Metode selanjutnya yaitu kromatografi kolom.

Pada proses pemisahan ini campuran yang

akan dipisah diletakkan pada bagian atas kolom adsorben yang berada dalam suatu tabung
seperti gelas logam ataupun plastik. Pelarut sebagai fase gerak karena gaya berat atau didorong
dengan tekanan tertentu dibiarkan mengalir melalui kolom membawa serta pita linarut yang
bergerak dengan kecepatan berbeda. Linarut yang telah memisah dikumpulkan berupa fraksi
yang keluar dari bagian bawah kolom, sehingga metode ini merupakan kromatografi elusi
(Kusmardiyani, 1992).
Pada pembuatan kromatografi kolom terdapat dua cara, yaitu cara basah dan cara kering.
Dalam praktikum ini, cara yang digunakan yaitu cara basah. Fase gerak atau eluen yang
digunakan adalah campuran antara N-heksana: kloroform: etanol 96% (45:45:10) yang dibuat 50
mL. Fase gerak tersebut merupakan pelarut organik yang bersifat nonpolar. Sementara fase diam
atau adsorben yang digunakan adalah serbuk silika gel yang bersifat polar. Pembuatan kolom
dengan menggunakan cara basah, mula-mula kolom dipasang pada statif agar berdiri tegak lurus.
Pada dasar bagian kolom diisi dengan anyaman glass wool agar dapat menahan silika gel yang
akan dimasukkan ke dalam kolom. Silika gel ditara setinggi 15 cm didalam kolom, kemudian
dituangkan kembali kedalam beaker glass dan ditimbang untuk mengetahui banyaknya silika gel
yang digunakan. Pada praktikum kali ini silika gel yang digunakan adalah 5,6268 gram. Silika
gel yang telah ditimbang dimasukkan ke dalam gelas beker dan ditambahkan fase gerak sedikit
demi sedikit secara melingkar melalui dinding beaker glass dengan pipet, kemudian diaduk
sampai terbentuk bubur silika. Setelah itu bubur silika dimasukkan ke dalam kolom
menggunakan pipet dan dialirkan turun melalui dinding kolom agar tidak terbentuk rongga udara
yang dapat merusak kolom. Bubur silika yang menempel didinding juga harus segera dibilas
dengan fase gerak untuk mencegah mengerasnya silika gel pada dinding kolom. Saat pengisian
bubur silika ke dalam kolom, keran ditutup sehingga udara tidak dapat masuk melalui keran yang
dapatr menyebabkan kolom pecah. Bubur silika dimasukkan semua ke dalam kolom hingga
setinggi 15 cm. Kemudian bagian atas kolom serta bagian bawah kolom (pada keran) ditutup
dengan plastik ikan dan aluminium foil, agar fase gerak tidak menguap. Kemudian kolom
didiamkan selama 1 hari sebelum digunakan. Kolom didiamkan berfungsi untuk mendapatkan
kolom yang homogen dan kompak agar hasil pemisahan yang diperoleh lebih baik.
Setelah didiamkan selama 1 hari, tahap berikutnya adalah pengisian cuplikan atau sampel
ke dalam kolom. Ekstrak kental dilarutkan terlebih dahulu dalam fase gerak, setelah itu
dimasukkan sedikit demi sedikit melalui dinding agar kolom tidak rusak. Setelah itu, keran
kolom dibuka untuk mengeluarkan fase gerak sambil menambahkan eluen (N-heksana :
kloroform : etanol 96% = 45 :45 :10) sedikit demi sedikit dan diusahakan agar eluen tetap berada
diatas silika agar silika tidak kering. Setelah sample dimasukkan kedalam kolom maka akan
terjadi pemisahan berdasarkan adsorbsi dari adsorben serta afinitas analit dengan kedua fase
(fase gerak dan fase diam), ekstrak berwarna kuning merupakan ekstrak yang paling pertama
turun dan berada diatas glass wool, segera diambil tetesan fraksi pertama sebanyak 5mL dengan
menggunakan botol vial sebagai wadah yang telah ditera 5 mL. Langkah tersebut dilakukan
sampai mendapat 10 fraksi dan kolom tetap dijaga agar tidak kering dengan menambahkan eluen
sampai sample habis. Setiap fraksi masing-masing diberikan label agar tidak tertukar. Fraksi-
fraksi dalam botol vial dibungkus dengan plastik ikan dan aluminium foil agar tidak
terkontaminasi dari udara luar dan tidak terurai akibat kontak dengan cahaya. Diperoleh lima
fraksi yang menghasilkan warna yang berbeda-beda, yaitu fraksi 1 berwarna kuning, fraksi 2
berwarna kuning pekat, fraksi 3 berwarna jingga muda, fraksi 4 berwarna jingga, dan fraksi 5
berwarna jingga jernih.

Daftar Pustaka
Kusmardiyani, Siti dan Nawawi As'ari. 1992. Kimia Bahan Alam. Yogyakarta: Pusat antar
Universitas Bidang Ilmu Hayati