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Desarrollo de OGMs:

Biotecnologa moderna y
nuevas aplicaciones

Dra. Laura Esther Tovar Castillo.


Directora Tcnica de Informacin y Fomento a la Investigacin.
Secretara Ejecutiva CIBIOGEM.
CONACYT
Organismo Genticamente Modificado:
Cualquier organismo vivo que ha adquirido una
combinacin gentica novedosa, generada a
travs del uso especfico de tcnicas de la
biotecnologa moderna.

Cultivos GM

(LBOGMs Artculo 3, fraccin XXI)


BIOTECNOLOGA

Segn el Convenio sobre Diversidad Biolgica:

Biotecnologa puede definirse como "toda aplicacin tecnolgica que


utilice sistemas biolgicos y organismos vivos o sus derivados para la
creacin o modificacin de productos o procesos para usos especficos".
Biotecnologa Ambiental
Industria Alimentaria
Agrobiotecnologa
Medicina y Farmacutica
Biofertilizantes Ingeniera Gentica
Biocombustibles

Tratamiento de aguas y biorremediacin


Mejora de cultivos y seleccin de
nuevas variedades.
Aplicaciones Diagnsticas
Aprovechando el conocimiento
en Biologa Molecular.
(CBD, 1992)
Desarrollo de la Biotecnologa Moderna

1950 1960 1970 1980 1990 2000 2010

1994
1982 Jitomate FlavrSavr
Aprobado por FDA
Vacunas Recombinantes
1995 Papa contra plagas
1953 (Aprobacin EPA)
Estructura del ADN 1980 Ratones GM
Watson-Crick
Wilkinson-Franklin
1985
Cerdos GM
1972 1996 Algodn y Soya
(Aprobacin USDA y FDA)
ADN Recombinante
Boyer-Cohen
1985-86 Tabaco GM
Primer vegetal transgnico

1999 Arroz vitaminado

1961
Mejoramiento gentico 1988
Maz resistente a plagas
Norman Borlaug
[Premio Nobel 1970] 1978
Interaccin Agrobacterium-Planta
1976-77 Schell-Van Montagu 2003
Secuencia ADN GlowFish
Sanger/Maxam-Gilbert 2002
Salmn de rpido crecimiento
BIOTECNOLOGA MODERNA

Por biotecnologa moderna se entiende la


aplicacin de:
a.Tcnicas in vitro de cido nuclico, incluidos el
cido desoxirribonucleico (ADN) recombinante y la
inyeccin directa de cido nuclico en clulas u orgnulos,
o
b.La fusin de clulas ms all de la familia
taxonmica,
que superan las barreras fisiolgicas naturales
de reproduccin o de la recombinacin y que
no son tcnicas utilizadas en la reproduccin y
la seleccin tradicional.

(Protocolo Cartagena, 2000; LBOGMs 3, VI)


Clasificacin
Comparacin
Ciencias Genmicas Diagnstico
e Informacin Certificacin
Biolgica
Provisin de Alimentos Desarrollo de nueva industria
Productos y/o materias soportada en tecnologa
primas para la industria biolgica ms limpia

Respeto y
Biotecnologa
Sustentabilidad del
Agroecolgica en el
Medio Ambiente y
campo mexicano
la Biodiversidad

Acceso y Nuevos Bioprocesos y


Metagenmica, Innovacin otras aplicaciones con
Caracterizacin, Biocatlisis
potenciamiento de
Tecnolgica potencial tecnolgico
e Ingeniera Celular la biodiversidad
nacional

Adaptacin. Academia Mexicana de Ciencias (2010) http://www.amc.unam.mx/biotecnologia/comite/tendencias.htm


El hombre ha
seleccionado y
modificado a las plantas.
Ms de 10,000 aos.
Fomento del avance de
la Ciencia y Tecnologa.
La influencia de la domesticacin

Reconoces esta raz?

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La influencia de la domesticacin

A travs de la seleccin
artificial:
favoreciendo la sobrevivencia
y reproduccin de individuos
de una especie con rasgos o
atributos de inters, durante
muchos aos, se han
domesticado numerosas
plantas y animales.

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Muchas de las variedades agrcolas comestibles ms comunes
se generaron inicialmente a travs de procesos de seleccin
humana favoreciendo las caractersticas deseables:
Variedades Agrcolas
Algunos resultados de aos del trabajo de la humanidad...
Seleccin artificial Ingeniera Gentica

La cruza del mejor con Reduce costos e


el mejor esperando lo incrementa
mejor rendimientos
La mutagnesis inducida se utiliza
desde mediados del siglo XX.

Sustancias qumicas o radiaciones.


Cambios al AZAR.
Diversas mejoras.
Aprox. 3088 nuevas variedades
vegetales, 70% rea de cultivo. W. Murcott mandarin (left) and Tango (right).
Photo credit: T. Williams, UC Riverside.

Cambios semejantes a los que ocurren


naturalmente de manera espontnea.

No son considerados
Organismos Genticamente Modificados (OGMs)
Mutaciones
Nucleasas Sitio Dirigidas (SDN)
Mutagnesis Dirigida por Oligonucletidos (ODM)

Producen alteraciones
en la secuencia de
nucletidos de un gen.
Prdidas
Inserciones
Sustituciones
La edicin de genomas de
refiere a un tipo de
ingeniera gentica en el
que manipulan
directamente secuencias en
el genoma.
A diferencia de las tcnicas
previas, esta manipulacin
se dirige a sitios
especficos.
1. Endonucleasas Sitio Dirigidas (SDN) y Tecnologa de
Dedos de Zinc
2. Oligonucleotide Directed Mutagenesis (ODM)
3. Cisgenesis/Intragenesis
4. Metilacin de DNA dirigida por RNA (RdDM)
5.Reverse breeding & other "negative segregants
(reproduccin inversa y otras segregantes negativas)
6. Agro-infiltracion
7. Injerto sobre Patrn GM
Las nucleases de dedos de Zinc son protenas
quimricas con un domino de dedos de Zinc (reconoce
especificamente 3 pares de bases de la secuencia de
DNA).

La nucleasa corta la doble hebra de DNA


Nucleasas de dedos de zinc (ZFN)
Nucleasas tipo activadores de transcripcin
(TALEN)
Nucleasas de Secuencias Palindrmicas
Repetidas Inversas (CRISPR-Cas)
Nucleasas tipo activadores
de transcripcin (TALEN)
Nucleasas tipo
activadores de
transcripcin (TALEN)
son protenas que se
unen al DNA de manera
secuencia- especfica y
se transforman tijeras de
DNA al unirse a una
nucleasa de dominio
cataltico FokI SDN.
Clustered Regularly Interspaced Short
Palindromic Repeats (CRISPR) and CRISPR
associated system (CRISPR-Cas9)

Los CRISPR han sido encontrados en el 40% de las


eubacterias y 90% de las arqueas secuenciadas.

Es un sistema inmune de las bacterias para


defenderlas del ataque de bacterifagos
Especificidad del sistema
CRISPR / CAS9
El sistema CRISPR se compone de dos partes
1) Un componente protico CAS9 con actividad de nucleasa
2) Un RNA gua que brinda especificidad al sistema
USO DE CRISPR / CAS9

Al igual que en los sistemas anteriores la edicin con


CRISPR puede emplearse para generar mutaciones
puntuales, deleciones o inserciones cortas
Uso de oligonucleotidos, los cuales
comparten homologa con la secunecia blanco
(target) con excepcin de los nucleotidos que
sern modificados.
Oligonucleotidos target con secuencia
homologa en el genoma
Crea uno o ms pares de base de mismatch
que corresponde a los nucleotidos no
complementarios.
La Cisgnesis es la introduccin de genes aislados con
sus promotores nativos de las especies susceptibles
de cruzamiento o de la propia planta de cultivo

En la intragnesis, el ADN insertado puede ser una


combinacin nueva de fragmentos de ADN de la
misma especie o de una especie sexualmente
compatible sujeto a recombinacin homologa.

Se usa en casos en donde el ADN flanqueante o el


vector no se originan de especies sexualmente
compatibles (Holme et al. 2013).
Cisgenesis/Intragenesis utilisa la misma base
tecnolgica que la transgenesis.
Holme et al. 2013. Intragenesis and cisgenesis as alternative to transgenic crop development. Plant
Biotechnology Journal. 1-13
Insercin de genes que codifican RNAs los cules son
homlogos al promotor de las regiones del gen blanco
La transcripcin de los genes dirige al RNAs de doble
cadena, el cual es cortado en pequeos RNAs
sRNAs inducen la metilacin de la regin promotora
del gen blanco target lo que lleva al silenciamiento
transcripcional del gen (TGS)
Los cambios en el patrn de metilacin sera heredaro
an en ausencia del transgene insertado
Silenciamiento

Es un mecanismo en el que las molculas


de doble cadena de ARN (dsRNA) regula
la expresin de los genes.

Mediado por

miRNA siRNA piRNA


Molcula de RNA de doble Molcula de RNA de doble
cadena, que tienen un cadena, que tienen un tamao
tamao de 21-25 de 21-25 nucletidos
nucletidos
Producida a partir de un
Los precursores de precursor de RNA que puede
microARN son transcritos a variar de tamao y origen
partir de genes celulares, tal
y como se producen los
RNAm
Muchos procesos en la
clula usan RNAi

A. Cuando un virus RNA B. La sntesis de muchas protenas es C. En la investigacin, Ias


infecta la clula, el RNAi controlada por genes que codifican molculas de dsRNA son
destruye el RNA viral, microRNA. Despus del diseadas para activar el
previniendo la formacin procesamiento el microRNA evita la complejo RISC para degradar el
de nuevos virus. traduccin del mRNA a protena. mRNA para un gen especfico.
Reproduccin inversa (RB) es una tcnica de fitomejoramiento
diseada para producir directamente lneas parentales para cualquier
planta heterocigtica.

El mejoramiento reverso genera lneas perfectamente


complementarias de parentales homocigotos mediante ingeniera
meitica.

El mtodo se basa en la reduccin de la recombinacin gentica en el


heterocigoto seleccionado mediante la eliminacin del cruzamiento
meitico. Las esporas femeninas o masculinas obtenidas de tales
plantas contienen combinaciones no recombinantes de los
cromosomas parentales que pueden ser cultivadas in vitro para
generar plantas homocigotas doble haploides (DHS).
A partir de estos DHS, los padres complementarios pueden ser
seleccionados y utilizados para reconstituir el heterocigoto a
perpetuidad.
Dirks et al. 2009
El transgene que codifca para una secuencia
de RNAi es liberado en el explante del material
La planta transgenica se regenera en cultivo de
tejido
El silenciamiento de genes dirige a la supresin
meiotica
Las microsporas haploides son producidas de
de flores de plantas transgenicas.
Las Microsporas son desarrolladas en plantas
diploides homocigas (tecnologa de dobles
haploides)
Reproduccin con lnea inductora transgnica
(segregantes negativas")

El transgene codificador de un constructo de


RNAi o una protena dominante-negativa es
insertado en el genoma de la lnea inductora.
La expresin del transgene permite la inhibicin
de la expresin genica o la funcin de la
protena.
El efecto del transgene es usado durante uno o
varios ciclos de reproduccin.
El transgene inductor finalmente es segregado
o eliminado.
REVERSE BREEDING
El injerto en s es un mtodo de cultivo clsico en el que dos
plantas con diferentes fenotipos se combinan fsicamente
adjuntndose.
Cuando se toma la parte inferior, el patrn, de una planta
transgnica y la parte superior, el vstago, de una planta
convencional, las hojas resultantes, tallos, semillas y frutos no
llevan el ADN transgnico.
Como un ejemplo, este mtodo puede ser utilizado para la
expresin de ARN de interferencia (o RdDM) en el patrn; estos
son sistmicamente transportados y puede llevar al
silenciamiento transitorio o heredable de los genes en el
vstago.
Las semillas resultantes, frutas o descendencia de un vstago
no contienen ADN de origen transgnico, mientras que la
regeneracin de brotes adventicios a partir de callos o
portainjerto puede llevar ADN transgnico.
Stegemann y Bock, 2009; Nagel et al, 2010;. Lusser et al., 2011
Una planta quimrica se produce mediante el Injerto No GM
injerto de un vstago no genticamente
modificado en un patrn modificado
genticamente.

En consecuencia, los frutos de la planta no Protena


contienen la secuencia de ADN insertada.

El patrn puede ser modificado para mejorar su


capacidad de enraizamiento o resistencia a ARNmi
las enfermedades transmitidas por el suelo,
resultando en un aumento sustancial en el
rendimiento de los componentes
cosechables.
ARN
El patrn tambin puede ser modificado para
obtener el silenciamiento de genes a travs
de la tcnica de ARN interferencia (ARNi). En
las plantas injertadas, los ARN pequeos ADN
pueden moverse a travs del injerto de modo
que la seal de silenciamiento puede afectar
Raz GM
a la expresin gnica en el vstago.
Fuente: Lusser et al 2012
La expresin transitoria de genes en plantas implica la
expresin de protenas recombinantes sin necesidad de
transformacin del material gentico de la planta.
El ADN recombinante no se inserta en el genoma, sino
que mediante distintos mtodos se consigue producir
grandes cantidades de ARN mensajero, que se traduce
a protenas en el citoplasma de parte de las clulas de
la planta.
Una vez que el mensajero es traducido a protenas la
planta lo degrada, no se transmite a la descendencia.

http://icono.fecyt.es/informesypublicaciones/Documents/2005-
Plantas%20biofactor%C3%ADa_d.pdf
La expresin transitoria de genes generalmente se utiliza para evaluar la
funcionalidad de las construcciones que se usan para transformar plantas de
manera estable, y para evaluar la calidad del producto que se obtiene.

Tambin es posible la expresin transitoria en plastos.

Ventajas de la expresin transitoria


Expresin rpida y flexible
No est influida por efectos de posicin
Puede producirse en plantas adultas, previniendo cualquier
efecto negativo que la protena recombinante pudiese tener
en el desarrollo de la planta
No es una modificacin gentica permanente, lo que desde
el punto de vista de la seguridad es una ventaja
Ideal para obtener pequeas cantidades de protenas a
medida en pocas semanas
Agroinfeccion
Infiltracin con
suspencin de
Agrobacterium sp.
Conteniendo el gen de
inters insertado en un
vector viral de tamano
completo
Facilita la
diseminacin y
expresin del gen
blanco en la planta
Floral dip
Transformacin
de gametocitos
femeninos
Se obtienen
semillas GM
(Lusser M, 2012)
(Lusser M, 2012)
(Lusser M, 2012)
Dra. Laura Esther Tovar Castillo
Secretara Ejecutiva-CIBIOGEM
Tel. 55756878
e-mail: ltovar@conacyt.mx