BAB 1.

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Enzim adalah biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai
katalis.Adanya enzim membuat reaksi kimia terjadi menjadi lebih cepat dari
normalya. Enzim dapat meningkatkan laju terjadinya reaksi dengan cara
menurunkan energi aktivasi.
Enzim di dalam tubuh manusia terdapat bermacam-macam yang membantu
kerja sel dan organ di dalam tubuh.Contoh yang mudah adalah enzim amylase
yang terdapat di dalam mulut.Enzim amylase merubah amilum menjadi
glukosa.Nasi yang banyak dikonsumsi oleh masyarakat mengandung banyak
amilum yang tidak dapat langsung diolah oleh tubuh.Adanya enzim ini dapat
merubah karbohidrat kompleks menjadi struktrur karbohidrat yang lebih
sederhana yaitu glukosa.
Akhir-akhir ini juga banyak sekali penelitian tentang enzim yang melibatkan
beberapa sektor, mulai dari sektor industry, pertanian, dan lain-lain.Penelitian ini
membuat adanya temuan baru tentang enzim yang dapat diisolasi melalui bakteri
karena dengan adanya enzim reaksi kimia yang kompleks dan rumit dapat
diamati. Percobaan ini akan mempelajari tentang isolasi dan produksi enzim.

1.2 Rumusan Masalah

Adapun rumusan masalah dalam percobaan ini adalah :
1. Bagaimana menentukan aktivitas enzim xilanolitik?
2. Berapa berat molekul enzim Endo--1,4-D-Xilanase ?
3. Berapa energi aktivasi enzim kasar (crude) ?
4. Berapa energi aktivasi enzim dengan fraksinasi bertingkat 40-50 ?
5. Berapa kadar protein yang dihasilkan oleh enzim ?

1.3 Tujuan
Adapun tujuan dalam percobaan ini adalah :
1. Menentukan aktivitas enzim xilanolitik.
2. Menentukan berat molekul relatif enzim Endo--1,4-D-Xilanase.
3. Menentukan energi aktivasi enzim kasar (crude).
4. Menentukan energi aktivasi enzim dengan fraksinasi bertingkat 40-50.
5. Menentukan kadar protein yang dihasilkan oleh enzim

1.4 Manfaat
Adapun manfaat yang akan didapatkan dalam percobaan ini adalah
1. Mahasiswa dapat menentukan aktivitas enzim xilanolitik.
2. Mahasiswa dapat menentukan berat molekul relatif enzim Endo--1,4-D-
Xilanase.
3. Mahasiswa dapat menentukan energi aktivasi enzim kasar (crude).
4. Mahasiswa dapat menentukan energi aktivasi dengan fraksinasi bertingkat
40-50.
5. Mahasiswa dapat menentukan kadar protein yang dihasilkan oleh enzim.
 BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian Enzim

Enzim merupakan unit fungsional dari metabolisme sel yang bekerja dengan
urutan yang teratur.Enzim mengkatalisis reaksi bertahap yang menguraikan
melekul nutrient, reaksi yang menyimpan dan mengubah energi kimiawi, dan
yang membuat makro molekul sel dari perkusor sederhana.Pemakaian enzim
memiliki banyak keunggulan seperti menghemat energi, mengurangi kebutuhan
bahan kimia (Thenawijaya, 1992).
Enzim adalah biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis
(senyawa yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi) dalam suatu
reaksi kimia organik. Molekul awal yang disebut substrat akan dipercepat
perubahannya menjadi molekul lain yang disebut produk. Jenis produk yang akan
dihasilkan bergantung pada suatu kondisi/zat, yang disebut promoter. Semua
proses biologis sel memerlukan enzim agar dapat berlangsung dengan cukup cepat
dalam suatu arah lintasan metabolisme yang ditentukan oleh hormon sebagai
promoter (Anonim, 2014).
Enzim umumnya merupakan protein globular dan ukurannya berkisar dari
hanya 62 asam amino pada monomer 4-oksalokrotonat tautomerase, sampai
dengan lebih dari 2.500 residu pada asam lemak sintase.Terdapat pula sejumlah
kecil katalis RNA, dengan yang paling umum merupakan ribosom.Jenis enzim ini
dirujuk sebagai RNAenzim ataupun ribozim.Aktivitas enzim ditentukan oleh
struktur tiga dimensinya (struktur kuaterner).Walaupun struktur enzim
menentukan fungsinya, prediksi aktivitas enzim baru yang hanya dilihat dari
strukturnya adalah hal yang sangat sulit (Anonim, 2014).

2.2 Enzim Xilanolitik

Xilan adalah komponen utama hemiselulosa yang memiliki tulang
punggung rantai D-xilopiranosa dengan ikatan glikosidik -1,4. Xilan memiliki
residu O-asetil, arabinosil dan 4-O-metil-D-asam glukoronat yang terikat pada
tulang punggungnya.Hidrolisa lengkap xilan menjadi monomernya memerlukan
kerja sinergi beberapa enzim xilanolitik (Subramaniyan dan Prema, 2002).
 Enzim xilanolitik merupakan enzim kompleks yang terdiri atas 1,4--
endoxilanase, -xilosidase, -L-arabinofuranosidase, -glukuronidase, asetil xilan
esterase dan asam fenolat (asam ferulat dan asam fumarat) esterase (Collins et al.,
2005). Xilanase mikroba memiliki aplikasi yang luas.Enzim ini dapat digunakan
untuk biobleaching pada industri kertas, penjernihan dan meningkatkan aroma jus
dan anggur, meningkatkan kualitas roti dan pakan ternak, pengolahan limbah serta
pengomposan (Meryandini et al., 2008).
Enzim xilanolitik dihasilkan oleh bakteri xilanolitik. Bakteri xilanolitik
mampu memproduksi enzim endo--1,4-xilanase, -xilosidase, -L-
arabinofuranosidose, -L-glukoronidase dan asetil xilan esterase. Hidrolisis total
xilan membutuhkan beberapa enzim yang berbeda yaitu : endo-1,4- -xilanase
yang menghidrolisis struktur dasar xilan secara acak menjadi xilooligosakarida;
1,4- -xilosidase yang memutus xilooligosakarida menjadi xilosa. Gugus samping
yang menyusun xilan akan dibebaskan oleh -L-arabinofurosidase, -L-
glukorosidase, galaktosidase dan asetil xilan esterase menjadi arabinosa,
glukuronat, galaktosa dan asetat (Subramaniyan dan Prema., 2002).

2.3 Enzim Xilanase

Xilanase merupakan enzim ekstraseluler yang mempunyai kemampuan

menghidrolisis xilan (hemiselulosa) menjadi xilo-oligosakarida dan xilosa. Enzim
ini terdiri dari endo--xilanase (EC 3. 2. 1. 8) dan-xylosidases (EC 3. 2. 1.37).
Xilanase dapat dihasilkan oleh mikroba melalui proses fermentasi. Enzim xilanase
diperlukan oleh beberapa industry antara lain industri pangan, pakan ternak,
pemutih bubur kertas/pulp, dan biokonversi lignoselulosa untuk bahan bakar
(Kimet al. 2000; Rifaat et al. 2005). Hal yang dilakukanuntuk mempercepat
proses pada umumnya industri menggunakan suhu tinggi. Salah satunya pada
industri kertas proses pembuatan bubur kertas dilakukan dengan pemanasan
(Sirait 2003), agar enzim xilanase dapat ditambahkan tanpa harus dilakukan
proses pendinginan maka diperlukan enzim xilanase termostabil.Hal ini
dikarenakan enzim termostabil mampu mempertahankan aktivitasnya pada suhu
tinggi.
 Xilanase adalah salah satu enzim yang memiliki prospek yang besar sebagai
enzim penghidrolisis hemiselulosa.Beberapa industri memerlukan xilanase yang
tahan pada suhu tinggi. Proses di industri memerlukan enzim yang aktif dan stabil
pada suhu tinggi, sehingga memudahkan pencampuran, substrat mudah larut,
mempercepat reaksi, dan mencegah kontaminasi. Salah satunya adalah mencari
enzim termostabil yang dihasilkan oleh mikroorganisme
termofilik.Mikroorganisme tersebut umumnya hidup di sumber air panas.Tujuan
dari eksperimen ini adalah untuk mengisolasi dan menyeleksi bakteri yang dapat
menghasilkan xilanase tinggi, serta menentukan kondisi produksi enzim. Seleksi
dilakukan dengan penapisan semikuantitatif menggunakan deteksi pada plat agar
mengandung substrat xilan dan penapisan kuantitatif dengan mengukur aktivitas
enzim. Kondisi optimal produksi enzim dipelajari dengan menentukan jenis dan
jumlah substrat, pH serta suhu
(Susilowati et al., 2002).
Xilanase dimurnikan dengan menggunakan kromatografi filtrasi gel dan
penukar ion. Matrik Sephadex G-100 dikembangkan dalam 10 mM bufer fosfat
pH 6,0. Matrik DEAE-Sephadex A50 dikembangkan dengan 10 mM Tris-HCl pH
8,0. Protein yang tidak terikat matrik dibilas dengan bufer yang sama, sedangkan
protein yang terikat matrik dibilas dengan gradien linier larutan NaCl (0-0,5 M
NaCl dalam bufer yang sama) dan 1 M NaCl. Pembilasan dilakukan dengan
kecepatan alir 0,5 ml/menit (Meryandini et al., 2008).
 BAB 3. METODOLOGI PERCOBAAN

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat
- Gelas ukur
- Alat sentrifugasi
- Tabung reaksi
- Beaker gelas
- Erlenmeyer
- Pipet volume
- Ball pipet
- Kantung dialisis
- Lempengan kaca sandwich
- Penangas air
- Set alat elektroforesis
- Power supply
- Spektrofotometer

3.1.2 Bahan
- 1 loop jarum ose bakteri positif xilanolitik
- MELB cair
- Enzim Endo--1,4-D-Xilanase
- Substrat oat-speltxylan 0,5%
- Buffer fosfat-sitrat
- Reagen DNS (Na-K tartrat, NaOH, DNS, C6H5OH, Na2SO3)
- Aquades
- D-xilosa
- Ammonium sulfat
- Buffer Tris-HCl 50 mM
- Reagen kerja Bradford (100 mg CBB G250, 100 mL H3PO4 85%, 50 mL
C6H5OH 95%, aquades 1000 mL)
- Larutan standar BSA
 - Enzim SDS-PAGE
- SDS 10%
- Gliserol
- -merkaptoetanol
- BPB 1%
- Glisin
- CH3OH
- CH3COOH

3.2 Alur Percobaan

3.2.1 Inokulasi/Produksi Bakteri Xilanolitik
Bakteri positif xinanolitik
- Diinokulasikan 1 loop bakteri ke dalam 5,0 mL medium
MELB cair yang disuplementasi xilan.
- Dikocok (dishaker) inkubasi selama 12 jam.
- Diambil sebanyak 1% dari volume medium produksi yang
akan dibuat.
- Diinokulasikan ke dalam medium MELB yang
displementasikan xilan (medium produksi).
- Dishaker inkubasi pada suhu 37oC selama 12 jam.
Hasil

3.2.2 Pemanenan Sel dan Isolasi Ekstrak Kasar Enzim Xilanolitik

Inokulum hasil inkubasi
- Disentrifuse pada kecepatan 1,0x104rpm selama 15 menit.
- Ditentukan aktivitas supernatan ekstrak enzim kasar
xilanolitik.

Hasil
3.2.3 Penentuan Aktivitas Enzim Xilanolitik (Enzim Endo--1,4-D-Xilanase)
Enzim Endo--1,4-D-Xilanase
- Diambil 100 l dan ditambahkan pada 100l suspensi
substrat oat-speltxylan 0,5% dalam buffer fosfat-sitrat
50mM (pH 5,0).
- Dibuat kontrol dengan mencampurkan 100 l enzim
inactive yang dipanaskan pada suhu 100oC selama 5
menit, 600 l reagen DNS dan 100 l suspensi substrat
oat-speltxylan.
- Diinkubasi hasil langkah 1 bersama kontrol selama 60
menit pada suhu 40oC.
- Ditambahkan 600 l reagen DNS (Na-K tartrat, NaOH,
DNS, C6H5OH, Na2SO3).
- Direinkubasi bersama dengan kontrol dalam air mendidih
selama 15 menit dan didinginkan secara langsung dalam
air es selama 20 menit.
- Ditentukan absorbansi warna yang dihasilkan
menggunakan spektrofotometer dengan panjang
gelombang 550 nm.
- Dibuat standar dengan menggunakan D-xilosa yang
diperlakukan sama dengan sampel dan kontrol.
- Diganti D-xilosa dengan aquades sebagai blanko.
Hasil
3.2.4 Purifikasi Parsial Enzim Endo--1,4-Xilanase
Endo--1,4-Xilanase
- Ditambahkan (NH4)2SO4 jenuh 0-100% dengan rentang
10% untuk proses fraksinasi ammonium sulfat.
- Dijenuhkan dalam keadaan dingin sambil diaduk perlahan.
- Disentrifugasi pada kecepatan 8x103rpm selama 15 menit
dengan suhu 4oC hingga diperoleh supernatan dan pellet-
pellet protein.
- Diresuspensi ke dalam buffer fosfat-sitrat 50mM (pH 7,5).
- Ditentukan aktivitas protein seperti prosedur 3.2.3 dan
kadar protein.
- Didialisis supernatan hasil langkah 5 yang aktivitas
spesifiknya tinggi selama 12 jam dalam buffer Tris-HCl
50mM (pH 7,5) menggunakan kantung dialisis pada suhu
4oC.
- Dilakukan penggantian buffer pada 2, 4, 6 jam setelah
dialisis dimulai.
- Ditentukan aktivitas dan kadar protein untuk enzim Endo-
-1,4-Xilanase hasil dialisis.

Hasil

3.2.5 Penentuan Kadar Protein Enzim Endo--1,4-Xilanase

Endo--1,4-Xilanase
- Diambil 20 l dan dicampur dengan buffer.
- Ditambahkan sebanyak 1000 l reagen kerja Bradford
(100 mg CBB G250, 100 ml H3PO4 85%, 50 ml C2H5OH
95%, aquades hingga 1000 ml) hingga volumenya 100 l.
- Diinkubasi selama 2-5 menit.
- Ditentukan absorbsivitas dengan spektrofotometer pada
panjang gelombang 595 nm dengan standar larutan BSA.
- Digunakan aquades sebagai blanko.
Hasil
3.2.6 Penentuan Berat Molekul Relatif Enzim Endo--1,4-Xilanase
Endo--1,4-Xilanase
- Diestimasi dengan elektroforesis protein SDS-PAGE
melalui metode Bollag.
- Ditentukan berat molekul relatifnya dengan
membandingkan pita migrasi protein dengan pita migrasi
marker.
- Ditentukan absorbsivitas dengan spektrofotometer pada
panjang gelombang 595 nm dengan standar larutan BSA.
Hasil

3.2.7 Tahapan Elektroforesis untuk Penentuan Berat Molekul Relatif Enzim

Endo--1,4-Xilanase
3.2.7.1 Preparasi Gel SDS-PAGE
Sampel
- Dilakukan pencucian untuk seluruh perangkat
elektroforesis.
- Dibersihkan lempengan kaca sandwich untuk pembuatan
gel dengan etanol dan dikeringkan.
- Dirangkai set alat elektroforesis sesuai petunjuk.
- Diisi lempengan kaca pencetak gel dengan aquades di atas
gel.
- Diinjeksikan formulasi gel ke dalam pencetak gel dan
segera dilakukan pemasangan sisir cetakan dan dilepas
apabila gel telah berpolimerisasi.
- Dibilas sumur yang terbentuk dengan aquades.
Hasil
3.2.7.2 Preparasi Sampel SDS-PAGE
Enzim
- Diambil 40 l yang telah ditambahkan bufer sampel (2 ml
SDS 10%, 5 ml gliserol 50%, 0,5 ml -merkaptoetanol, 1
ml BPB 1% dan 0,9 ml aquades dicampurkan ke dalam 0,6
ml Tris-HCl 1,0 M (pH 6,8)) sebagai campuran untuk SDS-
PAGE.
- Dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit untuk
mendenaturasi.

Hasil

3.2.7.3 Running SDS-PAGE

Protein
- Dirangkai set alat elektroforesis sesuai petunjuk.
- Diisi kompartemen dengan larutan buffer elektrode
(running buffer; 25 mM Tris, 250 mM glisin dan 0,1%
SDS/ stok 5x15,1 g Tris Base, 94 g glisin, 50 ml 10% SDS
ditambahkan aquades hingga volume 100 ml) hingga
memenuhi kompartemen atas dan bawah.
- Diinjeksikan sampel protein ke dalam masing-masing
sumur yang terbentuk pada gel.
- Ditutup kompartemen yang telah dibuat.
- Dihubungkan elektrode pada kompartemen atas dan bawah
pada power supply dengan voltase 40-100 V dan arus listrik
5,0 A.
- Dihentikan elektroforesis jika warna biru tracking dye
(BPB) telah mencapai sekitar 0,5 cm dari bagian bawah gel.

Hasil
3.2.7.4 Staining dan Destaining SDS-PAGE
Gel elektroforesis
-
- Diambil gel dari lempeng kaca pencetak gel dengan hati-
hati.
- Direndam dalam wadah berisi larutan pewarna (staining
solution; 1 g CBB R250, 450 ml CH3OH, 100 ml
CH3COOH, aquades hingga 100 ml).
- Digojok secara perlahan hingga larutan pewarna dapat
diikat oleh protein.
- Dicuci dengan larutan pelepas warna (destainingsolution;
100 ml CH3OH, 100 ml CH3COOH, aquades hingg 100 ml)
jika protein tidak terikat pada larutan pewarna hingga pita-
pita protein tampak jelas.
- Dilakukan penggoyangan untuk mempercepat pelepasan
larutan warna.

Hasil

3.3 Prosedur Kegiatan

3.3.1 Inokulasi/Produksi Bakteri Xilanolitik
Inokulasi 1 loop bakteri ke dalam 5,0 mL medium MELB cair yang
disuplementasi xilan. Kocok (shaker) inkubasi selama 12 jam. Ambil 1% dari
volume medium produksi yang akan dibuat. Inokulasikan ke dalam medium
MELB yang disuplementasikan xilan (medium produksi).Kocok (shaker) lagi
inkubasi pada suhu 37oC selama 12 jam.
3.3.2 Pemanenan Sel dan Isolasi Ekstrak Kasar Enzim Xilanolitik
Sentrifuse inokulum hasil inkubasi pada kecepatan 1,0x104rpm selama 15
menit.Tentukan aktivitas supernatan ekstrak enzim kasar xilanolitik.
3.3.3 Penentuan Aktivitas Enzim Xilanolitik (Enzim Endo--1,4-D-Xilanase)
Ambil 100 l enzim Endo--1,4-D-Xilanase dan tambahkan pada 100l
suspensi substrat oat-speltxylan 0,5% dalam buffer fosfat-sitrat 50mM (pH 5,0).
Buat kontrol dengan mencampurkan 100 l enzim inactive yang dipanaskan pada
suhu 100oC selama 5 menit, 600 l reagen DNS dan 100 l suspensi substrat oat-
speltxylan. Inkubasi hasil langkah 1 bersama kontrol selama 60 menit pada suhu
40oC.Tambahkan 600 l reagen DNS (Na-K tartrat, NaOH, DNS, C6H5OH,
Na2SO3).Reinkubasi bersama dengan kontrol dalam air mendidih selama 15 menit
dan dinginkan secara langsung dalam air es selama 20 menit.Tentukan absorbansi
warna yang dihasilkan menggunakan spektrofotometer dengan panjang
gelombang 550 nm. Buat standar menggunakan D-xilosa yang diperlakukan sama
dengan sampel dan kontrol. Ganti D-xilosa dengan aquades sebagai blanko.
3.3.4 Purifikasi Parsial Enzim Endo--1,4-Xilanase
Tambahkan (NH4)2SO4 jenuh 0-100% dengan rentang 10% untuk proses
fraksinasi ammonium sulfat dalam enzim Endo--1,4-Xilanase. Jenuhkan dalam
keadaan dingin sambil aduk perlahan. Sentrifugasi pada kecepatan 8x103rpm
selama 15 menit dengan suhu 4oC hingga diperoleh supernatan dan pellet-pellet
protein. Resuspensi ke dalam buffer fosfat-sitrat 50mM (pH 7,5). Tentukan
aktivitas protein seperti prosedur 3.2.3 dan kadar protein. Dialisis supernatan hasil
langkah 5 yang aktivitas spesifiknya tinggi selama 12 jam dalam buffer Tris-HCl
50mM (pH 7,5) menggunakan kantung dialisis pada suhu 4oC. Lakukan
penggantian buffer pada 2, 4, 6 jam setelah dialisis dimulai. Tentukan aktivitas
dan kadar protein untuk enzim Endo--1,4-Xilanase hasil dialisis.
3.3.5 Penentuan Kadar Protein Enzim Endo--1,4-Xilanase
Ambil 20 l enzim Endo--1,4-Xilanase dan campur dengan buffer.
Tambahkan sebanyak 1000 l reagen kerja Bradford (100 mg CBB G250, 100 ml
H3PO4 85%, 50 ml C2H5OH 95%, aquades hingga 1000 ml) hingga volumenya
100 l.Inkubasi selama 2-5 menit.Tentukan absorbsivitas dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm dengan standar larutan
BSA.Gunakan aquades sebagai blanko.
3.3.6 Penentuan Berat Molekul Relatif Enzim Endo--1,4-Xilanase
Estimasi berat molekul enzim Endo--1,4-Xilanase dengan elektroforesis
protein SDS-PAGE melalui metode Bollag. Tentukan berat molekul relatifnya
dengan membandingkan pita migrasi protein dengan pita migrasi
marker.Tentukan absorbsivitas dengan spektrofotometer pada panjang gelombang
595 nm dengan standar larutan BSA.

3.3.7 Tahapan Elektroforesis untuk Penentuan Berat Molekul Relatif Enzim

Endo--1,4-Xilanase
3.3.7.1 Preparasi Gel SDS-PAGE
Lakukan pencucian untuk seluruh perangkat elektroforesis.Bersihkan
lempengan kaca sandwich untuk pembuatan gel dengan etanol dan keringkan.
Rangkai set alat elektroforesis sesuai petunjuk. Isi lempengan kaca pencetak gel
dengan aquades di atas gel. Injeksikan formulasi gel ke dalam pencetak gel dan
segera lakukan pemasangan sisir cetakan dan lepas apabila gel telah
berpolimerisasi.Bilas sumur yang terbentuk dengan aquades.
3.3.7.2 Preparasi Sampel SDS-PAGE
Ambil 40 l enzim yang telah ditambahkan bufer sampel (2 ml SDS
10%, 5 ml gliserol 50%, 0,5 ml -merkaptoetanol, 1 ml BPB 1% dan 0,9 ml
aquades dicampurkan ke dalam 0,6 ml Tris-HCl 1,0 M (pH 6,8)) sebagai
campuran untuk SDS-PAGE. Panaskan dalam air mendidih selama 5 menit untuk
mendenaturasi.
3.3.7.3 Running SDS-PAGE
Rangkai set alat elektroforesis sesuai petunjuk. Isi kompartemen dengan
larutan buffer elektrode (running buffer; 25 mM Tris, 250 mM glisin dan 0,1%
SDS/ stok 5x15,1 g Tris Base, 94 g glisin, 50 ml 10% SDS ditambahkan aquades
hingga volume 100 ml) hingga memenuhi kompartemen atas dan bawah.
Injeksikan sampel protein ke dalam masing-masing sumur yang terbentuk pada
gel.Tutup kompartemen yang telah dibuat. Hubungkan elektrode pada
kompartemen atas dan bawah pada power supply dengan voltase 40-100 V dan
arus listrik 5,0 A. Hentikan elektroforesis jika warna biru tracking dye (BPB)
telah mencapai sekitar 0,5 cm dari bagian bawah gel.
3.3.7.4 Staining dan Destaining SDS-PAGE
Ambil gel dari lempeng kaca pencetak gel dengan hati-hati. Rendam
dalam wadah berisi larutan pewarna (staining solution; 1 g CBB R250, 450 ml
CH3OH, 100 ml CH3COOH, aquades hingga 100 ml). Gojok secara perlahan
hingga larutan pewarna dapat diikat oleh protein.Cuci dengan larutan pelepas
warna (destainingsolution; 100 ml CH3OH, 100 ml CH3COOH, aquades hingg
100 ml) jika protein tidak terikat pada larutan pewarna hingga pita-pita protein
tampak jelas.Lakukan penggoyangan untuk mempercepat pelepasan larutan
warna.
 BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
4.1.1 Penentuan Energi Aktivasi Enzim endo--1,4-D-xilanase
a. Sampel
Perlakuan
- Sampel 300L+ xylan 300 L (2
tabung eppendorf)
- Diinkubasi pada suhu 40C (30 menit)
- Ditambah 300 L reagen nelson
- Dipanaskan pada suhu 100C (10
menit)
- Ditambahkan arseno
- Diukur absorbansi (=540 nm)
Pengenceran : 400 L pada 3600 L
air
b. Kontrol
Perlakuan
- Sampel 300 L dimasukkan dalam
eppendorf dan dipanaskan
- Ditambah xylan 300 L
- Diinkubasi pada suhu 40C (30 menit)
- Ditambah 300 L reagen nelson
- Dipanaskan pada suhu 100C (10
menit)
- Ditambahkan arseno
- Diukur absorbansi (=540 nm)
Hasil
Sampel : berwarna kuning
Xylan : tidak berwarna
Berwarna kuning
Berwarna biru
Berwarna kuning kehijauan
Berwarna biru kehijauan
Absorbansi sampel 1 = 0,150
Absorbansi sampel 2 = 0,253
Hasil
Berwarna kuning pucat
Tidak berubah
Tidak berubah
Berwarna biru
Berwarna biru lebih pudar
Larutan berwarna biru tua
Absorbansi kontrol 1 = 0,292
Absorbansi kontrol 2 = 0,394
c. Pembuatan Kurva Standar Xilosa
Perlakuan Hasil
- Larutan xilosa (0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5) Berwarna biru
+ reagen nelson
- Dipanaskan dalam air 100C selama Berwarna kekuningan
10 menit
- Ditambah arsenomolybdat Berwarna biru pekat, meletup
- Diukur absorbansinya menggunakan A0,02 = 0,136
spektrofotometer UV A0,04 = 0,159
A0,06 = 0,168
A0,08 = 0,267
A0,10 = 0,394

Kurva Standar Xilosa

0.45
0.4
0.35
y = 3.12x + 0.0376
0.3
Absorbansi

R = 0.8492
0.25
0.2 Series1
0.15
Linear (Series1)
0.1
0.05
0
0 0.05 0.1 0.15
Konsentrasi

4.1.2 Fraksinasi Bertingkat 40-50

Absorbansi Uji bradford Kontrol Uji nelson
Sampel fraksinasi 40% 0,393 0,172 0,173
Sampel fraksinasi 40-50% 0,143 0,211 0,215
 Kurva Standar BSA
0.8
0.7
0.6 y = 15.74x + 0.2272
R = 0.9387
Absorbansi

0.5
0.4
Series1
0.3
Linear (Series1)
0.2
0.1
0
0 0.01 0.02 0.03 0.04
Konsentrasi

4.2 Pembahasan
Percobaan pertama yaitu unuk menentukan energi aktivasi enzim endo--
1,4-D-xilanase dengan mengenakan perlakuan yang berbeda antara sampel dan
kontrol. Sampel dan kontrol diletakkan pada tabung yang berbeda. Tabung
pertama berisi sampel 300L berwarna kuning dan ditambahkan xylan 100 L.
Tabung berisi sampel bertujuan untuk mengetahui xilosa enzim, substrat dan
aktifitas enzim xilanase. Tabung yang berisi sampel tersebut kemudian diinkubasi
selama 30 menit dengan suhu sekitar 40C. Proses inkubasi ini digunakan untuk
memberikan waktu kepada enzim untuk menurunkan energi aktivasi. Setelah 30
menit diinkubasi, larutan ditambahkan 300 L reagen nelson. Penentuan aktivitas
enzim dilakukan dengan mengukur konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan
dari aktivitas enzim menggunakan metode Nelson ini. Penambahan arseno
kemudian dilakukan, hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada larutan agar
dapat teranalisis ketika diukur menggunkan spektrofotometer UV. Hal tersebut
sesuai dengan salah satu syarat larutan dapat diukur menggunakan
spektrofotometer UV yaitu harus berwarna. Pengukuran absorbansi sampel
tersebut dilakukan pada panjang gelombang 540 nm. Nilai adsorbansi yang
dihasilkan oleh dua sampel adalah sebesar 0,160 dan 0,253.
Perlakuan pada tabung kedua yaitu membuat kontrol yang bertujuan untuk
mengetahui uji xilosa enzim dan xilosa substrat. Hal yang pertama dilakukan
adalah sampel sebanyak 300 L dipanaskan dalam eppendorf, dihasilkan warna
sampel berupa kuning pucat. Tujuan pemanasan ini adalah untuk menonaktifkan
enzim dalam sampel agar tidak dapat bekerja dengan substratnya. Selanjutnya
ditambahan dengan 300 L substrat xylan, dan dipanaskan pada suhu 40C selama
30 menit.Reagen nelson sebanyak 300 L ditambahkan ke dalam eppendorf yang
berisi sampel dan xylan. Penambahan ini membuat campuran yang mulanya
berwarna kuning pucat menjadi berwarna biru.Campuran kemudian dipanaskan
selama 10 menit dalam air panas dengan suhu 100C dan membuat campuran
menjadi biru yang memudar. Campuran tersebut kemudian ditambahkan reagen
arseno sebanyak 300 L dan campuran berubah menjadi biru tua.
Kontrol dibuat sebanyak 2 kali (dilakukan duplo). Selanjutnya, diukur
absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang
540 nm. Absorbansi yang dihasilkan adalah 0,292 dan 0,394. Hasil yang didapat
memberikan perbedaan yang signifikan pada masing-masing tabung yaitu dengan
melihat warna larutan dari tiap tabung. Perbedaan warna tersebut membuat
pengukuran absorbansinyanya berbeda pula. Pada tabung sampel warna
larutannya adalah kuning sedangkan tabung kontrol larutannya berwarna kuning
pucat. Perbedaan warna tersebut terjadi karena pengaruh dari penambahan enzim
xilanase pada saat telah dan belumdipanaskan sehingga mempengaruhi hasil
xilosa yang didapat pada masing-masing tabung. Penambahan enzim xilanase
pada tabung kontrol kemudiandipanaskan membuat aktivitas enzim xilanase tidak
melakukan reaksi-reaksinya, sedangkan pada tabung sampel sebelum inkubasi
sudah ditambahkan enzim xilanase diawal percobaan dan tidak dilakukan
pemanasan sehingga aktivitas enzim xilanase sudah terjadi dan telah melakukan
reaksi hidrolisis terhadap substrat (xilan).
Pemanasan pada kontrol dan sampel tanpa pemanasan dengan enzim
xilanase di dalamnya sangat mempengaruhi warna sampeldan membuat xilosa
yang dihasilkan juga berbeda yaitu dengan melihat warnanya yang kemudian
dapat diukur dengan spektrofotometer. Enzim xilanase dapat memproduksi 1
mol xilosa per 1 menit, sehingga tabung sampel xilosa yang didapat lebih
banyak dari pada pada tabung kontrol, hal ini disebabkan pada tabung sampel
tidak dilakukan pemanasan dan membuat enzim yang merupakan protein tidak
mengalami denaturasi dan tetap dapat melakukan aktifitasnya.
Pembuatan larutan sampel dan kontrol tersebut digunakan untuk
menentukan energi aktivasi enzim dengan membuat kurva standar xilosa.
Pembuatan kurva standar xilosa dengan membuat larutan xilosa pada konsentrasi
0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mg/mL. Masing-masing konsentrasi dari larutan xilosa
kemudian ditambah reagen nelson, selanjutnya larutan dipanaskan selama 10
menit pada suhu 100C.
Tahapan selanjutnya adalah purifikasi parsial enzim endo--1,4-xilanase.
Proses purifikasi ini melalui beberapa tahapan yaitu fraksinasi amonium sulfat,
dialisis yang selanjutnya diuji protein menggunakan metode bradford dan
penentuan berat molekul menggunakan elektroforesis SDS-PAGE. Tahapan
fraksinasi bertujuan untuk memekatkan enzim. Proses ini menggunakan ekstrak
kasar enzim endo--1,4-D-xilanase yang ditambahkan amonium
sulfat.Penambahan amonium sulfat ini dapat menarik molekul air yang pada
awalnya mensolvasi pada permukaan protein enzim sehingga residu hidrofob pada
permukaan protein terekspose dan menyebabkan protein mengendap. Hal tersebut
dapat terjadi karena adanya ikatan hidrogen antara protein dengan air. Semakin
banyak jumlah garam yang ditambahkan maka ikatan hidrogen antara protein
dengan air semakin kecil. Massa amonium sulfat yang ditambahkan ke dalam
sampel menggunakan perhitungan pada fraksinasi yang digunakan.
Fraksinasi yang digunakan oleh kelompok 6 adalah fraksinasi bertingkat 40-
50. Amonium sulfat yang ditambahkan merupakan 40% dari total sampel yakni 10
mL sehingga didapatkan jumlah amonium sulfat sebanyak 4 gram.Amonium
sulfat ditambahkan sedikit demi sedikit agar cepat larut dan mengurangi kesedian
air yang berinteraksi dengan protein. Pengadukan juga dilakukan dengan perlahan
untuk menghindari terbentuknya busa yang menandakan bahwa enzim
terdenaturasi. Perlakuan ini tetap dalam suhu rendah (4C) agar enzim endo--1,4-
xilanase tidak terdenaturasi. Amonium sulfat yang telah larut kemudian
disentrifugasi selama 15 menit. Proses ini tidak didapatkan pelet pada sampel
sehingga dilakukan sentrifugasi kembali selama 2 kali 15 menit.
 Larutan yang telah disentrifugasi selama 45 menit tersebut menghasilkan
volume 13 mL supernatan tanpa terbentuk pelet. Peningkatan volume sebanyak 3
mL dalam tabung tersebut disebabkan adanya pelarutan amonium sulfat dalam
surfaktan. Supernatan selanjutnya diambil volume sebanyak 10 mL untuk
ditambahkan amonium sulfat sebanyak 50% dari total volume supernatan yang
digunakan untuk dilakukan fraksinasi bertingkat. Penambahan amonium sulfat ini
dilakukan sedikit demi sedikit agar dapat larut dan mengurangi kesedian air yang
berinteraksi dengan protein. Namun, pelarutan pada fraksinasi ini cukup sulit,
dibutuhkan waktu yang lama agar amonium sulfat dapat larut. Amonium yang
sudah larut kemudian disentrifugasi selama 25 menit.
Supernatan yang sudah difraksinasi secara bertingkat (40-50) seharusnya
dilakukan dialisis. Proses dialisis ini untuk mengantisipasi adanya aktivitas
protease yang mungkin ada. Hal ini perlu dilakukan karena enzim protease
mampu merusak struktur enzim dan dapat menurunkan energi aktivasinya. Proses
ini dilakukan pada suhu 4C dengan memasukkan pelet yang dihasilkan pada
proses fraksinasi kemudian dimasukkan ke dalam kantung dialisis. Kantung
tersebut selanjutnya dimasukkan dalam larutan yang siap diaduk menggunakan
pengaduk magnetik atau stirer. Namun, proses ini tidak dilakukan karena kantung
dialisis yang tidak ada.
Reaksi antara enzim endo--1,4-xilanase dengan substratnya (xilan)
menghasilkan xilosa dan xilooligosakarida. Kemurnian enzim dapat dilakukan uji
menggunakan bradford dan uji nelson. Uji bradford dilakukan untuk menguji
kadar protein yang dihasilkan (xilosa) dan dilakukan uji menggunakan reagen
nelson simogyi untuk menentukan gula pereduksinya (xilooligosakarida).
Aktivitas enzimnya pada fraksinasi 40 dan fraksinasi bertingkat 40-50 diuji
keesokan harinya. Pengujian aktivitas enzim ini dilakukan dengan mengukur
absorbansi pada masing-masing fraksinasi dan didapatkan absorbansi pada
fraksinasi 40 adalah 0,173 dan 0,215 pada fraksinasi 50. Pengukuran aktivitas
enzim ini diperlukan kontrol sebagai pembanding sampel. Kontrol dibuat dengan
menambahkan enzim pada tabung eppendorf yang kemudian dipanaskan pada
suhu100C untuk menonaktifkan enzim. Enzim yang sudah dipanaskan ini
kemudian ditambahkan xylan sebagai substrat dan kemudian diinkubasi,
selanjutnya sampel ditambah dengan reagen nelson. Penambahan nelson ini
bertujuan untuk pengukuran gula pereduksi yang dihasilkan. Perlakuan
selanjutnya sampel dipanaskan dan ditambah dengan arseno sebanyak 300L
sampel teramati berwarna biru tua. Pengukuran dengan spektrofotometer dan
didapatkan hasil absorbansi sebesar 0,712. Pengukuran absorbansi juga dilakukan
setelah proses fraksinasi bertingkat 50, perlakuan untuk kontrol pada fraksinasi ini
sama dengan perlakuan kontrol pada fraksinasi bertingkat 40 dan dihasilkan nilai
absorbansi sebesar 0,211. Purifikasi enzimendo--1,4-xilanase ini diukur energi
aktivasinya menggunakan cara yang sama seperti pada sampel crude. Aktivitas
enzim yang didapatkan pada fraksinasi 40 adalah 2,701.10-5 unit/mL dan 2,91. 10-
5
unit/mL pada fraksinasi 50.
Uji yang dilakukan pada enzim adalah uji Bradford.Uji Bradford adalah
suatu uji untuk mengukur konsentrasi atau kadar protein total dengan metode
kolorimetri dalam suatu larutan. Prinsip pengukuran kadar protein menggunakan
metode Bradford adalah pengikatan pewarna Commassie Brilliant Blue G-250
yang terdapat dalam pereaksi Bradford dengan protein yang mengandung residu
asam amino dengan rantai samping aromatik (Tirosin, Triptofan dan Fenilalanin)
atau bersifat basa (Arginin, Histidin, dan Leusin) membentuk komplek berwarna
biru yang dapat diukur absorbansinya dengan spektrofotometri (LambertBeer)
pada panjang gelombang 465-595 nm (cahaya tampak).

NaO 2S
N NH
N
SO 2Na
OH

NaO 2S

Gambar 4.1.StrukturCommassie Brilliant Blue(Anam, 2010).

Langkah pertama yang dilakukan dalam pengujian bradford ini yaitu

sampel diambil sebanyak 7 L kemudian ditambahkan dengan 25 L larutan
buffer. Selanjutnya penambahan reagen bradford dilakukan sebanyak 1 mL,
penambahan ini membuat perubahan warna pada sampel yang terdapat pada
eppendorf, yaitu sampel menjadi berwarna biru tua. Perubahan warna ini
didasarkan pada pergeseran absorbansi pewarna Commassie Brilliant Blue G-250
yang dalam kondisi asam bentuk merah pewarna diubah menjadi bentuk yang
lebih biru untuk mengikat protein yang sedang diuji. Kompleks warna biru pada
larutan yang diberi reagen Bradford terjadi sangat cepat terbentuk dan bersifat
stabil. Kestabilan warna biru Commassie Brilliant Blue G-250 ini karena adanya
interaksi antara lapisan hidrofobik dari protein dengan bentuk anion dari zat warna
Coomassie BrilliantBlue G-250 yang menstabilkan bentuk anion tersebut,
sehingga jumlah saat ini yang kompleks dalam larutan adalah ukuran untuk
konsentrasi protein, dan dapat diperkirakan dengan menggunakan pembacaan
absorbansi.
Proses selanjutnya yaitu dilakukannya proses inkubasi selama 2-5 menit,
proses ini merupakan tahap dimana enzim akan melakukan aktivitasnya, dengan
kata lain hal ini merupakan pemberian waktu unutk enzim dalam melakukan
aktivitas. Langkah berikutnya yaitu pengukuran absorbansi yang dilakukan
dengan menggunakan alat spektrofotometer UV Vis, yaitu alat yang digunakan
untuk analisis kuantitatif farmasi yang memiliki prinsip radiasi pada rentang
panjang gelombang 200-700 nm yang dilewatkan melalui suatu larutan senyawa.
Elektron-elektron pada ikatan di dalam molekul menjadi tereksitasi sehingga
menempati keadaan kuantum yang lebih tinggi dan dalam proses penyerapan
sejumlah energi yang melewati larutan tersebut. Pengukuran dengan
spektrofotometer dapat dilakukan karena larutan menghasilkan warna berupa biru
tua sehingga dapat dideteksi oleh alat tersebut pada panjang gelombang 595 nm.
Hasil absorbansi yang didapatkan pada sampel 1 dan 2 adalah 0,686 dan 0,653.
Penentuan kadar protein xilanase dapat dilakukan dengan menggunakan
kurva standar bovine serum albumin (BSA). Pembuatan bovine serum albumin
(BSA) dilakukan dengan membuat variasi konsentrasi BSA di dalam 50 mM
larutan dapar Tris-HCl pH 9. Setiap variasi konsentrasi standar BSA diambil
sebanyak 50 L kemudian dicampurkan dengan 2,5 mL larutan bradford dalam
tabung reaksi. Larutan yang telah divampur kemudian dihomogenkan dengan
vorteks, kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar. Kurva standar
BSA adalah grafik hubungan konsentrasi protein standar (BSA dengan variasi
konsentrasi) dengan nilai absorbansi pada panjang gelombang 595 nm. Persamaan
garis dapat diperoleh dari hasil plot konsentrasi 0,01; 0,015; 0,02; 0,025; 0,03
terhadap nilai absorbansi dari masing-masing konsentrasi tersebut yaitu 0,345;
0,497; 0,571; 0,620; 0,677 yaitu y =15,74x + 0,2272 dengan nilai regresi sebesar
0,9387. Penentuan kadar protein dapat diperoleh dengan memasukkan nilai
absorbansi dari sampel kedalam persaman garis, sehingga menghasilkan
konsentrasi sampel 1 dan 2 yang telah dirata-rata absorbansinya yaitu 0,028
mg/mL.
Keuntungan dari metode ini adalah pereaksi yang digunakan sangat
sederhana dan mudah disiapkan, nilai akurasi dan presisi data yang didapatkan
cukup tinggi serta untuk menjamin keakuratan data sampel yang berada di luar
jangkauan dapat dilakukan uji ulang yang hanya membutuhkan beberapa menit
saja. Hal itu membuat keefektifan kerja sangat cepat (Septiningrum dan Moeis,
2008).
Perlakuan berikutnya yaitu melakukan uji nelson.Perlakuan ini bertujuan
untuk menentukan aktivitas enzim yang dapat dilakukan dengan mengukur gula
pereduksi dari sampel.gula pereduksi yang dihasilkan pada reaksi antara enzim
endo--1,4-D-xilanase dengan substrat xilan menghasilkan gula pereduksi
xilooligosakarida. Sampel yang telah difraksinasi bertingkat 40%-50% diukur
absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV dan dihasilkan absorbansi pada
fraksinasi 40% adalah 0,17 sedangkan absorbansi pada fraksinasi bertingkat 50%
adalah 0,215. Hasil tersebut menunjukkan bahwa semakin besar gula pereduksi
yang dihasilkan maka absorbansi yang dihasilkan juga semakin besar pula dengan
kata lain gula pereduksi yang dihasilkan menggunakan fraksinasi bertingkat 50%
lebih banyak dibandingkan pada fraksinasi 40%.
Uji kemurnian selanjutnya adalah penentuan berat molekul enzim endo--
1,4-D-xilanase dengan elektroforesis protein SDS-PAGE. Uji kemurnian
bergantung terhadap aktifitas enzim xilanase yang optimum.Penentuan berat
molekul enzim dilakukan dengan langkah-langkah berikut yaitu, enzim
ditambahkan larutan buffer sampel sebagai campuran SDS-PAGE, lalu
dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit untuk mendenaturasi enzim.
Sampel tersebut lalu diletakkan pada sumur-sumur pada sisir yang terdapat pada
lapisan gel atas, kemudian dirunning selama 5 jam (kira-kira 0,5 cm dari gel
terbawah).
Proses yang dilakukan setelah running adalah staining dan destaining.
Proses staining ini adalah proses pewarnaan pada protein pada enzim agar garis
pada gel yang dihasilkan pada proses staining dapat teramati. Proses
destainingadalah pencucian warna yang telah dilakukan sehingga akan nampak
bedanya antara garis yang menunjukkan berat molekul enzim dengan gelnya.
Namun, hasil yang diperoleh menunjukkan tidak adanya garis pada gel-gel dalam
sumur tersebut. Hal tersebut diakibatkan karena proses staining atau pewarnaan
yang berlebih sehingga mengakibatkan pencucian (destaining) tidak dapat
dilakukan secara optimal.
 BAB 5. PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Adapun kesimpulan pada percobaan isolasi enzim adalah
1. Penentuan aktivitas enzim dapat dilakukan menggunakan crude dengan uji
bradford menggunakan sampel dan xilosa terhadap kontrol.
2. Berat molekul enzim Endo--1,4-D-Xilanase tidak menunjukkan hasil
yang seharusnya.
3. Kemampuan suatu senzim endo--1,4-D-xilanase menghasilkan 1,12.10-3
unit/mL xilosa pada suhu 40C dengan suhu 30 menit
4. Energi aktivasi enzim pada fraksinasi 40% adalah 2,701. 10-5 unit/mL dan
fraksinasi bertingkat 40-50% adalah 2,91. 10-5 unit/mL.
5. Konsentrasi protein yang dihasilkan pada penentuan kadar protein enzim
adalah 0,028 mg/mL.

5.2 Saran
Saran yang dapat diberikan pada percobaan ini adalah praktikan dapat
melakukan kegitan praktikum secara lengkap agar tahu dan paham proses yang
seharusnya. Selain itu, pemberian warna pada proses staining seharusnya
diberikan dalam jumlah yang tidak terlalu banyak.
 DAFTAR PUSTAKA

Anam, Khoirul. 2010. Bioteknologi. Bandung : Institut Teknologi Bandung.

Anonim. 2014. Kloning Dan Overekspresi Gen Beta-Endoxylanase Asal Bakteri
Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah Dan Produksi Xilooligosakarida
sebagai Produsen Prebiotik. [Serial Online].http://repository.unej.ac.id/
bitstream/handle/123456789/1042/hbAnak%20Agung%20Istri%20Ratnade
wi. pdf?sequence=1. [diakses 12 November 2014].
Collins, Gerday, dan Feller. Fems Microbiol. Rev. (2005) 29:3-23
Kim, J., Kim, S.C & Nam, S.W. 2000.Constitutive overexpression of the
endoxylanase gene in Bacillussubtilis. J Microbiol Biotechnol 10: 551-553.
Meryandini, Widhyastuti, dan Lestari. 2008. Pemurnian Dan Karakterisasi
Xilanase Streptomyces Sp. Skk1-8.Jurnal Natur Indonesia 14(3), Juni 2012:
199-204. ISSN 1410-9379.
Rifaat, H.M., Nagieb, Z.A & Ahmed, Y.M. 2005.Productionof xylanases by
Streptomyces species and theirbleaching effect on rice straw pulp. App Ecol
env Res4(1): 151-160.
Septiningrum, Krisna Dan Moeis, Maelita. 2008. Isolasi Dan Karakterisasi
Xilanase dari Bacillus Circulans. Bandung : ITB.
Sirait, S. 2003. BleachingToba Samosir. Sumatera Utara : PT. Toba PulpLestari,
Training and Development Centre.
Subramaniyan, dan Prema.2002. BiotechnolCritical Rev. 22(1):33-46.
Susilowati, Raharjo, Kurniawati,Rahim, Sumarlin, dan Ardiansyah. 2002.
Produksi Xilanase Dari Isolat Sumber Air Panas Sonai, Sulawesi Tenggara
Menggunakan Limbah Pertanian. Sulawesi Tenggara :Universitas Haluoleo.
Thenawijaya, Maggy. 1992. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta : Erlangga.
Tim Penyusun. 2014. Penuntun Praktikum Biokimia. Jember : Universitas Jember.
Lampiran

1. Menghitung Energi Aktivasi

a. Crude
Konsentrasi Absorbansi
0,02 0,136
0,04 0,159
0,06 0,168
0,08 0,267
0,1 0,394

Kurva Standar Xilosa

0.45
0.4
0.35
y = 3,12x + 0,037
Absorbansi

0.3
R = 0,8492
0.25
0.2 Series1
0.15
Linear (Series1)
0.1
0.05
0
0 0.05 0.1 0.15
Konsentrasi (mg/mL)

y = 3,12x + 0,037
R2 = 0,849
Absorbansi sampel 1 = 0,160
Absorbansi sampel 1 = 0,253
0,160+0,253
Absorbansi rata-rata = = 0,2065
2

Absorbansi kontrol = 0,343

0,1385+0,037 4000
9
3,12 400
U/ml = = = 1,12. 10-3unit/mL
150,3 30

2. Fraksinasi Bertingkat 40-50%

a. Fraksinasi 40%
Absorbansi kontrol = 0,172
Absorbansi sampel = 0,173

0,001+0,037 4000
1
3,12 400
U/ml = = = 2,701. 10-5unit/mL
150,3 30

b. Fraksinasi bertingkat 50%

Absorbansi sampel = 0,215
Absorbansi kontrol = 0,211

0,004+0,037 4000
1
3,12 400
U/ml = = = 2,91. 10-5unit/mL
150,3 30

3. Menghitung Kadar Protein

Konsentrasi Absorbansi
0,01 0,345
0,015 0,497
0,02 0,571
0,025 0,62
0,03 0,677

Kurva Standar BSA

0.8
0.7
0.6 y = 15.74x + 0.2272
R = 0.9387
Absorbansi

0.5
0.4
Series1
0.3
Linear (Series1)
0.2
0.1
0
0 0.01 0.02 0.03 0.04
Konsentrasi (mg/mL)
Absorbansi sampel 1 = 0,686
Absorbansi sampel 2 = 0,653
0,686+0,653
Absorbansi rata-rata = = 0,670
2

y = 15,74x + 0,2272
R = 0,9387
Konsentrasi protein yang didapatkan adalah
y = 15,74x + 0,2272
0,670 = 15,74x + 0,2272
0,443 = 15,74x
0,443
x= = 0,028 mg/mL
15,74