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AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y CARACTERIZACION DE CEPAS AZOTOBACTER spp.

OBTENIDAS DE RIZOFERA DE STEVIA Y MAIZ.

PRINCIPIOS DE QUIMICA SUSTENTABLE:

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OBJETIVOS.

1. Aislar y seleccionar cepas de Azotobacter spp. provenientes de la rizosfera de la

Stevia en un medio Ashby.
2. Caracterización bioquímica y fisiológica de la Azotobacter spp.

FUNDAMENTO TEÓRICO

El azotobacter es el género que ha demostrado tener el rendimiento de adsorción más

alto ( 72.64%) a nivel de rizosfera comparado con microorganismos como Azospirillum
brasilense y Rhizobium analizados anteriormente en bibliografía que fijan nitrógeno en
aproximadamente 20mg de N/g de azúcar en un cultivo de Stevia en medio libre de
nitrógeno siente una gran fuente para obtener un biofertilizante químico nitrogenado,
tienen mayor velocidad de crecimiento que otras cepas aisladas de cultivos diferentes
ofreciendo una mayor productividad.

El azotobacter es capaz de generar ácidos como el indolacetico y citoquinas capaces de

acelerar y potenciar el crecimiento de las plantas; promueve la formación de sideroforos,
sustancias antifúngicas y generan enzimas que favorecen a la solubilizacion de fosfatos y
oligo elementos facilitando la asimilación de estos compuestos.

El uso de fertilizantes químicos constituye un daño biológico a laso suelos deteriorando la

calidad de los mismos: inducen el aumento de acidez y salinidad eliminando el humus y los
tejidos suavizados de la planta provocando que esta sea menos resistente y saludable,
eliminan el ecosistema natural de suela desarrollando plantas más vulnerables.(3)
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La tierra se hace dependiente a los químicos incrementando los daños al suelo y los
costos de fertilización

MATERIALES Y METODOS

Materias primas: Rizosfera de plantaciones de Stevia, Maíz

Reactivos de laboratorio: Agar Ashby (g /l): Manitol 1.5g; fosfato di potásico 0.02g; sulfato
de magnesio 0.02g ; Cloruro de Sodio 0.02g ; Sulfato de Calcio 0.01g; Carbonato de Calcio
0.5g; Benzoato de sodio 1g; Sacarosa 5g ; Agar Agar 1.6g, Alcohol 70, Hipoclorito de sodio,
cristal violeta, safranina, lugol, alcohol acetona, aceite inmersión, peróxido de hidrogeno,
Medio TSI, Reactivo de Kovacs, Reactivo de Oxidasa, Agua destilada estéril.

Material de laboratorio: Placas petri, Matraz, Tubos de ensayo, Probeta, Mechero,

Parafilm, Papel aluminio, portaobjetos, cubreobjetos, beaker, tubos de ensayo, asas de
siembra.

Instrumentos y equipos: Cocina, Bolsa de plástico , potenciómetro,Incubadora, Balanza

analítica, Cedazo domestico 1mm de luz, Autoclave.

Métodos

MUESTREO DEL SUELO:

Muestreo de cultivo de Stevia:

Se tomó una muestra de rizosfera de Stevia de 300 g aproximadamente a una

profundidad de 10 a 15 cm eligiendo el cultivo que muestre mejores características
fisiológicas y de maduración.

La muestra se empaca en bolsas de plástico y posteriormente se transportan al

laboratorio.

Muestreo de cultivo de Maíz:

Se tomaron 2 muestras de rizosfera de maíz de aproximadamente 300 g cada una, se

escogió el cultivo aleatoriamente tomando en cuenta características fisiológicas y de
maduración más apropiadas.
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PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

Una vez en el laboratorio, las muestras de suelo se pasaron por un cedazo domestico de
1mm de luz aproximadamente, con el fin de obtener gránulos uniformes, para realizar el
aislamiento.

MEDICIÓN DE PH DE LAS MUESTRAS DEL SUELO

La medición de pH se realiza de a cuerdo a la referencia (2) .Se calibra el potenciómetro con

buffer de pH 7. La medición de pH se realiza para cada muestra, stevia y maíz, se coloca en un
beaker 1 gramo de suelo tamizado de cada muestra diluida en 10 mililitros de agua destilada
estéril, en una proporción de una 1:10. La suspensión se deja precipitar durante 2 minutos y se
toma el valor del pH del sobrenadante.

AISLAMIENTO

Método de los gránulos

A partir de cada muestra de suelo obtenido de los diferentes cultivos, se realiza el

aislamiento, empleando la técnica de gránulos de suelo, que consiste en colocar pequeños
gránulos en placas de agar Ashby- Sacarosa (medio específico para Azotobacter spp.) a
una distancia aproximada de 0.5 cm. Las placas se incuban a 28°C por 7 días hasta
observar alrededor de los gránulos colonias translúcidas y mucilaginosas (3).

Método de dilución:

A partir de cada muestra de suelo obtenido de los diferentes cultivos, se pesa 1g de tierra
y se diluye en 9 ml de agua destilada estéril (1:10 p/v) en un matraz estéril , se
homogeniza y se siembra por el método de estría en placas con Agar Ashby Sacarosa. .
Las placas se incuban a 28°C por 7 días.(2)

CARACTERIZACION Y PRUEBAS BIOQUIMICAS:

1. CARACTERIZACIÓN

Se identifican las colonias crecidas en el medio de cultivo de acuerdo al color forma y

tamaño de las mismas. Luego se procede a hacer una coloración gram para su
identificación al microscopio.
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2. PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Para asegurar la presencia de azotobacter sp. Se procede a realizar las siguientes pruebas
bioquímicas. Fermentación de Glucosa, maltosa, manitol, prueba de la catalasa, oxidasa,
indol .(1).

FLUJOGRAMA DE ACTIVIDADES:

REFERENCIAS:

(1)HOLT, 2000; TEJERA et al.,2005

(2) Guia de Practicas Biotecnologia Vegetal UCSM 2009

(3) Andrade MJ, Correa C., Cueva P, Jacome R, Simbia S, Tufino C, 2009- Universidad Central de
Ecuador: Produccion de un Biofertilizante a partir a partir de cepas de Azotobacter aisladas de
plantaciones de Stevia. (http://www.scribd.com/doc/24636741/Produccion-de-un-
Biofertilizante-a-partir-de-cepas-Azotobacter-spp-Aisladas-de-plantaciones-de-Stevia-
Rebaudiana2)[20/08/2010]
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ANEXOS:

PRUEBA Azotobacter *

Tinción de
-
Gram

Catalasa +

Oxidasa -

Indol -

Ureasa -

Glucosa +

Manitol +

Maltosa -