogntique (cf. 3.5) peuvent
malgr tout entacher cette analyse. De plus l'amplification d'un gne n'implique pas obligatoirement
que celui-ci soit transcrit. Il est donc prfrable d'utiliser des techniques de PCR comptitive pour
quantifier la prsence du gne dans une population (Lee et al., 1996b; Kowalchuk et al., 1999). L'une
des solutions les plus lgantes consiste donc analyser les ARNm dont la prsence dans le
cytoplasme procaryotique est directement corrle l'expression du gne par le micro-organisme.
Cette technique fonde sur l'extraction des ARNm suivie d'une RT-PCR permis d'tudier
l'expression des gnes de rsistance au mercure dans des chantillons d'eau (Nazaret et al., 1994),
les gnes de la manganse proxydase dans le sol (Bogan et al., 1996), de la naphtalne
dioxygnase dans des eaux souterraines (Wilson et al., 1999), de la fixation de l'azote chez la
communaut symbiotique du termite Neotermes kokunensis (Noda et al., 1999). La quantification de
l'expression des ARNm peut tre effectue par PCR comptitive (Tsai et Wiltbank, 1996). La
technique de "Differential Display" employe couramment dans l'tude des ARNm d'Eucarya est aussi
37
applicable partir d'ARNm procaryotique (Fleming et al., 1998), il n'est alors pas ncessaire de
connatre la squence des ARNm dont on souhaite suivre l'induction. Une dernire technique
consiste rechercher une fonction mtabolique dans un environnement par clonage d'une banque
d'ADN gnomique dans Esherichia coli, puis par criblage de la banque en suivant l'expression des
gnes clons. Il a t possible l'aide cette technique, partir de diffrents chantillons de sol, de
dtecter la prsence de gnes codants pour l'utilisation du 4-hydroxybutyrate (Henne et al., 1999).
Cette technique est toutefois trs laborieuse puisqu'il a fallu cribler 930000 souches d'E. coli pour
dtecter 36 clones positifs dont seuls 5 possdaient un plasmide recombinant. Une tude similaire,
passant toutefois par une tape pralable clonage dans une banque de phage, a t entreprise pour
rechercher des chitinases partir d'chantillons d'eau de mer (Cottrell et al., 1999)
L'analyse d'un gne codant pour une fonction du mtabolisme ne nous renseigne pas sur la
position phylogntique du micro-organisme qui exprime ce gne. Seules les tudes de
communauts trs simples telles que les associations symbiotiques n'impliquant gnralement qu'un
hte et un symbiote permettent d'attribuer un micro-organisme dfini, la fois une position
phylogntique et une fonction mtabolique. Ainsi, il a t possible d'attribuer les gnes d'une
nouvelle famille de bisulfite rductase dissimilatoire aux pibiotes de l'annlide polychte Alvinella
pompejana (Cottrell et Cary, 1999) et les gnes codants pour une flagelline au symbiote de Riftia
pachyptila (Millikan et al., 1999). Une autre mthode consiste cloner des grands fragments d'ADN
gnomique partir d'une extraction directe d'ADN et rechercher dans les banques des fragments
portant les gnes codant pour l'ADNr 16S (Stein et al., 1996). Il est alors possible d'tudier les gnes
adjacents disposs sur le mme "contig". Comme dans le cas prcdent il n'est pas garanti que les
gnes dtects soient exprims, de plus l'effort d'chantillonnage fournir pour dtecter les gnes
d'ADNr 16S peut parfois tre dmesur. Cette technique employe dans l'tude d'une communaut
simple permis de caractriser l'ADNr 16S et les gnes de l'ADN polymrase de l'Archaea
Crenarchaeum symbiosum associe l'ponge Axinella mexicana (Preston et al., 1996; Schleper et
al., 1997b).
Les imposants projets de squenage gnomique humain et procaryotique ont favoris le
dveloppement des nanotechnologies. Nombre de ces dveloppements ne sont encore qu' l'tat
de pr-projet mais la demande en systmes d'analyse rapides et bon march de la part des industriels
les imposeront probablement trs rapidement au sein des laboratoires. L'effort de recherche semble
s'tre port sur diffrentes technologies de puces ADN fondes sur la dtection du signal par
fluorescence (Marschall et Hodgson, 1998; Schena et al., 1998; Gerhold et al., 1999) ou par
spectromtrie de masse (Tang et al., 1999) ainsi que sur la miniaturisation des dispositifs de migration
d'ADN utilisant des systmes lectrophortiques en microcapillaires de silicone (Chou et al., 1999) ou
des "crochets" anims de mouvements browniens (Bader et al., 1999). L'cologie microbienne n'a
pour l'instant que trs peu bnfici du dveloppement de ces techniques, seule une tude dcrit la
mise au point (Guschin et al., 1997b) puis l'emploi (Guschin et al., 1997a) de puces ADN pour
dtecter diffrentes communauts de bactries nitrifiantes. Les programmes de squenage
gnomique ont quant eux fourni de nombreuses informations sur l'organisation gnomique, sur la
38
fonctionnalit gntique et sur les mcanismes volutifs impliqus dans les micro-organismes
squencs (Olsen et Woese, 1996; Karp et al., 1998, 1999; Ge et Taylor, 1999). Ils permettent
dsormais de comparer les micro-organismes non sur la base de caractres phnotypiques ou
phylogntiques mais sur l'ensemble des informations contenues dans leur gnome (Koonin et
Galperin, 1997; Rastan et Beeley, 1997).
3.5 Les biais des techniques molculaires

A l'instar des techniques culturales, les techniques molculaires sont elles aussi soumises de
nombreux biais qui peuvent lourdement entacher l'analyse de la diversit microbienne d'un
chantillon. Ces biais peuvent intervenir diffrents stades de l'analyse : lors de l'chantillonnage, de
la conservation de l'chantillon, de la lyse cellulaire, de l'amplification de l'ADNr 16S, de l'analyse des
squences. Dans le cadre des tudes par hybridation in situ la construction et la spcificit de la
sonde, l'tat cellulaire et la permabilit des membranes ainsi que la sensibilit des mthodes
d'analyse peuvent influencer les rsultats de l'analyse. Trois publications rcentes font le point sur les
principaux bais de ces techniques. La premire (Amann et al., 1995) s'attache plus particulirement
dcrire les biais des techniques d'hybridation in situ et propose des techniques pour amliorer la
sensibilit de la mthode. La seconde (Wintzingerode et al., 1997) fait un inventaire trs complet des
biais majeurs rencontrs dans les tudes par amplification et squenage. La troisime (Head et al.,
1998) fait le point sur dix annes d'tudes molculaires ainsi que sur les biais de l'ensemble de ces
techniques.
3.5.1 Echantillonnage et conservation des chantillons

En dehors de trs rares milieux o la diversit microbienne est trs restreinte (par exemple
symbiose rduite un micro-organisme) l'chantillon prlev dans le milieu devra rendre compte le
plus fidlement possible de l'ensemble des espces prsentes dans l'environnement. Il est donc
ncessaire de connatre les conditions physico-chimiques de chaque chantillon.
Dans la mesure o il n'est pas possible de traiter (lyse, extraction) l'chantillon ds son
prlvement, il est ncessaire de le conserver dans les conditions qui permettront de conserver
l'intgrit des acides nucliques. Une tude a compar les effets de diffrentes techniques de
conservation sur la composition de banques de clones d'ADNr 16S (Rochelle et al., 1994). Il a t
observ que les chantillons congels rapidement et maintenus sous atmosphre anarobie (non-
oxydante) prsentent une diversit bien plus importante que les chantillons conservs en arobiose
ou congels plus tardivement. La conglation tardive des chantillons est source selon les auteurs
d'enrichissement de certains phylotypes.
39
3.5.2 Les techniques de PCR
3.5.2.1 La lyse cellulaire et l'extraction des acides nucliques
La lyse cellulaire est une tape cruciale de l'analyse de la diversit. Elle devra dtruire les parois
et membranes des micro-organismes en endommageant le moins possible les acides nucliques.
L'efficacit de la technique de lyse cellulaire sur un chantillon environnemental est d'autant plus
difficile dterminer que l'on ne connat pas le type et la quantit de cellules lyser. On sait toutefois
que les techniques de lyse bactrienne doivent tre modifies pour lyser des Archaea, que les
bactries Gram + sont plus difficiles lyser que les Gram -, que les spores et les petites cellules
rsistent mieux la lyse.
Tableau 1.13. Les techniques de lyse cellulaire
Techniques physiques Techniques chimiques

conglation- dconglation solvants
Azote liquide dtergents (SDS)
pilon et mortier enzymes
bead beating lysozyme
Presse de French protinase K
sonication - micro-onde N-acetylmuramidase
chauffage 100C Lysostaphin
Rsine d'change d'ions (Chelex) Achromopeptidase
Les techniques de lyse les plus efficaces sont celles qui combinent la fois les traitements
physiques et chimiques (cf. tableau 1.13). Toutefois elles peuvent conduire une forte fragmentation
de l'ADN et favoriser la production d'amplifiats chimriques. Aussi est-il parfois ncessaire de simplifier
la technique d'extraction afin d'avoir un ADN de meilleure qualit. On est alors confront la prsence
de contaminants tels que les acides humiques (pour des chantillons de sols) ou les mtaux lourds qui
peuvent inhiber l'action de certaines ADNpolymrases.
La solution idale consisterait utiliser plusieurs techniques de lyse et rassembler le rsultat

des diffrentes extractions pour raliser l'amplification.
3.5.2.2 L'amplification par PCR
L'amplification est l'une des sources majeures de biais dans l'tude de la diversit. Ces biais sont
introduits pour diffrentes raisons :
inhibition de la PCR en raison de la prsence de contaminants chimiques ou organiques (Wilson,
1997)
l'tat physiologique de la cellule va influer sur la qualit de l'amplification : les ADN des cellules l'tat
quiescent ou ltal vont tre plus difficilement amplifiables (Silva et Batt, 1995)
40
amplification prfrentielle de certaines molcules : celle-ci est lie au nombre de copies de l'opron
rrn16 (de 1 14) (Farrelly et al., 1995), au choix des amorces (Reysenbach et al., 1992; Brunk et Eis,
1998), l'chantillon (Suzuki et Giovannoni, 1996), la composition en GC de la squence (Dutton et
al., 1993), aux proportions initiales de squences dans l'chantillon (Suzuki et Giovannoni, 1996), aux
squences adjacentes de la zone amplifier (Hansen et al., 1998)
formation de molcules chimriques : lors de l'appariement les simples brins d'ADN vont s'associer
entre eux plutt qu'avec les amorces, en particulier lorsque l'ADN a t fragment (Pbo et al., 1990;
Liesack et al., 1991; Kopczynski et al., 1994; Wang et Wang, 1996)
formation de mutant de dltion : la structure secondaire de l'ADNr 16S va persister lors de la
dnaturation et la polymrase va "sauter" certaines structures rsistantes
mauvaise incorporation de la polymrase : selon les enzymes utilises et les conditions
d'amplification le taux d'erreur variera d'une toutes les 300 bases une toutes les 5000 bases.
variation des squences des diffrentes copies dans l'opron rrn au sein d'une mme souche (voir
3.1.3 et Ninet et al., 1996; Reischl et al., 1998).
prsence de squences de contaminants de la raction : les tampons de raction, l'eau ou les tubes
peuvent tre source de contaminants qui passent alors pour faire partie de la population indigne de
l'chantillon (Tanner et al., 1998). L'une des solutions est d'exposer le mlange d'amplification aux
U.V. (Goldenberger et Altwegg, 1995)
3.5.2.3 Le clonage et l'analyse des squences
Il semblerait que la technique de clonage influence la composition de la banque de clones. En

particulier pour les clonages en bouts cohsifs o il est ncessaire d'utiliser des enzymes de restriction
qui peuvent couper le fragment d'ADNr 16S (Rainey et al., 1994b). L'orientation du fragment clon
peut elle aussi gnrer des diffrences de profils lors de l'analyse par RFLP de la banque en cas de
clonage par TA-cloning. Pitule et Pace (1999) ont propos un vecteur spcialement construit pour le
clonage de l'ADNr 16S dans une orientation donne.
Le criblage de la banque doit tre effectu en tenant compte des espces minoritaires. Ainsi,
dans un chantillon contenant 108 cellules.g -1 et une population prsente 102 ou 10 4 individus.g-1, il
sera ncessaire de cribler 104 106 clones pour statistiquement dtecter cette population17.
La dtection des chimres est une tape essentielle lors de l'analyse des squences. Si
diffrents auteurs ont propos des techniques pour rduire le nombre de chimres lors de l'tape de
PCR (voir 3.4.2.2 et Wintzingerode et al., 1997), les outils pour dtecter ces squences sont assez
rduits. Il s'agira d'utiliser le programme CHIMERA sur le site du RDP (Robinson-Cox et al., 1995) ou de
comparer la topologie d'arbres phylogntiques en n'utilisant que certaines parties de l'alignement
(par exemple de la partie 5' la base 500, de 500 1000 et de 1000 la partie 3'). Ces squences
16
Ce nombre de copies peut tre variable au sein d'une mme espce. Pr et al. (1999) dtectent des squences signatures
spcifiques d'une part de souches psychrotolrantes et d'autre part de souches msophiles sur diffrentes copies de l'ADNr 16S de
Bacillus cereus dont le nombre varie de 6 10 selon les souches.
17
Lors de l'amplification, les ratios cellulaires ne sont pas maintenus, ce nombre de clones analyser est donc thorique.
41
seront d'autant plus difficiles dtecter qu'elles sont formes entre espces proches ou entre copies
d'un mme opron (Wang et Wang, 1997).
3.5.3 Les techniques d'hybridation

Les principaux biais des techniques d'hybridation sont lis d'une part la permation des
cellules, et d'autre part l'tat cellulaire et la construction des sondes.
Pour la fixation des cellules et leur permation l'utilisation d'aldhyde comme le
paraformaldhyde (agent de pontage) va tre plus efficace sur les bactries Gram - alors qu'un
dnaturant comme l'thanol fixera mieux les Gram +. Pour les Gram + il est parfois ncessaire d'utiliser
du lysozyme pour faciliter la pntration de la sonde.
Des cellules actives dans l'chantillon, donc riches en ribosomes, seront plus facilement
dtectes que des cellules en dormance. En effet le taux de croissance est corrl dans la plupart des
cas avec le nombre de ribosomes par cellule. Le nombre de ribosomes n'est toutefois pas un facteur
limitant de la croissance et de la synthse protique chez les bactries oligotrophes la diffrence des
htrotrophes (Fegatella et al., 1998).
La construction de la sonde devra tenir compte de la spcificit de la squence. Ainsi pour un
nuclotide de 18 bases, il y a 0,25-18 chance pour dtecter une squence non recherche. Mais dans
la pratique des hybridations non spcifiques peuvent se produire avec quelques msappariements
dans la sonde. Il est donc ncessaire de vrifier la validit de la sonde en la confrontant avec les
banques de squences et par hybridation sur membrane ou sur culture pure.
En jouant sur les conditions d'hybridation, Td ou pourcentage de formamide on modifie la
spcificit de la sonde. Zheng et al. (1996) ont quantifi avec plus de prcision des organismes des
trois domaines (Eucarya, Bacteria et Archaea) en diminuant la Td pour diffrentes sondes universelles.
Le type de marquage de la sonde influera sur la qualit de dtection, aussi des nouveaux
marqueurs et des nouvelles techniques de dtection ont t dvelopps (Glckner et al., 1996;
Schnhuber et al., 1997, 1999)
La sonde devra "accder" son site d'hybridation sur la molcule d'ARNr 16S. La forte
structure secondaire de l'ARNr ainsi que les interactions avec des protines peuvent rendre certains
sites inaccessibles. L'utilisation de formamide permet alors de rduire les liaisons hydrogne et
d'accrotre l'accessibilit du site. Et en utilisant une sonde dans les rgions dj connues pour donner
des hybridations efficaces il est possible de limiter ce biais (Frischer et al., 1996). Rcemment l'quipe
de Amann a tabli sur la base de l'ARNr 16S d'E. coli une carte d'accessibilit de la molcule en
comparant par cytomtrie en flux l'hybridation de l'ensemble des sondes couvrant les 1500
nuclotides de la squence avec la valeur de la sonde EUB 338 donne pour 100% d'hybridation
(Fuchs et al., 1998).
42
3.5.4 Les techniques de DGGE

Les biais de la technique DGGE sont semblables ceux rencontrs dans les techniques
d'amplification et de squenage. Dans la mesure o il est ncessaire d'effectuer une amplification de
fragments d'ADNr 16S, l'ensemble des biais d'chantillonnage, d'extraction et d'amplification sont
prsents. Seules les bandes de fortes intensits, correspondant aux populations majoritaires ou
majoritairement amplifies pourront tre dtectes.
3.5.5 Une solution : l'approche pluridisciplinaire

L'engouement "excessif" du dbut des annes 1990 vis vis des techniques molculaires
(Olsen et Woese, 1993; Olsen et al., 1994b; Woese, 1994 a et b) a dsormais fait place une vision
plus pondre des diffrentes mthodologies d'tude de la diversit microbienne (Palleroni, 1997;
Amann et Khl, 1998; Head et al., 1998). Si les biais des techniques culturales sont depuis longtemps
pris en compte, les rsultats obtenus par des techniques d'analyse des ARNr peuvent parfois tre
surprenants. D'une part :
La grande majorit des squences obtenues ne sont pas similaires celles de souches cultives.
Un grand nombre de squences bactriennes et archaennes correspondent de nouveaux
phylums.
Les squences de souches isoles de sites d'o provient une collection de clones d'ADNr 16S
sont rarement identiques celles des clones.
Des squences de clones obtenus de sites trs loigns peuvent tre trs similaires.
Des organismes trs peu ou pas cultivs peuvent prsenter une trs grande variabilit
phylogntique et tre ubiquitairement prsents dans la nature.
D'autre part :
Les donnes "de base" d'cologie ne peuvent tre obtenues par ces techniques; notamment en
raison des problmes mthodologiques il est difficile de quantifier les taxons prsents dans le milieu.
La qualit des amplifications est dpendante de conditions physiologiques et gnomiques
cellulaires que l'on ne peut prvoir.
Il est difficile de dfinir les proprits physiologiques, mtaboliques et le rle cologique des
organismes dtects partir de leur position phylogntique d'autant plus si ceux-ci forment de
nouveaux phylums.
Les amorces dites "universelles" n'ont t construites qu'en utilisant une trs faible fraction des
organismes connus.
La prsence d'un grand nombre de squences similaires est difficile interprter : s'agit-il de
microhtrognits au sein de l'opron rrn ou de souches trs proches?
La dtection et la quantification des cellules par hybridation in situ est actuellement soumise de
nombreux biais notamment lors de la dtection du signal et de la permation cellulaire.
43
Par amplification (squenage et DGGE) ou par hybridation il est encore trs difficile de dtecter les
espces minoritaires.
Le traitement des banques de clones devrait tre soumis plus de rigueur statistique.
Le pouvoir rsolutif de l'ADNr 16S au niveau de l'espce (qui est l'unit de base en cologie) est
limit. Des valeurs de 95% d'identit peuvent distinguer des espces diffrentes, contre 70% de
similitude en hybridation ADN/ADN.
Si les techniques molculaires ont permis de considrablement accrotre le champ des

connaissances en cologie microbienne (cf. partie suivante), il est dsormais indniable que seul
l'emploi combin de techniques culturales et non-culturales permettra de lier les informations
concernant la diversit et la fonction des communauts microbiennes dans leur environnement. Au
mme titre que la taxinomie bactrienne a su intgrer aux techniques classiques d'identification et de
taxinomie numrique les techniques molculaires et la phylognie molculaire, l'cologie microbienne
devra elle aussi intgrer l'ensemble des techniques mises sa disposition. Cette approche
polyphasique peut s'envisager par l'utilisation conjointe des sondes molculaires et des
microlectrodes (Schramm et al., 1996), des sondes molculaires et des mesures d'incorporation
spcifiques (Lee et al., 1999; Ouverney et Fuhrman, 1999), le clonage de grands fragments d'ADN
gnomique (Stein et al., 1996), l'utilisation des microscopes confocaux (Manz et al., 1995, 1999;
Harmsen et al., 1996b; Rocheleau et al., 1999) et des pinces optiques (Huber et al., 1995). La
biomasse procaryotique, cette "majorit invisible" telle que la dcrivent Whitman et al. (1998), ne
devrait nous tre accessible qu'au terme de ces efforts.
44
Les habitats microbiens
La Terre est un cosystme extraordinairement complexe o l'on peut distinguer trois habitats
majeurs : l'atmosphre, le sol et l'eau. Aux habitats naturels se sont adjoints de nouvelles niches
cologiques lies la prsence et aux activits humaines. L'tude de tous ces habitats a longtemps
t limite aux grandes formes de vie et nombre de textes d'cologie articulaient leur rflexion
uniquement autour de ce qui tait visible l'il nu. L'utilisation de techniques culturales en
microbiologie, relay ces dernires annes par l'emploi de techniques molculaires, nous a permis
d'observer quel point la diversit et le rle des procaryotes pouvait tre prpondrant dans l'quilibre
de la biosphre. Je me propose dans cette seconde partie introductive, aprs une description
sommaire des diffrents cosystmes et des micro-organismes qui y ont t isols, de prsenter une
revue des apports des techniques molculaires dans l'tude de la diversit de ces milieux. Les
cosystmes ptroliers et hydrothermaux seront plus particulirement approfondis. Un arbre
phylogntique prsent en annexe permettra au lecteur de reprer les diffrents groupes
phylogntiques cits dans cette seconde partie.
I Les origines de la vie
1.1 Les premires traces de vie

Aller la recherche des premires formes de vie sur terre c'est tenter de rpondre ces trois
questions : qu'est ce que la vie? Quand cela a-t-il commenc? Et quoi ressemblait la Terre cette
poque?
La premire question peut revtir des aspects tant mtaphysiques que physiologiques.
Norman Pace (Pace, 1991; et site web de l'quipe de Norman Pace http://pacelab.berkeley.edu)
rpond qu'une forme est considre comme vivante lorsqu'elle est autorplicative et ralise une
chimie organique sous une forme libre.
Pour rpondre la seconde et la troisime question nous disposons d'enregistrements
astronomiques (formation des systmes solaires et des plantes), d'enregistrements gologiques
(fossiles, mesure d'isotopes, tude des roches, etc.) et d'enregistrements biologiques (la phylognie
molculaire).
On considre que la Terre est apparue il y a 4,6 milliards d'annes, mais il faut attendre encore
800 millions d'annes avant que l'eau liquide apparaisse sur la terre crant ainsi des conditions
compatibles avec la vie telle que nous l'imaginons. Les premires traces fossiles de micro-organismes
datent de 3,6 milliards d'annes1. Ce sont des tapis microbiens fossiliss connus sous le nom de
stromatolites. On en retrouve encore en activit en Australie en Amrique et en Afrique dans des
lagunes ctires o dans des sources chaudes. A la diffrence des stromatolites actuels coloniss par
des cyanobactries (arobies) les premiers stromatolites devaient tre constitus de phototrophes
1
Il existerait une trace plus ancienne de vie dans des roches prleves au Groenland. Prleves dans des sdiments vieux de 3,8 3,9
milliards d'annes, des roches Isua prsentent des rapport isotopiques 13 C/12 C laissant supposer une origine biologique.
45
anarobies, l'oxygne sous une forme libre tant apparu il y a 2 2,5 milliards d'annes. Cette priode
correspond une augmentation de la diversit morphologique des fossiles microbiens laissant
supposer un accroissement de la diversit phylogntique.
Lorsque la vie est apparue, la Terre prsentait des conditions qui nous sembleraient
particulirement inhospitalires. C'tait un environnement trs rducteur o les gaz principaux taient
le mthane, le dioxyde de carbone et l'azote. On retrouvait des traces de sulfures sous la forme H 2S et
FeS. Lors du premier milliard d'annes la temprature tait alors trs leve (suprieure 100C). Ce
n'est que lorsque la Terre a commenc se refroidir (4 milliards d'annes) que la vie a pu se
dvelopper (cf. figure 2.1).
C
400
ocan magmatique
300 Condensation de leau
Synthses abiotiques
200
Synthses biotiques
100
4,5 4 3,5 Temps en milliards dannes
Figure 2.1. Reprsentation schmatique de l'volution de la temprature la surface de la Terre depuis sa formation.
On considre que les premires synthses de macromolcules comme les acides nucliques
et les protines se sont droules de manire abiotique sur des surfaces de roches ayant le rle de
catalyseur. La pyrite (FeS2) a probablement jou un rle majeur dans ces synthses o le rayonnement
U.V. tait la source principale d'nergie (trs importante l'poque du fait de la quasi absence
d'atmosphre) (Wchtershuser, 1988).
1.2 Une origine de la vie controverse

L'ensemble de la communaut scientifique semble s'accorder sur le type mtabolique des
premiers organismes vivant sur Terre. Il s'agirait d'organismes anarobies chimiolithotrophes tirant leur
nergie de la rduction du soufre (Pace, 1991; Stetter et al., 1996) ou plus probablement du fer (FeS
ou FeCO3) (Slobodkin and Wiegel, 1997, Vargas et al., 1998), la source de carbone provenant de
molcules organiques abiotiques2 ou du CO 2 atmosphrique. La temprature laquelle la vie est
apparue est quant elle sujette discussion.
Les similitudes observes entre les sources hydrothermales et les conditions retrouves sur
Terre il y a 4 milliards d'annes : milieu trs rducteur et anoxique, forte teneur en soufre, en mthane
et mtaux lourds, tempratures leves, ont conduit les scientifiques, au dbut des annes 70,
2
La voie d'assimilation du carbone par autotrophie tant un mcanisme complexe il est peu probable qu'il ait prcd l'htrotrophie.
46
considrer ces cosystmes comme des lieux possibles d'mergence de la vie sur Terre (Corliss et al.,
1981; Baross et Hoffman, 1985)
A la mme poque Woese propose une division tripartite du monde vivant en crant le
domaine des Archaebactries (Woese, 1987) (devenant par la suite Archaea, Woese et al., 1990) qui
ne regroupait alors que des micro-organismes aux prfrendums vitaux extrmes (trs forte
temprature, trs forte salinit, production de mthane, rduction du soufre). Les branches basses de
l'arbre du vivant taient courtes (donc ayant peu volu) et essentiellement occupes par des micro-
organismes thermophiles (Bacteria: Aquificales, Thermotogales; Archaea: Crenarchaeota soufre-
dpendantes, Thermococcales et mthanognes thermophiles) (Stetter et al., 1996). L'mergence
d'un concept de biosphre microbienne souterraine thermophile quelques annes plus tard (Gold,
1992) abonda dans le sens d'une origine de la vie thermophile. Or cette proposition va l'encontre de
la thorie d'un monde ARN.
On considre que l'apparition de l'ARN a prcd celle de l'ADN (les ribonuclides avant les
desoxyribonuclides). L'ARN jouait un rle de stockage d'information et un rle enzymatique. Il
possde encore des capacits catalytiques qui lui permettent d'associer les acides amins pour former
les protines (ribosyme). De plus s'il a t prouv que l'ADN (pour peu qu'il soit super-enroul) pouvait
rsister de trs fortes tempratures (Forterre, 1996; Forterre et al., 1996), l'ARN quant lui, est trs
rapidement dnatur mesure que la temprature augmente. Il est donc peu probable que les
premiers organismes ( ARN) aient pu supporter les trs fortes tempratures que supportent les
hyperthermophiles actuels3.
De plus les phylognies ralises sur les ARNr ont t rcemment remises en cause4.
La gnralisation des squenages gnomiques permet d'accder de nombreuses squences
protiques pouvant, au mme titre que l'ARNr, servir de base des phylognies. Or si la majeure
partie des arbres obtenus sont en accord avec une division tripartite du monde vivant (33 protines
sur 40), la monophylie de ces domaines est mise en cause dans 17 phylognies sur 40 (Williams et
Embley, 1996). Ce rsultat soulve le problme de la reprsentation d'un arbre universel refltant
soit la majorit des arbres obtenus partir de toutes les molcules, soit le rsultat d'une
phylognie sur un ou plusieurs gnes cls (Doolittle, 1996; Doolittle et al., 1996).
Des phylognies rcentes placent Aquifex (la bactrie branchant le plus profondment sur l'arbre
ARNr) non plus la base des Bacteria mais proximit de Bacillus ou au sein des Archaea (Klenk,
1998; Pennisi, 1998).
3
L'instabilit de l'ARN est en partie lie la prsence de cytidine , qui reprsente le moins stable des 3 acides nucliques. Il a donc t
propos que cet acide amin pouvait tre absent des premiers matriaux gntique (Levy et Miller, 1998), des liaisons A:U, G:U
pouvant tre suffisamment fortes pour maintenir la structure secondaire de la molcule. Il a de plus t dmontr que l'activit d'un
ribozyme tait accrue lorsque celui ci tait dpourvu de cytidine (Rogers et Joyce, 1999). Cet ARN primaire, stabilis, dpourvu de
cytidine pourrait tre alors en accord avec une origine de la vie dans des conditions thermophiles.
4
La division du monde vivant en trois domaines telle que l'avait propos Woese, a mme t remise en cause rcemment par Ernst
Mayr (1998). Cet article a conduit un change trs vif entre les deux protagonistes par journal interpos (Woese, 1998b). Pour sa part
Gupta (1998 a, b et c) s'interroge sur les similitudes entre les Archaea et les Firmicutes et propose une nouvelle classification du
monde vivant.
47
Il semblerait que la position d'un micro-organisme sur un arbre soit trs fortement lie la vitesse
laquelle la molcule ayant servi construire l'arbre a volu. Cette frquence mutationnelle varie au
sein de la molcule et entre les organismes induisant des phnomnes d'attraction des branches
longues5. Ces phnomnes perturbent particulirement les analyses d'organismes "branchant
profondment" sur les arbres phylogntiques et qui sont senss tre les plus proches de l'tat
ancestral (Philippe et Laurent, 1998).
On a observ que les ARNr d'hyperthermophiles taient riches en bases G et C. Or ces dernires
forment des structures stables qui pourraient ralentir les mutations, raccourcir les branches et donc
rapprocher les branches courtes (Galtier et Gouy, 1998; Galtier et al., 1999).
Enfin la dtection de squences de Crenarchaeota et d'Euryarchaeota (trs probablement non
thermophiles) au sein de nombreux environnements (sols, sdiments, eaux douce et eau de mer,
symbiose avec des animaux, voir Olsen, 1994; Schleper, 1999) vient faire vaciller le dogme
d'Archaea exclusivement cantonnes dans des environnements extrmes.
L'ensemble de ces informations prsente la thermophilie comme un caractre driv, une adaptation
de nouvelles niches cologiques et remet en cause une origine thermophile de la vie sur terre.
La nature de la premire forme de vie sur terre est elle aussi discute. Les phylognies
ralises sur les ARNr ont permis de prsenter un arbre de la vie non racin, mais des tudes ont t
entreprises afin d'enraciner cet arbre, partir de travaux effectus sur les protines codant pour les
facteurs d'longation, les ATPases et les ADN et ARN polymrases. Ces travaux prsentent la racine
de l'arbre entre la branche des Bacteria et celle des Eucarya-Archaea. Diffrents noms ont t
proposs pour nommer l'organisme qui serait la base de l'arbre : prognote, cenancestor, LUCA
(Last Universal Common Ancestor). Les deux premiers termes ont le dsavantage de donner une ide
primitive de la biologie de cette entit 6. Or il est tout fait probable que cet organisme ait eu un
mtabolisme assez complexe, qui ait volu en se simplifiant au cours des gnrations et de la
conqute de nouveaux milieux. De plus, raisonner en terme de dernier organisme commun ne doit
pas faire oublier qu' l'origine les changes gntiques et les frquences de mutations devaient tre
trs levs, favorisant l'apparition de gnes paralogues et xnologues (Woese, 1998a).
Le squenage du gnome de nombreux micro-organismes devrait fournir de nouveaux
matriaux pour tablir des relations phylogntiques plus solides et avancer de nouvelles hypothses
sur la nature des premiers organismes ayant colonis le globe.
Des trois compartiments de la biosphre, l'atmosphre constitue l'environnement le moins

propice au dveloppement d'une vie endmique. Il semble toutefois que les micro-organismes soient
parvenus coloniser ce milieu.
5
Les positions sur deux squences ayant des frquences de mutation trs leves peuvent s'avrer similaires par convergence sans
que cette similitude reflte un caractre d'ancestralit (Felsentein, 1978).
6
Les termes employs pour la dnomination des domaines peuvent conduire de faux raisonnements. Ainsi les Archaea ne sont pas
essentiellement confins dans des environnements extrmes (proches des conditions ancestrales) et les "pro"caryotes possdent des
mcanismes aussi volus que ceux des eucaryotes.
48
II. L'atmosphre
La prsence de micro-organismes dans l'air a t mise en vidence par les expriences de
Pasteur en 1864, mettant ainsi fin au concept de gnration spontane. Au sein de cet habitat
inhospitalier les micro-organismes ne sont qu'en transit. En haute altitude, l'absence de nutriments,
d'eau et les fortes irradiations (rayonnements U.V.) ne permettent pas le dveloppement des micro-
organismes 7. Les organismes sont donc sous la forme de spores. Au fur et mesure que l'on s'lve
dans l'atmosphre la concentration en micro-organismes diminue.
A l'chelle humaine les micro-organismes prsents dans l'air ambiant, sous forme d'arosols,
sont responsables d'un grand nombre d'infections humaines, en particulier dans des environnements
anthropiques clos, chauffs et humides comme ceux des hpitaux. Ces infections peuvent aussi
toucher d'autres organismes suprieurs tels que les plantes et les animaux domestiques. La teneur de
l'air en micro-organismes, qu'ils soient sous une forme viable, viable mais non cultivable ou mort, est
fonction de facteurs climatologiques (humidit, pluie, temprature) comme de facteurs lis
l'ensoleillement (saison, cycle nycthmral) (Lighthart, 1997). Les techniques de culture classiques
(Heidelberg et al., 1997; Shaffer et Lighthart, 1997; Reponen et al., 1998), comme les techniques de
biologie molculaire (Alvarez et al., 1995; Palmer et al., 1995; Pillai et al., 1996; Bartlett et al., 1997;
Strk et al., 1998) ont t mises profit de nombreuses reprises pour dtecter les micro-organismes
en suspension dans l'air. Il n'a s'agit toutefois que de dtecter des micro-organismes gnralement
impliqus dans des infections humaines, et aucune tude ne s'est encore intresse la diversit
totale des micro-organismes "ariens". Ce type d'tude est beaucoup plus commun au sein des
habitats terrestres.
III. Les habitats terrestres

On distingue trois compartiments majeurs parmi les habitats terrestres : la couche superficielle
du sol qui s'tend de la surface quelques mtres de profondeur, la biosphre souterraine qui s'tend
sur toute la lithosphre, et le cas particulier des rservoirs ptroliers. Chacune de ces niches abrite une
communaut particulire de micro-organismes.
3.1 Les couches superficielles de la lithosphre
3.1.1 Description de l'habitat

Le sol abrite de fortes quantits de micro-organismes qui interviennent activement dans
diffrents cycles gochimiques (C, N, S et mtaux). La diversit microbienne y est fonction du type de
sols tudis (par exemple : elle est plus abondante dans la rhizosphre que dans des sols nus) mais
7
Certains chercheurs auraient propos l'hypothse que des micro-organismes pourraient se dvelopper dans les nuages, l o la
teneur en eau est plus leve. Source : site du Microbe Zoo, Digital Learning Center for Microbial Ecology
(http://commtechlab.msu.edu/sites/dlc-me). De plus des bactries actives ont t dtectes dans des gouttes d'eau de nuage 3000 m
d'altitude (Psenner et Sattler, 1998).
49
elle s'tend dans toutes les niches o la vie est thermodynamiquement possible. La proportion de
micro-organismes saccrot mesure que l'on s'loigne de la surface du sol. A 10 cm de profondeur on
estime retrouver 75 95% de la population totale microbienne du sol. Les micro-organismes
procaryotes y ctoient des Eucarya. Par gramme de sol on retrouve 10 7 10 8 procaryotes, 10 5
champignons, 5.104 algues et 3.10 4 protozoaires (Madigan, 1996; Withman et al., 1998).
3.1.2 La rhizosphre
Au sein de la rhizosphre la diversit et la richesse microbienne sont trs importantes. Les
populations peuvent atteindre jusqu' 109 individus par gramme de sol. Cette richesse est attribuer
aux relations qui s'tablissent entre les plantes et les micro-organismes (Bally et al., 1999).
La plante excrte des sucres, des acides amins et des vitamines qui permettent la croissance des
micro-organismes alors que ces derniers produisent des hormones favorisant la croissance de la
plante (auxine, indole, acide actique ou des molcules "gibbereline-like").
Certains micro-organismes de la rhizosphre permettent de lutter contre les pathognes (bactries
et champignons) de la plante.
Les polysaccharides bactriens favorisent quant eux l'agrgation du sol autour des racines (Amellal
et al., 1998).
Enfin d'importants phnomnes symbiotiques sont observables, notamment chez les
lgumineuses o, au sein de bactriocystes, des Rhizobium permettent la fixation de l'azote
atmosphrique par le vgtal (Ferrera-Cerrato, 1980).
Les mthodes de culture classiques ont permis d'isoler essentiellement des micro-organismes
associs aux genres Bacillus, Arthrobacter et Actinomycetes. Or les milieux de culture utiliss ne
peuvent que difficilement recrer l'ensemble des interactions que les micro-organismes entretiennent
avec le sol et les plantes. De plus les micro-organismes retrouvs en culture diffrent de ceux
observs in situ. Ces derniers semblent avoir une paroi plus complexe et une taille plus petite (ce qui
les protgerait contre les contraintes hydriques et alimentaires).
3.1.3 L'apport des techniques molculaires

Compte tenu de l'importance des micro-organismes tant au niveau des cycles gochimiques
que de l'augmentation des rendements de cultures, de la production d'antibiotiques, et des
mcanismes d'infection (par exemple Clostridium tetani ou Bacillus anthrax), de nombreuses tudes
utilisant les techniques molculaires ont t entreprises (Liesack et al., 1997; van Elsas et al., 1998;
O'Donnel et Grres, 1999). Ces dernires ont rvl une diversit microbienne bien plus abondante
que celle obtenue par les mthodes de cultures classiques et dont les reprsentants se rpartissent
dans toutes les branches (msophiles) de l'arbre des bactries (Torsvik et al., 1990a; Borneman et al.,
1996).
50
La premire tape franchir dans le cadre de telles tudes, est l'extraction d'ADN partir
d'chantillons riches en matire humique et en substances susceptibles de fixer l'ADN telles que les
argiles (Vettori et al., 1996). Un grand nombre d'articles dcrivent et comparent l'efficacit de
diffrentes mthodes d'extraction partir de tels chantillons (Holben et al., 1988; Steffan et al., 1988;
Pillai et al., 1991; Tsai et Olson, 1992 a et b; Moran et al., 1993; Ogram et al., 1995; Felske et al., 1996;
Zhou et al., 1996; Jackson et al., 1997; Porteous et al., 1997; Abu Al-Soud et Rdstrm, 1998; Kuske
et al., 1998). Les plus efficaces de ces techniques sont dcrites dans la troisime partie de ce
manuscrit.
Une fois rsolus les problmes lis l'extraction de l'ADN, la communaut microbienne au sein
de diffrents types de sols a t analyse soit par squenage direct des ADNr 16S, soit par
hybridation l'aide d'amorce domaine-spcifique. Le tableau 2.1 prsente une liste non-exhaustive
des diffrentes tudes ralises sur les sols; chacune de ces tudes contribu la dcouverte de
nouvelles squences de micro-organismes proches de micro-organismes dj isols mais le plus
souvent correspondant de nouveaux phylums.
Tableau 2.1. Etudes de la diversit microbienne des sols par des approches molculaires
Sols cultivs Autres types de sols
mise en vidence d'une nouvelle ligne de Crenarchaeota (Bintrin et al., communauts rhizobiales (Khbaya et al., 1998;
1997; Buckley et al., 1998), Lafay et Burdon, 1998),
recherche des bactries actives dans le sol (Christensen et al., 1999), sols traits par des herbicides (elFantroussi et al.,
tude sur des sols isols de larchipel Hawaiien (Nsslein et Tiedje, 1999),
1998), sols pollus par des hydrocarbures par la
approche de la diversit bactrienne trs complte (squenage, mthode d'hybridation gnomique reverse (Shen et
hybridation, DGGE) et quantification des espces actives par RT-PCR al., 1998),
(Felske et al., 1998a; Felske and. Akkermans, 1998a), sols forestiers (Borneman et Triplett, 1997;
communaut des Archaea (Grokopf et al., 1998a et b) et des bactries Jurgens et al., 1997; Widmer et al., 1999),
oxydant le mthane (Henckel et al., 1999) se dveloppant sur les racines tourbires (Hales et al., 1996; Lloyd et al., 1998),
de riz, sols gels, permafrosts (Shi et al. 1997), ou sols
une des premires tudes mettant en vidence la prsence de de toundra (Zhou et al., 1997),
nouvelles lignes de Planctomycetales (Liesack et Stackebrandt, 1992) sols arides (Kuske et al., 1997; Dunbar et al.,
suivit des travaux de Stackebrandt et al. (1993), 1999),
communaut bactrienne des ptures (Borneman et al., 1996; Lloyd- sols hypersals : Mer Morte (Arahal et al., 1996),
Jones et Lau, 1998; McCaig et al., 1999) marais salants et marcages (Martnez-Murcia et
tude des mthanotrophes et des mthylotrophes dans des sols al., 1995; Nbel et al., 1999)
anoxiques ou "fluchs" en CH 4 (vres et al., 1998), aprs culture fumier et compost (Blanc et al., 1997; Kowalchuk
d'enrichissement (Jensen et al., 1998), et al., 1999).
approche gnrale (Picard et al., 1992; Ueda et al., 1995; Lee et al., sols pollus par le plomb et bactries rsistantes
1996b), associes (Konopka et Zakharova, 1999; Konopka et
approche de la diversit par analyse du G+C% et la rassociation de al., 1999)
l'ADN gnomique et par les mthodes de cultures classiques (Torsvik et
al., 1990 a et b).
D'autre part des recherches de plasmides susceptibles, par transfert horizontal, d'tre vecteurs
de rsistance aux antibiotiques ont t ralises en utilisant des techniques d'extraction directes sur
diffrents chantillons de sols (Gtz et al., 1996). Des techniques similaires ont t utilises pour
dtecter des entrovirus dans des sols amends par des boues actives (Straub et al., 1995).
D'autres techniques s'attachent amplifier ou hybrider spcifiquement certains types de micro-
organismes l'aide d'amorces et de sondes espces- ou sous espces- spcifiques, ou rechercher
des mtabolismes ou des gnes impliqus dans des mcanismes de rsistance (cf. tableau 2.2).
51
Tableau 2.2. Etudes de micro-organismes ou de mtabolismes spcifiques

Recherche d'une espce spcifique Recherche d'un mtabolisme ou d'une rsistance
une espce de Mycobacterium (Briglia et al., 1996), la mthane monooxygnase (gnes mmo) et la mthanol
un Bacillus incultivable (Felske et al., 1998b; Felske, 1999) et deshydrognase (gnes mxaF) des micro-organismes
une souche associe aux Verucomicrobiales (Felske et mthanotrophes (McDonald et al., 1995; Henckel et al., 1999),
Akkermans, 1998b) dtects en grande quantit par une tude de le gne mcr des mthanognes dans des chantillons de
diversit gnrale, tourbires (Nercessian et al, 1999),
des Acidobacterium (Barns et al., 1999), la nitrognase rductase (gne nifH) (Widmer et al., 1999),
des Pseudomonas par une approche traditionnelle de culture et sous unit du gne codant pour la coenzyme M rductase
d'amplification (Johnsen et al., 1999), (Hales et al., 1996),
des Leptothrix et des Sphaerotilus impliqus dans les processus l'ammoniaque monooxygnase (gne amoA) (Rotthauwe et al.,
d'oxydation du fer et du manganse (Siering et Ghiorse, 1997), 1997),
des Sphingomonas hybrids l'aide d'une sonde spcifique et la rsistance au mercure (gne mer) (Bruce et al., 1992),
quantifis par cytomtrie en flux (Thomas et al., 1997)., la rsistance au cadmium au cobalt et au zinc (Diels et
des Proteobacteria oxydant l'ammoniaque genresMergeay, 1990),
Nitrosomonas et Nitrospira dans des sols cultivs (Stephen et dgradation des PCB (polychlorinated biphenyl) (Walia et al.,
al., 1996, 1998) ou par DGGE dans des sables dunaires 1990).
(Kowalchuk et al., 1997) ou dans des sols cultivs (Bruns et al.,
1999),
des bactries sulfato-rductrices dans le sol (Telang et al.,
1994; Devereux et al., 1996) ou au niveau de la rhizosphre
d'une plante colonisant les marais salants (Hines et al., 1999).
On notera en particulier les tudes ralises pour tudier les
bactries magntotactiques dont la prsence dans les sdiments
fossiles est le tmoin des variations du champ
lectromagntique terrestre (Spring et al., 1992, 1998; Thornhill
et al., 1995).
Si les micro-organismes colonisant les couches superficielles du sol ont fait l'objet de
nombreuses tudes et ont mme conduit la cration d'une discipline part entire (la microbiologie
des sols), les couches stratigraphiques plus profondes sont moins bien connues et les micro-
organismes qui s'y dveloppent ne sont tudis que depuis rcemment.
3.2 La biosphre souterraine
3.2.1 Description de l'habitat

L'habitat souterrain est dfini comme celui compris au dessous de 8 mtres pour les habitats
terrestres et en dessous de 10 cm pour les sdiments marins. En terme de volume c'est le plus gros
habitat colonisable sur le globe. Il est constitu de roches magmatiques (basaltes, granites) et de
roches sdimentaires (les argiles par exemple). La temprature et la pression y croissent mesure que
la profondeur augmente. On considre que la limite infrieure de colonisation de la lithosphre ne
s'tend pas en dessous de 4 km o la temprature atteint 125C et avoisine la temprature limite de la
vie procaryotique (Whitman et al., 1998).
52
3.2.2 Le concept de biosphre souterraine

La notion de biosphre souterraine est ne au dbut des annes 90, en particulier grce aux
rflexions d'un astronome, Thomas Gold, qui le premier supposa qu'il pouvait exister dans la crote
terrestre (ou dans l'quivalent extra-terrestre) des conditions physico-chimiques pouvant permettre la
vie de micro-organismes tout fait indpendamment de la surface (Gold, 1992). On considrait
jusqu'alors que les micro-organismes souterrains taient essentiellement des chimioorganotrophes se
dveloppant trs lentement en mtabolisant les restes de matire organique qui s'infiltraient dans les
couches stratigraphiques profondes (Arrage et al., 1993; Paul et al., 1995). Les tudes ralises par la
suite par des microbiologistes dans les environnements tels que les sources hydrothermales (Deming
et Baross, 1993), les sdiments profonds (Parkes et al., 1994; Wellsbury et al., 1997) ou les puits de
ptrole (Bernard et al., 1992, L'Haridon et al., 1995), ainsi que les travaux de Yayanos et al. (1981;
Yayanos, 1995) sur les souches barophiles des fosses ocaniques, permirent de confirmer en partie
les hypothses de Gold. D'une part les souches thermophiles isoles en profondeur avaient une
pression optimale de croissance suprieure la pression laquelle elles avaient t rcoltes (ce qui
laissait supposer une origine plus profonde), d'autre part on retrouvait dans des environnements trs
loigns gographiquement, mais tous proches de la lithosphre (rservoirs ptroliers et sources
hydrothermales), les mmes espces de procaryotes, enfin les prlvements effectus dans des
sdiments marins profonds indiquaient la prsence de micro-organismes jusqu' 750 mtres de
profondeur des teneurs encore leves (1,8.106 bactries/g). Par ailleurs l'tude d'aquifres
basaltiques profonds par des mthodes molculaires et des mthodes de cultures classiques a
indiqu la prsence de micro-organismes chimiolithotrophes anarobies (BSR, mthanognes,
homoactognes) (Kotelnikova et Pedersen, 1997; Kotelnikova et al., 1998, Motamedi et Pedersen,
1998) ou thermophiles (Szewzyk et al., 1994; Boone et al., 1995) dont le mtabolisme (source de
carbone et d'nergie) pourrait entirement driver de composs librs par la lithosphre (Stevens et
McKinley, 1995). Ainsi H2 ne driverait pas de la dcomposition anoxique de la matire organique mais
de la raction de l'eau sur les basaltes et pourrait ainsi servir de donneur d'lectrons dans des ractions
o interviendraient en tant qu'accepteurs le CO2 ou le SO 42- prsents sous une forme inorganique
dans les couches profondes (cf. ractions ci dessous).
Production de H2 inorganique : 2FeO (basaltes) + H2O H2 + Fe2O3

Mthanogense : 4H2 + CO2 CH4 + 2H2O
Actogense : 4H2 + 2HCO3- + H+ CH3COO- + 4H2O
Rduction des sulfates : 4H 2 + SO42- + H+ HS- + 4H2O
Cette hypothse a t rfute rcemment par Anderson et al. (1998) car selon eux la
production de H 2 au pH in situ (pH8) ne peut tre suffisante pour pouvoir soutenir la croissance
chimiolithotrophique de toute la biomasse souterraine. Ils attribuent la croissance des micro-
organismes la matire organique emprisonne dans les sdiments, ou apporte par l'eau des
aquifres. Ils n'excluent toutefois pas la possibilit que cette croissance soit lie aux gaz rduits
53
provenant de couches stratigraphiques infrieures et percolant au travers de la lithosphre, comme

l'avait propos Thomas Gold.
3.2.3 La communaut microbienne souterraine

Les micro-organismes se dveloppant dans cette biosphre ne sont tudis que depuis une
quinzaine d'annes. L'intrt pour l'tude de la biosphre souterraine s'est accru ds lors que
l'homme a d trouver de nouveaux espaces pour enterrer des dchets. Il s'agissait particulirement de
se dfaire des dchets ultimes radioactifs des centrales nuclaires. Cet enfouissement tait ralis
dans des zones granitiques ou argileuses o les dchets pouvaient entrer en contact avec de l'eau
d'aquifre. Ces eaux charges en micro-organismes pouvaient acclrer la corrosion des contenants
dchets et favoriser la dispersion des radionuclides (Pedersen, 1996a; Santo Domingo et al., 1998a;
White et al., 1998). D'autre part l'tude de la flore souterraine permettait de suivre la dgradation de
polluants tels que les hydrocarbures ou les solvants chlors (Dojka et al., 1998; Klier et al. 1999). De
plus, on suppose que les micro-organismes interagissent avec les roches dans des processus de
formation de minraux (formation de silicates, de carbonates ou initiation de sites de nuclation des
minraux) comme dans des processus de dgradation (lixiviation) (Torsvik, 1997; Douglas et
Beveridge, 1998; Fisk et al, 1998). L'intrt pour ces micro-organismes s'est traduit par la mise en
place de sections spcialises dans l'tude de micro-organismes au sein des programmes de forages
ocaniques (O cean Drilling P roject) et par la constitution (par le Departement of E nergy des Etats-
Unis) d'une collection de souches isoles spcifiquement d'environnements souterrains (Stim, 1994;
Reeves et al., 1996; Balkwill et al., 1997). Cette collection ayant t ralise partir de techniques de
cultures traditionnelles, mettant en jeu des milieux de culture classiques pour htrotrophes arobies,
les souches isoles ne pouvaient que partiellement rendre compte de l'entire diversit du milieu.
Les tudes ralises notamment par Pedersen sur des forages d'aquifres profonds ont
quant elles mis en vidence des squences trs diverses pouvant correspondre aussi bien des
souches arobies qu'anarobies. Elles se rpartissent dans 11 branches du domaine bactrien et 5
nouvelles branches (Ekendahl et Pedersen., 1994; Pedersen et al., 1996 a, b, 1997). D'autre part,
des reprsentants des Proteobacteria , , , et , des Firmicutes haut et bas G+C%, des
Cytophagales (ex-C.F.B) ont t retrouvs de nombreuses reprises dans diffrents gisements
(Boivin-Jahns et al., 1996; Barns et Nierzwicki-Bauer, 1997; Chandler et al. 1997, 1998; Fry et al.,
1997; Stroes-Gascoyne et al., 1997). Rcemment Crozier et al. (1999) ont tudi les indices de
biodiversit partir des diffrentes squences collectes sur le site Oklo par l'quipe de Pedersen. 5
sites ont t compars et les rsultats semblent indiquer que, dans aucune des tudes, l'ensemble de
la population n'a pu tre dtect (par clonage et squenage). Les similitudes de population entre
sites de prlvement sont discutes en fonction de leur caractristiques physiques.
54
Une tude a permis de comparer l'effet d'une pollution par des carburants sur la flore
microbienne dans un aquifre l'aide de sondes spcifiques (domaine, classe, phylum, etc.) et de
ritrer cette exprience au laboratoire en fermenteur aliment en nitrates (Shi et al., 1999) 8.
La majeure partie des tudes ralises dans de tels environnements a port sur l'analyse de la
diversit l'aide du gne de l'ADNr 16S, mais quelques tudes ont port sur l'analyse de la naphtalne
dioxygnase (gne nahAc) (Herrick et al., 1993; Wilson et al., 1999).
L'utilisation des techniques molculaires a permis d'accrotre considrablement nos
connaissances sur la flore souterraine mais, comme dans tous les milieux o ces techniques ont t
utilises, un gros effort reste raliser pour amliorer les techniques d'chantillonnage (asepsie,
pression), en particulier pour les sites profonds, ainsi que les techniques de culture (prise en compte
des gaz disponibles sur le lieu d'chantillonnage, techniques d'enrichissement in situ).
3.2.4 Des profondeurs aux astres

Le concept de biosphre souterraine intresse particulirement les exobiologistes. Les
observations de chimie microbienne base de H2S, CO 2, Fe 3+ (Vargas et al., 1998), de minraux
rducteurs, et en quasi absence d'eau liquide, permettent d'extrapoler cette chimie prbiotique
d'autres plantes du systme solaire (ou leurs satellites) o ces composs sont prsents en grande
quantit (Brack, 1999; Brack et Raulin, 1999).
Il y a 20 ans alors que les premires sources hydrothermales taient dcouvertes, la sonde
Voyager mettait en vidence une activit volcanique sur deux satellites de Jupiter, Io et Gaymde. A la
surface d'Europe (un autre satellite de Jupiter) il a t observ des plaques (de nature inconnue) qui
se dplaceraient sur un fluide (liquide ou gazeux). Il y a de fortes prsomptions pour que ces plaques
soient des glaces d'eau qui se dplacent sur un ocan d'eau liquide. Les mouvements des plaques
sont attribuer des phnomnes de courants lis une mare due la force gravitationnelle de
Jupiter ou la prsence d'un noyau chaud au centre du satellite. Si ce noyau existe il est probable que
des phnomnes d'hydrothermalisme soient observables sur Europe. Aujourd'hui un programme
spatial a t initi afin de prlever des chantillons sur ce satellite et rechercher des traces de vie
proximit de sites hydrothermaux (Delaney, 1998).
La dcouverte (McKay et al., 1996) (conteste par Mc Coy, 1997) de formes associes des
micro-organismes dans la mtorite martienne ALH84001, (bien que ces formes n'atteignent que 380
nm de long !?) a permis de relancer, en plus de nouveaux crdits pour la NASA, le concept d'une vie
extraterrestre martienne (Carr, 1996; Farmer, 1996; McKay, 1997). Cette dcouverte ravive de plus
l'ide qu'un fort bombardement mtorique aurait pu initier la chimie prbiotique terrestre, c'est le
concept de panspermie (Brack et Pillinger, 1998) ou au contraire supprimer toute forme de vie et
induire la division tripartite du monde vivant (Gogarten-Boekels et al., 1995).
8
Une tude sur un environnement similaire a t ralise par Bekins et al. (1999) en utilisant une approche culturale : NPP (MPN) et
enrichissement de mtabolismes spcifiques (mthanognes, flore arobie, flore fermentative, etc.). Rooney-Varga et al. (1999) ont
analys par amplification et squenage la flore anarobie associe la dgradation des benznes dans un aquifre contamin.
55
1 2 3
1-Sdimentation de la matire organique 2-Recouvrement de la matire 3-Phnomnes gologiques de

organique par des couches sableuses mouvements du terrain (tectonique)
(jaune) et impermables (vert)
4 5 6
4-Phnomnes gologiques de 5 et 6 Migration de lhuile (vert clair) du gaz (rouge) et de leau (bleu cyan) dans la
transformation de la matire organique roche rservoir (jaune) jusqu atteindre la roche couverture (vert)
sous leffet de la pression et de la
temprature (mtamorphisme)
Figure 2.2. Mcanismes de formation du ptrole

images daprs le site Total (http://www.total.com)
3.3 Les rservoirs ptroliers
3.3.1. Formation et production du ptrole

3.3.1.1 La formation du ptrole
Le ptrole rsulte de la transformation de la matire organique en hydrocarbures. Les dbris
vgtaux ou animaux sont thoriquement dgrads par les micro-organismes, mais certains
chappent cette dgradation. Ils se dposent au fond des mers fermes, des lagunes, des lacs, des
deltas ou d'autres milieux aquatiques pauvres en oxygne. Protgs de l'action des bactries, les
matires organiques se mlangent des sdiments (sable, argile, sel...) et s'accumulent au fond des
ocans o ils sont recouverts par la suite d'autres sdiments plus jeunes. Par leur propre masse, ces
couches sdimentaires s'enfoncent naturellement. Les mouvements tectoniques qui agitent la
lithosphre les cassent, et les entranent plus profondment dans l'corce terrestre.
Lors de cet enfouissement, pression et temprature s'accroissent jusqu'au point o ces dbris
se transforment en hydrocarbures et sont expulss de leur matrice originelle. L'azote et l'oxygne sont
limins pour ne laisser que des molcules formes de carbone et d'hydrogne qui constituent les
hydrocarbures liquides et gazeux qui se retrouvent au sein d'une roche, appele roche mre. Moins
denses que l'eau, les hydrocarbures vont migrer vers la surface profitant de microcavits et de fissures
du sol. Si rien ne les arrte, ils s'chappent et suintent la surface ou bien se solidifient en bitume en
perdant leurs constituants volatils. Mais si au cours de leur migration, les hydrocarbures rencontrent
une couche impermable qu'on nomme la couverture, ils seront bloqus par cette barrire rocheuse
tanche. Pigs dans les interstices microscopiques et les fissures d'une roche dite roche rservoir,
ils vont constituer le rservoir de ptrole (cf. figure 2.2).
3.3.1.2 L'exploitation et la production du ptrole

Les premires traces d'utilisation du ptrole par d'homme datent de la haute antiquit, en
Msopotamie. Ramass en surface, le ptrole servait alors dans des prparations mdicinales, comme
combustible d'clairage ou pour tancher les bateaux (calfatage). Il faut attendre 1859 pour qu'en
Pennsylvanie le "colonel" Drake initie les premiers forages ptroliers qui taient alors de quelques
mtres de profondeur (cf. figures 2.3 et 2.4).
Figure 2.3. Premier

puits commercial Figure 2.4. Deux ans
d'Edwin Drake, plus tard exploitation
Titusville, Run Creeks,
Pennsylvanie, 1859 Pennsylvanie
Images site du D.O.E. agence "fossile energy" : http://www.fe.doe.gov/
Actuellement les forages peuvent atteindre des profondeurs de plusieurs milliers de mtres.
La premire phase d'une exploitation passe par l'exploration du site. A l'aide de techniques sismiques,
gravimtriques ou magntomtriques, des gologues et des gophysiciens dfinissent les proprits
56
physiques du sous sol et confirment la prsence d'hydrocarbures. La mise en vidence directe

s'opre par forage.
La production consistera rcuprer les hydrocarbures. Ils remontent la surface sous l'effet
naturel de la pression dans le gisement. Cinq 20% du ptrole est ainsi extrait. Afin d'accrotre le taux
de production des gisements, des techniques de rcupration secondaire sont mises en place. L'une
d'entre elle consiste injecter de l'eau ou du gaz au fond des puits afin d'y exercer une pression. La
rcupration peut alors atteindre 35%. Pour rcuprer le maximum des 65% restants, des techniques
d'extraction tertiaires ont t mises au point. Elles consistent en des procds complexes qui
amliorent le drainage du ptrole : injection de vapeur, injection d'eau additionne de produits
chimiques, injection de gaz miscible, combustion in situ. (Sources : TOTAL http://www.total.com et
ELF http://www.elf.fr).
Lorsque l'extraction du ptrole devient moins rentable, les grosses socits ptrolires (ELF,
TOTAL, EXXON) cdent leur place de petites socits qui se chargent de tarir la nappe en injectant
plus d'eau lors de l'extraction.
3.3.2. Composition physico-chimique du biotope

Les micro-organismes que l'on peut s'attendre trouver dans la nappe de ptrole se trouvent
en ralit dans la phase aqueuse pige avec l'huile et les gaz sous la roche couverture.
Dans cette eau, appele de production, les conditions physico-chimiques sont variables selon
les puits analyss, mais elles sont gnralement anoxiques et lgrement acides du fait de la
dissolution du CO2 ou de l'H2S (pH entre 3 et 7). La temprature du puits est fonction de sa profondeur
: raison d'une augmentation de la temprature de 3C tous les 100 m, la temprature de certains puits
peut atteindre 130 150C (gnralement de 60 130C, Beeder et al., 1994). Selon la profondeur
du puits la pression au sein de la nappe va varier entre 150 et 400 bars. En outre la salinit des puits
peut tre trs leve. Celle-ci dpend de la salinit de la roche mre au sein de laquelle la nappe va
tre emprisonne et peut varier entre 0 et 300 g.l-1 de sels totaux (NaCl, MgCl2, KCl essentiellement)
(pour revue Magot et al., 1999; Ravot, 1996).
L'analyse des accepteurs et donneurs d'lectrons potentiels dans la nappe de ptrole souffre
d'un cruel manque de donnes. En effet les industriels ne collectent pas de faon routinire les
donnes concernant par exemple le phosphore ou les nitrates. On estime toutefois que le potentiel
redox des eaux de production est relativement bas et que des accepteurs comme l'oxygne, les
nitrates et le fer ferrique sont gnralement absents. Par contre la prsence de sulfates et de
carbonates laisse supposer que les mtabolismes que l'on peut esprer rencontrer sont la sulfato-
rduction, la mthanogense, l'actogense et les fermentations. Les donneurs d'lectrons sont
quant eux l'H 2 d'origine biotique et abiotique ainsi que des molcules organiques. Les acides
organiques comme l'actate, le formate, le propionate et le butyrate sont souvent dtects dans les
puits de ptrole, mais on dtecte aussi des acides plus complexes. Si la dgradation arobie de
nombreuses molcules organiques prsentes dans le ptrole a souvent t dmontre (n-alcanes et
57
alkylbenznes), ce n'est que trs rcemment que des preuves d'une potentielle dgradation
anarobie de ces composs ont t apportes (Ruetter et al., 1994; Connan et al., 1996; Heider et al.,
1999; Zengler et al., 1999). De plus des composs comme les rsines et les asphaltnes, structures
riches en soufre, azote et oxygne, prsentes en grandes quantits dans les huiles, pourraient servir
de sources de carbone et d'nergie des micro-organismes anarobies (Magot, communication
personnelle). Enfin la production anarobie de l'hydrogne lors de la raction de l'eau avec du basalte
pourrait servir de donneur des hydrognotrophes tels que les micro-organismes mthanognes, les
sulfatorducteurs et homoactognes (Stevens et McKinley, 1995) (voir 3.2.2).
3.3.3. La diversit microbienne des puits de ptrole

Mme si la prsence des micro-organismes dans les puits de ptrole a t tablie depuis
longtemps, c'est seulement depuis une dizaine d'annes que les industries ptrolires ont pris en
compte le rle de ces micro-organismes dans la formation des huiles et les problmes lis la
dgradation des systmes d'extraction. La premire tude de la flore microbienne associe aux puits
de ptrole a mis en vidence des bactries sulfato-rductrices (Bastin, 1926), et ds cette poque
l'auteur s'est interrog sur la nature endmique des souches tudies. La microflore des gisements
ptroliers est relativement peu diversifie (Ravot, 1996). On retrouve principalement des micro-
organismes anarobies qui appartiennent aux deux rgnes des Procaryotes : Archaea et Bacteria. On
a cependant mis en vidence la prsence dorganismes arobies dont l'origine semble tre exogne.
3.3.3.1 La colonisation exogne des gisements de ptrole

L'tude de la flore des nappes de ptrole pose le dlicat problme de l'origine des micro-
organismes prsents dans l'chantillon tudi. En effet, le mcanisme d'extraction du ptrole,
notamment les techniques d'extraction secondaires et tertiaires, sont des sources non ngligeables
de contamination de la nappe de ptrole.
L'eau injecte dans la nappe peut avoir diverses origines :
eau d'un rseau interne l'entreprise de forage : injecte, rcupre, traite et rinjecte,
eau de rivire ou de mer dans le cas d'exploitation "offshore",
eau de nappe phratique adjacente la nappe de ptrole,
eau de consommation courante lorsque qu'aucune nappe souterraine n'est proche du puits ou
lorsque ce puits est trop loign du site de production pour tre aliment par un rseau d'eau
interne.
- La contamination peut aussi provenir du matriel utilis. Les ttes de forage et les canalisations
peuvent perturber la composition initiale de la nappe. La nature de ces dernires favorise
particulirement le dveloppement de bactries sulfato-rductrices (BSR) qui en se multipliant en
biofilm autour des canalisations provoquent une dgradation acclre des installations connue sous
le terme de "pitting".
58
Enfin, les micro-organismes prsents dans les diffrentes couches stratigraphiques qui surmontent
la nappe peuvent eux aussi contaminer l'eau de production. Dans les couches superficielles on
retrouve des micro-organismes chimio-organotrophes se dveloppant sur la matire organique
prsente en grande quantit dans le sol. Il s'agit de souches arobies ou anarobies qui interviennent
dans les cycle de l'azote, du soufre et des mtaux. Dans les couches plus profondes on retrouve une
flore plus spcifique (voir 3.2.).
Des tudes menes sur diffrents gisements ont indiqu que certains puits de ptrole taient
striles. Ces gisements pouvaient tre classs en trois catgories diffrentes :
Les puits dont la temprature dpassait 82C, ce qui semble correspondre la temprature pour
laquelle aucune biodgradation des huiles n'a t observe (Philipi, 1977). Il faut toutefois noter
qu'il a t possible d'isoler des micro-organismes thermophiles et hyperthermophiles ayant des
optima de croissance suprieurs 85C dans les puits de ptrole terrestres et marins (Stetter et al.,
1993; Jeanthon et al., 1995; L'Haridon et al., 1995; Ravot et al., 1995b). La temprature leve
des puits n'est donc pas un critre d'absence de micro-organismes. On estime toutefois que les
gisements dont la temprature dpasse les 130 150C (temprature frquemment observe
dans des puits profonds) sont striles. Les processus indispensables la "machinerie cellulaire" ne
peuvent se drouler convenablement de telles tempratures.
Les puits dont la temprature est suprieure 50C mais dont la salinit tait suprieure celle de
l'eau de mer (Bernard et al., 1992). Cette dernire donne corrobore l'incapacit actuelle des
microbiologistes isoler des souches la fois halophiles et thermophiles.
Enfin des gisements dont les caractristiques physico-chimiques les rendraient favorables au
dveloppement de micro-organismes, mais dont le parcours gologique a port ces gisements
des tempratures plus leves que la temprature actuelle ce qui a eu pour effet de "striliser" la
nappe de ptrole (Bernard et al., 1992).
3.3.3.2 Les micro-organismes des gisements ptroliers

Les techniques molculaires n'ont t que trs peu utilises dans les rservoirs ptroliers
comparativement d'autres environnements. La majeure partie des tudes a t initie par Gerrit
Voordouw. Elles consistent en une tude par hybridation gnomique inverse sur des cultures
d'enrichissement et par squenage des ADNr 16S (Voordouw et al., 1991, 1992, 1996; Leu et al.,
1998). Les travaux de Voordouw et de Leu ont permis de dtecter, en plus des BSR, la prsence de
micro-organismes arobies ou anarobies facultatifs semblables ceux trouvs dans les eaux de
surface (genres Bacillus, Micrococcus, Pseudomonas). Mais il a t galement possible de dtecter
(amplification de l'ADNr 16S) des micro-organismes associs aux genres microarophiles :
Oceanospirillum, Thiomicrospira et Campylobacter. Une souche nomme CVO associe aux
Campylobacter a d'ailleurs t isole par Voordouw et al. (1996) partir de cultures d'enrichissement
sur milieu pour Thiomicrospira denitrificans. Les Campylobacter et les Thiomicrospira pourraient trouver
une niche de dveloppement au sein de la nappe de ptrole dans des cavits micro-ares de la
59
roche mre et pourraient intervenir dans la roxydation des sulfures (aprs rduction des sulfates par
les BSR) en utilisant les nitrates ou les nitrites comme accepteurs d'lectrons (Voordouw et al., 1996).
Si ces micro-organismes peuvent tre anarobies facultatifs, leur caractre indigne peut tre
contestable : aussi considre-t-on plus srement comme indignes des micro-organismes anarobies.
Parmi ceux-ci les micro-organismes sulfato-rducteurs, fermentaires ou homoactognes sont les plus
frquemment retrouvs dans les tudes de diversit par une approche classique de culture.
Les micro-organismes sulfato-rducteurs
Les micro-organismes sulfato-rducteurs reprsentent la grande majorit des micro-

organismes endognes aux gisements de ptrole. Ces organismes anarobies stricts (du domaine
des Bacteria comme des Archaea) ont la particularit d'utiliser les ions sulfate SO42- comme accepteurs
d'lectrons dans des oxydations gnratrices d'ATP. Les ions SO42- sont rduits en plusieurs tapes
mtaboliques en soufre lmentaire (ions sulfure S2- en gnral) qui, lorsqu'il est libr ragit avec les
molcules d'H 2O pour donner du sulfure d'hydrogne H2S en conditions acides, d'o la prsence de
ce gaz en trs grandes quantits dans les rservoirs.
Il a t prouv galement que ces bactries ont la proprit de rguler leur environnement,
c'est--dire le biofilm, par une diminution ou une augmentation de la consommation d'ions H+ . On
distingue parmi ces micro-organismes les msophiles, impliqus dans la prcipitation de sulfures de fer
ou pitting (fer provenant des systmes d'extraction) et les thermophiles impliqus dans les
phnomnes d'acidification du rservoir.
Le tableau 2.3 numre les souches et genres sulfato-rducteurs couramment isols dans les
gisements ptroliers (d'aprs Magot et al. 1999).
Tableau 2.3. Micro-organismes sulfato-rducteurs isols de rservoirs ptroliers.
Bacteria Archaea
Sulfato rducteur msophile Sulfato rducteur thermophile Sulfato rducteur hyperthermophile
Genre Desulfovibrio Genre Desulfotomaculum Genre Archaeoglobus
Desulfotomaculum halophilum Desulfacinum infernum
Desulfomicrobium aspheronum Thermodesulforabdus novegicus
Genre Desulfobacter Thermodesulfobacterium mobile
Les mthanognes
Ces micro-organismes appartiennent exclusivement au domaine des Archaea. Ce sont des

anarobies stricts qui tirent leur nergie de la rduction du CO2 en oxydant H2 tout en produisant du
mthane (CH4). La mthanogense n'a t que rcemment dcrite au sein des gisements ptroliers.
Elle est souvent associe des puits riches en sels. Jusqu' prsent seules des souches msophiles
ou thermophiles modres ont t isoles de gisements ptroliers; aucune souche hyperthermophile
n'a pu tre isole de gisements en raison de la teneur en sel trop leve de ces derniers. Certaines
souches mthanognes sont capables de se dvelopper sur d'autres composs en C1 plus rduits
que le CO2, ce sont des mthanognes mthyloclastiques. Elles se dveloppent sur mthylamine
(CH3NH2), mthanol (CH3OH), dimthyl sulfures ((CH3)2S) (Madigan, 1996; Thauer, 1998). L'actate
60
(CH3COO-) prsent de trs fortes concentrations dans certains puits pourrait lui aussi servir de
substrat certaines mthanognes actoclastiques soit directement, soit en syntrophie avec d'autres
organismes actoclastiques ou actognes.
Parmi les souches mthanognes isoles d'environnements ptroliers on retrouve des micro-
organismes appartenant l'ordre des Methanobacteriales, des Methanoccoccales, des
Methanomicrobiales, des Methanosarcinales.
Les micro-organismes fermentaires
Les micro-organismes fermentaires sont des Archaea ou des Bacteria msophiles,

thermophiles ou hyperthermophiles htrotrophes, c'est--dire qu'ils utilisent de la matire organique,
comme les sucres ou les peptides, en tant que substrat nergtique en l'absence d'accepteur
d'lectron externe.
Les bactries msophiles sont le plus souvent des halophiles modres anarobies et
appartiennent au genre Haloanaerobium. Certaines de ces souches prsentent un intrt pour les
industriels car en produisant des acides, des solvants et des gaz partir des sucres elles pourraient
participer une augmentation du rendement d'extraction du ptrole (MEOR : microbial enhancement
oil recovery). Magot et al. (1999) rapportent l'isolement de deux bactries halophiles modres
appartenant aux genres Spirochaeta et Dethiosulfovibrio. Les techniques fondes sur l'tude des
ADNr 16S par amplification sur des enrichissements ont quant elles permis de dtecter la prsence
de micro-organismes potentiellement anarobies stricts ou facultatifs associs aux genres Clostridium,
Eubacterium et Synergistes (Voordouw et al., 1996).
Les bactries thermophiles appartiennent gnralement l'ordre des Thermotogales
pour lequel on retrouve dans les gisements, les genres Thermotoga, Geotoga et Petrotoga. Au sein
de cet ordre le genre Thermotoga regroupe les seuls micro-organismes du domaine des Bacteria
considrs comme hyperthermophiles. Il constitue une des branches phylogntiques les plus
ancestrales de ce domaine. Thermotoga, isole et identifie dans les gisements ptroliers, pourrait
jouer un rle dans les phnomnes de corrosion, en rduisant le thiosulfate en sulfures (Jeanthon et
al., 1995; Ravot et al., 1995a). En effet la rduction du soufre interviendrait en tant que mcanisme de
dtoxication en oxydant H2 produit lors de la fermentation. D'autres familles ont galement t
identifies dans des puits ptroliers comme les Thermoanaerobiaceae capables de rduire le
thiosulfate en soufre (Thermoanaerobacterium) ou en sulfures (Thermoanaerobacter) (Grassia et al.,
1996) et la souche Anaerobaculum thermoterrenum (Rees et al. 1997) capable de rduire le soufre et
le thiosulfate.
Des Archaea fermentaires ont, elles aussi, t identifies au sein des gisements de ptrole
(Stetter et al., 1993; L'Haridon et al., 1995). Elle appartiennent au genre Thermococcus et
Pyrococcus. Leur caractre endmique a t discut par Stetter (1993) mais leur capacit rduire le
soufre et le fer temprature leve en fait des candidats potentiels pour des phnomnes de
biocorrosion (Magot et al. 1994; Grassia et al. 1996; Magot, 1996).
61
Les bactrie s homoactognes et les bactries rductrices des mtaux
Les bactries homoactognes se caractrisent par une production exclusive d'actate partir
de CO2 et de H2. En dehors des composs gazeux habituels H 2 et CO2, elles peuvent rduire le CO2
partir d'autres composs en C1 ou de sucres. A ce jour, peu de bactries homoactognes ont t
mises en vidence en milieu ptrolier (Acetobacterium romashkowii par Davydova-Charakhch'yan et
al., 1992).
Magot et al. (1999) rapportent dans leur revue l'isolement au sein de gisements ptroliers de
micro-organismes bactriens capables de rduire le fer (Shewanella putrefaciens) ou le fer et le
manganse (Deferribacter thermophilus, Green et al., 1997). Le manque de donnes concernant le
cycle de ces composs au sein du gisement ne nous permet pas de dterminer le rle de ces micro-
organismes au sein de la nappe. Il semble toutefois que les processus de rduction du Fe (III) soient
trs largement rpartis dans le monde procaryotique en particulier au sein des genres thermophiles.
Aussi de nombreux genres initialement dcrits comme fermentatifs pourraient sous certaines
conditions respirer en anarobiose le fer ferrique (Slobodkin et Wiegel, 1997; Vargas et al., 1998;
Slobodkin et al., 1999).
3.3.4 Activit microbienne lie aux hydrocarbures

Les techniques d'exploration et de production d'hydrocarbures bnficient de nouvelles
informations fournies par les tudes microbiologiques : les proprits physiologiques des bactries
identifies pourraient renseigner sur la temprature du milieu. Ces tudes peuvent aussi tre un
indice pour montrer la correspondance entre deux gisements, apparemment distincts, si la flore
microbienne est similaire dans les deux puits. Un suivi rgulier de la flore peut permettre de s'assurer
de l'effet de certains biocides que les producteurs injectent dans les puits lors de l'extraction des
huiles pour se dfaire des BSR, ou dans les tanks pour limiter le dveloppement des souches oxydant
les hydrocarbures en prsence d'O2.
La dtection de certaines bactries peut galement annoncer un risque majeur pendant la
phase de production : la biocorrosion. Les BSR constituent le groupe majeur impliqu dans ce
phnomne. La corrosion provoque des dgts considrables sur le matriel, en particulier sur les
pipelines.
Mais la dgradation des hydrocarbures par des micro-organismes peut tre aussi mise profit
dans le cas de catastrophes cologiques majeures telles que l'chouage de ptrolier ou la rupture de
canalisations (Button et al., 1992). La dcomposition des hydrocarbures est alors assure par des
bactries arobies, des algues ou des champignons (Swanell et al., 1996). Les hydrocarbures
aliphatiques n'tant pas fermentables, leur dgradation se produit en prsence d'O2 sous l'action de
bactries telles que des Pseudomonas, des Corynebacterium ou des Mycobactries. Pour acclrer
le dveloppement de ces micro-organismes il est parfois ncessaire d'apporter des nutriments (azote
et phosphore) sous forme de "spray" en surface de la zone nettoyer. Les micro-organismes peuvent
aussi produire des surfactants qui peuvent acclrer la dispersion des hydrocarbures dans le cas de
62
pollution par des nappes de ptrole (Desai et Banat, 1997). Il est possible de suivre le dveloppement
et la prsence de ces souches en amplifiant ou en hybridant spcifiquement les gnes impliqus dans
le mtabolisme de dgradation des hydrocarbures (Guo et al., 1997): xylE : cathcol 2,3-dioxygnase,
tod : tolune dioxgnase, alkB : alcane hydroxylase, tmo : tolune monooxygnase, nahAcd :
composant de la naphtalne dioxygnase.
McNaughton et al. (1999) ont suivi, par mesure des profils lipidiques (PFLA) et DGGE (sur
ADNr 16S), l'volution des populations eucaryotiques et procaryotiques lors d'une pollution simule
aux hydrocarbures en eau de mer. Les deux techniques permettent de suivre la disparition des
eucaryotes au profit de bactries Gram - (Proteobacteria et Cytophagales).
Il est noter que certains micro-organismes eucaryotes produisent des hydrocarbures en C30 jusqu'
C36. Cette "production microbienne" de ptrole est ralise par l'algue verte Botryococcus braunii
(Dennis et Kolattukudy, 1991; Madigan, 1996).
Si les premires tudes molculaires des communauts microbiennes des sols s'attachaient
surtout dcrire la formidable diversit procaryotique qui s'y dveloppe, l'effort s'est dsormais port
sur l'analyse de l'activit et la taille des diffrentes populations. L'ensemble de ces informations devrait
permettre de mieux dfinir l'action de l'Homme dans cet environnement et notamment d'amliorer les
pratiques agriculturales et les processus de dgradation des dchets.
IV. Habitats aquatiques

Au mme titre que les habitats terrestres, on distingue trois habitats aquatiques physiquement
et chimiquement diffrents : l'eau douce (rivire, lac), l'eau de mer et les estuaires qui constituent la
frontire physique entre l'eau douce et l'eau de mer. Au sein de chaque habitat, de fortes variations
physiques et chimiques vont avoir lieu entre la surface de l'eau, la colonne d'eau et le fond. Ces
variations vont influer fortement sur la disponibilit en nutriments et donc sur la composition de la
communaut microbienne. D'autre part l'analyse de cette communaut est confronte au dlicat
problme de la nature endmique des souches isoles ou dtectes. Au mme titre que les tudes
ralises dans des environnements terrestres, les premires analyses effectues sur des chantillons
d'eau douce et d'eau de mer ont essentiellement permis d'isoler la flore arobie, htrotrophe,
correspondant majoritairement des bactries Gram - (Bertrand et Larsen, 1988). Ces bactries taient
en tout point semblables celles obtenues partir d'environnements terrestres et cette diversit
apparemment limite comparativement la multitude de formes observes en comptage direct laissait
prsager d'un biais norme dans les mthodes d'chantillonnage et de culture employes.
L'utilisation des mthodes molculaires ainsi que l'introduction de techniques plus fines d'observation
(microscopie, cytomtrie en flux) ont permis de rvler quel point les milieux aquatiques pouvaient
tre plus riches et diversifis que ce que les premires tudes culturales pouvaient laisser prsager.
63
4.1 L'habitat d'eau douce

Au mme titre que l'eau de mer, la composition microbiologique de l'eau douce des lacs et des
rivires sera fonction de la disponibilit du milieu en oxygne et en matire organique. Dans les rivires
et dans les lacs en hiver o on peut observer de trs forts courants de fond, toute la masse d'eau va
tre brasse, oxygne et alimente en matire organique. Par contre au cours de l't les couches
d'eau superficielles chauffes par le soleil et donc moins denses vont se disposer au dessus des eaux
plus froides et plus denses crant ainsi une stratification au sein de laquelle les micro-organismes
arobies vont coloniser prfrentiellement les couches suprieures en consommant activement la
matire organique. Les couches infrieures appauvries en oxygne vont tre colonises par les micro-
organismes micro-arophiles ou anarobies.
Au sein des rivires (mme avec un fort courant) un apport massif de matire organique (rejet
d'industrie, boues d'puration) peut entraner des conditions ponctuelles d'anarobiose qui peuvent
alors profondment perturber la composition de la communaut microbienne indigne.
Diffrentes mthodologies molculaires ont t mises profit afin d'tudier la population totale
microbienne :
par extraction des ARN bas poids molculaire (LMW RNA), lectrophorse et squenage des
bandes majoritaires partir d'chantillons d'eau d'un lac eutrophe (Hfle et al., 1999). La
comparaison des profils LMW RNA permet de suivre l'volution des populations au cours de l'anne.
Par amplification et squenage de l'ADNr 16S d'chantillons d'eau d'un lac de montagne (Hiorns et
al., 1997),
par amplification et DGGE sur des chantillons de diffrentes profondeurs d'un lac mromictique
(vres et al., 1997) et d'un fjord (Teske et al., 1996a),
par utilisation de sondes domaines- et phylum- spcifiques sur des chantillons de lac de montagne
(Alfreider et al., 1996; Pernthaler et al, 1998; Tonolla et al., 1998), d'eau de Fjord (Ramsing et al.,
1996), d'eau de rivire (Kenzaka et al., 1998),
Il a t aussi possible de dtecter des micro-organismes spcifiques tels que des bactries
sulfureuses pourpres associes aux Chromatiaceae dans la chmocline d'un lac suisse (Tonolla et al.,
1999), et des bactries ammonium oxydantes (Proteobacteria ) participant activement au cycle de
l'azote dans les sdiments lacustres ou dans les eaux de surface. La prsence de ces Proteobacteria
tait connue depuis longtemps mais elles taient difficilement dtectables par les techniques de
culture classiques (Voytek et Ward, 1995; Hastings et al., 1998; Speksnijder et al., 1998).
Une tude trs complte a t ralise par Priscu et al. (1998) afin d'analyser la diversit
biologique au sein de lacs gels en Antarctique. Au sein de cet environnement la temprature ne
dpasse pas 0C en t. Il est toutefois possible d'y observer une activit microbienne. Durant l't,
des poches d'eau liquide se crent l'intrieur de la glace et des sdiments parviennent atteindre
ces poches d'eau. Ces "oasis" permettent alors la croissance de bactries photoautotrophes
(cyanobactries) et htrotrophes ainsi que de certaines algues (Priscu et al., 1998; Psenner et
Sattler, 1999).
64
4.2 L'habitat maritime
4.2.1 Les micro-organismes marins isols

Les cosystmes marins peuvent tre considrs comme des environnements stressants en
raison de la salinit (3,5% soit 0,6M NaCl), de la pression (1 atm tous les 10 mtres; on considre que
90% des ocans correspondent des profondeurs suprieures 1000 mtres), de la temprature
(90% des ocans sont une temprature infrieure 5C).
On distingue communment dans cet habitat deux zones principales : les ocans et le littoral.
Les ocans sont pauvres en matire organique (oligotrophe) et taient donc considrs jusqu'il y a
peu comme pauvres en producteurs primaires, sauf lorsque certains courants permettent des
nutriments de profondeur de passer en surface comme au large du Prou et de la Californie. Les ctes
ocaniques quant elles sont des rgions riches en matires organiques (eutrophe), donc riches en
producteurs primaires et riches en poissons et en coquillages. Les premires tudes ralises l'aide
de techniques de culture classiques confirmrent ces hypothses. Les bactries isoles en haute mer
(Oceanospirillum, Vibrio, Photobacterium et Alteromonas) correspondaient des micro-organismes
htrotrophes prsents en trs faibles quantits (10 2 10 5 organismes/l). L'amlioration des
techniques de microscopie a permis au dbut des annes 80 de mettre en vidence au milieu des
ocans une diversit microbienne jusque l insouponne. Dans un premier temps des quipes
amricaines ont mis en vidence une abondante colonisation des eaux de haute mer par des
Cyanobactries associes au genre Synechococcus. Par la suite les techniques de cytomtrie en flux
permirent d'isoler le plus petit et le plus abondant des micro-organismes photosynthtiques connus :
Prochlorococcus. Ces deux micro-organismes cohabitent dans les ocans en colonisant des zones
concomitantes. Alors que les Synechococcus colonisent les eaux de surface bien claires et sont
prsents dans tous les ocans aussi bien oligotrophes qu'eutrophes, les Prochlorococcus colonisent
des zones plus oligotrophes et sont retrouvs des profondeurs plus importantes (pour revue
Madigan, 1996; Blanchot et al., 1998; Partensky et al, 1999).
4.2.2 L'utilisation des techniques molculaires

4.2.2.1 Le bactrioplancton ocanique et ctier
Les techniques molculaires bases sur l'identification directe des gnes codants pour l'ARNr
16S furent appliques trs rapidement aux chantillons d'eau de haute mer. L'une des premires
tudes a consist comparer plusieurs chantillons d'eau de mer par hybridation de l'ADN gnomique
total extrait (Lee et Fuhrrman, 1990). Chaque chantillon servait successivement de sonde et de cible.
Il tait alors possible de dterminer des similitudes entre les chantillons mais la diversit de ces
derniers tait encore inaccessible. Aprs la mise au point d'une technique d'chantillonnage
permettant de filtrer de trs grandes quantits d'eau de mer (Giovanonni et al., 1990a), les travaux de
l'quipe de Giovanonni et de DeLong (Giovanonni et al., 1990b; Britschgi et Giovannini, 1991;
Schmidt et al., 1991) permirent de confirmer la prsence d'une part (pour la moiti de la banque) de
65
squences associes aux Cyanobactries (Synechococcus et Prochlorococcus, ces derniers

n'taient alors pas dcrits) et d'autre part de squences associes aux Proteobacteria communment
isoles (Alteromonas, Vibrio, Pseudomonas pour les Proteobacteria et Caulobacter pour les
Proteobacteria ), ou ne correspondant aucun genre connu (clade SAR11). Par la suite des travaux
raliss sur de nouveaux sites permirent de confirmer l'ubiquit des squences prcdemment
dcrites comme le clade SAR11 mais aussi la prsence de squences associes aux Firmicutes haut
G+C%, aux Flavobactries (Fuhrman et al., 1993), aux bactries vertes non-sulfureuses (Giovannoni et
al., 1996). Rcemment une tude plus approfondie des squences proches des Actinobacteria a
confirm l'existence d'un clade de squences marines provenant d'chantillons ctiers et hauturiers
sur les ocans Pacifique et Atlantique (Rapp et al., 1999). Des tudes similaires ont t ralises
partir des squences proches des Proteobacteria associes au clade SAR11 (Fields et al., 1997), de
la sous-classe 3 des Proteobacteria 9 (Gonzalez et Moran, 1997) et des bactries sulfureuses vertes
associes au clade SAR 406 (Gordon et Giovannoni, 1996). Des tudes menes par une quipe
espagnole en Mditerrane permirent dans un premier temps de suivre les variations de la diversit
microbienne de diffrents chantillons (formes libres et attaches, variations de profondeur, variations
temporales) ceci par une tude uniquement fonde sur l'analyse des profils RFLP (Acinas et al, 1997)
puis par squenage des profils majeurs associs aux formes libres et attaches (Acinas et al, 1999).
L'approche suivie par Giuliano et al. (1999) sur des chantillons de surface et profonds de
Mditerrane consiste en une premire tape d'isolement par dilutions successives suivie d'une
analyse des squences d'ARNr 16S prsentes dans la dernire dilution. Cette technique conduit
l'identification de squences proches des Proteobacteria et et des Cytophagales mais elle ne
permet l'analyse que des micro-organismes majoritaires de l'chantillon.
Des tudes similaires ont t ralises sur les micro-organismes associs aux neiges marines
rvlant l encore une grande diversit de squences se rpartissant au sein de nombreux groupes
bactriens mais apparemment diffrents de ceux trouvs sous une forme libre dans la colonne d'eau
environnante (DeLong et al., 1993). On a retrouv des squences associes aux Proteobacteria (, ,
, ), aux Cytophagales, aux Planctomycetales, aux Verucomicrobiales (DeLong et al., 1993; Rath et
al., 1998). Une comparaison de la diversit bactrienne existant sous une forme libre ou sous une
forme associe avec des particules a t ralise par extraction de l'ADN et squenage de l'ARNr 16S
le long de la rivire Columbia (Crump et al., 1999). Les auteurs ont compar des prlvements dans la
rivire, dans l'estuaire et sur la cte et ont observ une plus grande diversit phylogntique au
niveau de l'estuaire.
Une des premires tudes ralises sur des sites ctiers a t effectue dans deux lagunes
franaises en baie d'Arcachon et dans une zone saumtre prs de Palavas (Benlloch et al., 1995).
Cette tude complte (comptage, mesure du mtabolisme et squenage) mettait en vidence une
diversit bactrienne plus importante dans l'chantillon eutrophe (Mditerrane) et une grande
diversit de micro-organismes majoritairement associs aux Cytophagales et aux Proteobacteria . Les
9
Il a t possible d'isoler des reprsentants de ce clade pralablement dtects par squenage.
66
analyses phylogniques de cette tude souffrent toutefois de la faible longueur d'ADNr 16S
squenc (210 pb). L'tude effectue sur des chantillons provenant de la cte Est des Etats-Unis
rvle encore une fois la prdominance des squences associes aux Proteobacteria et (75% de
la banque bactrienne de squences) (Rapp et al., 1997). Par contre les eaux ctires se distinguent
des eaux du large par la prsence de squences associes aux Proteobacteria (notamment
associes au mthylotrophes), l'absence de cyanobactries et l'abondance de squences plastidiales
(explique par l'absence de filtration de l'chantillon et l'abondante biomasse d'eucaryotes dans les
environnements ctiers). On note aussi la prsence de Cytophagales, d'Actinobacteria et de
Planctomyces comme dans les tudes prcdentes.
L'emploi de la DGGE a permis de comparer la composition du bactrioplancton sur deux
estuaires de la cte Californienne (Murray et al., 1996). Il a t ainsi possible de relier la variation de
types mtaboliques dtects par des techniques classiques d'incorporation de radioisotopes des
variations de phylotypes.
L'tude ralise par Suzuki et al. (1997) est particulirement intressante car elle compare les
rsultats d'une analyse directe des gnes codants pour l'ARNr 16S par squenage et RFLP ceux
obtenus aprs culture d'enrichissement sur milieu solide pour htrotrophes marins. Si les
Proteobacteria et sont bien les phylums les plus reprsents dans les deux banques de
squences, seules 4 squences d'isolats (sur 127) sont retrouves dans la banque
environnementale. De plus la diversit des squences est plus grande dans la banque de clones
environnementaux que dans la banque d'isolats. Cette tude nous permet d'observer la fois le biais
engendr par les techniques de culture classiques (la plupart des micro-organismes ne sont pas
prsents sous une forme cultivable) comme celui engendr par les techniques d'amplification
(l'ensemble des micro-organismes prsents dans l'chantillon n'a pas t dtect, soit il n'a pas t
amplifi, soit l'effort d'chantillonnage tait trop important pour le dtecter).
Enfin on peut citer l'tude ralise sur un msocosme constitu d'eau de mer
mditerranenne rendue eutrophe par addition d'azote et de phosphore (Pukall et al., 1999). Les
auteurs comparent les rsultats obtenus par extraction directe de l'ADN et squenage des ADNr 16S
ceux obtenus par isolement aprs dilutions successives. Parmi les 739 clones analyss (96 clones
squencs - le reste est discrimin par dot-blot) et les 128 souches isoles, les squences associes
Alteromonas macleodii prdominent largement dans les deux banques. Les auteurs s'interrogent
alors sur la trs forte micro-variabilit de squence qu'ils n'attribuent pas uniquement un grand
nombre d'oprons rrn dans cette souche mais un possible mcanisme adaptatif.
Les tudes molculaires des communauts bactriennes de l'eau mer ont confirm que les
techniques culturales n'avaient permis d'accder qu' une trs faible part de la diversit. Si on retrouve
toujours les mme grands groupes bactriens (Proteobacteria et , Cytophagales) de nouveaux
phyllums sont apparus proximit ou au sein de ces groupes. On peut considrer toutefois que l'un
des apports majeurs de l'approche molculaire dans l'tude des communauts microbiennes marines
a t la dcouverte, en grande quantit et de manire ubiquitaire, de deux grands groupes d'Archaea
67
rattachs aux Euryarchaeota et aux Crenarchaeota visiblement non associes des conditions
physico-chimiques extrmes.
4.2.2.1 L'archaeoplancton ocanique et ctier

En 1992, quelques mois d'intervalle, Fuhrman et al. (1992) et DeLong (1992) dtectent dans
des eaux prleves 100 et 500 m de profondeur dans l'ocan Pacifique (Fuhrman) et dans les eaux
ctires d'Amrique du Nord (DeLong) des squences de micro-organismes branchant profondment
la base des Crenarchaeota (Marine Group I - DeLong, 1992; Fuhrman et al., 1992; Fuhrman et al.,
1993) et des squences associes aux Euryarchaeota mais formant l encore un clade bien distinct
(Marine Group II - DeLong, 1992; Fuhrman et al., 1993). Leur abondance semble indiquer qu'elles
interviennent activement dans les cycles chimiques ocaniques et ne correspondraient donc pas
des micro-organismes au mtabolisme thermophile ou halophile comme le sont leur plus proches
"voisins" isols. De plus le G+C% de leur ADNr (I : 0,51, II : 0,55-0,57) est infrieur celui observ pour
des souches thermophiles (entre 0,60 et 0,69). DeLong propose alors que ces Archaea pourraient
correspondre soit des mthanognes soit des Archaea msophiles, arobies 10. Par la suite
l'analyse d'chantillons provenant d'eau de surface de l'Antarctique (DeLong et al., 1994) a confirm
l'abondance des Archaea dans le picoplancton marin (jusque 34% de la biomasse procaryotique).
Ensuite des squences associes au groupe I furent dtectes dans l'estomac d'une Holoturie (Mc
Inerney et al., 1995), parmi les symbiotes d'une ponge (Preston et al., 1996) et parmi d'autres
chantillons de bactrioplancton (Stein et al., 1996; McInerney, 1997). Des squences associes au
groupe II ont t dtectes dans l'estomac de poissons (van der Maarel et al., 1998). L'approche
utilise par Stein est particulirement sduisante quoique fastidieuse. Elle consiste cloner non pas
un produit d'amplification mais des fragments gnomiques extraits de l'environnement. On dispose
donc la fois de l'information phylogntique en recherchant dans la banque de fosmides les gnes
codants pour l'ARNr 16S 11 et d'informations sur le mtabolisme en analysant les autres gnes
contenus dans la banque. Il faut toutefois garder l'esprit que les gnes clons ne sont pas forcment
exprims. Enfin l'tude ralise par l'quipe de DeLong l'aide de sondes nucliques spcifiques des
groupes I et II semble indiquer une zonation dans la colonisation de la colonne d'eau. Le groupe I serait
dominant en profondeur alors que le groupe II prolifrerait en surface (Massana et al., 1997).
La dtection de nouvelles Crenarchaeota dans des chantillons de sol (Bintrim et al., 1997),
d'un champ de soja (Ueda et al., 1995), de sources chaudes terrestres (Barns et al., 1994) et marines
(Takai et Sako, 1999) et de sdiments lacustres (MacGregor et al., 1997), ainsi que les squences
d'Archaea associes au groupe II dtectes avec d'autres Euryarchaeota (proches des
10
Une tude ralise sur les thers lipidiques prsents dans la colonne d'eau associe ces derniers des Archaea mais leur nature les
distingue clairement des mthanognes (Hoefs et al., 1997 dans Vetriani et al, 1998). Les Crenarchaeota non thermophiles restent la
source principale de ttrathers lipidiques dans les chantillons de plancton marin (DeLong et al., 1998). Des Archaea mthanognes
ont toutefois t dtectes dans des chantillons d'eau de mer, associes des particules ou dans l'estomac de poissons (van der
Maarel et al., 1999)
11
Un "screening" plus complet de banque fosmidique a permis par la suite de dtecter des squences de clones associes aux
Panctonomycetales (Vergin et al., 1998).
68
Methanosarcinales et des Halophiles) dans des sdiments de marais salants (Munson et al., 1997) et
sur des racines de riz (Grokopf et al., 1998b) nous amne considrer ces "nouveaux" micro-
organismes comme les Archaea les plus reprsentes la surface du globe (Olsen, 1994; Schleper,
1999)12.
4.2.3 Les fosses ocaniques

Les fosses ocaniques constituent des environnements particulirement atypiques. En plus
de supporter des tempratures basses (2C) les micro-organismes (bien souvent psychrophiles) se
dveloppant dans de tels environnements (jusqu' 10000 mtres de profondeur) doivent supporter
de trs fortes pressions. On retrouve donc jusqu' 4000 mtres de profondeur des micro-organismes
barotolrants, entre 5000 et 6000 mtres de profondeur des micro-organismes barophiles et des
barophiles stricts des profondeurs avoisinants les 10000 mtres, ncessitant pour certains 700 bars
de pression minimale pour se dvelopper (Yayanos et al., 1981; Nogi et Kato, 1999).
Trs peu d'tudes ce jour ont mis profit les mthodes molculaires pour analyser les
chantillons provenant de fosses ocaniques. Seuls les travaux de Kato et al. (1997) et de
Yanagibayashi et al. (1999) associant les extractions directes et les techniques de culture en pression
et sans pression suivies d'extraction font rfrence. Rcemment Li et al. (1999) ont compar aprs
extraction de l'ADN total et squenage la composition de sdiments abyssaux prlevs diffrentes
profondeurs (entre 1159 m et 6482 m de profondeur). Ils n'ont pas observ de diffrences majeures
entre les chantillons domins, pour la plupart, par des squences proches de Pseudomonas, du
symbiote de Solemya velum ou des Proteobacteria .
4.3 Les zones sdimentaires marines et lacustres
4.3.1 Description du biotope

Interfaces entre le milieux terrestre et le milieu aquatique, entre des zones arobies et
anarobies, les sdiments sont le sige d'importants processus biogochimiques impliquant les
principaux cycles de matire (N, C, S, O). La disponibilit de ces diffrents constituants dans la couche
de sdiments ainsi que les changes de matires raliss avec l'eau vont entraner une forte zonation
des micro-organismes prsents dans les sdiments en fonction de leur type mtabolique et de leur
prfrendum (cf. figure 2.5).
12
Des tudes similaires celles effectues sur les Procaryotes ont t entreprises sur les picoeucaryotes ocaniques. En effet la taille
de ces organismes ainsi que la difficult les obtenir en culture ou maintenir les cultures pures ont favoris l'emploi de
mthodologies molculaires pour accder la diversit eucaryotique de certains chantillons (Lim, 1996; Guillou, 1999). L'une des
techniques consiste analyser les ADNr 16S plastidiaux contenus dans les banques de squences (Rapp et al., 1998). Les ADNr
plastidiaux constituent dans cette tude prs de 47% de la banque bactrienne.
69
En dehors des sdiments abyssaux qui sont ars sur plusieurs mtres, les sdiments
prsentent une couche oxygne trs fine et donc une succession de types respiratoires microbiens
trs rapide. On a donc affaire des micro-organismes ralisant des respirations arobies sur les toutes
premires couches de sdiments puis plus profondment des bactries fermentaires ou des bactries
ralisant des respirations anarobies en utilisant les nitrates (bactries dnitrifiantes), les sulfates
(bactries sulfato-rductrices) ou les carbonates (bactries mthanognes). De la mme faon un
gradient s'tablit entre les bactries arobies, anarobies facultatives, microarophiles et anarobies
strictes. La disponibilit de la matire organique va conditionner quant elle la prsence de micro-
organismes htrotrophes et chimio-autotrophes alors que le rayonnement lumineux la surface du
sdiment va favoriser la prsence de photoautotrophes.
Les techniques de culture classiques

AIR
Accepteurs
dlectrons
terminaux
ont conduit l'isolement de nombreux genres

ZONE AEROBIE
bactriens associs aux diffrents types

EAU
mtaboliques dcrits prcdemment. Parmi

O2
O2 Respiration arobie Bactries arobies les plus spectaculaires on peut citer

H2O
S
Fermentation Bactries
fermentatives
Bactries
+ sulfo-oxydantes Thiomargarita namibiensis, une bactrie sulfo-
H2S
NO 3-
NO3- Respiration nitrate Bactries dnitrifiantes oxydante accumulant les nitrates dans une
ZONE ANOXiQUE
N2
grande vsicule qui permet cet organisme

SEDIMENT
SO42-
Bactries
SO42- Respiration sulfate sulfato-rductrices
H2S
d'atteindre 750 m de diamtre (Schlulz et al.,
HCO3-
HCO3- Methanognse Bactries mthanognes 1999). C'est ce jour le plus gros Procaryote
CH4
connu. Dans ces zones o l'oxygne et l'H2S

coexistent sous forme de gradient (stables ou
Figure 2.5. Reprsentation schmatique des populations
bactriennes dans les couches de sdiments (d'aprs Marty et al., versatiles en raison des courants, de la mare,
1988).
des pluies qui remettent les sdiments en
suspension) on peut observer des micro-organismes accumulant le soufre sous forme de granules
internes Thioplaca ou Beggiatoa (Jrgensen et Gallardo, 1999; Teske et al., 1999) ou sous forme de
trs longs filaments externes crant de vritables rseaux "mycliens" dans les gradients d'O2 et d'H2S
(Taylor et Wirsen, 1997; Taylor et al., 1999).
4.3.2 Les techniques molculaires

L'application des techniques molculaires a contribu accrotre le nombre d'espces
dtectes dans cet environnement. Comme pour les tudes de sols, le problme principal a t
l'extraction d'ADN des chantillons de sdiments. Ds 1992 Rochelle et al. proposent des techniques
d'extraction couples des amplifications partir d'chantillons de diffrentes profondeurs. Par la
suite, les travaux d'extraction d'ADN partir d'chantillons de sols (cits 3.1.3) servirent de
rfrence.
70
Compte tenu du rle des bactries sulfato-rductrices dans les mcanismes de production
d'H 2S dans les sdiments, ces dernires ont t couramment tudies: soit aprs extraction de l'ADN
total de l'chantillon et amplification l'aide d'amorce spcifique des BSR affilies aux Proteobacteria
(Devereux et Mundfrom, 1994), soit aprs extraction et dtection l'aide de sondes spcifiques de
ces mmes BSR (Trimmer et al., 1997). Une tude rcente ralise sur des chantillons de sdiments
lacustres ctiers et profonds s'est attache tudier les BSR aprs isolement, squenage de l'ADNr
16S et empreinte gnomique ("genomic fingerprints") (Sass et al., 1998). Les auteurs ont ainsi
observ que mme si leur souches correspondaient majoritairement (70%) au mme genre
(Desulfovibrio) et prsentaient de trs fortes similarits d'ADNr 16S, leur contenu gnomique, et donc
leur capacit physiologique, taient trs variables. Ce rsultat permettrait d'attribuer l'hypervariabilit
de squences de phnotypes proches des souches ayant des rles mtaboliques distincts.
Des tudes s'intressant la diversit globale de l'chantillon ont t aussi ralises :
sur des chantillons de sdiments ctiers prs de Seattle (Etats-Unis) o malgr le peu de clones
analyss (22 essentiellement bactriens) les auteurs observent une grande diversit
phylogntique dans leur chantillon (Gray et Herwig, 1996). L'tude ralise par Wise et al. (1997)
sur des chantillons prlevs dans une baie en Caroline (Etats-Unis) avec peu de clones (35 clones
bactriens) dmontre encore cette trs grande diversit.
sur des chantillons marins provenant de sdiments sableux et boueux (Mer de Wadden en
Allemagne) hybrids l'aide d'un grand nombre de sondes sur diffrentes profondeurs (Llobet-
Brossa et al., 1998) 13. Un des points marquants de cette tude est la dtection de squences
associes aux Proteobacteria proches du genre Arcobacter.
sur des sdiments coquilliers continentaux o Vetriani et al. (1998) dtectent pour la premire fois
dans ce biotope des squences associes aux Archaea plagiques proches du groupe I et d'autres
proches du groupe II. Puis sur des sdiments profonds o ces squences sont de nouveau
dtectes (Vetriani et al., 1999)
des squences similaires sont dtectes (Crenarchaeota groupe II et mthanognes) dans des
sdiments d'un lac du Michigan (Etats-Unis) (MacGregor et al., 1997; Schleper et al., 1997a). Les
squences crearchaennes semblent tre plus abondantes dans la zone oxique du sdiment o
elles n'interviennent toutefois que pour 10% de l'ensemble des ARN archaens.
sur des sdiments lacustres d'origine postglaciaire sur lesquels une tude complte a t entreprise
(comptage total, comptage de bactries viables, culture, extraction et squenage) (Miskin et al.,
1998). Les 14 clones bactriens se rpartissent parmi les Firmicutes haut et bas G+C% et parmi les
Proteobacteria et , et 9 clones archaens sont quant eux associs aux mthanognes.
enfin sur des sdiments lacustres dats de plus de 9000 ans o des squences associes aux
bactries pourpres sulfureuses sont dtectes ( l'aide d'amorces genre-spcifique : Chromatium) et
analyses par DGGE et squenage (Coolen et Overmann, 1998).
13
Cette tude a t suivie d'une analyse plus pousse concernant les Proteobacteria soufre oxydantes du genre Thiomicrospira, par
comptage, culture, amplification et DGGE (Brinkhoff et al., 1998).
71
D'une manire similaire aux tudes menes partir d'chantillons de sols, la diversit
microbienne associe au sdiments marins ou lacustres s'avre tre trs importante. La part que
prennent chacun des groupes phylogntiques dtects dans les processus gochimiques reste
malgr tout encore dfinir. Si extraordinaire que semble tre la dcouverte de nouveaux phylums
archaens ou bactriens, il ne semble pas que ceux-ci interviennent de manire prpondrante dans
les communauts. Les tudes sont donc poursuivre en s'attachant a dfinir les rles que chaque
micro-organisme dtect peut tenir dans le biotope tudi.
4.4 Les sources hydrothermales ocaniques profondes

Les mouvements de la crote terrestre (ou tectonique des plaques) ont gnr la surface du
globe des zones d'anfractuosits o de l'eau (de mer ou douce) entre parfois en contact avec le
magma profond (cf. figure 2.6).
Figure 2.6. Reprsentation des zones d'accrtion et de subduction.
De droite gauche : cration de la lithosphre au niveau de la dorsale mdio ocanique. La surface du bassin ocanique s'accrot alors
que sur la gauche la plaque plus ancienne glisse sous une marge passive continentale. Cette subduction est accompagne de la
cration d'une faille profonde et l'accroissement de temprature sur cette zone de friction cre un arc volcanique (par exemple les les
japonaises) et une nouvelle zone d'accrtion dans le bassin arrire arc (d'aprs Press, F. et Siever, R. (1978) Earth (second edition).
W.H. Freeman, San Francisco).
Ces zones sont le sige de phnomnes hydrothermaux. Charge en mtaux, l'eau merge
soit au niveau de sites ocaniques profonds, de sites marins ctiers ou de sites terrestres. Ces deux
derniers sont connus depuis fort longtemps car ils sont le sige de phnomnes spectaculaires
comme les geysers (Parc de Yellowstone (USA), site de Geysir (Islande) pour les plus connus mais
aussi Russie, Nouvelle Zlande, Japon, Chili et Aores), les solfatares (Solfatara (Italie), Aores) ou les
mergences ctires (Vulcano (Italie), Ile de Santorin (Grce), Iles Kouriles (Russie), Afrique). Si la
prsence des sites hydrothermaux profonds tait connue (ou suppose) dj depuis plusieurs
72
annes, il faut attendre la fin des annes 70 pour que les premires plonges profondes mettent
jour la formidable vie associe ces sites.
4.4.1 Nature et structure des missions hydrothermales profondes

4.4.1.1 Localisation des sources
La carte (figure 2.7) prsente une liste non exhaustive des sites hydrothermaux tudis
jusqu' prsent, o une faune associe a t observe (d'aprs Chevaldonn, 1996).
On retrouve des sites hydrothermaux profonds dans des zones forte activit tectonique :
- Soit proximit des zones d'accrtion, le long des dorsales mdio-ocaniques.
(Middle Atlantic Ride (MAR), East Pacific Ride (EPR), lgende ____).
- Soit proximit de zones de subduction, au niveau des bassins arrire arc (Bassin
de Lau, Bassin Nord Fidjien, lgende tt).
Figure 2.7. Emplacements des sites hydrothermaux marins sur le globe
4.4.1.2 Composition du fluide hydrothermal

Les sources tudies jusqu' prsent sont situes entre 700 et 4000 mtres de profondeur.
Dans ces zones o la crote ocanique a t fragilise, l'eau de mer froide et dense s'infiltre. Elle est
alors porte trs haute temprature, trs forte pression et peut atteindre le stade de fluide
supercritique. Sous cet tat sa fluidit augmente ainsi que son pouvoir solvant. Elle remonte donc en
surface, et en percolant dans la lithosphre des changes chimiques importants sont raliss avec la
roche crustale. Les sulfates ragissent avec le fer contenu dans la roche pour produire du sulfure
d'hydrogne (H2S) ou des oxydes de fer, le magnsium ragit avec les hydroxydes et la silice. Le fluide
hydrothermal se charge en gaz dissous (H2S, CH4, CO, CO2, H2) et en mtaux (Si, Mn, Fe, Zn). Ce fluide
est anoxique, acide, de salinit variable et ne contient pas de magnsium, de sulfates, de nitrates et de
phosphates. Sa composition contraste donc trs fortement avec celle de l'eau de mer.
73
La temprature, le dbit et la composition du fluide hydrothermal sont variables selon le site

tudi et mme selon les points d'mission sur un mme site. Ces donnes vont conditionner la forme
sous laquelle le fluide va tre mis et les types de faunes associes.
4.4.1.3 Edification des chemines hydrothermales

(d'aprs Erauso, 1994; Chevaldonn, 1996)
Les fumeurs noirs
Si le fluide en remontant dans la lithosphre ne subit pas de dilution avec l'eau de mer, il est
mis en surface de trs fortes tempratures (jusqu' 400C) et un dbit important (0,7-2,4 m.s-1)
(Converse et al. 1984). Il entre alors en contact avec l'eau de mer et forme une matrice poreuse de
sulfates (barytine ou anhydrite). La paroi de l'difice crot alors verticalement et des grains de sulfure de
cuivre, de zinc et de fer se dposent sur la crote externe (cf.
figure 2.8). Par la suite, la forte temprature du fluide induit le
dpt d'une couche interne de sulfures de cuivre et de fer en
formant un conduit. La permabilit de l'difice diminue alors que
de nouveaux sulfures se dposent la place de l'anhydrite. Les
minraux s'arrangent de manire concentrique, stabilisant la
structure de la chemine et crant un gradient de temprature
horizontal dans l'difice. La communaut microbienne associe
ce type de chemine est essentiellement de type thermophile ou
hyperthermophile. On observe trs peu d'Eucarya proximit de
la zone d'mission de ces chemines. La colonisation par des
Figure 2.8. Fumeur noir sur le site du
Bassin Nord Fidjien bivalves ou des gastropodes et les vers est plus loigne de la
chemine.
Les fumeurs blancs ou diffuseurs
Lorsque le fluide sort des tempratures moins

leves (<280C), des chemines riches en zinc peuvent alors
se former. Elles sont qualifies de diffuseur car le conduit
central de la chemine est absent ou trs troit et le fluide
diffuse trs faible vitesse (0,5 m.s-1) au travers d'un rseau de
petits canaux dans la chemine. La chemine va alors crotre
dans toutes les directions car les dpts de minraux vont se
Figure 2.9. Diffuseur sur le site du Snake Pit
(MAR) faire trs lentement (cf. figure 2.9)
Ces diffuseurs peuvent tre surmonts d'une structure en nid d'abeille au sein de laquelle des
changes importants entre l'eau de mer et le fluide ont lieu. Ces structures trs poreuses sont idales
pour tudier les zonations de peuplement qui s'tablissent en fonction des gradients de nutriments et
74
de temprature. On y retrouve aussi bien des micro-organismes msophiles que thermophiles. Ces
structures sont toutefois trs difficiles chantillonner car elles sont trs fragiles.
Les autres structures
En fonction de la composition du fluide et de sa clrit, d'autres types d'difices vont tre

rencontrs. Certaines chemines sont dpourvues de sulfures et sont essentiellement constitues
d'anhydrite ("La Dame Blanche" dans le bassin nord Fidjien). Pour d'autres, le fluide a travers une
couche de sdiments au cours de sa remonte. Le conduit de la chemine est alors constitu de
dpts argileux. Enfin des structures horizontales sont parfois observes. Elles se constituent
progressivement lorsque le fluide mis le long d'une surface verticale rencontre un obstacle qui initie
le dpt des minraux. Le fluide retenu sous ces constructions s'en chappe par les bords ou en
percolant au travers de la structure. Il se cre alors un gradient de temprature dans l'paisseur de la
structure qui favorise la colonisation par une grande diversit de micro-organismes (Delaney , 1998).
4.4.1.4 Autres types d'mission

L'mission des fluides hydrothermaux peut ne pas conduire la formation d'difices, c'est le
cas par exemple dans le bassin de Guaymas ou au fond du lac Tanganyika. En plus des structures
classiques en chemine, le fluide percole au travers de sdiments d'origine planctonique trs riches
en matire organique et en sulfates. Ses sdiments sont le sige d'une forte activit sulfato-rductrice
se produisant diffrentes profondeurs (donc diffrentes tempratures) dans les sdiments ( pour
revue Elsgaard, 1995). Ces biotopes abritent une communaut bactrienne trs riche qui se nourrit de
la matire organique prsente en grandes quantits dans ces bassins.
Des suintements froids, ou faible temprature, observs proximit des marges passives
(Golfe de Californie, Golfe du Mexique), sont coloniss par une faune similaire celle des sites
hydrothermaux profonds. La communaut microbienne est quant elle essentiellement msophile.
Rcemment Hinrichs et al. (1999) ont analys, par amplification et squenage de l'ADNr 16S, la
communaut microbienne se dveloppant dans les sdiments proximit des suintements de
mthane manant des rserves de mthane solidifi ("methane hydrates"). En plus de la flore
anarobie de sulfato-rducteurs et de Gram +, les auteurs dtectent des squences associes aux
mthanognes msophiles (Methanomicrobiales et Methanosarcinales). L'analyse du contenu
13
lipidique de leur chantillon et le suivi du C leur permet de supposer que parmi les squences
proches des mthanognes certaines souches utiliseraient le mthane solidifi comme source de
carbone. La prsence dans ces chantillons de sulfato-rducteurs laisserait supposer que ces
nouvelles souches raliseraient une oxydation anarobie du mthane en utilisant les sulfates comme
accepteurs d'lectrons (Hinrichs et al., 1999; Summons, 1999).
75
4.4.2 Faune associe l'cosystme hydrothermal

L'une des caractristiques les plus remarquables des sources hydrothermales est la faune que
l'on peut y observer. Jusqu'en fvrier 1977 (date des premires plonges ralises par John Corliss et
John Edmond) les fonds sous-marins taient considrs comme des espaces dsertiques. Ces oasis
de vie que reprsentent ces nouveaux biotopes ont alors considrablement boulevers la biologie,
remettant en question le dogme d'une vie impossible sans lumire (Corliss et Ballard, 1977; Corliss et
al., 1979).
Les premiers prlvements raliss sur des sites hydrothermaux entre les Iles Galpagos et
l'Equateur permirent de collecter les premiers spcimens de Calyptogena magnifica et de
Bathymodiolus thermophilus, deux mollusques se dveloppant proximit des fumeurs noirs. Par la
suite, de nombreux autres organismes ont t isols de cet cosystme. Parmi ceux-ci les
vestimentifres : Riftia pachyptila et Tevnia jerichonana, les polychtes appartenant aux genres
Alvinella (pompejana et caudata) et Paralvinella. Les crevettes Rimicaris exoculata sont quant elles
uniquement prsentes sur les sites de la dorsale mdio-Atlantique.
Cette faune est caractrise par (d'aprs Laubier 1989; Tunnicliffe, 1991, 1992 cits dans
Cornec, 1995):
Une dpendance vis vis du systme hydrothermal.
- Une biomasse trs importante rpartie sur des surfaces limites de l'ordre de 10 kg.m-2 (contre
quelques grammes par m2 dans les zones intra-plaques).
Un fort taux d'endmisme : 97% de la faune observe sur ces sites est taxonomiquement distincte
de celle observe des profondeurs quivalentes.
Un nombre important d'espces nouvelles de grande taille appartenant des taxons nouveaux (du
genre jusqu' l'embranchement).
Mais l'une des caractristiques les plus importantes de cette faune est son dveloppement
infod aux symbiotes dont elle tire son nergie (voir plus loin) (Wirsen et al. 1993)
Les Riftia, les Alvinella et les
Rimicaris sont probablement les
organismes les plus surprenants de ce
biotope.
Les premiers (cf. figure 2.10)
sont de long vers pouvant atteindre 2
mtres de long pour 4-5 cm de diamtre.
Ils se dveloppent en vritables
buissons pouvant atteindre une densit
de 100 200 individus au m2. Ces vers
Figure 2.10. Colonie de Riftia pachyptila (photo site University of dpourvus de systme digestif tirent leur
Washington) nergie des producteurs primaires qu'ils
abritent dans leur trophosome, des
76
bactries sulfo-oxydantes endosymbiotiques. Ces bactries sont alimentes en H2S par

l'hmoglobine des Riftia qui possde la capacit de fixer aussi bien l'O2, le CO 2 que l'H 2S. Une fois
l'change ralis au niveau du trophosome l'hmoglobine transporte l'H+ l'extrieur du ver.
L'hmoglobine de Riftia assure l'alimentation des symbiotes et la protection du vers vis vis de l'H2S
hautement toxique en le transportant sous une forme stable (pour revue rcente voir Zal, 1999).
Les seconds (cf. figure 2.11) sont des Alvinellids

vivant dans des tubes construits en surface des
chemines, mais ils peuvent aussi se dplacer librement
sur le site hydrothermal pour se nourrir de bactries.
L'une des caractristiques majeures de ces vers est la
prsence d'une importante communaut pibiotique de
bactries filamenteuses (voir plus loin) (pour revue
Desbruyres et al., 1998; et pour analyse molculaire
Haddad et al., 1995; Cary et al. 1997). Si la majeure partie
de la faune se dveloppant dans les sites hydrothermaux
Figure 2.11. A. pompejana. Photo C. Cary. Taille 6 cm. se trouve dans des zones "froides" (20-30C), les
On observe la surface du vers les filaments bactriens
Alvinellids sont quant eux frquemment rencontrs
qui dominent la communaut pibiotique.
proximit d'missions trs haute temprature. A de
nombreuses reprises il a t observ des vers traversant le panache de fluide la sortie d'un fumeur
o la temprature dpassait les 100C (Chevaldonn et al., 1992). La temprature l'intrieur des
tubes dans lesquels ces vers se rfugient correspond un trs fort gradient thermique de 60C (entre
22C la sortie du tube et 81C au fond du tube) (Cary et al., 1998).
La troisime communaut (cf. figure

2.12) trs frquemment rencontre sur les
sites hydrothermaux de la MAR est
constitue par les crevettes du genre
Rimicaris. Rimicaris exoculata constitue une
biomasse trs importante sur ces sites de 25
50000 individus.m -2 (Segonzac et al.,
1993; Van Dover, 1994). Elles ingrent des
petites particules de soufre recouvertes de
bactries et sont elles-mmes recouvertes
de bactries filamenteuses sur leur carapace
Figure 2.12. Des essaims de Rimicaris exoculata broutant la surface
et autour de leur orifice buccal (Polz et d'une chemine. On observe la tache blanche la surface de la crevette
Cavanaugh, 1995). correspondant l'oeil. Photo E. Gaten.
Ces crevettes considres auparavant
77
comme aveugles possdent la surface de leur cphalo-thorax un oeil fonctionnel dont le caractre
ancestral a t discut (Gaten, 1998; Gaten et al. 1998a et b; Hering et al., 1999).
4.4.3 Les micro-organismes des sources hydrothermales

La dcouverte des sources hydrothermales, o la vie en l'absence de lumire s'tait
dveloppe, a incit de nombreux scientifiques rechercher l'activit microbienne source de la
production primaire chimiolithotrophique. C'est en 1979 que Jannasch et Wirsen (entre autres) ont mis
en vidence cette prsence pour la premire fois en indiquant le rle prpondrant dans cet
cosystme des bactries sulfo-oxydantes sous une forme libre, associes symbiotiquement la
macrofaune ou dans des consortiums microbiens (Jannasch et Wirsen, 1979). Par la suite, de
nombreuses tudes (comptages, techniques de culture, mesure de l'activit du mtabolisme) ont
permis de mettre jour une flore microbienne aux mtabolismes et aux prfrendums trs diversifis.
Si ces dernires annes l'accent a t mis prfrentiellement sur l'tude des micro-organismes
thermophiles, peu de choses sont en fait connues des micro-organismes msophiles (Baross et
Deming, 1995). L'emploi rcent des techniques molculaires devrait nous permettre d'apprhender
l'cosystme hydrothermal dans sa globalit.
4.4.3.1 Habitats et types mtaboliques microbiens

On considre actuellement que les communauts microbiennes s'tablissent au sein des
cosystmes hydrothermaux ocaniques dans les habitats suivants (Karl, 1995) (cf. figure 2.13) :
Les micro-organismes vivant sous une forme libre dans le fluide hydrothermal. Ces micro-
organismes se dvelopperaient dans une biosphre souterraine sous-jacente aux chemines et
seraient transports par le fluide. Ce concept de biosphre souterraine (cf. 3.2.2) expliquerait
l'ubiquit de certains micro-organismes dans des zones o la crote terrestre profonde entrerait en
contact avec des milieux plus superficiels. C'est le cas par exemple des Thermoccoccales, des
Mthanognes des Archaeoglobales retrouves sur la quasi totalit des sites hydrothermaux
profonds et ctiers et au sein des rservoirs ptroliers (Prieur et al., 1995).
- Les micro-organismes se dveloppant la surface des chemines ou des roches proches des
missions et qui seraient aliments en nutriments par le fluide. On distingue les micro-organismes
se dveloppant dans les chemines (essentiellement thermophiles) des micro-organismes se
dveloppant sous forme de tapis proximit des chemines (essentiellement msophiles). La
prsence de tapis bactriens trs abondants est l'une des caractristiques majeures de certains
sites hydrothermaux (Jannasch et Wirsen, 1981; Prieur, 1992). Ces enchevtrements constituent
des zones frontires la fois en contact avec des zones arobies (l'eau de mer) et anarobies (le
fluide). Le type de chemine, sa porosit principalement, va influer sur la profondeur de
colonisation des micro-organismes. Afin d'tudier la communaut capable de se dvelopper la
surface des chemines, diffrentes expriences ont t menes. Elles consistaient soit prlever
directement le tapis microbien afin de raliser des cultures d'enrichissement et des isolements, soit
78
mettre proximit du fluide des coupons de diffrentes matires (Tflon, acier, porcelaine,
mtaux, plastiques) durant des dures d'expositions variables (Prieur et Ferra, rsultats non
publis dans Prieur, 1992; Guezennec et al., 1998)
Les micro-organismes se dveloppant en ecto- ou endo-symbiose avec les macro-organismes
colonisant les chemines : vers polychtes, vestimentifres, mollusques. L'tude des symbiotes
associs aux mollusques des sources hydrothermales constitue la plus ancienne rfrence
l'utilisation des techniques molculaires pour accder la diversit microbienne d'un chantillon
(Stahl et al., 1984).
Les micro-organismes retrouvs dans les panaches ("plume") de fluides hydrothermaux. Ces
derniers correspondent de l'eau de mer enrichie par les minraux communment retrouvs dans
le fluide. Ces panaches peuvent atteindre des tailles considrables (700m d'paisseur pour 20 km
de diamtre) (Winn et al., 1995).
Enfin les micro-organismes se dveloppant dans les sdiments o le fluide peut percoler comme
c'est le cas dans le bassin de Guaymas.
Communaut bactrienne
Oxydation/prcipitation par
dans les panaches mlange avec l'eau de mer froide
environnante
FeS + O2 Fe(O)OH
Mn + O2 MnO 2
350C
350C Communaut
Thermophiles/Msophiles
350C Sous forme libre
50 100C 20 40C
Macr aune
Communaut Msophiles
Communaut bactrienne Sous forme libre/
msophile symbionte Sous forme de mats
Percolation de l'eau de
mer froide
100C
Fort dbit
Temprature leve
1-3 km
200C
Zone de mlange des eaux
Eau de mer chauffe Temprature moyenne
300C enrichie en minraux
400C
Lessivage de Ca2+, Mn2+, Mg2+,Fe 2+ et Cu2+ SO2- rduit en S2-
4
BASALTE
Figure 2.13. Schma de fonctionnement d'une source hydrothermale ocanique

(d'aprs Jannasch et Mottl, 1985).
Si les bactries sulfo-oxydantes et mthanotrophes semblent constituer le premier maillon de

la chane alimentaire de l'cosystme hydrothermal, la chimiolithoautotrophie ne constitue pas le seul
type mtabolique et nergtique rencontr au sein des sources hydrothermales. De nombreux
auteurs ont propos une liste des mtabolismes bactriens observs ou potentiellement observables
proximit des missions de fluide (cf. tableau 2.4 d'aprs Prieur et al., 1987; Jannasch, 1995; Karl,
1995).
79
Tableau 2.4. Mtabolismes microbiens observs d'isolats de sources hydrothermales profondes

Donneur Accepteur Source Temprature Type Processus
d'lectron d'lectron de carbone de raction respiratoire mtabolique
S2- O2 CO2 mso, hyper Arobie Oxydation de sulfures
S O2 CO2 mso, hyper Arobie Oxydation du soufre
S2O32- O2 CO2 mso, hyper Arobie Oxydation du thiosulfate
Fe2+ O2 CO2 mso Arobie Oxydation du fer
Mn2+ O2 [CH2O] mso Arobie Oxydation du manganse
NH 4+, NO2- O2 CO2 mso Arobie Nitrification
CH 4, CO O2 CH 4, CO2, CO mso Arobie Oxydation du mthane
et des composs en C1
[CH2O] O2 [CH2O] mso, hyper Arobie Htrotrophie arobie
H2 O2 CO2 mso, hyper Arobie Oxydation de l'hydrogne
H2 NO3- CO2 mso, hyper Anarobie Dnitrification
H2 S CO2 hyper Anarobie Sulfo-rduction
H2 SO42- CO2 mso, hyper Anarobie Sulfato-rduction
H2 CO2 CO2 mso, hyper Anarobie Mthanognse
S2- , S, S2O32- NO3- CO2 mso Anarobie Dnitrification, Sulfo-oxydation
[CH2O] S [CH2O] hyper Anarobie Htrotrophie soufre rducteur
[CH2O] SO42- [CH2O] mso, hyper Anarobie Htrotrophie sulfatorductrice
[CH2O] NO3- [CH2O] mso Anarobie Dnitrification
[CH2O] [CH2O] [CH2O] mso, hyper Anarobie Fermentation
mso : msophile; hyper : hyperthermophile
4.4.3.2 Abondance des micro-organismes

Les comptages raliss sur des chantillons provenant de diffrents sites donnent des
rsultats trs variables en fonction de la technique de comptage utilise et du type d'chantillon
analys (cf. tableau 2.5).
Tableau 2.5. Densit microbienne sur les sites hydrothermaux

Echantillon Temprature Densit Rfrences
(C) $ (Cellules.ml-1); (Cellules.g-1);
& (Cellules.cm-2)
Fluide basse temprature <50 5-10 106 $ Jannasch et Wirsen, 1979

<50 <2 106 $ Karl, 1987; Straube et al., 1990
<50 108-109 $ Corliss et al., 1979
Fluide haute temprature 304 5 105 $ Baross et al., 1984
174-357 <3 105 $ Straube et al., 1990
Chemine 65-80 2 105-5 107 Harmsen et al., 1997a
104-1010 Chevaldonn et Godfroy, 1997
Flange 20-100 et+ 106->108 Baross et Deming, 1995
Colonisation sur coupon 2 104-5 105 & (3 jours) Prieur et Ferra (com. perso.)
3 105-5 107 & (10 jours) ""
Colonisation sur Vent Cap 20 -80 4 108-2 109 $ (2-5 jours) Ce manuscrit (Article 3)
Sdiments 80-104 2 107-2 108 Hoaki et al., 1995
Tubes A. pompejana face externe 2-3 106 & Chevaldonn, 1989
Tubes A. pompejana face interne 0,4-2 106 & ""
Endobiote (R. pachyptila) 3 109 trophosome (humide)14 Cavanaugh et al., 1981
Ectobiote (R. exoculata) 8,5 106 (cellules/individu) Poltz et Cavanaugh, 1995
14
Le trophosome correspond 40-60% du poids total du ver, ce qui fait des vers des animaux chimioautotrophes (Felbeck et
Childress, 1988)
80
Les trois mthodes principales de numration sont les comptages sur boites, la mthode par
dilution (NPP) et la microscopie. Les rsultats obtenus par les deux premires mthodes sont
entachs des erreurs inhrentes toute technique culturale. Les mthodes microscopiques sont
quant elles entaches de l'erreur "humaine". Il est en effet difficile de distinguer au microscope
certaines cellules des granules de soufre qui prsentent parfois une trs forte autofluorescence. Je
reviendrai dans la troisime partie sur les techniques mises au point pour limiter les erreurs de
comptage en microscopie.
4.4.3.3 Les micro-organismes isols de tapis microbiens et d'chantillons d'eau de

mer
Les micro-organismes msophiles
Les premires observations ralises sur les tapis microbiens du bassin de Guaymas ont
indiqu la prsence de bactries soufre-oxydantes se prsentant sous la forme de longs filaments et
associes aux genres Beggiatoa et Thiothrix (Jannasch et Wirsen, 1981; Jannasch et al., 1989). Ces
micro-organismes autotrophes oxydent l'H2S en utilisant les nitrates accumuls dans une large
vacuole. Ces enchevtrements peuvent atteindre des paisseurs de 10 ou 20 cm et sont aussi
observables proximit des suintements froids (Ahmad et al., 1999; Nealson, 1999). Une souche
sulfo-oxydante, autotrophe associe au genre Arcobacter a t retrouve dans les sdiments chauds
du bassin de Guaymas. Cette souche pralablement observe dans des sdiments ctiers produit
d'importants filaments de soufre (de 0,5 5 m de diamtre pour 20 500 m de long) qui pourraient
servir de facteur d'initiation pour la colonisation des Alvinella (Taylor et Wirsen, 1997; Taylor et al.,
1999).
La plupart des isolats obtenus partir d'chantillons de fluides ou de surfaces exposes aux
fluides correspondent des bactries soufre-oxydantes autotrophes ou mixotrophes associes aux
genres Thiomicrospira, Thiobacillus (Durand et al., 1993; Jannasch et al., 1985; Ruby et al., 1981). Des
tudes rcentes effectues sur un isolat de Thiomicrospira prlev sur la dorsale mdio-Atlantique,
indiquent que ce dernier correspondrait une Thiomicrospira crunogena pralablement isole dans le
Pacifique (Wirsen et al., 1998). Cette espce semble donc prsenter une rpartition ubiquitaire. Mais
un grand nombre d'autres bactries soufre-oxydantes htrotrophes ou mixotrophes ont t isoles
de milieux hydrothermaux. Elles sont associes aux genres Pseudomonas, Acinetobacter et Vibrio
(Durand et al., 1994). Des bactries sulfato-rductrices associes au genre Desulfovibrio ont t
isoles partir d'chantillons provenant de la Ride Est-Pacifique (Elsgaard et al., 1991). Jannasch dans
sa revue (1995) rapporte l'isolement de bactries oxydant le mthane du genre Methylococus et de
bactries oxydant l'hydrogne du type des Hydrogenomonas. Des bactries mangano-oxydantes et
des bactries rsistantes de fortes concentrations en mtaux lourds ont t isoles de coupons
coloniss et d'chantillons de moules et d'Alvinellids (Ehrlich et al., 1983; Durand et al., 1990;
Jeanthon et Prieur, 1990). Elles sont associes aux genres Pseudomonas, Aeromonas et Vibrio. La
recherche de bactries productrices d'exopolysaccharides partir de divers chantillons
81
hydrothermaux a conduit l'isolement de souches apparentes aux Vibrio et aux Alteromonas

(Vincent, 1993; Raguenes et al., 1997 a et b). Enfin des bactries nitrifiantes, htrotrophes, arobies
ont t isoles partir d'chantillons de chemines actives sur le site 13N, EPR et dans le bassin de
Guaymas (Mevel et al., 1996). Ces bactries correspondent majoritairement des Pseudomonas et
des Alcaligenes. Rcemment une souche arobie anoxygnique photosynthtique a t isole
2000m de profondeur dans un panache hydrothermal (Yurkov et Beatty, 1998). Cette prsence
atypique ( de telles profondeurs) mais significative (prs de 10% des enrichissements) n'est pas
explique par les auteurs.
Les micro-organismes msophiles associs la macrofaune
La majeure partie de la faune observe au niveau des sites hydrothermaux prsente de fortes
associations avec des micro-organismes sulfo-oxydants15. Ces symbioses correspondent des
associations htes-bactries trs spcifiques qui ont t tudies dans le cas des vestimentifres
Riftia pachyptila, des mollusques bivalves Bathymodiolus thermophilus et Calyptogena magnifica, des
gastropodes Alviniconcha hessleri et Neomphalus fretterae, des polychtes annlids Alvinella
pompejana et A. caudata, des crustacs Rimicaris exoculata et R. chacei (Prieur, 1992; Nealson et
Fisher, 1995). L'ensemble de ces tudes souffre de l'impossibilit d'isoler les symbiotes de leur hte.
Seules des techniques de mesure d'incorporation d'isotopes stables de carbone et d'azote, des
recherches d'enzymes impliques dans le cycle de Calvin et des observations des tissus par
microscopie lectronique balayage et transmission avaient permis, avant l'emploi des techniques
de squenage et de marquage molculaire, d'tablir les relations trophiques s'tablissant entre l'hte
et les bactries (Prieur, 1992). Si les relations nutritionnelles entre les ectobiotes d'A. pompejana et de
R. exoculata ne sont pas encore compltement tablies 16 (Poltz et Cavanaugh, 1995; Cary et al.,
1997; Desbruyres et al., 1998), celles entre les endobiotes et les mollusques ou les vestimentifres
des sources hydrothermales ont t plus tudies et l'emploi des techniques molculaires a permis
d'accrotre considrablement le champ des connaissances sur les mcanismes relationnels htes-
symbiotes (Nealson, 1999; cf. 4.4.3.4).
Les micro-organismes thermophiles
Dfinition de la thermophilie
La temprature est l'un des facteurs qui conditionnent la vie sur terre17. On peut alors diviser le
monde vivant en trois groupes principaux, en fonction des tempratures optimales de croissance : les
psychrophiles se dveloppant de faibles tempratures, les msophiles se dveloppant des
tempratures moyennes et les thermophiles se dveloppant des tempratures leves.
15
Il a t aussi observ des symbioses avec des micro-organismes mthanotrophes chez Bathymodiolus (Cavanaugh et al., 1992;
Distel et al., 1995; Nealson et Fisher, 1995).
16
Une tude a t mene par Poltz et al. (1998) afin d'tablir (par assimilation de carbone marqu, techniques molculaires de
marquage, etc.) les relations que R. exoculata entretenait avec ses ectobiotes.
17
La temprature influe sur la structure des molcules (notamment des protines et de l'ADN) et sur la disponibilit de l'eau par
exemple.
82
Les Archaea et les Bacteria thermophiles peuvent tre divises en trois sous-groupes (cf. figure 2.14):
Frontire de la les thermophiles modrs, dont
thermophilie
(50 60C)
la temprature maximale de croissance
Thermophiles Thermophiles Hyperthermophiles
modres extrmes (Tmax ) ne dpasse pas 70C,
Vitesse de croissance
les thermophiles extrmes,

capables de se dvelopper au del de
85C,
les hyperthermophiles, dont la
temprature optimale de croissance
Temprature (C)
(Topt) est suprieure 90C.
Figure 2.14. Rpartition des micro-organismes thermophiles (d'aprs Brock,
1986)
La notion de frontire de thermophilie, d'organismes msophiles et thermophiles modrs ne

fait pas l'unanimit. On peut toutefois dfinir pour chaque organisme trois points cardinaux : la
temprature minimale, T min , partir de laquelle la croissance est possible; le taux de croissance
augmente ensuite presque linairement jusqu' la T opt , puis gnralement chute brutalement dans les
5 10C qui suivent jusqu' T max18.
Isolement des micro-organismes thermophiles
Les fortes tempratures releves au sein des sites hydrothermaux profonds ont conduit
rechercher des micro-organismes thermophiles et hyperthermophiles. Le tableau 2.6 prsente les
principaux genres thermophiles isols au sein des sources hydrothermales profondes.
Tableau 2.6. Micro-organismes thermophiles isols de sources hydrothermales profondes (d'aprs la revue de Stetter, 1996).
Domaine Genres Optimum Mtabolisme Rfrences
(C) nergtique
BACTERIA Thermus 60-70 Htrotrophe, arobie Marteinsson et al., 1995
Bacillus 60-80 Htrotrophe, arobie Marteinsson et al., 1996
Thermotoga 80 Fermentaire, anarobie Marteinsson et al., 1997
Thermosipho 70 Fermentaire, anarobie Antoine et al., 1997
Desulfurobacterium 70 Autotrophe, anarobie L'Haridon et al., 1998a et b
ARCHAEA
Euryarchaeota Thermococcus 80-90 Fermentaire, anarobie Kobayashi et al., 1994
Pyrococcus 95-100 Fermentaire, anarobie Erauso et al., 1993
"Palaeococcus" Fermentaire, anarobie Takai et al., 1998 (resul. non pub.)
Archeaoglobus 83 Mixotrophe, anarobie Burggraf et al., 1990
Methanococcus 85 Methanogne, anarobie Jones et al., 1983;*
Methanopyrus 98 Methanogne, anarobie Kurr et al., 1991
Crenarchaeota Staphylothermus 92 Htrotrophe, anarobie Fiala et al., 1986
Pyrodictium 97 Htrotrophe, anarobie Pley et al., 1991
Pyrolobus Autotrophe, arobie Blchl et al., 1997
Desulfurococcus 85-90 Fermentaire, anarobie Jannasch et al., 1988
* Jeanthon et al., 1998, 1999 a et b
18
D'une manire analogue aux courbes d'efficacit enzymatique, les courbes de croissance des micro-organismes en fonction de la
temprature sont les rsultantes de la combinaison de la loi d'Arrhenius jusqu' la Topt et de la dnaturation du micro-organisme jusqu'
la Tmax .
83
La plupart de ces micro-organismes sont des anarobies stricts (htrotrophes fermentaires,

mthanognes ou sulfato-rducteurs) appartenant au domaine des Archaea. Mais il a t possible
d'isoler certaines Bacteria thermophiles ( tableau 2.6). Il s'agit gnralement de souches appartenant
des genres dj dcrits au niveau des sources ctires ou terrestres. Ce phnomne pourrait tre
expliqu soit par l'ubiquit de ces souches au sein des diffrents points chauds du globe, soit par un
biais li aux techniques de cultures toutes issues d'tudes des environnements ctiers et ne tenant
pas compte de l'un des principaux paramtres: la pression (Prieur, 1997).
Les applications industrielles des souches thermophiles
Ces dix dernires annes les tudes portant sur les Archaea et les Bacteria ont amen les
chercheurs s'intresser aux proprits de ces micro-organismes pouvant se dvelopper dans des
conditions extrmes de pH, de temprature et de salinit. Leur capacit produire des enzymes trs
stables a trs rapidement t tudie par les industriels. Toutefois si certains de ces organismes
taient dj employs depuis longtemps (Archaea mthanognes) d'autres, bien qu'offrant des
perspectives fort intressantes, entraient en concurrence avec des bactries dj sur le march et
beaucoup plus simples produire en grande quantit. D'autre part les conditions optimales de
croissance (temprature, pression, anarobiose) rendent complexe la mise en culture de telles
souches(Cowan, 1992).
Les Archaea thermophiles ont surtout t pressenties par les industriels pour les
caractristiques de leurs enzymes. Les avantages apports par l'utilisation d'enzymes thermophiles et
thermostables par rapport aux enzymes classiques sont :
un gain de temps (pas de refroidissement) une diminution des cots de refroidissement
l'amlioration de la strilit la possibilit d'extraction de composs volatils
la rduction de la viscosit
La thermostabilit d'une protine implique le plus souvent une meilleure rsistance aux agents
dnaturants et la protolyse. Il faut garder l'esprit que des enzymes thermostables ne ragiront pas
plus rapidement que des enzymes classiques. La vitesse de raction d'une enzyme ayant son
optimum de temprature 90C ne sera pas 32 fois suprieure celle de l'enzyme ayant une Topt de
37C (la loi d'Arrhenius prvoit en effet un doublement de la vitesse de raction pour une
augmentation de 10C). Ceci est d des relations structure-fonction qui accroissent certes la stabilit
mais rduisent la flexibilit de l'enzyme aux faibles tempratures (Cowan, 1992). On peut augmenter la
vitesse d'une raction en utilisant une enzyme thermostable, lorsqu' des tempratures leves le
substrat est plus susceptible d'tre catalys. C'est le cas des mcanismes de dgradation des
polymres protiques et glucidiques.
Le tableau 2.7 donne un aperu des applications actuelles des enzymes extraites des micro-
organismes extrmophiles.
84
Tableau 2.7. Applications biotechnologiques des extrmophiles

Organismes extrmophiles Enzymes / Compos organique Applications Produits
Thermophiles 50 - 110C Amylases Glucose,Fructose , Edulcorants
Xylanases Blanchiment du papier
Protases Acides amins produits de la kratine, dtergents,
agro-alimentaire : cuisson, brasserie.
ADN-polymrases, Intines Biologie molculaire
Psychrophiles 0 - 20C Protases neutres Production laitire et fromagre
Protases, Amylases, Lipases Additifs de dgradation dans les dtergents
Acides gras polyinsaturs Industrie pharmaceutique
Dshydrognases Biocapteurs
Acidophiles pH < 2 Oxydation des sulfures Dsulfuration des minerais et du charbon
Alcaliphiles pH > 9 Cellulases, Protases Additifs de dgradation dans les dtergents
Amylases, Lipases
Cyclodextrines Stabilisation de substances volatiles
Antibiotiques Industrie pharmaceutique
Halophiles 3 - 20% sel Carotne Colorants alimentaires
Glycrol et additifs solubles Industrie pharmaceutique
Membranes Surfactants pour l'industrie pharmaceutique
Barophiles Amylase, Protases Agro-alimentaire, Industrie ptrolire
(d'aprs Querellou et al., 1999; site programme europen (voir note bas de page n19))
L'un des domaines d'application courant de telles enzymes est celui de la biologie molculaire.
La PCR a ouvert le champ l'utilisation de nombreuses enzymes thermostables. Dans un premier
temps la Taq polymrase extraite de la Bacteria Thermus aquaticus a remplac le fragment de Klenow
qui exigeait des manipulations longues et tait thermosensible, puis de nouvelles polymrases plus
fidles ont t extraites d'organismes hyperthermophiles (voir pour revue rcente Qurellou, 1999).
D'autres domaines d'applications de la biologie molculaire peuvent tre envisags:

Applications ind ustrielles (Knig, 1989; Cowan, 1992; Querellou et al., 1999) : 75% des enzymes
utilises dans le monde le sont dans les industries des dtergents, de l'amidon et du lait. Si des
enzymes thermostables pouvaient logiquement intervenir dans de telles industries, il faudrait toutefois
que cette substitution aux enzymes classiques soit commercialement intressante. Il faut rappeler
notamment que :
Certains procds industriels ne sont pas compatibles avec des tempratures leves (ex :
industrie fromagre).
Certains procds fonctionnent de prfrence faible temprature (ex : dtergents).
Des enzymes suffisamment thermostables sont dj utilises (ex : saccharification de l'amidon).
Parfois il n'y a pas d'intrt augmenter la temprature de raction (ex : certaines ractions de
chimie fine sur les acides amins ou les pnicillines).
L'augmentation de productivit haute temprature peut ne pas couvrir l'augmentation des
cots de chauffage.
Par consquent l'utilisation d'une enzyme thermostable doit tre dicte par les rgles suivantes :
L'enzyme doit tre disponible dans des quantits quivalentes une enzyme classique.
85
Son prix par unit d'activit doit tre plus faible.

Ses performances doivent tre significativement suprieures l'enzyme classique.
Son utilisation ne doit pas entraner de modifications majeures de l'quipement existant.
Il s'avre donc difficile de remplacer par des enzymes extraites d'Archaea thermophiles les
enzymes dj prsentes sur le march. L'emploi d'enzymes thermostables devra donc plutt
s'orienter vers de nouvelles niches d'utilisation (cf. tableau 2.8).
Tableau 2.8. Domaines d'applications des enzymes issues de micro-organismes thermophiles
Enzymes Applications
A.D.N. ligases recherche d'enzymes plus thermostables, plus processives et plus fidles que la Taq polymrase
classique.
Alcool-dshydrognases des alcools secondaires DH thermostables pourraient avoir de nombreuses applications en
chimie pour la production de molcules chirales. Leur rsistance aux produits de raction (alcool,
aldhydes et ctones) rendent les DH de Sulfolobus solfataricus et de Hyperthermus butylicus
intressantes.
Estrases permettant des ractions en milieu non liquide.
Enzymologie en phase gazeuse l'aide de l'alcool DH de S. Solfataricus. Cette technique permettrait de minimiser l'emploi de
solvant.
Biolixiviation jusqu' prsent des Bacteria msophiles taient utilises trs grande chelle (500 tonnes par an)
pour le traitement du minerai d'uranium. L'emploi d'Archaea sulfo- et mtalo-oxydantes
thermophiles se limitait la rcupration de mtaux prcieux. Les Archaea acidophiles
Sulfolobus, Acidianus et Metallosphaera pourraient tre d'un usage intressant dans le cas de bio-
lixiviation thermodpendante. Le problme rside dans la sensibilit parfois trop forte aux mtaux
de ces bactries dans les racteurs.
Actuellement le march des enzymes et des autres composs issus de micro-organismes

extrmophiles correspondrait 17 milliards de dollars. Les programmes europens du type
"Extrmophiles, usines cellulaires"19 ainsi que le squenage de gnomes totaux de micro-
organismes hyperthermophiles20 tmoignent de l'intrt grandissant des industriels pour ces
souches. Toutefois une exploitation grande chelle de ces enzymes tarde encore venir.
4.4.3.4 L'apport des techniques molculaires

Les environnements hydrothermaux ont constitu l'un des premiers champs d'essai des
techniques molculaires pour accder la diversit microbienne en s'affranchissant de toute tape de
culture (Stahl et al., 1984; Lane et al., 1985a). Les premiers chantillons analyss provenaient des
symbiotes de R. pachyptila, de C. magnifica et de Soleyama velum. Ces tudes confirment par analyse
des ARNr 5S l'affiliation de ces symbiotes avec les bactries soufre-oxydantes correspondant aux
Proteobacteria (appeles alors bactries pourpres). L'engouement suscit par l'emploi de telles
mthodes a conduit l'analyse d'chantillons (coupons coloniss) provenant de sites hydrothermaux
terrestres (Octopus Spring dans le Parc de Yellowstone, Stahl et al., 1985) et la publication de
nombreuses revues dans les annes qui ont suivi (Pace et al., 1985, 1986 a et b; Olsen et al., 1986;
Turner et al., 1989). Par la suite les limites de dtermination des souches lies la petite taille du 5S
19
Extremophiles as cell factories http://www.tu-harburg.de/tv/ecf/ecf0_1.htm.
20
Sur 17 gnomes microbiens squencs , 5 correspondent des micro-organismes hyperthermophiles.
86
entranrent les scientifiques vers l'analyse des gnes codants pour l'ARNr 16S (1500 nuclotides
contre 120 pour le 5S). Aprs la mise au point d'une technique rapide et efficace de squenage
(Lane et al., 1985b), les premires tudes de diversit microbienne fondes sur l'analyse des gnes
codants pour l'ARNr 16S ne sont appliques qu'en 1990 en milieu hydrothermal continental (Ward et
al., 1990 a et b) et en 1994 et 1995 par Moyer et al. en milieu profond.
Jeanthon (1999) propose une revue trs complte sur l'emploi des techniques molculaires
en milieu hydrothermal profond. Ces dernires ont permis d'tudier la fois les bactries associes la
macro-faune comme celles prsentes sous une forme libre;
ce sont :
les travaux de Poltz et Cavanaugh sur les ectobiotes de R. exoculata (Poltz et Cavanaugh, 1995),
les travaux de l'quipe de Cary sur les symbiotes d'A. pompejana (Haddad et al., 1995; Cary et al.,
1997),
les travaux de Distel sur les symbiotes de Riftia par tude du gne de l'ADNr 16S (Distel et al.,
1988, 1994),
les travaux de l'quipe de Vrijenhoek sur la co-volution des symbiotes et de leur hte chez
Calyptogena (Peek et al., 1998)et chez Riftia (Feldman et al., 1997),
les travaux de Moyer sur des tapis microbiens d'un site hydrothermal du Pacifique (Moyer et al.,
1994, 1995, 1998)
les travaux de Harmsen sur la quantification l'aide de sondes nucliques des micro-organismes
de chemines hydrothermales d'un site Atlantique (Harmsen et al., 1997 a et b)
les travaux de Riley sur les communauts mthanognes des chemines (Riley, 1997, 1999)
les travaux de Takai sur des sources ctires et profondes au large du Japon (Takai et Horikoshi,
1999; Takai et Sako, 1999),
Des travaux et on retiendra la prdominance dans les banques d'ADNr 16S de phylotypes
bactriens associs aux Proteobacteria parmi les pibiotes de R. exoculata et A. pompejana. Ces
pibiotes correspondent dans les deux cas de longs filaments situs sur l'piderme dorsal des
annlides et sur des excroissances buccales des crustacs. Cette prdominance a t confirme par
des expriences d'hybridation in situ ou de Dot-blot sur des chantillons d'animaux21. De plus il
semblerait que l'association bactrie-hte ne soit pas exclusive. En effet il a t dtect dans
l'environnement proche des animaux (tubes externes des annlides, surfaces des roches) des
phylotypes similaires ceux observs la surface des animaux (jusque 60% des bactries dtectes
la surfaces des roches dans le cas du symbiote de R. exoculata). Les pibiotes de R. exoculata
pourraient de plus correspondre des bactries plomorphes comme l'indiquent les expriences
d'hybridation menes sur 3 morphotypes diffrents l'aide d'une sonde spcifique du symbiote.
Les travaux et confirmrent les premires tudes portant sur l'ADNr 5S, sur le
positionnement phylogntique des symbiotes de Riftia. Par contre il a t possible de dfinir deux
21
La prsence de squences associes d'autres Proteobacteria a t aussi dtecte dans le trophosome de vestimentifres
proches de suintements froids (Naganuma et al., 1997)
87
modes d'acquisition probables du symbiote pour les mollusques et les vestimentifres. Alors que les
symbiotes de Riftia n'ont jamais t dtects dans les oeufs ou les tissus juvniles des vers et que le
mme symbiote est retrouv sur des individus d'origines gographiques distinctes ou des individus
de genre proche (Ridgea piscesae) (laissant supposer un mode d'acquisition horizontal du symbiote),
les symbiotes thioautotrophes de Calyptogena taient quant eux retrouvs dans les oocytes du
mollusque (mode d'acquisition vertical). La forme libre du symbiote de Riftia n'a jamais t dtecte
dans l'environnement proche des vers, mais le gne codant pour une flagelline a t dtect dans
l'endosymbiote (Millikan et al., 1999). La forme libre du symbiote pourrait donc tre mobile.
Les travaux effectus sur des chantillons de tapis microbien confirment eux aussi la
prdominance dans les banques d'ADNr 16S de phylotypes bactriens associs aux Proteobacteria
(diffrents des prcdents). Ces phylotypes ne correspondent aucun micro-organisme isol de
source hydrothermale. La squence bactrienne la plus proche est celle de Thiomicrospira
denitrificans 22 une bactrie sulfo-oxydante chimiolithoautotrophe pouvant dnitrifier et isole de
sdiments marins ctiers. Ces micro-organismes pourraient revtir un rle dans le cycle du soufre au
sein des cosystmes hydrothermaux. Le second phylotype le plus abondant correspond une
Proteobacteria proche de Xanthomonas sp. rcemment isole d'eau douce, oxydant l'ion Fe 2+
(Emmerson et Moyer, 1997). En ce qui concerne les squences archaennes, Moyer (1998) dtecte
2 groupes principaux de squences rpartis parmi les Archaea marines du groupe I (Crenarchaeota) et
les Archaea marines du groupe II (Euryarchaeota). Ces dernires ont t aussi dtectes dans les
chantillons provenant de la dorsale mdio-Atlantique (Reysenbach et al., 1999, rsultats non
publis).
Sur des chantillons de chemine provenant du mme site, Harmsen () dtecte une forte
proportion (40%) de bactries hybridant la fois avec la sonde bactrienne et avec la sonde ciblant les
Aquificales. Ces micro-organismes s'avreront correspondre aux Desulfobacteriaceae isoles des
mmes chantillons (L'Haridon et al., 1998). Malgr l'isolement de Thermus, de Bacillus et de
Thermotoga de ces chantillons, seul ce dernier genre a pu tre dtect par hybridation in situ. Ces
tudes confirment de plus que la colonisation microbienne est plus abondante l'extrieur qu'
l'intrieur des chemines (avec de plus en plus de Bacteria par rapport aux Archaea mesure que l'on
se rapproche du centre de la chemine).
L'un des problmes majeurs lors des tudes molculaires d'chantillons hydrothermaux est rencontr
durant l'extraction d'ADN 23.
Riley () a probablement solutionn ce problme en extrayant directement l'ADN bord du
bateau l'aide d'un Ribolyser (Hybaid). Il lui a ainsi t possible d'obtenir de l'ADN gnomique
amplifiable l'aide d'amorces ribosomales. Il n'a toutefois pas pu dtecter de mthanognes comme il
l'aurait dsir.
22
Le genre Thiomicrospira est mal attribu car il ne s'agit pas ici d'une Proteobacteria comme les autres Thiomicrospira isoles
d'environnements hydrothermaux (Muyzer et al., 1995)
23
Ce problme a t report d'ailleurs sur des chantillons hydrothermaux par Reysenbach et al., 1998.
88
Takai () est quant lui parvenu extraire de l'ADN procaryotique d'chantillons de fumeurs
profonds. Une exploitation rapide des chantillons ainsi qu'une technique efficace de broyage et de
filtration des chantillons lui a permis de disposer de suffisamment d'ADN pour raliser des
amplifications et des clonages. Il a observ une trs forte diversit de squences archaennes se
rpartissant parmi des phylums dj dtects dans les sources profondes (Archaeoglobales,
Methanoccoccales) mais aussi parmi de nombreux nouveaux phylums dont certains sont associs aux
Euryarchaeota, aux Crenarchaeota et aux Korarchaeota. De manire trs surprenante aucune
Thermoccoccales n'a t dtecte durant ces tudes.
Les conditions extrmes de temprature, de pression ainsi que les forts gradients physico-
chimiques observs dans des cosystmes hydrothermaux profonds font de ces sites des candidats
idaux pour les tudes molculaires de la diversit. Jusqu' prsent les rsultats obtenus laissent
augurer une diversit trs abondante qui ne dment pas le qualificatif "d'oasis" qui avait t attribu
aux sources il y a 20 ans.
4.5 Les sites hydrothermaux continentaux et ctiers
4.5.1 Description des biotopes

4.5.1.1 Les sites terrestres
D'une manire analogue aux systmes profonds, les systmes continentaux et ctiers sont
lis la rencontre d'eau d'infiltration avec le magma profond. Le parcours de cette eau dans la crote
terrestre va conditionner sa composition chimique et sa forme d'mergence (fumerolles, geysers,
mares de boues acides ou basiques).
S'il s'infiltre une faible quantit d'eau, celle ci va s'chapper sous la forme de fumerolles comme c'est le
cas Pozzuoli en Italie. Mais souvent ces missions sont associes une activit hydrothermale plus
diversifie. Ainsi, aux fumerolles places en haut des collines sont souvent associs des geysers et
des sources chaudes situes quant elles dans la partie basse du bassin.
Les fumerolles et les geysers
(cf. figure 2.15) correspondent

l'mission d'un fluide trs minralis
qui a travers profondment la crote
terrestre et qui ressort violemment
100C dans le cas des geysers ou qui
recircule sur de longues distances
dans la lithosphre pour ressortir sous Photos ParkVision.
Figure 2.15. Old Faithfull Geyser ( droite) et
formes de vapeurs (fumerolles). fumerolles (en haut) au parc de Yellowstone (USA).
Il existe deux formes de sources chaudes , en fonction du type de
89
minraux dont se sera charg le fluide en traversant la lithosphre. S'il est charg en acide sulfurique le
pH sera de 1 2,5. S'il est par contre charg en carbonate ou en bicarbonate il sera de l'ordre de 6,3
10,2.
Dans les sources acides (cf. figure 2.16), on relve
une forte concentration en soufre et en fer mais une trs

faible minralisation (l'eau n'a pas pntr profondment
dans le sol). Les gaz volcaniques qui s'chappent de la
source sont chargs en H2, CO 2, H2, H2S, CO et NH3. En
arrivant au contact de l'air les sulfures sont oxyds en S.
Cette oxydation est poursuivie par les bactries soufre-
oxydantes qui produisent alors de l'acide sulfurique
Figure 2.16. Bassin de boues acides dans le Upper
Geyser Bassin. Photos ParkVision. Yellowstone (USA) H2SO 4. Il peut se former de manire concomitante des
mares de boues acides. Elles seront trs acides en
surface (pH 0,5 4) et anoxiques et plus basiques en profondeur. Elles ne constituent pas par contre
un biotope stable car les eaux de pluie modifient trs rgulirement leur pH.
Les sources alcalines correspondent des eaux
ayant circul en profondeur dans la crote terrestre (cf.

figure 2.17). Trs charges en minraux qui vont se
solidifier au contact de l'air, elles constituent un biotope
trs stable car les eaux de profondeur les alimentent
rgulirement et tamponnent les effets lis aux eaux de
pluie. Ces cosystmes sont caractriss par la
prsence d'amas bactriens trs stratifis. Les sources
du parc de Yellowstone ont fait l'objet d'tudes trs
Figure 2.17. Fountain Paint Pot Photo Park Vision.
pousses et de suivis rguliers dont des synthses ont Yellowstone (USA)
t proposes rcemment par D. Ward et al. (1998) et
par Reysenbach (en prparation).
4.5.1.2 Les sites ctiers

On observe des sites hydrothermaux faible profondeur
sur les ctes de l'le Vulcano en Italie et proximit des ctes
Islandaises (cf. figure 2.18). Comme dans les sites profonds on peut
retrouver des petites chemines mettant un fluide charg en H2S
mais on peut aussi observer le fluide qui percole parmi les
sdiments ou le sable. Les tempratures sont alors proches de
100C mais ne peuvent atteindre de trs fortes valeurs du fait de la
faible pression hydrostatique.
Figure 2.18. Emissions ctires sur le site de Vulcano.
Source site web de la municipalit de Vulcano.
Il existe aussi un hydrothermalisme lacustre. Certains lacs situs sur les failles actives sont le
90
sige de phnomnes d'hydrothermalisme. Le fluide hydrothermal peut percoler aux travers de

sdiments faible temprature ou sortir des tempratures plus leves en difiant de petites
chemines.
4.5.2 Les micro-organismes des sites ctiers et continentaux

Les sites hydrothermaux ctiers et terrestres ont fait l'objet de nombreuses tudes. En effet
leur facilit d'accs (par rapport aux sites ocaniques profonds)24 permet de raliser des suivis et des
collectes d'chantillons d'une manire beaucoup plus simple donc beaucoup plus frquente. Ceci
explique en partie la grande diversit de souches isoles aussi bien de milieux marins que terrestres.
De plus les isolements raliss en surface ou proches de la surface permettent d'accder une
communaut arobie ou micro-arophile srement moins abondante dans les gisements profonds. Il
ne semble pas qu'il y ait des genres particulirement infods aux milieux terrestres et d'autres aux
milieux marins. En effet, de nombreuses souches ont t retrouves de manire ubiquitaire dans des
sources ctires aprs avoir t dcrites dans des sources continentales. Seules certaines
sulfothermophiles acidophiles n'ont pu tre isoles de milieu marin.
4.5.2.1 Les souches msophiles marines et continentales

Les souches msophiles observes dans les cosystmes marins ctiers sont les mmes que
celles observes en milieux profonds. On retrouve notamment des bactries sulfo-oxydantes
associes aux genres Beggiatoa et Thioplaca (Hoaki et al., 1994, 1995) et de nombreuses
htrotrophes (Gugliandolo et Maugeri, 1998). Dans certains sdiments on retrouve la communaut
microbienne associe aux sdiments froids (BSR, mthanognes, dnitrifiantes, voir 4.3.1).
En milieu terrestre le facteur de dilution observ en milieu marin n'a pas cours. Les
cosystmes sont beaucoup plus stables et sont aussi beaucoup moins tendus. Les cosystmes
terrestres chauds ne vont donc tre coloniss que par de pures thermophiles (modres
hyperthermophiles).
4.5.2.2 Les souches thermophiles marines et continentales.

Les cosystmes terrestres tels que ceux observs au Parc de Yellowstone aux USA
constituent les premiers milieux d'tude des micro-organismes thermophiles. En 1964 Thomas Brock
se rend pour la premire fois au Parc de Yellowstone afin d'isoler des reprsentants du genre Thiotrix.
Les relevs de temprature qu'il ralise l'incitent rechercher des micro-organismes capables de se
dvelopper aux tempratures observes in situ. En 1965 il observe et tente de cultiver de longs
filaments roses, particulirement abondants la sortie du fluide et dans un bassin qui deviendra par la
suite un bassin de rfrence pour les tudes microbiologiques : l'Octopus Spring25 (Brock, 1995). Si la
24
Les sites ctiers ne ncessitent pas de submersibles et sont souvent accessibles par de simples plongeurs.
25
Cette source fait la couverture de la 8me dition de "Biology of Microorganisms" de T. Brock.
91
position phylogntique de ces filaments a t dfinie en 1994 (Reysenbach et al., 1994) ces
derniers vont rester incultivables jusqu'aux travaux de l'quipe de Stetter (Huber et al., 1998b) qui va
mettre au point une chambre de culture recrant les conditions de croissance in situ, notamment en
recrant les surfaces permettant la fixation des filaments exposs un flux chaud de nutriments, et va
utiliser des pinces optiques pour isoler spcifiquement les micro-organismes qui seront remis en
culture par la suite.
Mais l'une des dcouvertes majeures ralise Yellowstone est l'isolement en 1966 de
Thermus aquaticus qui deviendra en 1980 la source de l'enzyme cl de la biologie molculaire la Taq
polymrase (Brock et Freeze, 1969 puis Saiki et al., 1985, 1989).
Le tableau 2.9 prsente l'ensemble des bactries thermophiles isoles de sites terrestres et ctiers.
Tableau 2.9. Bacteria isoles de sites hydrothermaux terrestres et ctiers

Domaine Genres Optimum Origine Type Rfrences
BACTERIA (C) Respiratoire
Acidothermus sp. 55 t arobie Mohagheghi et al., 1986
Aquifex sp. 85 m microarobie Huber et al. , 1992
Alicyclobacillus (=Bacillus) 60-80 t/m arobie (Darland et Brock 1971) Wisotzkey et al., 1992.
Calderobacterium 75 t arobie Kryukov et al. , 1983
Chloroflexus 50 t arobie Pierson et Castenholz,1974
Fervidobacterium 70 t anarobie Patel et al., 1985
Hydrogenobacter 70-75 t arobie Kawasumi et al. , 1984
Miothermus 60-70 t arobie Chung et al. , 1997
Moorella 60 t ananrobie Slobodkin et al., 1997a
Rhodothermus 65 m arobie Alfredsson et al. , 1988
Synechococcus 65 t arobie
Thermoanaerobacter ium 60 t anarobie Schink et Zeikus, 1983
Thermoanaerobacter 65 t anarobie Zeikus et al. , 1979
Thermobrachium 55 t anarobie Engle et al., 1996
Thermocrinis 80 t arobie Huber et al. , 1998b
Thermodesulfobacterium 70 t anarobie Zeikus et al., 1983
Thermodesulfovibrio 60 t anarobie Henry et al., 1994
Thermoleophilum 60 t arobie Zarilla et Perry, 1986
Thermomicrobium 73 t arobie Jackson et al., 1973
Thermonema 60 t arobie Hudson et al., 1989
Thermosipho 75 m anarobie Huber et al., 1989b
Thermosyntropha 60 t anarobie Svetlitshnyi et al., 1996
Thermoterrabacterium 65 t anarobie Slobodkin et al. , 1997b
Thermothrix 72 t anarobie Caldwell et al. , 1976
Thermotoga 80 m anarobie Huber et al. , 1986
Thermus 60-70 t arobie Brock et Freeze, 1969
t: terrestre; m: marine cotire, Acido: acidophile
D'une manire analogue le tableau 2.10 prsente l'ensemble des souches d'Archaea
thermophiles isoles d'environnements hydrothermaux terrestres et ctiers.
92
Tableau 2.10. Archaea isoles de sites hydrothermaux terrestres et ctiers.

Domaine Genres Optimum Origine Type Rfrences
ARCHAEA (C) Respiratoire
Euryarchaeota
Thermococcales Thermococcus 80-90 t,m anarobie Zillig et al. , 1983b
Pyrococcus 95-100 m anarobie Fiala et Stetter , 1986.
"Aphrodite" m anarobie Arab,1999 (result. non pub.)
Archaeoglobales Archeaoglobus 83 t,m anarobie Stetter, 1988
Ferroglobus 85 m anarobie Hafenbradl et al. , 1996
Mthanococcales Methanococcus 65 m anarobie Huber et al. , 1982
Mthanobactriales Methanobacterium 55-65 t anarobie Winter et al. , 1984
Methanothermus 83-88 t anarobie Stetter et al. , 1981
Thermoplasmales Thermoplasma 59 t,m Acido, arobie Darland et al. , 1970
Picrophilus 60 t Acido, arobie Scleper et al. , 1995
Crenarchaeota
Thermoprotales Thermoproteus 88-90 t anarobie Zillig et al. , 1981
Thermofilum 80-88 t anarobie Zillig et al. , 1983a.
Pyrobaculum 100 t, m anarobie Huber et al. , 1987
Thermocladium 75 t anarobie Itoh et al. , 1998
Dsulfurococcales Desulfurococcus 85-90 t anarobie Zillig et al. , 1982
Staphylothermus 92 m anarobie Fiala et al. , 1986
Stetteria 93 m anarobie Jochimsen et al., 1998
Sulfolobales Sulfolobus 65-87 t Acido, arobie Zillig et al. , 1980
Sulfurisphaera 85 t Acido, arobie Kurosawa et al., 1998
Stygiolobus 80 t Acido, arobie Segerer et al. , 1991
Mettalosphaera 75 t Acido, arobie Huber et al. , 1989a
Sulfurococcus 70-75 t Acido, arobie Karavaiko et al. , 1994
Desulfurolobus 81 t Acido, arobie = Acidianus sp.
Acidianus 70-90 t, m Acido, arobie Segerer et al. , 1985
Pyrodictiales Pyrodictium 80 m anarobie Stetter et al. , 1983
Hyperthermus 95-106 m anarobie Zillig et al. , 1990
non-classs Aeropyrum 90-95 m arobie Sako et al. , 1996
Caldococcus t Aoshima et al. , 1996
Igneococcus t Burggraf et al. , 1997
Sulfophobococcus 90 t anarobie Hensel et al. , 1997
Thermodiscus 93 m Burggraf et al. , 1997
Thermosphaera 85 t anarobie Huber et al. , 1998a
t: terrestre; m: marine ctire, Acido: acidophile
Au sein de nombreux cosystmes terrestres, notamment les sources chaudes pH neutre,

on retrouve comme producteurs primaires des thermophiles modrs bactriens ralisant la
photosynthse. Ces bactries appartiennent aux cyanobactries du genre Synechococcus ou
Mastigocladus et des bactries vertes non sulfureuses (GNS) du genre Chloroflexus.
4.5.2.3 L'apport des techniques molculaires
Sur les sites hy drothermaux ctiers
D'une manire analogue aux sites profonds, trs peu d'tudes ont t ralises afin de
dterminer la diversit microbienne des sites ctiers par des mthodes molculaires. Les sources
tudies jusqu' prsent sont des sources situes proximit des ctes japonaises ou prs des les
grecques. Yamamoto et al. (1998) ont tudi la diversit microbienne d'enchevrtrements bactriens
soufrs par squenage de l'ADNr 16S clon et par hybridation in situ. Ils observent :
93
- qu'il n'est pas possible d'amplifier de l'ADN archaen,

- que les banques de 16S diffrent selon qu'elles sont construites partir du lysat brut ou de l'ADN
purifi du lysat (diversit plus abondante dans le dernier cas),
- que ces squences bactriennes sont majoritairement (40 68 %) associes aux Aquificales. Les
autres squences correspondent des Firmicutes et des Proteobacteria (, et ).
Cette tude a t complte rcemment par une analyse des profils quinoliques indiquant que
lorsque la temprature du tapis bactrien augmente sa diversit dcrot (Hiraishi et al., 1999).
Les travaux de Takai et Sako (1999) ont port sur des sources terrestres et ctires en
ralisant des banques de squences archaennes et universelles. Dans le cas des sources marines
(fluide chaud : 128C), l'ensemble des squences isoles des banques universelles correspond des
Bacteria se rpartissant parmi des Pseudomonas, des bactries fixatrices d'azote (Bartonella,
Rhizobium, Agrobacterium)26 et des hyperthermophiles (Aquifex). Les squences archaennes se
rpartissent parmi les Euryarchaeota hyperthermophiles (Thermococcales) et les Crenarchaeota
proches de reprsentants isols (Pyrolobus, Pyrodictium, Stetteria) ou proches du groupe I de
Crenarchaeota marines. Mais l'un des plus intressants rsultats est la dtection en milieu marin de
squences associes aux Korarchaeota dtectes jusqu' prsent uniquement dans des sources
terrestres (voir plus loin). Les squences provenant d'chantillons de sdiments hydrothermaux sont
rparties essentiellement autour des Archaea marines du groupe I, de Proteobacteria et des
Firmicutes bas G+C%.
Enfin Dando et al. (1998) dcrivent la composition microbienne de sdiments chauds sur le
site de la baie de Palaeochori sur l'arc volcanique grec. Ils ont ralis des enrichissements
d'hyperthermophiles coccodes anarobies correspondant de nouveaux genres : Stetteria
(Jochimsen et al., 1997) et "Aphrodite" (Arab, 1999 result. non pub.) et de bactries arobies proches
des genres Bacillus, Achromatium et Thioplaca. Des amplifications ont t ralises l'aide d'amorces
spcifiques des Archaea et des Crenarchaeota conduisant l'identification de squences associes
aux genres Staphylothermus, Desulfurococcus, Thermodiscus, Thermosphaera, Stetteria et
Sulfofobococcus ainsi qu' des squences correspondant de nouvelles lignes archaennes.
Sur les sites continentaux
Une abondante littrature dcrit l'utilisation des techniques molculaires afin d'identifier la flore
microbienne associe aux sources hydrothermales et notamment aux sources du parc de
Yellowstone. Ces techniques ont permis non seulement d'tudier la composition de la communaut
microbienne mais de suivre l'volution de cette communaut dans le temps et dans l'espace. Ward et
al. (1992, 1997, 1998) ont propos un historique des travaux raliss dans leur laboratoire, qui ont
26
Il attribue ces deux premiers types de micro-organismes des contaminants non reprsentatifs de la communaut hydrothermale
comme l'avait suggr Tanner et al. (1998).
94
port essentiellement sur l'tude des tapis bactriens. Ces travaux ont t complts par ceux de
l'quipe de Pace qui a travaill sur des chantillons de sdiments prlevs dans un autre bassin.
Figure 2.19. Octopus Spring Figure 2.20. Obsidian Pool

Photos : N. Pace http://crab2.berkeley.edu/~pacelab/
La premire tude a port sur l'analyse de l'ARNr 5S (Stahl et al., 1985) sur le bassin d'Octopus
Spring (cf. figure 2.19). Les auteurs dcrivent alors 3 phylotypes dominants : un premier associ aux
Crenarchaeota soufre-dpendantes et deux autres associs aux Bacteria proches du genre Thermus.
Cette tude a t suivie dans le laboratoire de Ward d'une analyse des ADNr 16S d'un tapis
cyanobactrien (Ward et al., 1990 a et b; Weller et al., 1992) en utilisant diffrentes techniques de
clonage molculaire. Ces travaux ont conduit la description de nouvelles squences associes aux
cyanobactries et aux GNS. Conjointement aux travaux de squenage, des essais d'isolement furent
entrepris afin d'identifier les bactries associes aux squences de clones (Nold et al., 1996) ainsi que
14
des essais d'incorporation de CO2 pour tudier les mcanismes photosynthtiques en fonction du
cycle nycthmral (Nold et Ward, 1996). La mise au point de sondes spcifiques des cyanobactries
et des GNS cultives et non cultives (Ruff-Roberts et al., 1994) permet de mettre en vidence les
biais lis aux mthodes culturales (l'espce cultive n'est pas l'espce la plus abondante dans le milieu
et elle est slectionne dans diffrents chantillons). Puis, par des techniques de dilutions
successives de l'inoculum avant l'enrichissement, il a t possible d'isoler pour la premire fois un
micro-organisme correspondant une squence d'ADNr 16S pralablement clone (Ferris et al.,
1996b). La technique de DGGE a t utilise afin d'identifier la communaut microbienne colonisant
diffrents gradients de temprature au sein du tapis microbien (Ferris et al., 1996a). Il a ainsi t
possible d'observer une grande diversit de squences toutes associes au cyanobactries ou aux
GNS. Cette diversit pourrait correspondre une adaptation de l'espce en fonction des tempratures
du biotope. La DGGE a par ailleurs t utilise afin de dtecter les modifications dans la communaut
microbienne : (I) lors d'un enrichissement (Santegoeds et al., 1996 27; Ward et al., 1997 28), (II) lors des
changements de saisons29 (Ferris et Ward, 1997), (III) lors d'une modification du milieu30 (Ferris et al.,
1997).
27
Il est par ailleurs observ que de nouvelles squences sont dtectes aprs enrichissement alors que celles-ci n'avaient pas t
dtectes ni par isolement ni par clonage direct.
28
L'accent est mis cette fois ci sur le choix de la temprature d'isolement. A forte temprature, des souches de Thermus sont
prfrentiellement isoles alors qu'elles ne reprsentent qu'une trs faible proportion de la communaut microbienne prsente dans
l'chantillon dans cette gamme de temprature.
29
Il n'y a pas proprement parler de succession de populations mais une adaptation des souches diffrentes gammes de
tempratures. Certains phylotypes semblent accrotre puis restreindre, au cours de l'anne, leur gamme de temprature.
95
L'ensemble des rsultats obtenus sur le site d'Octopus Spring a t synthtis rcemment
permettant aux auteurs d'apporter un regard critique sur leur approche polyphasique de la diversit
(Ward et al., 1998).
Au sein de l'quipe de Pace, Reysenbach et al. (1994) s'attachent une description
phylogntique de la communaut bactrienne associe aux filaments roses du bassin d'Octopus
Spring. Ils observent 3 phylotypes majeurs se rpartissant au sein des Thermotogales (1) et au sein
des Aquificales (2). Barns et al. (1994) vont travailler sur la source Jim's Black Pool (appele maintenant
Obsidian Pool, cf. figure 2.20). Aprs amplification des ADNr 16S archaens ils observent une grande
diversit de squences associes la fois des Crenarchaeota soufre-dpendantes et des
Euryarchaeota. Un nouveau groupe de squences enracin trs profondment la base de l'arbre
archaen est aussi dtect (Barns et al., 1996a). Il sera dcrit plus tard comme un nouveau domaine :
les Korarchaeota (Barns et al., 1996b). Il n'a pas t possible jusqu' prsent d'isoler des
reprsentants de ce domaine. Brunk et Eis (1998) sont toutefois parvenus maintenir un
enrichissement en activit dans un chemostat et tudier les mcanismes d'amplification spcifique
des squences d'ADNr 16S korarchaennes en fonction du type d'amorces utilises. Les travaux de
Barns ne portant que sur des amplification archaennes, Hugenholtz et al. (1998a) prsentent par la
suite les amplifications ralises l'aide d'amorces bactriennes et universelles. D'une manire
surprenante les banques universelles ne contiennent pas de squences archaennes (alors que
Barns en avait dtect prcdemment) mais elles contiennent par contre une grande diversit de
squences bactriennes. Ces dernires se rpartissent, pour 70% d'entre elles, dans 14 des 24
divisions bactriennes couramment reconnues : parmi celles ci on retrouve des groupes thermophiles
dont la prsence s'explique dans un tel environnement (Aquificales, Thermotogales, Thermus) mais
aussi des squences correspondant des divisions plus msophiles (Proteobacteria, Firmicutes haut
G+C%, Cytophagales, etc.). Les 30% de squences bactriennes restantes forment 12 nouvelles
divisons dans l'arbre bactrien au sein desquelles aucun reprsentant n'a t jusqu' prsent isol.
Hugenholtz et al. (1998b) proposent donc une nouvelle version de l'arbre bactrien se rpartissant en
36 divisions dont seulement 23 prsentent des reprsentants isols.
A la lumire de l'ensemble des rsultats obtenus sur les sites hydrothermaux terrestres de
Yellowstone, il est vident que les tudes menes par des techniques culturales et non-culturales ont
considrablement accru nos connaissances de cet cosystme. Il est, dans bien des cas, possible de
rpondre aux questions de la composition, de la structure, et de la fonction des diffrentes
populations de micro-organismes se dveloppant dans cet environnement simple et stable. Si de
nombreuses questions restent encore en suspens concernant le type mtabolique de certaines
squences uniquement dtectes par clonage et les relations que l'on peut tablir entre les distances
phylogntiques et les distances gographiques, Ward et al., (1998) nous dmontrent la puissance
de l'approche polyphasique et pluridisciplinaire en cologie microbienne.
30
Cette approche a consist retirer les premiers centimtres de cellules la surface d'un mat. Cette tude est complmente par
l'utilisation de microlectrodes O2 et par des mesures d'assimilation du 14 CO2. Il est alors possible de suivre les successions de
populations lors de la colonisation du mat ainsi que leur mtabolisme.
96
V La flore microbienne lie l'Homme, aux animaux et

l'activit humaine
5.1 L'Homme comme cosystme microbien

L'homme constitue un environnement favorable la croissance microbienne31. C'est un
"milieu" constant physiquement (pH, temprature, pression osmotique) et riche en nutriments (matire
organique, facteurs de croissance). Les micro-organismes colonisent donc de nombreux
compartiments (la peau, les cavits buccale et vaginale, le tractus digestif, les voies respiratoires)
l'exception du sang, des organes et des voies urinaires32. Mais c'est aussi un "milieu" htrogne o
des compartiments de composition chimique particulire ont slectionn certains organismes ayant
dvelopp des mcanismes de rsistance aux systmes de dfense de leur hte (les
lactoproxydases et les lysozymes de la salive, l'acide lactique des scrtions cutanes, la bile et
l'acidit du tractus digestif). L'tude de la flore microbienne est importante car on peut ainsi dtecter
des modifications lors d'infections, en dduire la source de contamination et mieux saisir (voir induire)
les mcanismes immunitaires de dfense.
5.1.1. La flore de la cavit buccale

(d'aprs Marsh et Bradshaw, 1995; Madigan, 1996)
C'est un environnement complexe et htrogne, il est constitu de surfaces lisses et
crevasses baignes dans la salive (qui contient des nutriments mais aussi des anti-bactriens). Les
dents sont constitues de structures minrales comme l'mail (cristaux de phosphate de calcium
formant une matrice enrichie en fluor qui limite les processus de dgradation) et de structures
"vivantes" comme la dentine et la pulpe.
Certains micro-organismes forment des plaques qui se dveloppent comme des films la
surface de la dent. Cette colonisation correspond une succession de populations de micro-
organismes. Dans un premier temps les glycoprotines de la salive crent un film fin de matire
organique la surface des dents sur lequel des Streptoccocus (S. sanguii, S. sorbinus et S. miltis)
forment des microcolonies. Par la suite des bactries filamenteuses (Fusobacterium et Spirochtes)
contribuent l'paississement de la plaque. Si aucun brossage n'intervient, des germes anarobies
peuvent s'installer, principalement des Actinomyctes.
Si la plaque dentaire n'est pas dtruite rgulirement, l'acide lactique produit par les bactries
conduit gnralement la formation de caries par dcalcification de l'mail. Deux micro-organismes
sont impliqus dans la formation des caries. S. mutans produit partir des sucres contenus dans
31
Chez l'homme ont dnombre 1014 cellules bactriennes pour 1013 cellules purement humaines. 10% du poids de l'homme serait
d'origine bactrienne et 1/3 des fces sont constitues de bactries.
32
Ceux-ci ne sont coloniss qu'en cas d'infection.
97
l'alimentation d'importants rseaux de polysaccharides (dextran) qui favorisent la fixation de S.

sorbinus qui lui utilise les sucres pour produire de l'acide lactique.
Enfin certains micro-organismes (Bacteroides gingivalis) peuvent former une plaque la base
de la dent. Ils produisent une protase qui peut conduire une inflammation, puis une ncrose des
tissus de la gencive et un dchaussement des dents.
5.1.2. Les micro-organismes du tractus digestif

Le tractus digestif est constitu de trois parties principales : l'estomac, le petit intestin
(duodnum, jjunum, ilon) et le gros intestin (ou colon) (cf. figure 2.21).
Pricipales bactries Organe

dtectes
Oesophage
Lactobacilles
Estomac
Duodnum
Petit intestin
Enterococcus
Lactobacilles
Jjunum
Enterobactries
Bacteroides Ilon
Enterococcus faecalis
Bifidobacterium
Eubacterium
Gos intestin
Peptonococcus Colon
Ruminococcus
Peptonostreptococcus
Clostrium
Lactobacilles
Anus
Figure 2.21. Micro-organismes du tractus digestif (d'aprs Madigan, 1996)
L'estomac est un milieu particulirement agressif. Les sucs gastriques un pH proche de 2

sont constitus d'HCl et de nombreuses enzymes digestives qui constituent une barrire efficace
contre les germes pathognes (l'estomac est lui mme protg des sucs par une paisse couche de
mucus). L'estomac est toutefois colonis par de nombreux micro-organismes Gram + tels que des
Lactobacillus et des Streptococcus. Cette colonisation fluctue avec l'ge, l'alimentation et l'tat de
sant de l'individu. L'un des germes pathognes le plus frquemment tudi est Helicobacter pylori.
Cette Proteobacteria micro-arophile utilise l'ure contenue dans la salive et les sucs gastriques, la
convertit en ammoniaque et carbonate 33 (base fortes) et contrecarre les effets de l'acidit stomacale. H.
pylori pntre alors dans le mucus et produit des cytotoxines qui dtruisent les cellules mucosales.
Sans mucus l'acidit naturelle de l'estomac et les pepsines contribuent la formation des ulcres.
33
CO(NH 2) 2 + H+ +2H2O --urase--> HCO3- + 2(NH4)
98
Dans le petit intestin le pH et la densit microbienne vont s'accrotre au fur et mesure que l'on
s'loigne de l'estomac. On peut atteindre des densits de 105-10 7 bactries.g -1.
Dans le gros intestin la colonisation microbienne est trs importante. Elle atteint 107 cellules.g-1
pour les micro-organismes arobies jusqu' 10 10-10 11 cellules.g-1 pour les anarobies. Le tractus
digestif d'un nouveau n est strile. Par la suite des micro-organismes pionniers colonisent cet
environnement, le modifient et permettent la mise en place d'une seconde flore qui prend la place des
pionniers.34 A la naissance cette flore est essentiellement constitue de Bifidobacterium puis la
modification du rgime alimentaire entrane l'apparition d'une nouvelle flore intestinale incluant un
grand nombre de genres fermentatifs comme Clostridium, Bacteroides, Enteroccocus et les coliformes
mais aussi des Archaea mthanognes, des bactries sulfato-rductrices et actognes (Pochart et
al., 1992; Bernalier et al., 1996; Morvan et al., 1996)
5.1.3 L'apport des techniques molculaires en microbiologie humaine

La flore microbienne associe l'homme a t intensivement tudie par des techniques de
culture et jusqu' prsent trs peu de travaux ont abord l'tude de la diversit par une approche
molculaire. On estime toutefois que pour cet environnement entre 20 et 40% des micro-organismes
ont chapp aux mthodes culturales (Suau et al., 1999). Les techniques molculaires ont par contre
t mises profit pour dtecter spcifiquement certains germes commensaux ou le plus souvent
pathognes. En microbiologie clinique la recherche de germe spcifiques prime souvent sur
l'cologie et de nombreuses techniques de dtection par PCR l'aide d'amorces spcifiques du
genre, de l'espce, de la sous-espce ou d'un biovariant ont t dcrites pour tudier la flore
pathogne comme la flore indigne (Schmidt et Relman, 1994; Dzik, 1995; Whelen et Persing, 1996).
Certaines techniques ont toutefois t dveloppes afin d'extraire l'ADN procaryotique de
tissus particuliers comme la plaque dentaire (Parrish et Greenberg, 1995) ou les gencives (Smith et al.,
1989 a et b).
Sur la flore de la cavit buccale, jusqu' prsent, une seule tude a t ralise pour tudier la
diversit microbienne d'un abcs dentaire par amplification de l'ADNr 16S bactrien et squenage
(Dymock et al., 1996). Ce travail a t approfondi par une tude plus prcise de trois phylotypes
(pralablement dtects) dans des tissus de patients sains et malades par amplification l'aide
d'amorces de PCR spcifiques (Harper-Owen et al., 1999). Au sein du mme laboratoire une tude
similaire a port sur l'amplification spcifique d'ADNr 16S codant pour le genre Eubacterium suivi d'un
squenage (Spratt et al., 1999). Une tentative de quantification bactrienne par PCR comptitive de
la flore buccale a rcemment t entreprise (Rupf et al., 1999). Mais la majeure partie des tudes
entreprises sur la flore buccale consiste dtecter par PCR des germes connus l'aide d'amorces
34
Chez la souris Flavobacterium, Lactobacillus et entrococci sont les micro-organismes pionniers. Flavobacterium disparat au bout
de 8 jours et Lactobacillus au bout de 18; Bacteroides (anarobies stricts) apparat par la suite et domine la communaut.
99
spcifiques dfinies sur l'ADNr 16S. Pour exemple : Helicobacter pylori (Nguyen et al., 1993; Wahlfors
et al., 1995), Treponena sp. (Willis et al., 1999), Spirochtes incultivables (Choi et al., 1994), Eikenella
corrodens et Actinobacillus actinomycetemcomitans (Furcht et al., 1996). Des sondes
oligonuclotidiques ont t utilises pour dtecter des Bacteroides forsythus sur des extraits d'ADN
buccaux (Moncla et al., 1991).
La diversit de la flore intestinale a t tudie par culture et extraction de l'ADN total suivi de
l'amplification et du squenage des gnes d'ADNr 16S bactriens par Wilson et Blitchington (1996).
Cette tude rvle la fois la diffrence obtenue entre les deux mthodes (certaines squences sont
abondantes dans la banque d'ADNr 16S mais sont absentes dans les cultures et inversement) et le
biais produit par la PCR (la diversit phylogntique est bien plus importante aprs 9 cycles de PCR
qu'aprs 35 cycles). La majorit des squences dtectes sont associes des genres ou des
espces communment enrichies dans la flore intestinale (Bacteroides, Clostridium). Une tude plus
rcente mene par Suau et al. (1999) obtient des rsultats similaires. Quatre-vingt quinze pour cent de
la banque de clone sont associs trois groupes phylogniques (Bacteroides, Clostridium coccoides,
C. leptum), mais seuls 24% de la banque sont clairement associs des espces isoles. Wang et al.
(1996) quantifient quant eux les principaux germes anarobies retrouvs dans les flores intestinales
animales par des techniques de dilutions successives suivies de PCR l'aide d'amorces spcifiques
de certaines espces. Des approches fondes sur l'emploi d'un grand nombre de sondes
nuclotidiques (domaine spcifique et orientes vers la flore anarobie) (Franks et al., 1998) et sur
l'emploi de la TGGE (Zoetendal et al., 1998) ont aussi t utilises. Enfin d'une manire similaire la
flore buccale, beaucoup de publications dcrivent la dtection par PCR d'espces ou de genres
spcifiques l'aide d'amorces ou de sondes dessines sur l'ADNr 16S (cf. revue de Whelen et
Persing, 1996). Des articles rcents ont mis profit la puissance de la dtection PCR pour analyser des
septicmies anciennes dans des tissus conservs dans le formol :
infection de 1979, individus susceptibles d'avoir t infects par des "armes biologiques"
(Bacillus anthracis; Jackson et al., 1998b),
infection de 1997, dans des tissus d'animaux ayant t tus par le charbon (Patra et al.,
1998),
infection datant des 16 eme et 18 eme sicles, dans des restes de pulpe dentaire sur des
squelettes d'individus probablement morts de la peste (Yersinia pestis; Drancourt et al., 1998),
infection datant de 1918, dans des tissus de foie d'individus ayant t tus lors de l'pidmie
de grippe espagnole (Reid et al, 1918).
Des tudes similaires celles ralises sur la flore buccale et intestinale ont t effectues sur
la flore pathogne pouvant infecter le liquide crbro-spinal (Greisen et al., 1994) et sur les micro-
organismes impliqus dans les infections chroniques de la prostate (Tanner et al., 1999).
5.2 La flore microbienne associe aux autres animaux

Les micro-organismes entretiennent des relations avec un grand nombre d'Eucarya :
protozoaires, animaux comme vgtaux. La microbiologie classique a permis de rsoudre nombre des
100
relations qui peuvent tre de nature commensale, mutualiste ou parasitaire. Mais certaines relations
mettent en jeu des mcanismes de symbiose trs stricts que des techniques d'tude uniquement
culturales ne peuvent rsoudre. Les techniques molculaires ont donc permis d'accder la diversit
des micro-organismes impliqus dans ces relations, je me propose dans ce chapitre d'en dcrire
certaines.
Mollusques, Eponges et Holoturies :
Les travaux sur la communaut symbiotique des mollusques hydrothermaux ont t dcrits
prcdemment (cf. 4.4.3). On peut toutefois citer des travaux similaires effectus sur des
mollusques prlevs dans des environnements tropicaux ctiers (Distel et al., 1991; Durand et al.,
1996; Gros et al., 1996; Krueger et Cavanaugh, 1997).
Les travaux de Preston et al. (1996) sur les Eponges et ceux de Mc Innerney et al. (1995) sur
les Holoturies ont t dcrits plus haut (cf. 4.2.2.1). Les travaux de Preston ont t poursuivis par la
construction d'une banque fosmidique d'ADN gnomique permettant d'accder des gnes
fonctionnels comme le gne de l'ADN polymrase (Schleper et al., 1997b) mais aussi aux micro-
htrognits au sein de l'opron ADNr (Schleper et al., 1998).
Insectes :
De nombreux insectes prsentent de fortes relations symbiotiques avec les micro-organismes.
Ces derniers sont trs souvent retrouvs dans le tractus digestif de ces animaux (Cazemier et al.,
1997). Les micro-organismes contenus dans l'estomac des termites ont t trs tudis. En effet
cette communaut conditionne chez cet Arthropode la digestion des composs base de cellulose
et, une chelle rduite, peut tre compare au fonctionnement du rumen chez un grand nombre de
ruminants. Jusqu' prsent trs peu d'isolats ont pu tre obtenus; les informations dont on dispose
proviennent d'tudes ralises l'aide de microlectrodes (Brune, 1998) ou d'amplifications des
gnes d'ADNr 16S partir d'extrait d'estomac :
du termite Reticulitermes speratus par analyse de l'ADNr 16S (Ohkuma et Kudo, 1996); de l'ADNr
16S, du gne mcr et du gne NifH (Kudo et al., 1998),
du termite Cryptotermes domesticus (Ohkuma et Kudo, 1998),
du termite Reticulitermes speratus par T-RFLP (Liu et al., 1997)
du termite Reticulitermes speratus par analyse de l'ADNr 16S et hybridation in situ de la
communaut archaenne (Shinzato et al., 1999),
des symbioses entre les mthanognes et R. speratus (Ohkuma et al., 1995) et chez d'autres
termites (Ohkuma et al., 1999),
des termites Nasutitermes lujae (spirochtes incultivables, Paster et al., 1996), et de
Mastodermes darwiniensis (spirochtes incultivables, Brechtold et Knig, 1996), (flore totale par
hybridation in situ, Bertchold et al., 1999)
et des protozoaires de l'estomac de R. speratus par analyse de l'ADNr 18S (Ohkuma et al., 1998)
et des facteurs d'longation (Moriya et al., 1998).
Des tudes similaires ont t ralises sur les micro-organismes intestinaux de Criquets (Santo
Domingo et al., 1998b). Il a mme t possible d'tudier les bactries associes des insectes
101
emprisonns dans l'ambre depuis 25 40 millions d'annes. Aprs la mise au point d'une technique
efficace d'extraction d'ADN partir d'chantillons anciens (Cano et Poinard, 1993), il a t possible de
dtecter par amplification et squenage des Bacillus dans des chantillons d'insectes (Proplebeia
dominicana) (Cano et al., 1994) puis de remettre en culture des spores de Bacillus provenant des
mmes chantillons (Cano et Borucki, 1995)35 ainsi que des Staphylococcus (Lambert et al., 1998).
Rcemment des isolements caractriss par squenage et FAME suivis d'une analyse molculaire de
la communaut totale d'chantillons d'ambre par T-RFLP a t entreprise (Greenblatt et al., 1999). Les
rsultats obtenus par ces deux mthodes sont cohrents mais il apparat que les mthodes
molculaires peuvent tre biaises en raison de la forte dgradation des ADN dans de trs vieux
chantillons et par la prsence d'inhibiteurs de la PCR.
Chords:
Les micro-organismes du rumen ont t aussi intensivement tudis que ceux des intestins
humains, dans un premier temps par des techniques culturales puis par l'emploi de sondes nucliques
(Krause et Rusell, 1996a; Stahl et al., 1988). Dans un environnement stabilis on peut observer des
micro-organismes dgradant la cellulose (Bacteroides, Ruminococcus), les protines (Veillonella),
l'amidon (Selenomonas), et des producteurs de mthane (Methanobacterium). L'utilisation de sondes
plus spcifiques a permis de suivre l'volution de certaines espces en fonction du rgime alimentaire
(Forster et al., 1996; Krause et Rusell, 1996b; Schofield et al., 1997). Rcemment Tajima et al. (1999)
ont tudi le rumen de vaches en amplifiant spcifiquement l'ADNr 16S bactrien partir
d'chantillons liquides et solides. Ils n'observent pas de diffrences avec les rsultats obtenus par les
mthodes de mise en culture : les Firmicutes haut G+C% et les Cytophagales dominent dans les
banques. Des techniques fondes sur l'analyse du G+C% de l'ADN total extrait de tractus digestifs de
poulets a permis de suivre l'volution de la flore intestinale entre le petit intestin et le ccum (Apajalahti
et al., 1998). Il n'est toutefois pas possible dans cette tude de dfinir prcisment les genres des
bactries prsentes dans l'chantillon.
Angert et al. (1993) ont isol par micromanipulation et squenage le symbiote incultivable du
poisson chirurgien. Epulopiscium fishelsoni tait alors la plus grande bactrie connue (80 x 600 nm).
Enfin la communaut intestinale du poisson (Platichthys flesus) a t tudie aprs amplification et
squenage. Il a t possible d'y dtecter des squences associes aux Archaea marines du groupe II
(van der Maarel et al., 1998), et des squences associes aux methanognes (van der Maarel et al.,
1999).
Autres:
Les symbiotes d'Acanthamoeba spp. ont t tudis aussi par amplification de l'ADNr 16S et
squenage (Fritshe et al., 1999). Ces organismes retrouvs de manire ubiquitaire dans le sol et l'eau
se nourrissent de micro-organismes et sont des facteurs de dissmination de germes pathognes
notamment en milieu hospitalier.
35
Des tudes sur la flore intestinale de Mammouth ont t aussi ralises mais elles consistaient uniquement en une mise en culture
des souches retrouves dans des restes d'intestins (vieux de 12000 ans) suivi d'un squenage des isolats (Rhodes et al., 1998). On ne
peut dans ce cas exclure la possibilit de contaminants.
102
Les micro-organismes associs aux algues ont t tudis galement par des techniques semblables
chez Halophila stipulacea (Weidner et al., 1996) et chez des algues vertes de la classe des
Charophyceae (Fisher et al., 1998).
Aux cosystmes animaux, marins et terrestres naturellement coloniss par les micro-
organismes, les activits humaines ont contribu adjoindre de nouveaux biotopes drivant de
processus industriels de productions alimentaires ou chimiques (fermentation, bioconversion), de
transformation des dchets (traitements biologique) ou d'extraction des minerais (biolixiviation).
L'essor des biotechnologies, intgrant celui de la microbiologie industrielle, a contribu faire prendre
pleinement conscience du rle des micro-organismes dans notre conomie. L'tude de ces
cosystmes devait dpasser alors l'aspect purement cologique pour permettre de contrler, c'est
dire de prvoir et de modifier le comportement des diffrentes populations microbiennes au sein d'un
environnement confin. L'emploi de mthodes molculaires grandement facilit cette tche.
5.3 Les micro-organismes associs aux activits humaines

Deux biotopes lis des activits anthropomorphiques ont t particulirement tudis
l'aide des techniques molculaires : les boues de station d'puration et les bassins de biolixiviation. Le
fonctionnement de ces deux biotopes est intimement li la prsence de micro-organismes qui dans
un cas (boues actives) vont acclrer la dgradation de la matire organique et les processus de
floculation et dans l'autre cas, faciliter la solubilisation des mtaux prcieux (lixiviation).
5.3.1 L'extraction de minerai

L'extraction des minerais comme le Cuivre ou l'Uranium est ralise grande chelle par des
procds de solubilisation des minerais (soufrs gnralement) par des solutions acides. Cette
solubilisation ralise l'air libre permet la colonisation des rservoirs par une communaut
bactrienne trs abondante constitue essentiellement de micro-organismes soufre-oxydants,
autotrophes ou htrotrophes. Les techniques molculaires ont t mises profit pour suivre les
successions de populations au sein de ces rservoirs soit par amplification et squenage des ADNr
16S (Goebel et Stackebrandt, 1994), soit par amplification et squenage de l'espace inter-gnique
16-23S sur l'ADNr (Pizarro et al., 1996; Espejo et Romero, 1997; Vsquez et Espejo, 1997), soit par
DGGE (Fournier et al., 1998). Une tude rcente a permis de dtecter, dans des extraits de
biolixiviation de cuivre des squences archaennes correspondant aux Thermoplasmales (la souche a
t cultive mais n'a pas pu tre obtenue en culture pure) (Vsquez et al., 1999).
103
5.3.2. Les boues de stations d'puration

Les stations d'puration constituent un systme complexe o se mlent la fois des
techniques physiques (filtration, sdimentation, chloration, cf. figure 2.22) et des techniques
biologiques mettant en jeu une importante communaut microbienne .
La connaissance de la structure de la communaut microbienne des boues actives (traitement
arobie de la phase soluble) et des fermenteurs (traitement anarobie de la phase insoluble) est un
axe de recherche majeur. En effet la connaissance de cette structure permet d'influer sur sa
dynamique (en jouant sur les nutriments ou sur l'ensemencement par une flore dfinie) et donc sur
l'efficacit du traitement des eaux uses (cf. figure 2.22). Compte tenu de la diversit des nutriments
disponibles dans les boues, la diversit mtabolique et phylogntique est aussi trs importante.
Aussi les techniques de culture, d'analyse par immunofluorescence, comme les profils quinoliques et
polyaminiques ne rendent qu'une image trs restreinte de cette diversit (Snaidr et al., 1997). Les
techniques molculaires ont donc t utilises abondamment pour rendre compte de la diversit aussi
fidlement que possible.
Eaux
Filtration
uses Sdimentation
Boues solides Effluant liquide

fraction insoluble fraction soluble
microbiologique
Traitement anarobie: Traitement arobie:

Traitement
digestion oxydation
Boues actives Egouttage
Schage Dsinfection:
Incinration - chloration
Effluant trait
rejett dans les
rivires
Figure 2.22. Reprsentation schmatique du fonctionnement d'une station d'puration (d'aprs Madigan, 1996)
Les tableaux 2.11 et 2.12 se proposent d'numrer une partie des analyses ralises l'aide
de techniques molculaires sur diffrents chantillons de boues actives ou d'eau uses de stations
d'puration.
Tableau 2.11. Analyse de la diversit microbienne totale
Rfrences Techniques Commentaires
Bond et al. , 1995 Amplif. 16S / Squ. Comparaison de la population microbienne de 2 fermenteurs dont l'un limine les
phosphates.
Bradford et al. , 1996 Micromanipulation / Isolat Etude des bactries filamenteuses. Isolement par micromanipulation,
Amplif. 16S / Squ. squenage et localisation l'aide de sondes spcifiques.
Sondes 16S
Eichner et al. , 1999 TGGE 16S Effet de l'addition d'un micro-organisme pouvant dgrader les phnols sur une
population microbienne lors d'un choc phnolique.
Harmsen et al. , 1996b Sondes 16S Analyse des gradients de population dans des granules des boues actives.
Analyse des successions syntrophe/mthanognes.
Kmpfer et al. , 1996 Isolats 70% des souches isoles (Proteobacteria ) ne correspondent qu' 5% des
Sondes 16S et 23S bactries dtectes par hybridation in situ.
104
Tableau 2.11. (suite)

Liu et al., 1997 T-RFLP Quantification de flore microbienne de boues actives et de fermenteurs.
Nielsen et al. , 1999 DGGE 16S Analyse de la flore de boue d'un fermenteur pour l'limination du phosphore.
Sondes 16S Dtection d'un nouveau groupe de Proteobacteria .
Pillai et al. , 1996 Ribotypage sur l'espace Dtection de Clostridium dans l'atmosphre proximit des tanks d'puration.
intergnique 16-23S
Sekiguchi et al. , 1998 Amplif. 16S / Squ. Analyse des gradients de population dans des granules des boues actives
Sekiguchi et al. , 1999 Sondes spcifiques prleves 35 et 65C. Relation entre les Syntrophobacter et les mthanognes.
Microscopie confocale
Snaidr et al. , 1997 Amplif. 16S / Squ. Concordance des proportions entre les hybridations ralises sur la banque et
Sondes 16S celles ralises in situ.
Vainio et al. , 1997 Isolats Communaut microbienne cultivable et non cultivable. Aucun clone ne
Amplif 16S/Squ correspond aux isolats.
Wagner et al. , 1993 Isolats / sondes 16S Effet de la charge en matire organique sur la population microbienne.
Wagner et al. , 1994 Proportion d'Acinetobacter dans les tanks liminant les phosphates.
Wallner et al. , 1995 Sondes 16S Analyse et slection de la population microbienne des boues.
Wallner et al. , 1997 Cytomtrie en flux
Tableau 2.12. Analyse de genres ou d'espces particuliers

Harmsen et al. , 1996a Sondes 16S Analyse des bactries oxydant le propionate et des syntrophes associs.
Neef et al. , 1998. Sondes 16S Recherche et quantification de Planctomycetales. Ces souches peuvent
correspondre jusqu' 5% de la population totale mais ne sont pas dtectes par
les sondes bactriennes (EUB 338).
Juretschko et al. , 1998 Isolats Analyse des bactries oxydant l'ammoniac et les nitrites.
Rotthauwe et al. , 1997 Sondes 16S
Mobarry et al. , 1996 Amplif. amoA et 16S
Holben et al. , 1998 Squ.
Hallin et Lindgren, 1999
Raskin et al. , 1994b sondes spcifiques 16S Analyse de la flore anarobie des boues : tude des mthanognes.
Miguez et al. , 1999 Amplif. mmoX
Schuppler et al. , 1995 Amplif. 16S / Squ. Recherche des Actinomycetes nocardioformes agents pathognes responsables
Schuppler et al. , 1998 Sondes sur clones de la prise en masse et de la mousse dans les tanks.
de los Reyes et al. , 1997 Microscopie confocale
de los Reyes et al. , 1998
Straub et al. , 1994 PCR Dtection d'entrovirus dans les boues.
Rocheleau et al. , 1999 Sondes 16S Etude de Methanosaeta concilii et Methanosarcina barkeri
Microscopie confocale
Tsai et al. , 1993 Amplif. de 16S et de uidA Dtection spcifique de E.coli
Sondes 16S
Lee et al. , 1999 Microscopie confocale
Watanabe et al., 1998a TGGE 16S et LmPH Analyse de l'effet du phnol sur la population microbienne. Isolement d'une
Isolats souches spcifique de la dgradation de ce compos.
Watanabe et al. , 1998b Amplif. gyrB Quantification des bactries dgradant le phnol dans un fermenteur par
quantification des produits de PCR
Selvaratnam et al. , 1995 RT-PCR tfdB et dmpN Mise au point de la technique puis suivi de l'expression des gnes mtabolisant
les phnols par mesure des ARN messagers.
Amplif. : amplification par PCR Squ : Squenage
5.3.3 Les autres milieux

La gestion de dchets produits par les activits humaines est une proccupation conomique
et cologique majeure. En effet il ne s'agit pas simplement de se dfaire de grandes quantits de
produits finaux des mtabolismes humains ou animaux (matire organique, fces), mais aussi de
dtruire des composs uniquement produits par synthse chimique : les xnobiotiques (pesticides,
herbicides, plastiques). Ces produits n'entrent pas naturellement dans les grands cycles de
105
dgradation des composs naturels, mais des micro-organismes peuvent avoir un rle prpondrant
dans leur dgradation. Les tudes molculaires ont t mises profit pour tudier ces micro-
organismes, notamment pour suivre les dynamiques de dgradation. Le tableau 2.13 prsente une
liste non-exhausive d'tudes ralises sur des fermenteurs industriels ou sur des reproductions
l'chelle du laboratoire de milieux naturels contamins par des polluants d'origine anthropique. Ces
travaux sont trs souvent associs des mthodes culturales. Il est effet indispensable de disposer du
ou des micro-organismes impliqus dans les processus de dgradation afin d'envisager une mise
l'chelle industrielle du processus.
Tableau 2.13. Etude d'autres processus de dgradation
Milieux Techniques d'tude Rfrences

Effluent de papeterie culture Gonzlez et al. , 1996
(riche en lignine) amplification de l'ADNr 16S
squenage
quantification sur ADN total
Filtre biologique amplification de l'ADNr 16S Sakano et Kerkhof, 1998
pour contaminants arosols amplification du gne amoA
squenage
Biofilm bactrien dans les sondes nucliques 16S Kalmbach et al. , 1997
canalisations d'eau potable sondes nucliques 16S et 23S Manz et al. , 1993
Culture d'enrichissement amplification de l'ADNr 16S Pulliam Holoman et al. , 1998
sur milieux riches en PCB squenage
de sdiments ctiers
Culture en flux continus de sondes nucliques 16S Bruns et Berthe-Corti, 1998
sdiments ctiers pour suivre la
dgradation des hydrocarbures
Flore thermophile implique dans amplification de l'ADNr 16S Inagaki et al. , 1997
les dpts siliceux dans une usine squenage
gothermale
Processus de dgradation amplification de l'ADNr 16S Britschgi et Fallon, 1994
des cyanures squenage
Fermenteur anarobie amplification de l'ADNr 16S Godon et al. , 1997
sur vinasses et mlasses squenage
Processus de dgradation amplification de l'ADNr 16S von Wintzingerode et al. , 1999
du trichlorobenzne squenage
Reproduction d'un aquifre pollu par culture-isolement Hess et al. , 1997
des carburants l'chelle du laboratoire sondes nucliques 16S espce-spcifiques
Fermenteur aliment en eau uses culture-isolement Stoffels et al. , 1998
de peinture de carrosserie sondes nucliques 16S
VI Conclusion et prsentation du projet d'tude

Les formidables avances dans le domaine des biotechnologies sont certes attribuer aux
efforts raliss par les microbiologistes pour cerner le fonctionnement des micro-organismes, mais
aussi la manne financire de l'industrie pharmaceutique destine au dveloppement de nouvelles
molcules forte valeur ajoute. Comprendre le fonctionnement des populations microbiennes au
sein des cosystmes naturels est certes une tche laborieuse et coteuse mais qui requiert avant
tout une approche holistique. Aux comptences du microbiologiste doivent s'ajouter celles de
l'cologiste, du biologiste molculaire, du chimiste et du physicien afin d'apprhender
106
l'environnement dans sa totalit. Un inventaire complet de la diversit microbienne terrestre n'est

certes pas envisageable mais, comme cela a t propos par Pace (1997), il est possible de dfinir sur
le globe une centaine de sites (biotopes aux conditions physico-chimiques diffrentes) pour lesquels
une tude intensive de la diversit tant procaryotique qu'eucaryotique serait entreprise. Certains sites
naturels, comme les sources chaudes du parc de Yellowstone (Etats-Unis), font dj l'objet de suivis
rguliers depuis de nombreuses annes. D'autres sites, comme les sources hydrothermales
profondes et les rservoirs ptroliers, pourraient tre des candidats potentiels cette entreprise
d'inventaire.
Jusqu' prsent les informations concernant l'cologie de ces milieux ont t principalement
obtenues par des travaux fonds sur des techniques de cultures traditionnelles, peu d'tudes
molculaires y ont t entreprises.
Le but de mon travail de thse aura t d'utiliser des technologies molculaires fondes sur
l'analyse des ARNr 16S (squenage - hybridation in situ) au profit de l'tude de la diversit et de la
taxonomie microbienne, en association avec deux environnements extrmes (un rservoir ptrolier et
des sources hydrothermales ocaniques).
Aprs un expos des mthodes gnrales utilises, les rsultats sont prsents sous forme
d'articles, soumis ou soumettre.
Le premier article (Article 1) prsent dans ce manuscrit dcrit l'analyse de la diversit

microbienne associe un rservoir ptrolier situ dans le bassin Parisien. Si quelques travaux
dcrivent l'isolement et la caractrisation de micro-organismes, msophiles ou thermophiles, impliqus
dans des mcanismes de fermentation, de mthanogense ou d'actogense, la majeure partie des
tudes ralises sur les puits de ptrole se sont intresses aux micro-organismes impliqus dans les
phnomnes de sulfato-rduction. L'originalit de cette tude tait d'accder la diversit
microbienne totale d'un rservoir en s'affranchissant de toute tape de mise en culture. L'analyse a
port sur des chantillons d'eaux de production prlevs en tte de puits et dans des collecteurs. On
observe que les communauts microbiennes s'organisent diffremment selon les chantillons. Dans
certains puits, les BSR thermophiles ou msophiles dominent les banques de clones, alors qu'elles
sont absentes d'autres chantillons provenant du mme rservoir. En revanche on retrouve dans ces
chantillons des squences associes des souches micro-arophiles pouvant tre impliques dans
le cycle du soufre. En introduction de cet article je prsenterai une tude ralise sur un chantillon
d'eau chaude prleve sur un site hydrothermal terrestre en Roumanie. Les rsultats obtenus sur cet
chantillon d'eau gothermale clairent ceux qui sont prsents pour certains chantillons d'eau de
production.
Le second et le troisime articles dcrivent l'utilisation conjointe de techniques

culturales (enrichissements) et molculaires (squenage et hybridation in situ) pour tudier la
diversit microbienne associe des fluides hydrothermaux prlevs sur le site du "Snake Pit" sur la
107
dorsale mdio-Atlantique durant la campagne "Microsmoke" (1995). Les fluides ont t collects
l'aide d'un chantillonneur original, le "Vent Cap", qui est dploy durant plusieurs jours sur le site
d'mission du fluide. Deux sites ont t chantillonns au cours de dploiements de 2 et 5 jours.
L'article 2 dcrit, par une approche d'extraction d'ADN total et squenage des ADNr 16S, la
diversit bactrienne associe un dploiement de 5 jours sur le "Chi". On observe que la banque de
clones est domine par une grande diversit de micro-organismes associs ou proches des
Proteobacteria epsilon. Deux nouveaux phylums associs la classe des Proteobacteria, mais
distincts des sous-classes dcrites jusqu' prsent, sont aussi observs dans cet chantillon. Deux
sondes nucliques spcifiques sont construites afin d'identifier les micro-organismes dtects par
squenage.
L'article 3 (Manuscrit en prparation) prsente une synthse des rsultats obtenus partir
de l'ensemble des dploiements du "Vent Cap" lors de la campagne "Microsmoke". Il reprend les
rsultats dcrits dans l'article 2 sur le site "Chi" et ceux dcrits par Reysenbach et al. (1999) sur le site
"Les Ruches". Il prsente, de plus, des rsultats originaux d'enrichissement de micro-organismes
thermophiles, de comptage de cellules totales, d'analyse par squenage du dploiement de 2 jours
sur le site "Les Ruches" et de quantification de micro-organismes par hybridation in situ l'aide de
sondes nucliques spcifiques. La confrontation des rsultats obtenus par ces diffrentes analyses
avec ceux obtenus lors de l'tude de chemines hydrothermales nous permet de mieux cerner la
distribution des micro-organismes au sein des sources hydrothermales profondes.
Comme nous l'avons vu dans les deux premires parties de ce manuscrit, l'utilisation de
techniques molculaires et l'emploi de mthodes culturales classiques ne sauraient s'exclure dans
l'tude de la diversit d'un cosystme. Dans le cadre de la caractrisation d'une nouvelle souche,
l'analyse phylogntique de l'ADNr peut permettre d'asseoir une taxonomie sur une base cladistique.
Le travail que j'ai effectu pour les articles suivants constitue une contribution la caractrisation de
souches isoles d'environnements hydrothermaux (articles 4, 5 et 6).
L'article 4 (article publi) prsente la caractrisation d'une nouvelle espce de
Methanococcales, Methanococcus vulcanius et l'identification d'une Methanococcales dj isole, M.
fervens.
L'article 5 (manuscrit en prparation) prsente la caractrisation phylogntique de 5
Thermococcales radiorsistantes isoles sur des sites hydrothermaux des dorsales mdio-Atlantique
et est-Pacifique.
L'article 6 (manuscrit en prparation) prsente la caractrisation phylogntique d'une
souche de Bacillus thermophile isole sur le site hydrothermal du bassin de Lau au sud-est des les
Fidji.
108
Matriel et Mthodes
1 2
Ardennes
Val-d'Oise Marne
Yvelines Paris
Seine- MONTMIRAIL
et-Marne
Essonne Aube
Haute-
Marne
3 4
Lgendes:
1: Situation gographique de Montmirail.
2: Puit de Ptrole (LMN).
3: Dcanteur (B01C).
4: Echantillonnage en tte de puits (I50).
5: Procd de filtration de leau de
production.
Figure 3.1. Echantillonnage des puits de ptrole. Site de Montmirail
Planche 1
Matriel et Mthodes
I Echantillonnage et conservation de l'chantillon

Durant ce travail de thse, trois types de sites ont t chantillonns :
des puits de ptrole en rgion parisienne (chantillons d'eau de production),
des sources hydrothermales profondes sur la dorsale mdio Atlantique (chantillons de
fluides et de chemines),
des sources chaudes terrestres Roumaines (chantillon d'eaux).
1.1 Echantillonnage des puits de ptrole

Les chantillons proviennent des puits de ptrole du site de Montmirail, dans le Bassin Parisien
(cf. planche photos figure 3.1). La socit COPAREX, spcialise dans l'exploitation des puits en fin
de production, en assure la gestion. Les techniques d'extraction utilises ncessitent l'envoi d'eau
pressurise dans le rservoir afin de faire remonter l'huile. Une fois en surface, le mlange eau/huile
est envoy par des pipelines vers des bassins de dcantation, puis vers des bassins de collecte.
Les chantillons tudis sont des mlanges eau/huile prlevs en tte de puits ou dans un
dcanteur. Aprs dcantation des chantillons, la partie aqueuse a t conserve. Afin de rcuprer
un grand nombre de micro-organismes, les chantillons ont t filtrs ou centrifugs. Les extractions
d'ADN sont donc ralises partir d'un filtre ou d'un culot de centrifugation.
La technique de filtration est drive de la technique dcrite par Sommerville et al., 1989. Cette
technique peut s'appliquer de nombreux chantillons liquides. Elle permet de concentrer les
chantillons et d'effectuer directement la lyse cellulaire sur filtre. Ralise initialement sur des filtres
Millipore Sterivex GT (2 mL), elle peut tre extrapole des filtres de plus grande taille afin de pouvoir
filtrer de plus gros volumes d'chantillons.
Il convient de filtrer lchantillon l'aide d'une pompe pristaltique. Le filtre utilis est un filtre GT
(Millipore) de 0,2 m en polycarbonate. En fin de filtration le filtre est lav avec 10 mL de tampon S E T
strile (S ucrose E DTA Tris, voir composition 2.1.1) puis stock -20C.
1.2 Echantillonnage des sources hydrothermales profondes

Les chantillons ont t prlevs 3500m de profondeur durant la campagne "Microsmoke" en
1995 (chef de mission Daniel Prieur). Cette campagne a t effectue sur le site du Snake Pit
(2322'118N, 4456'984W) sur la dorsale mdio Atlantique (cf. planche cartes figure 3.2). Le site du
"Snake Pit" a t retenu car il tait profond (donc susceptible d'tre colonis par des micro-organismes
barophiles), la faune associe tait relativement simple (essentiellement des crevettes) et les
chemines prsentaient des structures minralogiques permettant un bon chantillonnage.
Plusieurs types de chemines sont observables sur ce site. Les chemines dnommes "Chi"
et "les Ruches" ont retenu notre attention.
109
Planche 2
Localisation des sites d'chantillonnage sur le Snake Pit. Vignette: localisation du site
Snake Pit sur la dorsale Mdio-Atlantique. (d'aprs Y. Fouquet)
Chi Les Ruches
Localisation des chemines sur le site du SnakePit . Section
Figure 3.2. Localisation : Campagne MICROSMOKE, Oct-Nov 95

Matriel et Mthodes
Deux types d'chantillons ont t prlevs durant cette campagne : des chantillons de
chemine (solides) et des chantillons de fluides collects l'aide d'un incubateur in situ, le Vent Cap.
La troisime planche de photos reprsente les diffrents chantillonneurs utiliss durant la campagne.
1.2.1 Echantillons de chemine

Afin d'tudier la rpartition des micro-organismes le long de la chemine par des mthodes
culturales et molculaires, les chemines ont t sous-chantillonnes en suivant un axe longitudinal
et radial (cf. figure 3.3).
B PARTIE Top
Section BB Section AA
B
PARTIE B
1
1
2 2 3
PARTIE A
Figure 3.3. Echantillonnage des chemines prleves sur le site du Snake-Pit.
Les chantillons ont t prlevs par grattage des chemines bord du bateau (Le Nadir) aprs
collecte de la chemine l'aide du sous marin (Le Nautile). Ils ont t conservs -20 ou -80C jusqu'
extraction de l'ADN. Les chantillons conservs pour l'hybridation in situ ont t fixs par la mthode
dcrite 3.3.3.
La technique de conservation des chantillons pour l'extraction d'ADN n'a pas t optimale et a
srement contribu une forte dgradation des chantillons. S'il n'est pas possible de raliser
l'extraction d'ADN ds la remonte de la chemine, il est prfrable de conserver les chantillons dans
l'thanol ou dans un milieu rducteur bloquant l'activit des DNAses afin d'viter la dnaturation des
cellules et la dgradation de l'ADN. Par exemple il est possible de conserver les cellules dans un
tampon GIT (Guanidine isothiocyanate) 5 M, raison de 1 volume de solution de GIT pour 1 volume
d'chantillon puis on stocke 4C.
solution de GIT 5M :
Dissoudre 60 g de GIT dans 5 mL 1 M Tris buffer pH 7,4, 5 mL 0,5 M EDTA (le GIT reprsente la majeure partie des 98,2 mL :
dissoudre le GIT dans le Tris l'EDTA et trs peu d'eau en chauffant la solution au micro-ondes). Ajouter de l'eau MilliQ pour un volume
final de 98,2 mL. Ajouter 800 l -mercaptoethanol et 1 mL dune solution de Sarkosyl strile 10 % (p/v) (sodium N-lauroyl-
sarcosinate). Conserver la solution temprature ambiante.
1.2.2 Echantillons de fluides

Le fluide a t collect l'aide d'un chantillonneur, le Vent Cap, qui permet, la diffrence des
bouteilles Niskin ou des seringues de titane, de collecter du fluide sur plusieurs jours. Ce dispositif a
t mis au point par l'quipe de Norman Pace (Karl et al., 1988) (cf. planche photos figure 3.4).
110
Planche 3
1
5
Sonde de temprature
Chambre
2 dincubation
Jupe de
collecte
Lgendes:
3
1 Submersible Le Nautile
2 Seringues de prlvement en
titane
Crdits photos: 3 Bouteille NIO
4 Vent Cap sur site (2 jupes)
1 IFREMER
2,3 Laboratoire de microbiologie Roscoff
5 Vent Cap sur site (1 jupe)
4, 5, 6 A.L. Reysenbach 6 Vent Cap schma descriptif
Figure 3.4. Echantillonnage des sites hydrothermaux profonds

Matriel et Mthodes
Dispos sur le lieu d'mission du fluide (petite chemine ou fissure), le fluide est dirig vers une
chambre d'incubation par une jupe en Tflon. Cette chambre est ouverte et ferme par une trappe
manoeuvrable par le submersible. A l'intrieur de la chambre on peut disposer des surfaces de
diffrents matriaux (Tflon, acier, porcelaine, etc.) qui serviront de support au dveloppement des
micro-organismes. Le fluide ressort de la chambre l'extrieur de la jupe lorsque la trappe est ouverte.
Les chantillons de fluide contenus dans le Vent Cap ainsi que les coupons sont conservs dans
l'thanol - 20C ou fixs pour des hybridations in situ.
1.3 Echantillonnage des sources chaudes terrestres

Un chantillon provenant d'une source chaude Roumaine a t analys. Il provient du site de
Caciulata (Roumanie du sud) et a t prlev (par D. Prieur et I. Gomoiu) la sortie du puits 1003 ayant
3000 m de profondeur. La temprature de l'eau tait de 89,6C et le pH de 6,8-6,9. Cette eau trs
riche en sel est utilise dans un systme de chauffage.
II Analyse de l'ADNr 16S

L'analyse de la diversit microbienne de nos chantillons s'est droule selon le schma suivant
1. Extraction de l'ADN.
2. Amplification spcifique du gne codant pour l'ARNr 16S par PCR.
3. Clonage des fragments d'ADNr 16S dans un plasmide.
4. Analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction des clones (RFLP), afin
de dterminer des classes de clones (O.T.U. ou phylotype).
5. Squenage des diffrents clones.
6. Analyse des squences l'aide d'outils informatiques et construction d'arbres
phylogntiques.
2.1 Extraction d'ADN

Plusieurs protocoles d'extraction d'ADN ont t utiliss et tests notamment pour extraire l'ADN
des chemines hydrothermales (cf. figure 3.5A). Diffrents essais ont t entrepris pour tester
l'efficacit des mthodes d'extraction. Des cellules de E. coli on t ajoutes un chantillon de
chemine et l'chantillon a t soumis diffrents protocoles d'extraction. Les quantits d'ADN extrait
ont t compares par Spot -test (cf. figure 3.5B). Les codes utiliss dans cette figure correspondent
ceux utiliss dans la figure 3.5. Les mthodes qui semblent tre les plus efficaces pour les
chemines hydrothermales sont : la technique du CTAB (2), la technique du micro-ondes (5) et la
technique de Tiedje (6). Pour les chantillons de fluide d'hydrothermaux et d'eaux de production les
protocoles les plus efficaces ont t ceux dcrits ci dessous.
111
A
Mthode du PVPP
Mthode de Delong
8 Tampon sucrose 4
PVPP
4-aminosalicylate 1min 100C B
Mthode deTiedje Mthode du 100 75 50 25 10 (ng dADN)

Micro-onde 5
6 SDS 65C et M.O.
pilon-mortier
congl-dcongl
agitation
1 2 3 4
Mthode du Chelex
Echantillon Chelex/100C / 3
de PCR directe
chemine 5 6 7 8
Mthode par
sonication
1
Sonication/GIT
SDS Mthode du GIT
7
GIT/ Bead Beating
Mthode du Chelex/
PEG
9
Mthode du CTAB 2
Bead Beating/Chelex
PEG
Rfrences:
1 Pierre Chevaldonn,1995 personal communication. 5 C. Bollet, M.J. Gevaudant, X. de Lamballerie, C. Zandotti and P. de
2 Currents protocols in Molecular Biology 2.4.1. Micco, A simple method for the isolation of chromosomal DNA from Gram
3 M.A. Voytek and B.B. Ward, Detection of ammonium-oxidizing bacteria of positive od acid-fast bacteria, Nucl.Acids Res., 1991,19, 1955.
Figure 3.5. Techniques dextraction dADN beta-subclass of the class Proteobacteria in aquatic samples with the PCR, 6 J. Zhou, M.A. Burns and J.M. Tiedje, DNA recovery from soils of
A.E.M., 1995, 61, 4, p 1444-1450. diverse composition, A.E.M., 1996, 62, 2, p 316-322.
4 D.L. Distel, E.F. Delong and J.B. Waterbury, Phylogenetic 7 Jeff Stein, personal communication.
characterization and in situ localization of the bacterial symbiont of 8 Sue Barns, personal communication.
shipworms (teredinidae: bilvalva) by using 16S rRNA sequence analysis and 9 P.R. Herron, Phage ecology and genetic exchange in soil, Molecular
oligodeoxynucleotide probe hybridization, A.E.M. 1991, 57, 8, p 2376-2382. Microbial Ecology Manual,1995, 5.3.2., p 1-12, Elsevier.
Matriel et Mthodes
2.1.1 Extraction de l'ADN sur filtre ou sur culot de centrifugation

(d'aprs Sommerville et al., 1989)
Ajouter sur le filtre ou sur le culot de centrifugation :
1,8 mL de tampon SET (voir composition plus bas) + 20 L de lysosyme 20 mg/mL (fragilisation
de la paroi cellulaire). Placer le mlange 15 min sur la glace. Ajouter 20 L de S D S 10% et 20 L de
N-lauryl-sarcosyl 10% (p/v) (dnaturant des protines et des polysaccharides). Laisser 1 heure en
agitation temprature ambiante. Ajouter 50 L de protinase K 20 mg/mL. Laisser 2 heures 50C
(digestion des protines). La solution est rcupre dans le filtre. Ajouter : 0,5 volume d'actate
d'ammonium 7.5 M pH 8 (prcipitation des protines et des polysaccharides). Il est possible ce
niveau de raliser une extraction au phnol chloroforme (extraction des protines), mais il est aussi
possible de passer directement l'tape suivante. Laisser 10 min temprature ambiante. Centrifuger
12000 g 20C durant 10 min. Eliminer le culot et ajouter 2 volumes d'thanol 100% au surnageant.
Laisser 20 min -20C (prcipitation de lADN). Centrifuger 10000 g temprature ambiante durant
20 min. Eliminer le surnageant. Resuspendre le culot avec 1 mL d'thanol 70% (v/v) (lavage de lADN
et limination des sels). Centrifuger 13000 RPM 4C durant 30 min. Jeter le surnageant et scher le
culot au SpeedVac.
Dissoudre le culot dans 30 L d'eau milliQ ou du TE (voir composition ci-dessous).
Composition des tampons

SET : 20% saccharose (p/v) TE : 10 mM Tris
50 mM EDTA 1 mM EDTA
50 mM Tris pH=7,6
pH=7,6
2.1.2 Extraction de l'ADN chromosomique par la mthode de Sambrook et al. (1989)

Chaque milieu est centrifug et les culots contenant les bactries sont rcuprs. Ces culots
sont resuspendus dans 400 L de tampon TNE (Tris Cl /NaCl /EDTA). On ajoute 15 L de lysozyme (5
mg/mL) et 10 L de la protinase K 20 mg/mL. Ce mlange est incub durant 1 heure 50C. Il est
alors possible de rajouter 0,1 volume de SDS 10% (p/v) et 0,1 volume de L-Lauryl-Sarcosyl 10%
(p/v) et d'incuber de nouveau pendant 2 heures 50C. Afin d'extraire les protines, 1 volume de
phnol quilibr dans du Tris est ajout. La phase aqueuse est rcupre aprs centrifugation de 5
10 min 10000 g. Ajouter 1 volume dun mlange contenant du phnol satur TRIS, du chloroforme
et de lalcool isoamylique (24:24:1) avant de centrifuger durant 10 min 6000 g. La phase aqueuse
contenant lADN est rcupre et traite au chloroforme et lalcool isoamylique (24:1), et centrifuge
nouveau. LADN est prcipit avec 0,1 volume d'actate de sodium 3 M et 2 volumes d'thanol
100% durant 1 heure -20C avant une dernire centrifugation. Le culot contenant lADN prcipit est
sch puis repris dans de l'eau MilliQ ou dans du TE.
112
Matriel et Mthodes
2.1.3 Mthode d'extraction au micro-ondes

(d'aprs Bollet et al., 1991)
Laver les cellules ou l'chantillon dans du TE ou du TNE. Ajouter du SDS une concentration
finale de 5% (p/v). Mettre 30 min 65C. Centrifuger et supprimer le surnageant. Mettre le culot au
micro-ondes 2 fois 1 min 900 W (ou 3 x 1 min 750 W). Resuspendre le culot dans du TNE et
effectuer une extraction au phnol-chloroforme suivie d'une prcipitation de l'ADN l'thanol.
2.1.4 Extraction de l'ADN chromosomique par la mthode de Pitcher et al. (1989)

Cette mthode peut tre utilise la place de la mthode traditionnelle dcrite par Sambrook et
al., (1989) pour extraire l'ADN partir de cultures pures. Il conviendra de rajouter du L-Lauryl-Sarcosyl
pour lyser plus efficacement les Archaea.
1,5 mL de culture en phase exponentielle (ou d'chantillon) sont centrifugs durant 5 min
5000 g. Les cellules sont resuspendues dans 100 L de tampon TE et lyses avec 0,5 mL de tampon
GES (5 M guanidium thiocyanate, 100 mM EDTA, 0,5% v/v SDS, pH 8). Les cellules en suspension
sont agites brivement et laisses temprature ambiante durant 10 min. Le lysat est refroidi sur
glace et on ajoute 0,25 mL d'actate d'ammonium 7,5 M froid. Les chantillons sont maintenus sur
glace pendant 10 min et occasionnellement agits. On ajoute 0,5 mL de chloroforme/2-pentanol
(24:1). Aprs agitation les phases sont spares par 2 min de centrifugation 2000 g. La phase
aqueuse est transfre dans un nouveau tube et 0,54 volume d'isopropanol froid est ajout. On agite
les tubes par inversion pendant 10 min et l'ADN prcipit est recueilli par centrifugation durant 1 min
7000 g. Les culots d'ADN sont lavs l'thanol 70% (v/v) et schs (Speed Vac ou air ambiant). L'ADN
est resuspendu durant une nuit dans 100 L de tampon TE strile (pH 8).
2.1.5 Extraction de l'ADN au "Bead-Beater"

Cette technique a t utilise avec succs par la socit Diversa et par Paul Riley (1997) pour
extraire l'ADN de sdiments ou de chemine.
Utiliser 10 20 grammes de chemine ou de sdiments. Ajouter un volume de billes pour "bead-
beating". Puis ajouter un volume (billes + chantillons) de solution de 5M GIT contenant 0.1% (p/v) de
SDS. Agiter vigoureusement (Bead-beater ou Ribolyser) durant 30 min 1 h. Centrifuger faible
vitesse pour liminer les dbris cellulaires et extraire l'ADN de la solution de GIT. Le culot est
resuspendu dans un tampon de lyse (TE/SDS 10% (p/v) par exemple) et trait par la protinase K et
subit ensuite une extraction phnol/chloroforme.
2.2 Amplification de l'ADNr 16S

Afin d'amplifier l'ADNr 16S de nos chantillons nous avons utilis une technique d'amplification
classique. Il a toutefois t ncessaire d'introduire des modifications dans la technique lorsque l'ADN
extrait tait en trop faible quantit ou lorsque des contaminants (hydrocarbures, mtaux) inhibaient la
raction.
113
Matriel et Mthodes
2.2.1 Ractions d'amplification classiques

Deux types denzymes ont t utilises. La Taq polymrase commercialise par Promega et
l'ampliTaq Gold (Perkin Elmer). L'avantage de cette dernire est de n'tre active qu'aprs un passage
95C. Ceci revient raliser une PCR Hot Start (moins dhybridations aspcifiques lors de la monte
en temprature du mlange d'amplification). A chaque cycle de dnaturation un nouveau pool
enzymatique est libr (il y a moins de risque d'erreur), il est donc possible de faire plus de cycles (cf.
tableau 3.1).
Tableau 3.1. Protocole d'utilisation de la Taq polymrase et de l'AmpliTaq Gold
AmpliTaq Gold (Perkin Elmer) Taq polymrase (Promega)

Milieux d'amplification : Milieux d'amplification:
Tampon 10X 1X Tampon 10X 1X
MgCl 2 25 mM 2,5 mM MgCl 2 25 mM 1,5 mM
dNTP 100 mM 200 M de chaque dNTP 100 mM 200 M de chaque
Amorce Foward 0,2 M Amorce Foward 0,2 M
Amorce Reverse 0,2 M Amorce Reverse 0,2 M
AmpliTaq Gold 5U.l-1 2,5 U/100 L Taq polymrase 5U.l-1 2,5 U/100 L
Matrice d'ADN < 1 g/tube Matrice d'ADN < 1 g/tube
Eau MilliQ qsp Eau MilliQ qsp
Cycles employs : Cycles employs :

1 cycle : 12 min 96C (activation de l'enzyme), 1 min 15 50C, 1 cycle : 5 min 96C puis 1 min 15 50C, 2 min 15 72C.
2 min 15 72C. 29 cycles : 1 min 15 95C, 1 min 15 50C, 2 min 15 72C.
34 cycles : 1 min 15 95C, 1 min 15 50C, 2 min 15 72C. 1 cycle : 7 min 72C.
1 cycle : 7 min 72C.
Afin d'amplifier un fragment clon (voir technique de clonage) nous avons directement ralis
les ractions de PCR sur cellules entires. Les cellules sont prleves sur boites l'aide d'un cure-
dent ou d'un cne de pipette et sont resuspendues dans un mlange d'amplification sans enzyme.
Aprs un premier cycle de 10 min 95C, on ajoute l'enzyme et on effectue une PCR classique.
2.2.2 Techniques d'optimisation de la raction

Diffrents paramtres peuvent tre modifis afin d'optimiser la raction d'amplification :
La concentration de l'chantillon : une simple dilution du produit d'extraction contenant l'ADN suffit
parfois faciliter l'amplification. En effet, les inhibiteurs de la PCR sont alors galement dilus. On peut
effectuer des gammes de dilutions du 1/10e au 1/100 e par exemple.
Le milieu ractionnel : il est possible d'ajouter de l'actamide et de la BSA (Bovin Serum Albumin) ou
de la BSA seule. L'actamide rend thoriquement l'amplification plus spcifique. La BSA, quant elle,
tend stabiliser la Taq polymrase en fixant les inhibiteurs possibles de la raction.
L'enzyme : on peut utiliser de la Taq classique ou de l'AmpliTaq Gold (voir plus haut).
Les amorces : partir d'un premier produit d'amplification, on effectue une nouvelle raction mais en
utilisant des amorces diffrentes. Ces secondes amorces sont choisies de faon permettre
l'amplification d'une portion de la squence dj amplifie par fixation " l'intrieur" de celle-ci. On parle
114
Matriel et Mthodes
de "PCR niche". Par exemple, si le premier couple d'amorces utilis est 8F-1525R, le second peut
tre 50F-1492R. La squence alors amplifie sera lgrement plus courte mais le rendement de la
"PCR interne" est parfois meilleur car les amorces peuvent s'hybrider sur plus de matrice.
Le nombre de cycles effectus : sur des produits ayant subi une premire raction, il est possible de
rajouter de l'enzyme (1 ou 1,5 U) et de relancer un nouveau cycle de PCR. La premire amplification

est parfois insuffisante pour permettre de visualiser une bande lors de la vrification sur gel.
Rparation pralable du matriel gntique : lors d'un cycle particulier (1 fois : 5 min 95C puis 10 fois
: 30 sec 95C, 30 sec 54C et 45 sec 72C) on met l'ADN extrait en prsence d'un milieu
ractionnel classique de PCR mais sans amorce. Il se produit alors une rparation de l'ADN; c'est--dire
que la polymrase ajoute des dNTP aux endroits dgrads. Les petits fragments d'ADN servent en
quelque sorte d'amorces l'enzyme. Cette technique est susceptible d'augmenter la quantit de
chimres.
2.2.3 Choix des amorces d'amplification

Les amorces suivantes (cf. tableau 3.2) sont utilises pour les diffrentes ractions
d'amplification.
Tableau 3.2. Spcificit et description des amorces d'amplification
Amorces Localisation Squence Spcificit

E. coli Archaea Bacteria Eukarya
Orientation Forward
4F (3-20) 5'- TCCGGTTGATCCTGCCRG -3' +
21F (2-21) 5'-TTCCGGTTGATCCYGCCGGA-3' +
333F (333-348) 5'- TCCAGGCCCTACGGG -3' +
8F (8-27) 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3' +
50F (50-68) 5'- AACACATGCAAGTCGAACG -3' +
515F (515-533) 5'-GTGCCAGC(AC)GCCGCGGTA-3' + + +
Orientation Reverse
1492R (1510-1492) 5'- CGGTTACCTTGTTACGACTT -3' + + +
1525R (1541-1525) 5'- AAGGAGGTGATCCAGCC -3' + + +
Universal MCS 5'- GGAAACAGCTATGACCAT -3' hybridation avec

Reverse MCS 5'- GTAAAACGACGGCCAGTG -3' le plasmide
MCS: site multiple de clonage localis sur le plasmide de chaque cot de l'insert.
2.3 Clonage des produits de PCR

Deux techniques de clonage ont t utilises durant ces tudes. La plus frquemment utilise
est la technique du TA cloning". Il a t aussi possible de transformer les cellules en utilisant un
lectroporateur.
2.3.1 Utilisation du kit TOPO TA Cloning (Invitrogen )

Le protocole de clonage repose sur une erreur de la Taq polymrase qui ajoute
systmatiquement un dNTP de type adnine (A) aux extrmits 3' du brin nosynthtis. Le vecteur
utilis possde, quant lui, une thymine (T) au niveau du site d'insertion, ses extrmits 3'. Une
115
Matriel et Mthodes
liaison entre ses deux bouts cohsifs est donc possible. Elle est facilite par l'action d'une
topoisomrase qui va liguer les deux fragments d'ADN temprature ambiante.
Clonage dans le plasmide pCR 2.1 et transformation:
Le protocole de clonage et de transformation est celui dcrit par le fabriquant.
Analyse des clones positifs :
Couler en bote de Ptri un milieu LB additionn de 0.1 g/L d'ampicilline et de 0.3 mL/L de ttracycline
50g/mL. Appliquer sur le milieu une solution contenant 40L de X-Gal 5% dans du DMSO (p/v) et
40L d'IPTG 100 mM. Etaler 80 l de la solution de transformation. Incuber au minimum 18 heures
37C. Puis placer les botes environ 2 heures 4C pour faire apparatre la coloration bleue. On
repique les colonies blanches sur des botes de Ptri contenant du milieu LB additionn d'ampicilline
et de ttracycline (mme milieu que prcdemment), ceci afin de les conserver. On ralise galement
une PCR suivie d'une lectrophorse sur gel d'agarose 0.8% (p/v) pour vrifier la taille de l'insert. La
PCR est effectue directement sur les souches contenues dans le milieu de raction l'aide des
amorces universal et reverse s'hybridant sur le plasmide.
Conservation des clones :
Il est possible de conserver les clones obtenus en les cultivant sur microplaques dans du milieu LB
liquide. On ajoute par la suite 5% (final) de glycrol la culture. La microplaque protge (film plastique
ou couvercle) peut tre conserve - 20C (pendant une nuit) puis - 80C (pendant plusieurs mois).
Composition des milieux utiliss :

Milieu LB (Luria-Bertani) : 1.0% Tryptone, 0.5% d'extrait de levure (Yeast Extract), 1.0% NaCl, pH 7.0
Glose LB : milieu LB + 15 g/L d'agar avant d'autoclaver
IPTG = isopropylthio--D-galactoside
X-Gal = 5-bromo-4-chloro-3 indolyl--D-galactopyranoside
2.3.2 Transformation des cellules par lectroporation

Une autre technique de transformation des cellules a t utilise. Moins rapide que la technique
du choc thermique, la technique d'lectroporation est toutefois trs efficace.
1- Dessaler les produits de ligation. S'il y a trop de sel dans les chantillons ou si la cuvette est trop
vieille, celle-ci peut exploser durant l'lectroporation. Utiliser 2 L de produit de ligation. Les dposer
sur un filtre 0,022 m flottant dans une boite de Ptri remplie d'eau dsionise. Effectuer la dialyse
durant 45 min 1 heure.
2- Dcongeler les cellules comptentes (sur la glace) en vitant les chocs thermiques. Mettre la
cuvette d'lectroporation dans la glace. Aliquoter dans des tubes de 5 mL, 50L de cellules
comptentes. Conserver ces tubes au froid. Ajouter les 2 L de produit de ligation dialys aux cellules
comptentes. Laisser 1 min sur glace.
116
Matriel et Mthodes
3- Mettre les cellules dans la cuvette la fin de la minute et procder l'lectroporation.

4- Puis rapidement : Rcuprer la cuvette et y ajouter directement 1 mL de milieu SOC puis
retransfrer le tout dans un tube. Mettre les tubes 37C durant 45 min avec agitation.
5- Dposer entre 100 et 800 L de la culture sur boite de Ptri en fonction de l'efficacit de la
transformation. Mettre les boites 37C durant la nuit.
2.4 Analyse des clones par RFLP : Restriction Fragment Length

Polymorphism
Afin de raliser un premier tri parmi les clones squencer, nous avons analys ces derniers par
RFLP. A chaque profil de restriction correspondait une classe, ou phylotype ou OTU. A chaque classe
correspondait des squences diffrentes mais au sein d'une mme classe on pouvait retrouver des
squences diffrentes. Le choix des enzymes a t dict par les rsultats obtenus par Moyer et al.
(1996). MspI et HinP1I (ou HhaI son isoschyzomre) sont parmi les enzymes les plus discriminantes sur
l'ADNr 16S.
Site de coupure des enzymes de restriction :
MspI 5 C*CGG 3 HinP1I 5 G*CGC 3 HhaI 5 GCC*C 3

3 GGC*C 5 3 CGC*G 5 3 C*GCG 5
Coupure :
Sur une microplaque, on met en prsence l'ADN, le tampon et l' (les) enzyme(s) dans les
proportions suivantes (pour un puits) : 9 L dADN, 1,2 L de tampon, 0,6 L HinP1I ou HhaI, 0,3 l
MspI. La microplaque est place au bain-marie 37C durant au moins deux heures. L'ADN matrice est
le produit de PCR ayant permis de vrifier l'efficacit du clonage.
Electrophorse des produits de restriction:
L'lectrophorse est ralise dans des gels rsolutifs pour des fragments de (100 1500 pb).
Idalement elle sera effectue dans un gel d'agarose "NU Sieve" 4% (p/v) dans un tampon TAE. On
pourra aussi pour des raisons d'conomie faire la migration dans du gel "Sea Kem LE" 2% (p/v) avec
un tampon TAE. Les chantillons sont chargs avec un tampon de charge contenant de l'Orange G
afin de dtecter la sortie des bandes faible poids molculaire. Le marqueur couramment utilis est le
"100 bp DNA ladder" (5L par puits soit 5 U) . Ce marqueur comporte 11 fragments dADN double-brin
de 100 1500 paires de bases .
Composition des produits d'lectrophorse

Tampon TAE : 0.04 M Tris-actate Loading Buffer : 0.25% Orange G (p/v)
0.001 M EDTA 40% saccharose dans du TE (p/v).
117
Matriel et Mthodes
2.5 Squenage
Si une des squences a t ralise manuellement (souche de Bacillus SG9) la majeure partie
des squences ralises durant cette thse (clones et autres souches) l'ont t l'aide d'un
squenceur automatique. Nous ne dcrirons donc que cette mthode de squenage.
2.5.1 Ractions de squence

Le principe de squenage utilis est celui dvelopp par Sanger : l'incorporation de
didsoxynuclotides. A ce principe de squenage a t couple une raction de PCR afin d'amplifier
le signal de squenage. Il s'agit donc de squenage cyclique ou "cycle sequencing". Lamorce est
marque au moyen d'un fluorochrome (Texas Red) fix aux extrmits 3' du simple brin et l'enzyme
Thermo Squnase, analogue de la Taq polymrase, est thermostable et trs processive.
Les conditions de squenage sont celles dcrites par le fabriquant du kit de Squenage
(Amersham). Seul le cycle de PCR est modifi et l'ADN matrice utilis est le produit de PCR obtenu
aprs amplification des clones l'aide des amorces "universal et reverse".
Cycle : 97C - 5 min (1 cycle); 95C - 1 min, 54C - 1 min, 61C - 1 min (24 fois).
2.5.2 Amorces de squenage

Les amorces utilises pour le squenage (cf. tableau 3.3) sont semblables celles utilises pour
l'amplification de l'ADNr 16S. Il est ncessaire d'utiliser des amorces internes l'ADNr 16S afin de
couvrir la totalit de la squence de la molcule.
Tableau 3.3. Spcificit et description des amorces de squenage.
Amorces Localisation Squence Spcificit

E. coli Archaea Bacteria Eukarya
Forward
4F (3-20) 5'- TCCGGTTGATCCTGCCRG -3'TRed +
8F (8-27) 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'TRed +
515F (515-533) 5'- GTGCCAGCMGCCGCGGTAA -3'TRed +/- + +
906F (906-922) 5'- GAAACTTAAAKGAATTG -3'TRed + +
Reverse
515R (533-515) 5'- TTACCGCGGCKGCTGGCAC -3'TRed +/- + +
906R (922-906) 5'- CAATTCMTTTAAGTTTC -3'TRed + +
1492R (1510-1492) 5'- CGGTTACCTTGTTACGACTT -3'TRed + + +
Universal MCS 5'- GGAAACAGCTATGACCAT -3'TRed hybridation avec

Reverse MCS 5'- GTAAAACGACGGCCAGTG -3'TRed le plasmide
MCS: site multiple de clonage localis sur le plasmide de chaque cot de l'insert. IUB nomenclature: M=A ou C, K=G ou T.
118
Matriel et Mthodes
2.5.3 Migration des ractions de squences

L'obtention d'une squence ncessite donc quatre dpts (1 par base). Le gel utilis a un fort
pouvoir rsolutif. C'est un gel dnaturant 7% d'acrylamide-bisacrylamide. Le caractre dnaturant est
d la prsence d'ure (6M)1.
Pour 30 mL de gel 7% de polyacrylamide : 4,2 mL de Long Ranger 50% (mlange Acrylamide-
Bisacrylamide) TEBU-FMC Bio Products, 11g d'ure, qsp 27 mL d'eau MilliQ. Le mlange est
dsionis (aide d'une rsine changeuse d'ions) et 3 mL de TBE X10 filtrs sont ajouts. Avant de
couler le gel on ajoute les agents polymrisants : 150L de TEMED et 15L d'APS 10% (p/v)2. Le gel
est coul entre deux plaques de verre borosilicat et polymris durant 45 min 1 heure. Le gel est
plac verticalement dans le squenceur. Un peigne dents de requin permet de former les puits. Les
chantillons peuvent ensuite tre chargs.
Principe du squenceur
La migration de 10 ractions de squences (40 puits) s'effectue verticalement (cf. figure 3.6).
Les brins les plus courts migrent plus rapidement; ils vont donc se retrouver les premiers en bas du
gel. 512 photodiodes sont situes en ligne au bas du gel. Un faisceau laser de longueur d'onde 594
nm traverse le gel dans sa largeur et excite les fluorochromes qu'il rencontre. Les photodiodes
enregistrent l'intensit lumineuse mise 612 nm par les fluorochromes excits. Le signal est
numris et transmis l'ordinateur qui enregistre et analyse les donnes.
Figure 3.6. Reprsentation schmatique du fonctionnement d'un squenceur automatique.
1
La teneur en ure du gel peut varier de 4 7 M.
2
APS = Ammonium Persulfate, Long Ranger = Acrylamide et N,N'-mthylenebisacrylamide 50%, TEMED = N,N,N',N'
Ttramthylthylnediamine
119
Matriel et Mthodes
2.6 Analyse des squences

Les principes d'analyse des squences ont t rappels dans la premire partie de ce
manuscrit. Aprs migration les squences sont vrifies afin d'liminer d'ventuelles erreurs de
lecture (logiciel du squenceur Vistra V 2.0). Puis elles sont compares aux banques de donnes
(RDP et GenBank), alignes contre les squences les plus proches et assembles (logiciel ARB).
L'analyse phylogntique est ralise par la suite en comparant les rsultats obtenus par les
techniques d'analyse des distances, de maximum de parcimonie et de maximum de vraisemblance
(logiciel ARB).
III Hybridation in situ

La technique d'hybridation in-situ peut elle aussi se diviser en plusieurs tapes : la construction
des sondes, la mise au point des sondes et l'hybridation in situ.
3.1 Construction des sondes

La construction des sondes est ralise sur ordinateur. A partir d'un choix de squences le
logiciel ARB permet de construire des sondes spcifiques des squences cibler. Les paramtres
considrer sont le nombre de msappariements, la longueur de la sonde, le Tm relatif de la sonde, le
G+C% de la sonde (plus il est important plus le signal d'hybridation sera fort).
A partir de la liste de sondes fournie par le logiciel il convient de dterminer la plus efficace , c'est dire:
la sonde qui ciblera le plus grand nombre d'organismes que l'on souhaite marquer.
la sonde qui aura un nombre de msappariements suffisant avec les micro-organismes
que l'on souhaite exclure; l'idal est 3 msappariements rpartis sur toute la longueur
de la sonde (notamment au centre de la sonde).
la sonde qui s'hybridera sur une rgion de l'ADNr 16S o la structure secondaire de la
molcule n'empchera pas sa fixation (cf. la structure secondaire analyse par Fusch et
al., 1999 et voir exemple de structure secondaire en annexe).
3.2 Mise au point des sondes - Test de spcificit

Avant de raliser les hybridations in situ il convient de tester la spcificit de la sonde sur
membrane (pour vrifier la fixation de la sonde sur l'ADN) et sur culture pure (afin de vrifier la
pntration de la sonde dans la cellule et son hybridation sur la structure secondaire de l'ARN).
3.2.1 Hybridation sur membrane

On va dposer sur membrane l'ADN gnomique, l'ARNr ou l'ADNr de souches dont on souhaite
vrifier l'hybridation avec la sonde. Il convient de choisir la fois:
des espces qui sont spcifiquement cibles par la sonde,
120
Matriel et Mthodes
des espces de groupes phylogntiques proches et loigns ne s'hybridant pas avec la sonde,
des espces non recherches mais pour lesquelles la sonde prsente peu de msappariements.
Il est possible de fixer sur la membrane des ARNr ou de l'ADNr 16S. Les ARN sont extraits
l'aide des techniques classiques d'extraction (cf. Harmsen et al., 1997a). Les ADNr 16S dposs sur la
membrane peuvent tre le produit d'amplification de l'ADNr 16S de souches pures ou d'ADNr 16S
clons.
Dpt sur membrane :
On dpose sur la membrane (par puits) soit 30 ng d'ARNr soit 100 ng d'ADNr. Avant dpt,
l'appareil est nettoy l'eau MilliQ et sch l'thanol absolu. La membrane (Zeta Probe, GT-BioRad
ou Hybond N+-Amersham) est humidifie par flottaison dans de l'eau MilliQ strile puis sche sur
papier Whatman. Les ADN ou les ARN sont dnaturs durant ce temps dans 1 volume de 0,4N NaOH,
4 mM EDTA 10 min 100C. On ajoute 0,1 volume de solution stop (2M d'actate d'ammonium +
Bleu). Les chantillons sont conservs sur glace avant leur dpt. Le volume total est de 50L/dpt.
On dpose les matrices dnatures sur la membrane l'aide d'un appareil Dot-Blot ou Slot-Blot.
Aprs schage sommaire (sur papier Whatman) et emballage dans du film alimentaire, les matrices sont
fixes sur la membrane l'aide d'un Cross linker (2 cycles de 30 mJoules). Les membranes sont
conserves - 20C.
Marquage de la sonde :
La sonde est commande non marque. Pour les tests de spcificit la sonde est marque
32
l'[ - P]ATP l'aide de la T4 polynuclotide kinase. 100ng (dans 1L) de sonde sont marqus
chaque raction. On ajoute 2L de tampon, 16L d'eau MilliQ strile, 1 L de sonde et 0,5 1 L de
T4-Kinase et pour finir 1 L de [ -32P]ATP.
Hybridation sur membrane :
Les membranes sont prhybrides dans un volume minimal de tampon d'hybridation (10 20
mL) prchauff durant 15 min 45C. Aprs marquage, la sonde (20L) est introduite dans le tube et
l'hybridation se droule durant la nuit 45C. Le lendemain, le mlange d'hybridation est limin et la
membrane est lave 2 ou 3 fois avec du tampon 5X SSC. 20 mL de tampon de lavage prchauff
(45C) sont ajouts et la membrane est incube 20 min 45C. Le tampon est renouvel et la
membrane est incube Td (voir plus bas) durant 1 heure au moins. Les membranes sont emballes
(humides) dans du film alimentaire et dposes contre un cran photo-stimulable. Les crans sont lus
aprs 15 min 1 heure d'exposition sur un Fluorimager (Storm, Molecular Dynamics). Les membranes
sont stockes -20C jusqu' leur lavage.
Tampon d'hybridation Tampon SSCx20 Tampon de lavage

0,5M tampon phosphate 0,15 M NaCl 1X SCC
7% SDS (p/v) 0,015M Citrate de sodium 1% SDS (p/v)
1% BSA (p/v)
1 mM EDTA pH7,2
121
Matriel et Mthodes
Mesure de la Td :
La technique de mesure de la Td est celle mise au point par Raskin et al. (1994a). Elle consiste a
effectuer des lavages successifs des tempratures de lavage croissantes (avec un pas de 3 C par
lavage par exemple).
CPM
6000 CPM max
4000
CPM 50%
2000
Td
40 50 60 70 80 C
Temprature de lavage
Figure 3.7. Mesure de la temprature de dissociation (Td)
Dans un premier temps, la sonde est hybride avec sa cible en duplicat ou en triplicat puis est
lave comme prcdemment 2 3 fois par 5X SSC. Aprs ce premier lavage, chaque "dot" est
dcoup et dpos dans des tubes scintillation contenant 2,5 mL de tampon de lavage prchauff.
Le premier lavage est effectu 38C durant 20 min (pour supprimer l'excs de sonde). Puis un
deuxime lavage est effectu 38C durant 45 min 1 heure. Aprs chaque lavage le "dot" est
transfr dans un nouveau tube scintillation contenant du tampon de lavage. L'ancien tube est
rempli de 2,5 mL de liquide scintillation et est conserv jusqu'au comptage. On procde alors un
nouveau lavage 41C durant 45 min 1 heure (puis 44, 47, 50, etc., jusqu' 71 ou 74C). Lorsque
tous les lavages sont effectus, les tubes sont compts et la courbe de valeur cumules de
CPM=f(temprature de lavage) est construite. La Td est la temprature pour laquelle 50% de la
radioactivit aura t libre (cf. figure 3.7).
Lavage des membranes pour rhybridation :
Les membranes peuvent tre rhybrides plusieurs fois pour peu qu'elles aient t laves.
Pour ce faire les membranes froides (-20C) sont plonges dans une solution chaude (85C) de 0,5%
SDS (p/v) dans de l'eau MilliQ. Elles y sont laisses durant 30 min au minimum. Puis les membranes
sont laves avec du tampon de lavage froid, emballes dans du film alimentaire et stockes -20C.
3.2.2 Hybridation sur culture pure

Pour les hybridations sur culture pure, on choisit gnralement deux souches. Chacune d'entre
elles s'hybride avec la sonde gnrale (EUB 338 par exemple pour la sonde bactrienne) et une seule
des souches s'hybride avec la sonde analyser. Les hybridations sur souche pure permettent
d'optimiser la stringence du tampon d'hybridation en utilisant diffrentes concentrations de formamide.
Pour les conditions d'hybridation voir ( 3.3).
122
Matriel et Mthodes
3.3 Hybridation in situ

3.3.1 L'enrobage des lames d'observation
Avant le dpt des cellules, les lames sont traites. Laver les lames dans du KOH-thanol (10%
KOH : 10 mL 5M KOH+ 40 mL thanol). Rincer abondamment avec de l'eau MilliQ (2X). Plonger dans
une solution chaude (70C) de glatine 0,1% (p/v) et CrKSO4 0,01% (p/v). Scher l'air et conserver
l'abri de l'humidit.
3.3.2 Fixation des cellules

Cette technique s'applique aux cellules obtenues par culture pure ou aux chantillons.
Prparation de la solution de fixation:
Chauffer 20 mL d'eau MilliQ dans un tube de 50 mL 60C (micro-onde). Ajouter 2 g de

paraformaldhyde. Ajouter 100 l de NaOH 5N et agiter. La poudre doit se dissoudre rapidement.
Ajouter 100 l HCl 5N. Ajouter 15 mL PBS 10x et 10 mL d'eau. Refroidir la solution temprature
ambiante. Equilibrer le pH 7,2 et ajuster 50 mL. Striliser par filtration 0,2 m.
Fixation des cellules
Centrifuger 1 mL de culture en fin de phase logarithmique dans un microtube 4000 g durant 5 min.
Supprimer le surnageant. Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS 3x et centrifuger 4000 g durant 5
min. Resuspendre le culot dans 1 mL de solution de fixation (paraformaldhyde 4% (p/v) dans du PBS
3x). Fixer les cellules durant 3 heures 4C (au minimum) ou 1,5 heure temprature ambiante.
Centrifuger 5 min 3000 g (attention les cellules sont fragiles). Resuspendre le culot dans 1 mL de
PBS 3x et centrifuger 3000 g (optionnel). Resuspendre le culot dans 100 L de PBS 1x /0,1%
IGEPAL (p/v) et ajouter 100 L d'thanol. Stocker -20C.
3.3.3 Extraction des cellules de l'chantillon

Afin de limiter le bruit de fond li des hybridations non spcifiques des sondes sur des
morceaux de chemine, il a t ncessaire d'extraire les cellules de l'chantillon avant de raliser les
hybridations. Les cellules sont extraites aprs agitation avec un agent chlateur (le Chelex) et
migration sur un gradient de sucrose.
Dposer l'chantillon fix dans un tube de 25 mL. Ajouter 5 mL de PBS 1x/2% PEG8000 (p/v)
et 1 g Chelex-100. Agiter vigoureusement. Puis agiter durant 1 heure 4C l'aide d'un agitateur
horizontal. Centrifuger 700 g pendant 1 min et rcuprer le surnageant. Effectuer deux nouvelles
extractions sur le culot en ne rajoutant que 3 mL de PBS 1x/2% PEG8000 (p/v). Aprs centrifugation,
rassembler les surnageants et les centrifuger 5 min 700 g. Le surnageant est finalement centrifug
10 min 4000g. Le culot (contenant les cellules) est resuspendu dans 1 mL de PBS 1x/0,1% IGEPAL
(p/v) (Sigma) et est dpos la surface de 2 mL d'une solution de PBS 1x/0,1% IGEPAL (p/v)/ 50%
Ficoll (p/v) (Sigma). Aprs 1 min de centrifugation 4000 g les cellules sont rcupres la surface du
gradient de Ficoll et sont laves dans du PBS 1x/0,1% IGEPAL (p/v). Elle sont resuspendues dans 60
L de PBS 1x/ 0,1% IGEPAL (p/v) et 60L d'thanol 100%.
123
Matriel et Mthodes
3.3.4 Hybridation in situ

Il faut dans un premier temps fixer les cellules sur la lame puis raliser l'hybridation. Les lames
sont ensuite laves et conserves jusqu' leur observation.
Fixation des cellules sur la lame :
Essuyer les cts de la lame avec du papier Whatman. Ajouter 1 5 L de la solution de cellules fixes
(1L pour les cultures pures). Laisser scher l'air en agitant avec un cne de pipette. Scher 10 min
46C. Pour les bactries Gram + ajouter 10 L de lysozyme 2 mg/mL (5 min temprature ambiante).
Laver l'eau MilliQ et scher l'air. Scher les cellules en transfrant les lames dans des tubes de 50
mL contenant : 50% (v/v) d'thanol dans l'eau MilliQ (5 min), 70% (v/v) d'thanol dans l'eau MilliQ (5
min), 96% (v/v) ou thanol pur (5 min). Scher les lames l'air comprim.
Chambre humide :
Utiliser un petit rcipient avec un couvercle. Mettre des serviettes en papier au fond et les humidifier
avec une solution de la mme force ionique que le tampon d'hybridation. On peut utiliser du tampon
d'hybridation ou une vieille solution de lavage. Prchauffer la chambre 48C.
Hybridation :
0,5 L de sonde (50 ng pour chacune des deux sondes) sont mlangs 9 L de tampon
d'hybridation (Les solution filles de sondes sont prpares 100 ng/L; la solution stock est
gnralement 1g/l). Dposer les 10 l dans les puits de la lame. Transfrer rapidement dans la
chambre humide pour viter l'vaporation. Incuber 3h la temprature d'hybridation (gnralement
46C).
Stringence des tampon d'hybridation (% de formamide)

Pour Eub/Arch : 20% (optimum) 40% (maximum). Pour Cren/Eury : 0%.
Pour Thermus : 60%. Pour Thermus/Eub: 60%. Pour Bacillus : 40%. Pour Bacillus/Eub: 40%.
Pour Hydrogeno : 60%. Pour Hydr/Eub: 60%. Pour Toga : 20 40%. Pour Toga/Eub: 20 to 40%.
Pour Epsi : 40%. Pour Epsi/Eub: 40%. Pour GroupC : 40%. Pour GroupC/Eub: 40%.
Pour Cren/Arch : 30% Pour Arch : pas plus de 40%
Tampon d'hybridation Tampon de lavage

0,9M NaCl 180mM NaCl
20mM Tris pH 7,5 20mM Tris pH 7,5
0,1% SDS (p/v)
% de formamide dsir
(voir articles 2 et 3 pour la description des sondes)
Lavage des cellules :
Prchauffer 50 mL de solution de lavage dans un tube de 50 mL la temprature d'hybridation plus

2C (soit 48C). Prvoir deux lames par tube au maximum. Rincer les lames avec de la solution de
lavage et les mettre dos dos dans les tubes de 50 mL. Incuber de 15 minutes 1 heure. Rincer les
lames sur les deux faces avec prcaution l'eau MilliQ pour supprimer le tampon de lavage. Scher
124
Matriel et Mthodes
rapidement l'air comprim (pour viter l'lution de la sonde par l'eau MilliQ). Conserver 4C ou
observer directement.
Epifluorescence :
Ajouter environ 20 L de Citifluor (dans du PBS-glycrol) la surface de la lame (pas directement dans
les puits) et mettre une lamelle. Laisser 15 30 min temprature ambiante. Le Citifluor (pH 9)
quilibre le pH des cellules et limite les phnomnes de fading (affaiblissement). Visualiser les cellules
sous un microscope pifluorescence l'aide de filtres appropris :
Fluorescine : excitation 490 nm, mission 520 nm.
Rhodamine : excitation 550 nm, mission 580 nm.
IV Observation et quantification des cellules

Les chantillons fixs sont colors au SYBR-Green I ou II pour raliser des comptages de
cellules totales. A la diffrence du DAPI, le SYBR Green se fixe spcifiquement sur les acides
nucliques. Il y a trs peu de bruit de fond avec cette coloration, mme sur des chantillons dans
lesquels les cellules n'ont pas t extraites.
1 5 L d'chantillon ou de cellules extraites sont resuspendus dans 4,5 mL de TE strile. Le
mlange est agit et filtr sur Anodisc 25 0,2 m (Whatman). Afin d'assurer une filtration rgulire un
second filtre de 0,65 m (Millipore) est plac sous le filtre de 0,2 m. Le filtre 0,2 m est rcupr puis
est dpos sur une goutte (100 L environ) de solution dilue de SYBR Green I ou II (dilution au
1/1000 e de la solution mre). La coloration s'effectue par diffusion durant 15 min (au moins)
l'obscurit. Le filtre est mont sur lame, recouvert d'un mlange d'anti-fading (100 150 L) puis d'une
lamelle.
Les comptages sont effectus au grossissement X 1000. Un filtre est compt lorsque le nombre
de bactries dans le champ est compris entre 30 et 200. On compte 20 champs par filtre et 2 filtres par
chantillon. Loculaire de comptage permet le dnombrement soit sur toute la surface de loculaire soit
sur la surface quadrille. Le filtre optique du SYBR Green est le mme que celui utilis pour
l'observation des cellules marques la fluorescine.
Les comptages de cellules marques par des sondes nucliques sont effectus sur le mme
nombre de filtres et de champs.
Solution d'anti-fading Solution Fille de SYBR Green

50% 1x PBS (v/v) dilution au 1/1000ede la solution mre dans du TE
50% Glycrol (v/v) le SYBR Green est instable dans l'eau MilliQ.
0,1% p-phnylnediamine (p/v)
125
Articles
Article 1
- Analyse molculaire de la diversit phylogntique de rservoirs ptroliers continentaux et d'une
source chaude terrestre.
- Article soumis Applied and Environmental Microbiology (Janvier 2000).
Corre Erwan, Laurent Toffin,and Christian Jeanthon. Molecular Phylogenetic Analysis of the
Microbial Diversity of Continental Oil reservoirs.
Article 2
- Etude de la diversit phylogntique bactrienne associe un chantilloneur dploy sur un site
hydrothermal de la dorsale mdio-Atlantique.
- Article soumettre Applied and Environmental Microbiology (Janvier 2000)
Corre Erwan, Daniel Prieur and Anna Louise Reysenbach. Molecular Phylogenetic Bacterial
Diversity Associated with In Situ Growth Chambers deployed on a Vent Site on the Mid Atlantic Ridge.
Article 3
- Article en prparation :
Corre Erwan, Laurent Toffin, Julie Kirshtein, Anna-Louise Reysenbach, Daniel Prieur et Christian
Jeanthon. Analyse de la diversit procaryotique associe des fluides hydrothermaux profonds par
squenage des ADNr 16S, hybridation in situ et enrichissement.
Article 4
-Caractrisation d'une Archaea hyperthermophile mthanogne provenant d'un site hydrothermal
profond.
- Article publi dans International Journal of Systematic Bacteriology (1999).
Jeanthon C., S. L'Haridon, A.L. Reysenbach, E. Corre, M. Vernet, P. Messner, U.W. Sleytr and D.
Prieur. 1999. Methanococcus vulcanius sp. nov., a novel hyperthermophilic methanogen isolated
from East Pacific Rise and identification of Methanococcus spp. DSM 4213 as Methanococcus fervens
sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 49:583-589.
Article 5
- Article en prparation : Caractrisation phylogntique d'Archaea hyperthermophiles
radiorsistantes isoles d'un site hydrothermal profond.
Edmond JOLIVET, Stphane L'HARIDON, Erwan CORRE, Patrick FORTERRE and Daniel PRIEUR
Article 6
- Article en prparation : Caractrisation phylogntique dune Bacteria thermophile isole sur le site
du Bassin de Lau.
127
Bibliographie :
Les rfrences bibliographiques non cites dans les articles sont prsentes dans la partie rfrences
du manuscrit.
128
Conclusion gnrale
Conclusion gnrale
Le but de ce travail de thse tait d'tudier, l'aide de techniques de phylognie molculaire,

la diversit microbienne infode aux rservoirs ptroliers et aux sources hydrothermales profondes.
A la lumire des rsultats prsents dans ce manuscrit, une reprsentation schmatique des relations
s'tablissant entre les diffrents groupes bactriens et archaens des cosystmes ptroliers (cf.
figure 11.1) et hydrothermaux (cf. figure 11.2) peut tre propose.
Les processus de production primaire autotrophes au sein du rservoir ptrolier sont encore
mconnus. Il est donc probable que les micro-organismes se dveloppant dans les rservoirs utilisent,
en absence d'oxygne, les hydrocarbures et leurs drivs comme sources de carbone et comme
donneurs d'lectrons. Les hydrocarbures peuvent soit subir une dgradation abiotique lie aux fortes
pressions, aux fortes tempratures et des ractions physico-chimiques avec la roche mre, soit subir
une dgradation biotique lie aux micro-organismes prsents dans l'eau de production ou dans la
roche rservoir. Il a en effet t dmontr que les alcanes et un grand nombre d'alkyles benznes
pouvaient tre dgrads en anarobiose par des micro-organismes (Heider et al., 1999 pour revue;
Zengler et al., 1999). Il s'agit de bactries rduisant le sulfate et fer ferrique, ainsi que de bactries
dnitrifiantes. Certains consortiums de bactries syntrophes et mthanognes peuvent dgrader les
hydrocarbures si l'hydrogne et l'actate sont consomms activement par mthanogense
actoclastique et hydrognoclastique. Enfin, certaines fermentations peuvent tre impliques dans la
dgradation des hydrocarbures (Heider et al., 1999). Les composs simplifis (chanes d'alcanes
rduites, composs cycliques "ouverts") vont tre disponibles pour des micro-organismes pratiquant
la respiration anarobie ou la fermentation. Le mthane et le CO2 peuvent tre prsents comme les
produits terminaux de cette dgradation anarobie des hydrocarbures. Or le mthane pourrait tre
son tour consomm par d'autres micro-organismes. Il y a peu, seuls les mcanismes d'oxydation
arobie du mthane taient connus, mais la dtection rcente de micro-organismes assimilant en
anarobiose le mthane au sein de sdiments marins (Hinrichs et al., 1999) rend cette raction
galement envisageable au sein d'un rservoir ptrolier.
Les tudes ralises par des techniques molculaires (article 1) et culturales (L'Haridon et al.,
1995; Jeanthon et al., 1995) dans le rservoir de Montmirail, nous ont permis de dtecter ou de
cultiver des micro-organismes fermentaires, sulfato- ou thiosulfato-rducteurs, des bactries
syntrophiques et des mthanognes. Ces populations pourraient dgrader forte temprature et en
absence d'oxygne les hydrocarbures et constitueraient la communaut indigne. Cette
communaut a pu tre "enrichie" par des micro-organismes injects dans le rservoir lors des
processus de rcupration secondaire. Prsents dans l'eau potable, l'eau de nappe phratique ou
dans les eaux de production retraites, ces micro-organismes, exognes et gnralement arobies,
sont par la suite retrouvs dans les chantillons prlevs en tte de puits. Les conditions physico-
chimiques rgnant au sein du rservoir ne permettent probablement pas ces micro-organismes de
participer trs activement la dgradation des hydrocarbures. Toutefois il est probable que certaines
micro-niches, proximit de la zone d'injection d'eau ou dans le puits, rendent cette dgradation
possible dans des conditions d'arobiose ou de micro-arophilie. Les canalisations des puits
209
Injection deau
de nappe
CO2 de production potable phratique
Matire organique NO3- Fe3+ Micro-organismes

Bactries sulfato- htrotrophes ou
Mn4+ SO42- rductrices msophiles fermentaires
Proteobacteria delta
(Desulfovibrionaceae) Proteobacteria alpha
CO2 Peptococaccaceae
N2 Fe2+ Proteobacteria beta
Proteobacteria epsilon (Desulfotomaculum)
NO3- Mn2+ S2-
(Campylobacteriaceae) Proteobacteria gamma
Firmicutes haut
G+C%
N2
Mn4+ MnO2(S) Gaz

Processus de sulfato-rduction et
fermentaires msophiles
Mn2+ induisant le Pitting
Fe3+ FeXOXOHX(S)
Propionibacteriaceae
Thermococcales
Fe2+ Thermotogales
Thermoanaerobacter
SO42- Thermodesulfobacterium
Bactries syntrophiques
S2- Firmicutes
Proteobacteria
Composs en C1
CO2
Fermentations
Alcools
n-Alcanes
CH4 Apport de micro-
Acides gras organismes arobies
Composs Actogenese courte chaine CO2 contaminants
Bactries du sol et souterraines cycliques
Actate actoclastique
CO2 Respirations Mthanogense
CH4 H2 Acides gras CH4
anarobies CO2 hydrognoclastique
longue chaine Micro-organismes
htrotrophes ou
fermentaires
Bactries sulfato- Methanosarcinales Proteobacteria alpha
rductrices thermophiles
Proteobacteria beta
Proteobacteria delta
(Desulfobulbaceae, Proteobacteria gamma
Desulfovibrionaceae) Firmicutes haut
Gaz dorigine gologique Fe3+ SO42- S2O32- Peptococaccaceae G+C%
(Desulfotomaculum)
NO3- Mn4+ HCO3- Dgradation
Archaeoglobales arobie
Fig. 11.1. Ecologie microbienne des sous forme soluble Zone msophile darobiose
rservoirs ptroliers Processus indignes thermophiles et msophiles partielle
Conclusion gnrale
constituent par ailleurs des biotopes favorables au dveloppement de micro-organismes sulfato-

rducteurs msophiles intervenant activement dans les phnomnes de biocorrosion. La prsence
de cette communaut msophile est corrle un faible dbit d'extraction. Plus la longueur de
canalisation est importante, plus le dbit est rduit et plus il est possible aux micro-organismes de se
dvelopper au sein des installations. Tout autour du rservoir, les communauts de micro-organismes
souterrains peuvent elles aussi interagir avec celles prsentes dans le rservoir. Il a t propos
(Voordouw et al., 1996) que des micro-organismes sulfo-oxydants (pouvant correspondre dans notre
cas des Proteobacteria epsilon) interviendraient dans la roxydation des composs soufrs rduits
produits par les bactries sulfato-, thiosulfato- et soufre-rductrices du rservoir. Mais d'autres
interactions entre ces deux communauts sont envisageables notamment via les processus de
respiration anarobie.
Les mcanismes biotiques et abiotiques se droulant au sein des rservoirs ptroliers sont
encore mal connus en raison, notamment, des difficults d'chantillonnage et de notre incapacit
prvenir les contaminations par les micro-organismes des sols ou injects dans la nappe. Aussi
considre-t-on comme endmiques des micro-organismes dont les conditions de croissance sont
compatibles avec les conditions physico-chimiques des puits. Il est toutefois difficile de connatre
l'ensemble des conditions physico-chimiques inhrentes un rservoir s'tendant sur une surface de
plusieurs kilomtres carrs, sur plusieurs dizaines de mtres de profondeur et au travers de
diffrentes roches. Aussi, il est probable que des conditions de temprature modre et/ou
d'arobiose partielle puissent exister au sein du rservoir en particulier lorsque la nappe est en contact
avec la roche couverture.
Il ne nous aura pas t possible au cours de cette tude d'estimer la reprsentativit des
squences dtectes au sein du rservoir. Si les squences correspondant aux micro-organismes
sulfato-rducteurs semblent dominer certaines des banques obtenues, seules des expriences
d'hybridation in situ nous permettraient de prciser la contribution de ces micro-organismes dans cet
environnement. Par ailleurs ce type d'tude n'a jamais t ralis partir d'chantillon de rservoirs
ptroliers.
Au sein des cosystmes hydrothermaux profonds on distingue les micro-organismes se

dveloppant dans la "zone chaude" proximit des fumeurs, dans le fluide ou les parois des
chemines (partie gauche de la figure 11.2), de ceux se dveloppant dans la zone froide ou
temprature modre, dans l'eau de mer, sous forme libre ou en association symbiotique avec la
macro-faune des sources hydrothermales (partie droite de la figure 11.2).
Dans la zone froide, la production primaire est assure par des bactries chimiosynthtiques
autotrophes sulfo-oxydantes sous une forme libre ou associes la macrofaune. Les Proteobacteria
epsilon que nous avons dtectes dans les chantillons de "Vent Cap" pourraient intervenir dans ces
processus puisqu'elles semblent tre associes certaines espces d'Annlides (Haddad et al.,
1994) et de Crustacs (Poltz et Cavanaugh, 1995) mais qu'elles sont aussi prsentes sous une forme
libre dans des tapis bactriens ou sur des difices minraux (Moyer et al., 1995; Poltz et Cavanaugh,
210
Micro-organismes Micro-organismes
autotrophes S2O32- htrotrophes Communaut microbienne Communaut microbienne marine
(CH2O)n Sulfato-, thiosulfato-
S2-
Sulfato-rducteurs SO42-
rducteurs thermophile sous une forme libre CO2
Archaeoglogus SO42- Archaeoglogus
S2- Thermotoga dans les panaches ou dans les parois Micro-organismes Micro-organismes
S2- S
htrotrophes photosynthtiques Production primaire
Soufre-rducteurs
Desulfurobacteriales
Soufre-rducteurs
Thermococcales
des chemines Cytophagales Cyanobactries
Pyrodictium S 60 100C S2- Staphylothermus Planctonomycetales (CH2O)n
H2O O2 Arobies Verucomicrobiales Archaea Groupes I et II
Hydrogne-oxydants Thermus sp.
H2 Proteobacteria Firmicutes
Aquificales H2O Bacillus sp.
(CH2O)n Fermentaires
Mthanognes CH4
hydrognoclastiques CO2
Thermococcales (CH2O)n CO2
CO2 Thermosipho sp.
Methanococcales CO2
Methanopyrus Desulfurococcus sp.
Staphylothermus
Production primaire Pyrodictium
Consommateurs
350C
350C
? Consommateurs
Archaea non cultives
?
H2O
CO2 Micro-organismes
350C ? Proteobacteria inconnues
O2 arobies
350C ? SO42- CO2
Micro-organismes
sulfo-oxydants Micro-organismes
Proteobacteria (CH2O)n fermentaires
Oxydation/prcipitation par S2- N2 Fe2+ Mn2+
Thiomicrospira sp.
mlange avec l'eau de mer froide Micro-organismes
Thiobacillus sp.
Mn4+ NO3- Fe3+ Mn4+ respiration anarobie
Beggiatoa sp.
Fe3+ S2-
Micro-organismes (dont micro-organismes
FeS + O2 Fe(O)OH CO2 (CH2O)n SO42- Fe-, Mn- oxydants SO42-
sulfato rducteurs)
Thiobacillus sp. Mn2+ CH4
Mn + O2 MnO2 Fe2+ Micro-organismes
CH4 CH4 CO2 (CH2O)n mthanognes
S2- CO2
Micro-organismes Micro-organismes
methylo, sulfo-oxydants Communaut microbienne
methanotrophes msophile sous forme libre ou
100C Proteobacteria
Proteobacteria
Proteobacteria
Proteobacteria sous forme de tapis
Percolation de l'eau de Fort dbit
mer froide Temprature leve
Macro-faune et communaut
Eau de mer chauffe microbienne msophile symbiotique Communaut microbienne
enrichie en minraux
Zone de mlange des eaux soutrraine
Temprature moyenne
(voir Fig. 11.1)
1000C
Lessivage de Ca2+, Mn2+, Fe2+ et Cu2+
Fig. 11.2. Ecologie microbienne des

sources hydrothermales
BASALTE
profondes
Conclusion gnrale
1995; Cary et al., 1997) ou dans le fluide (articles 2 et 3). Jusqu' prsent aucun micro-organisme
mthanotrophe autotrophe n'a t dtect sous une forme libre mais ceux-ci interviennent activement
en tant que producteurs primaires sous une forme symbiotique associe des Mythilids (Nealson et
Fischer, 1995). D'autre part, des activits in situ correspondant une oxydation du mthane par des
formes libres ont dj t enregistres proximit des sources hydrothermales profondes (De Angelis
et al., 1991). Des micro-organismes n'oxydant strictement que les mtaux, tels que le Fe(II) et le Mn(II),
n'ont pas t isols. Si certains Thiobacillus peuvent se dvelopper en autotrophie en oxydant les
mtaux, le fer ferreux n'est quant lui stable que dans des conditions acidophiles qui ne sont
rencontres dans les sources hydrothermales que dans le fluide chaud. Les consommateurs du ple
froid sont soit les macro-organismes associs aux bactries symbiotiques, soit d'autres micro-
organismes sous une forme libre se dveloppant en htrotrophie en conditions d'anarobiose
(fermentations, respirations anarobies) ou d'arobiose complte ou partielle (respiration arobie,
micro-arophilie). On connat peu de chose sur ces micro-organismes msophiles en grande partie
parce que les tudes microbiologiques se sont trs vite focalises sur les micro-organismes
thermophiles. Il est toutefois probable qu'on puisse retrouver dans cette communaut des micro-
organismes issus des communauts microbiennes marines et souterraines. Ces micro-organismes
transports par les courants, dposs avec les sdiments ou charris par des missions de fluide
hydrothermal base temprature, profiteraient d'un apport abondant en matire organique pour se
dvelopper activement et contribuer aux diffrents cycles gochimiques (C, N, S, mtaux) au sein de
l'cosystme hydrothermal.
Dans la zone chaude, c'est dire dans le panache du fluide hydrothermal, proximit et dans
les parois des chemines, la production primaire pourrait tre assure par des micro-organismes
chimiolithoautotrophes thermophiles. Il est aussi possible que la matire organique produite dans les
zones froides se retrouve dans les zones chaudes ou que des processus gochimiques de
profondeur puissent tre gnrateurs de matire organique. Les Methanococcales ralisant une
mthanogense hydrognoclastique (article 4), les Archaeoglobales sulfato-rductrices et les
Desulfurobacteriales soufre-rductrices dtectes dans nos chantillons pourraient contribuer
activement la production primaire biotique du ple chaud (Harmsen et al., 1997b; article 3). Les
micro-organismes associs aux Aquificales dtects dans l'chantillon VC 2.1 pourraient quant eux
intervenir dans la production primaire en oxydant l'hydrogne (article 3; Reysenbach et al., 1999). Les
micro-organismes thermophiles htrotrophes se dveloppant dans le ple chaud sont mieux connus
que leurs analogues du ple froid. Les enrichissements d'htrotrophes thermophiles en prsence
de soufre sont gnralement domins par les Thermococcales, micro-organismes fermentaires
rduisant le soufre (articles 3 et 5). Il nous a t possible, par ailleurs, de dtecter des Thermotogales
et des Thermus dans de faibles proportions, pouvant eux aussi se dvelopper, respectivement en
anarobiose et arobiose, au niveau du ple chaud (article 3). Bien qu'ils n'aient pas t dtects
dans nos chantillons, des Bacillus ont dj t isols sur le site du Snake Pit (cf. tableau 6.1;
Marteinson et al., 1996). Ces micro-organismes sont prsents de manire ubiquiste dans de
nombreux environnements terrestres ou marins, en raison notamment de leur capacit sporuler. Ils
211
Conclusion gnrale
dominent gnralement les enrichissements arobies haute temprature. Ces micro-organismes

peuvent prendre part activement la consommation de la matire organique au niveau du ple chaud
des sources hydrothermales (article 6).
Les variations de disponibilit des nutriments, lies aux caractre abrupt des gradients
physico-chimiques la sortie des sources hydrothermales, mais aussi aux forts courants de fond,
favorisent trs probablement le dveloppement des micro-organismes mixotrophes. Mais les
techniques d'isolement gnralement utilises ne favorisent pas la dtection de ce type mtabolique
(Karl, 1995). La forte variabilit de squences d'ADNr 16S observe pour de nombreux groupes
phylogntiques (notamment pour les Proteobacteria epsilon) dans chacun de nos chantillons
(articles 2 et 3, Reysenbach et al., 1999) pourrait correspondre une rponse adaptative corrle aux
variabilits des conditions environnementales.
Les cosystmes ptroliers et hydrothermaux profonds prsentent de fortes similitudes tant

au niveau de leur localisation (environnements souterrains ou profonds), de leurs conditions physico-
chimiques (forte temprature, forte pression, anoxie) que des communauts microbiennes qu'ils
hbergent (micro-organismes thermophiles, fermentatifs, sulfato-rducteurs, soufre-oxydants). Le
soufre et les composs soufrs y sont considrs comme des lments-cls des processus
mtaboliques indignes. Comme les micro-organismes dcrits les plus intimement associs au dernier
anctre commun sont des hyperthermophiles anarobies rduisant le soufre, il a t suggr que la
rduction du soufre pourrait tre l'une des premires formes de respiration microbienne (Madigan et
al., 1996). Il a cependant t rcemment dmontr qu'un grand nombre de micro-organismes
thermophiles isols d'cosystmes chauds (par exemple des mthanognes, des fermentatifs ou des
sulfato-rducteurs) taient galement capables de rduire le fer ferrique en prsence d'H 2 comme
seule source d'lectrons (Vargas et al., 1998; Slododkin et al., 1999). Compte tenu de l'abondance de
ce mtal dans l'ensemble de la biosphre terrestre, la rduction du fer aurait pu constituer un
processus majeur sur la Terre primitive et serait encore actuellement prpondrante dans les
biosphres souterraines (Liu et al.,1997b; Lovley, 1997).
Un grand nombre de squences, en particulier celles affilies des groupes phylogntiques

o aucun isolat n'est disponible (Crenarchaeota et Euryarchaeota non cultives, Bacteria "branchant"
profondment, nouvelles Proteobacteria) ne peuvent clairement tre associes un biotope ou un
processus mtabolique. L'utilisation de nouvelles techniques d'isolement (comme par exemple les
pinces optiques) combine celle de sondes molculaires, l'analyse phylogntique et la
quantification de gnes impliqus dans des fonctions mtabolique (via le squenage, les puces
ADN et l'analyse des ARNm) ainsi que la gnralisation des tudes gnomiques pourraient permettre
d'attribuer une fonction et une place dans l'cosystme ces micro-organismes.
L'origine endmique ou cosmopolite des communauts de micro-organismes thermophiles et

msophiles des cosystmes hydrothermaux et ptroliers reste encore indtermine. Si certains
212
Conclusion gnrale
genres, l'instar de Thermococcus, de Bacillus, de Thermotoga, de Thermosipho ou de

Methanococcus, ont t dtects de manire ubiquiste en milieu hydrothermal ctier et profond, et
en milieu ptrolier marin et continental, d'autres semblent strictement associs un environnement
donn, comme les Petrotoga et les Geotoga dans les rservoirs ptroliers ou les Pyrolobus et
Desulfurobacterium dans les cosystmes hydrothermaux profonds. En poursuivant l'analyse de ces
cosystmes, en entreprenant par exemple des tudes de gntique des populations, sur la base
des espaces intergniques ou des gnes codants pour des protines, de diffrencier les populations
cologiquement distinctes et d'tablir leur origine biogographique.
L'analyse de la diversit des communauts microbiennes d'environnements extrmes peut

prsenter un intrt conomique autant que fondamental. Hunter-Cevera s'interrogeait rcemment
sur la valeur que pouvait prsenter cette diversit (Hunter-Cevera, 1998). On peut y voir une valeur
pcuniaire au travers des processus mtaboliques que l'on peut dtecter, cloner et exprimer une
chelle industrielle (Garrity et Hunter-Cevera, 1999). Mais elle prsente avant tout une valeur
fondamentale. De telles tudes contribuent d'une part un inventaire des espces vivantes tel que
cela a t propos par Pace (1997), et d'autre part mieux dfinir quelles pourraient tre les frontires
gographiques et physico-chimiques du vivant et la nature des premires formes de vie terrestres.
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U A
G A
G U 700
C G
G C G U
A A
U G
G
U A G A
G U
G C
680
A U U A AG
C G U
C G U 1100
G C
U A G C A
U G 720 G CC AC
A G U G
A A C G G GA G C A A 1120
G A C U GC C
U GC
A U A G G U CC UU A UC
G U C C UUU G UU G A G
U G G U G GA CC C GG UC
C A U UA GG GGU A G
G C C C G G G G AAA C A
G C G G A G A U G GG G CC C
U A 1180 A A
G C A 1080 A G A UC GG
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G C GU A 1140
C G U
G C 740 G
U U G
A G UG G CA GA
G C 1160
G 1060 C
A U AG U A G A
A G A C G U G
U U G C
G C U
660 C GA U A G C 1200 A UG
A C U A A
U A G C UC A
C G U G A U AU
G C C
U A A U 800 C G C
G C C G G UA
780 A A C GG
G A U A 1020 G A U G
G U G U A C G
640 U C A A G AA U G
G U GA C
A UG C
1040
A A C A C U G G C
A
A CCU GG G U G C A U C U G A U U G G C A A G C C A G G U AG AC UUU UG G G C
620 C G G G C A A GC UGA C G C
UC GG GCC C G U G U A G A C U G A A U U G U U U G C CU C G C AC G A A UU
A G A 760 U A
C 600 G 1000 CU A
U AA G G C
A G C G 840 C UU A C
C A C G C C G
G C U A G C CG C A G U UU A
A GA G GA G C
C CG U
GU CG
580 1260
980
G A G C GC
A U
C U UG C U U CU A A GCGA C G
A G G C A G 1220
A C CU G A
G C G G A C G G
A 820 A C A A
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Structure secondaire de lARN r 16S dE. coli.

Methanospirillum hungatei str. JF1 (DSM 864)
Methanosarcina barkeri str. 227 (DSM 1538)
Haloferax volcanii str. DS-2 (ATCC 29605)
Thermoplasma acidophilum str. 122-1B2
Santa Barbara Channel bacterioplankton DNA clone SBAR16

Archaeoglobus fulgidus str. VC-16 (DSM 4304)
Methanothermus fervidus
Methanobacterium formicicum (DSM 1312)
Thermococcus celer str. VU 13 (DSM 2476)
Methanococcus vannielii str. EY33
Methanococcus jannaschii str. JAL-1 (DSM 2661)
Methanopyrus kandleri str. av19 (DSM 6324)
Mud Volcano area of Yellowstone NP ("Black Pool") hot spring DNA clone pJP27 Korarchaeota
Santa Barbara Channel bacterioplankton DNA clone SBAR12

Mud Volcano area of Yellowstone NP ("Black Pool") hot spring DNA clone pJP89
Thermofilum pendens str. Hvv3 (DSM 2475)
Sulfolobus acidocaldarius str. 98-3 (ATCC 33909)
Thermoproteus tenax
Aquificales
Aquifex pyrophilus str. Kol5a
Fervidobacterium islandicum str. H-21 (DSM 5733)

Thermotogales
Thermotoga maritima str. MSB8 (DSM 3109)
Chloroflexus aurantiacus str. J-10-fl
Thermomicrobium roseum (ATCC 27502)
Meiothermus ruber str. Loginova 21 (ATCC 35948) Deinococcus -

Thermus Group
Deinococcus radiodurans (ATCC 35073)
Acholeplasma laidlawii str. JA1
Clostridium ramosum str. 113-I (ATCC 25582)
Mycoplasma capricolum (ATCC 27343)
Streptococcus thermophilus (ATCC 19258)
Enterococcus faecalis
Lactobacillus casei subsp. casei (NCDO 161)
Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii str. Calvert (NCIMB 8130)
Listeria monocytogenes
Bacillus cereus (IAM 12605)
Bacillus stearothermophilus (NCDO 1768)
Bacillus subtilis str. 168
Eubacterium barkeri (NCIMB 10623)
Heliobacterium chlorum (ATCC 35205)
Clostridium quercicolum (ATCC 25974)

Clostridium leptum (ATCC 29065)
Clostridium pasteurianum (ATCC 6013)
Clostridium butyricum str. E.VI.3.6.1 (NCIMB 8082)
Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum (ATCC 25586) Fusobacteria
Streptomyces ambofaciens
Corynebacterium xerosis (ATCC 373)
Bifidobacterium bifidum (DSM 20456)

Arthrobacter globiformis (DSM 20124)
Spirillum volutans (ATCC 19554)
Rubrivivax gelatinosus str. ATH 2.2.1 (ATCC 11169)
Rhodocyclus purpureus str. 6770 (DSM 168)
Neisseria gonorrhoeae str. B 5025 (NCTC 8375)
Stenotrophomonas maltophilia (NCIMB 9203)
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa (NCPPB 965)
Chromatium vinosum (ATCC 17899)
Ectothiorhodospira halochloris str. A (ATCC 35916)
Rhodospirillum rubrum str. ATH 1.1.1; S.1 (ATCC 11170)
Azospirillum brasilense str. Sp 7 (DSM 1690) {1461 bp}
Rickettsia prowazekii str. Breinl (ATCC VR-142)
Sphingomonas capsulata (JCM 7508)
Rhizobium leguminosarum (IAM 12609)
Rhodomicrobium vannielii str. EY33 (ATCC 51194)
Bradyrhizobium japonicum (LMG 6138)

Myxococcus xanthus str. DK1622
Desulfobacter postgatei str. 2 ac 9 (DSM 2034)
Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 27774)
Bdellovibrio stolpii str. UKi2 (ICPB 3291)
Campylobacter jejuni subsp. jejuni str. TGH 9011 (ATCC 43431)

Campylobacter jejuni subsp. jejuni str. TGH 9011 (ATCC 43431)
Helicobacter pylori (RPH 13487)
Wolinella succinogenes str. 602W (FDC) (ATCC 29543)
Treponema pallidum str. Nichols
Spirochaeta stenostrepta str. Z1 (ATCC 25083)

Borrelia burgdorferi str. B 31 (ATCC 35210)
Spirochaeta halophila str. RS1 (ATCC 29478)
Serpulina hyodysenteriae str. B204 (ATCC 31212)
Leptonema illini str. 3055
Leptospira interrogans str. Kennewicki, serovar pomona
Acidobacterium capsulatum str. 161 Fibrobacter

Fibrobacter succinogenes str. S85 (ATCC 19169) group
Zea mays (maize) -- chloroplast

Chloroplastes
Olisthodiscus luteus (stramenopile) -- chloroplast
Synechococcus sp. (PCC 6301)

Nostoc muscorum (PCC 7120)
Gloeobacter violaceus (PCC 7421)
Mount Coot-tha region (Brisbane, Australia) 5-10cm depth soil DNA
clone MC 18 Planctomycetes-
Chlamydia psittaci str. 6 BC (ATCC VR-125) Verrucomicrobia-
Chlamydia group
Pirellula staleyi (ATCC 27377)
Chlorobium limicola str. 8327 GS
Thermonema lapsum (ATCC 43532)
Flexibacter litoralis str. Lewin SIO-4 (ATCC 23117)
Cytophaga hutchinsonii str. D465 (P.H.A. Sneath) (ATCC 33406)
Cytophaga diffluens str. Lewin LIM-1 (ATCC 23140)

Saprospira grandis (ATCC 23119)
Flexibacter canadensis (ATCC 29591)
0,5 Cytophaga lytica str. LIM-21 (ATCC 23178)

Empedobacter brevis (ATCC 14234)
Bacteroides fragilis (ATCC 25285)

Prevotella ruminicola subsp. ruminicola
(ATCC 19189)
RESUME
L'tude des communauts de micro-organismes des sources hydrothermales profondes et des rservoirs
ptroliers a longtemps t limite par l'utilisation exclusive de mthodes culturales ne permettant d'accder qu' une
part restreinte de la diversit microbienne. Afin de dpasser cette restriction, nous avons utilis les approches
culturales en combinaison avec des approches molculaires pour tudier les communauts microbiennes de deux
rservoirs ptroliers du bassin parisien et des fluides hydrothermaux profonds collects sur la dorsale mdio-
Atlantique. Ces approches ont consist d'une part en une analyse phylogntique des gnes codant pour l'ARNr 16S
par amplification et hybridation in situ en s'affranchissant de toute tape de culture, d'autre part dans l'enrichissement
de difrents types mtaboliques haute temprature, et enfin dans le positionnement phylogntique de souches
isoles d'environnements hydrothermaux.
L'tude ralise partir d'chantillons d'eau de production de deux rservoirs ptroliers a conduit la
description de squences d'Archaea mthanognes, halophiles ou hyperthermophiles affilies aux Methanosarcinales
ou aux Thermococcales. Pour deux chantillons, les squences de Bacteria taient associes des Thermotogales,
des Proteobacteria delta et des Firmicutes bas G+C% gnralement impliqus dans des processus thermophiles et
msophiles de sulfato- ou thiosulfato-rduction. Des squences associes au genre Arcobacter pouvant intervenir
dans le cycle des composs soufrs au sein du rservoir ont t dtectes dans un troisime chantillon. Enfin un
dernier chantillon au sein duquel les squences associes au genre Herbaspirillum, provenant probablement d'une
contamination lie aux processus d'extraction secondaires des hydrocarbures, taient dominantes.
Des fluides hydrothermaux ont t chantillonns l'aide d'un collecteur original, le "Vent Cap". Des
enrichissements de diffrents types mtaboliques (soufre-rducteurs autotrophes et htrotrophes, sulfato- et
thiosulfato-rducteurs, et mthanognes) 65 et 80C ont t positifs dans la majorit de nos chantillons.
L'amplification et le squenage des ADNr 16S bactriens et archaens a conduit la dtection d'une grande diversit
de squences. Les Proteobacteria epsilon dominent gnralement les banques de squences bactriennes et sont
dtectes avec les Desulfurobacteriales en forte proportion par hybridation in situ. Des squences d'Archaea
communment isoles en milieu hydrothermal profond, telles que les Thermococcales, les Methanococcales et les
Archaeoglobales ont galement t dtectes.
L'utilisation combine de diffrentes mthodes molculaires et de mthodes culturales nous a permis de
dpasser les limitations inhrentes chacune de ces mthodes et de proposer une image des relations s'tablissant
entre les diffrentes communauts de micro-organismes prsents dans ces deux environnements.
ABSTRACT
Studies of the microbial communities from deep sea hydrothermal vents and oil reservoir have been for a long
time exclusively limited to the use of cultural techniques which described only a restricted part of the diversity. To
circumvent this limitation we used cultural techniques in conjunction with molecular methods to investigate microbial
communities of continental oil reservoirs in the East Paris Basin and of hydrothermal fluids collected on the Mid Atlantic
Ridge. Our approach combined total 16S rDNA sequencing and in situ hybridization without any cultural step,
enrichments of differents metabolic types at high temperature and phylogenic characterisation of strains isolated from
hydrothermal environment.
The study of oil reservoirs water production lead to the description of archaeal sequences affiliated with the
methanogenic, halophilic or hyperthermophilic, Methanosarcinales and Thermococcales orders. Bacterial sequences
are mostly affiliated, in two of our samples, to thermophilic or mesophilic sulfate- or thiosulfate-reducing bacteria
belonging to the Thermotogales and -Proteobacteria phylum and to the Low G+C Gram-positive bacteria. Sequences
affiliated to the genus Arcobacter, probably involved in the sulphur cycle inside/or in the vicinity of the oil reservoir, were
also detected in another sample. Finally a last sample was dominated by sequences related to the aerobic genus
Herbaspirillum, that may come from contaminations occuring during the secondary oil recovery process.
Deep hydrothermal fluids were sampled by a special collector, the Vent Cap. Enrichments of heterotrophic and
autotrophic sulphur-reducers, sulphate and thiosulfate reducers and methanogenes at 65 and 80C were positive in
most of our samples. Archaeal and bacterial 16S rDNA analyses revealed a wide sequences diversity. -Proteobacteria
dominated the bacterial clones libraries and have been detected in high proportions by in situ hibridization with
Desulfurobacteriales. Archaeal sequences associated to genera commonly isolated in the deep hydrothermal
environment, as Thermococcales, Methanococcales and Archaeoglobales were also detected.
Combined use of molecular and cultural methods allows us to overcome the limitations inherent to each
techniques and yield to the description of the relations between the different microbial communities in their
environments.

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Approches moleculaires de la diversite microbienne de

deux environnements extremes : les sources

To cite this version:

HAL Id: tel-01115381

HAL is a multi-disciplinary open access Larchive ouverte pluridisciplinaire HAL, est

Au vu de la lgislation sur les droits d'auteur, ce travail de thse demeure la

prsente pour l'obtention

Approches molculaires de la diversit

Soutenue le Mercredi 2 Fvrier 2000 devant le jury compos de :

MM. P. CAUMETTE, Professeur, Universit de Pau Examinateur

- de prsenter une revue des techniques d'cologie microbienne classiques et molculaires

ISRT : In Situ Reverse Transcription

AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism LPS : Lipopolysaccharides

APS : Ammonium Persulfate LUCA : Last Unversal Common Ancestor

ARDRA : Amplified rDNA Restriction Analysis. MAR : Middle Atlantic Ride

ARN : Acide ribonuclique MPN : Most probable number

ARNm : ARN messag NPP : Nombre le plus probable

ARNr : ARN ribosomale p/v : (masse volume)

ATP : Adnosine tri-phosphate pb : paire de base

BrdU : bromodoxyuridine. PCB : PolyChlorinated Biphenyl

BSA : Bovine Serum Albumin PCR : Polymerase Chain Reaction

BSR: Bactries sulfato-rductrices PFLA : analyse des profils lipidiques

C : Cytosine PGFE : Pulsed-Field Gel Electrophoresis

C.F.B. : Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides RAPD : Randomly Amplified Polymorphic DNA

CDGE : Constant Denaturant Gel electrophoresis RDP : Ribosomal Database Project

CMF : Cytomtrie en flux RFLP : Restriction Length Fragment Polymorphism

comm. pers. : communication personelle RPM : Rotation par minute

CTAB : Hexadecyltrimethyl ammonium bromide RT-PCR : Reverse Transcriptase-PCR

CTC : 5-cyano-2,3-dotolyl tetrazolium chloride S : Svedberg

Da : Dalton SDS : Sodium dodecyl sulfate

DAPI: Acide diamino-pimlique SET (tampon) : Sucrose/EDTA/Tris

DMSO : Di methyl sulfoxyde T-RFLP : Terminal Restriction Length Fragment

I Notions d'cologie microbienne

Complexit de l'interaction croissante

Effet des facteurs abiotiques (environnement)

Figure1.1. Reprsentation schmatique des relations au sein d'un cosystme

Les interactions entre les composants de l'cosystme

La structure d'une communaut microbienne va donc tre soumise des fluctuations

II Les mthodes classiques d'cologie microbienne

2.1 Les cultures d'enrichissement et l'isolement

2.1.2 L'isolement et la taxinomie

d'erreurs. Le dveloppement de la taxinomie numrique3 et des approches polyphasiques dans les

2.2 Quantification et mesure d'activit microbienne

2.2.1.1 Les techniques culturales

2.2.1.2 Les techniques de comptage direct

Comptage par pifluorescence

Colorants des acides nucliques Ex/Em Proprits et usages

Longueur d'onde d'excitation et d'mission (nm/nm)

confocale, camra CCD), l'acclration de l'acquisition et du traitement des donnes (cartes

La cytomtrie en flux (CMF)

Signaux optiques Paramtre mesur

2.2.1.3 Les mesures de constituants cellulaires

L'adnosine-triphosphate peut tre utilise comme marqueur de biomasse active en cologie

Mesure de l'Azote et du Carbone cellulaires

Par spectromtrie de masse il est possible de dfinir la quantit de N et C prsents dans

Mesure des constituants de la paroi microbienne

2.2.1.4 L'analyse lipidique et les autres marqueurs molculaires

Tableau 1.6. Principaux marqueurs bactriens (d'aprs Guezennec, 1995)

2.2.2 Mesure d'activit microbienne

2.2.2.1 Incorporation des radio-isotopes

Ils permettent de suivre la dgradation, la production ou la transformation d'un compos, d'en

2.2.2.2 Mesure des ratios isotopiques

2.2.2.3 Mesures d'activits spcifiques