Diagnstico de Arbovirus de alto impacto en Salud Pblica de las Amricas:

Dengue, Zika, Chikungunya y Fiebre Amarilla:

Aspectos crticos del diagnstico serolgico.
Bqca. Mara Alejandra Morales
Especialista en Bioqumica Clnica, orientacin Virologa. Jefe Divisin
Virologa e Inmunologa

Centro Nacional de Referencia para el Diagnstico de Dengue y otros Arbovirus

Centro Colaborador OMS/OPS, ANLIS, Pergamino-Argentina
Tcnicas de laboratorio ARBOVIRUS
Aislamiento viral (lneas celulares,
mosquitos, huspedes de laboratorio) ,
Deteccin de antgenos (NS1 en DENV),
Secuenciacin

Deteccin de genoma viral: qRT-

TCNICAS
PCR y convencional DIRECTAS
(1-20 dpi)

TCNICAS
INDIRECTAS
(> 4 dpi)
Deteccin de anticuerpos: IgM/IgG
(ELISA, IHA,PRNT)
 CRITERIOS PARA LA ELECCIN DE MTODOS DE DIAGNSTICO :
Conocer ciclos de trasmisin y tipo de husped en
el cual se requiere el diagnstico

Husped
Amplificador

Husped
Terminal

IgG(2)
Viremia
IgM
IgM suero
IgG(1)

IgG suero
viremia
IgM LCR

-3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 // 30 60 >90 das
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 das
Inicio Sntomas
Inicio sntomas
Mtodos virolgicos Mtodos serolgicos
Mtodos virolgicos Mtodos serolgicos

Las metodologas serolgicas se requieren para acceder al diagnostico una vez superada la fase de viremia
 Algoritmo serolgico: secuenciales o paralelos?
De acuerdo a los datos clnicos y
DEFINICIN CLNICA DE CASO SOSPECHOSO epidemiolgicos, se suma la
investigacin de Fiebre Amarilla,
Encefalitis de San Luis, Nilo
Occidental u otro Arbovirus

1 Etapa : Tamizado de Muestras de pacientes

tomadas con 4 ms das de evolucin

DETECCIN DE IgM DETECCIN DE IgM DETECCIN DE IgM

(MAC- ELISA o kits comerciales (MAC- ELISA o kits comerciales (MAC- ELISA o kits comerciales

2 Etapa Confirmacin por Neutralizacin: los primeros casos de un brote, un % de los casos durante un brote y aquellos que presentan
cuadro clnico severo, atpico o constituyen grupos de riesgo. Panel de Flavivirus o Panel de Alphavirus segn corresponda

Gentileza Dr. Jairo, Mendez (adaptado)

Consideraciones para manejo con adecuado
nivel de bioseguridad
El riesgo primario asociado es la transmisin a travs de la ingestin,
inoculacin y membranas mucosas.
Aunque generalmente los arbovirus no se transmiten por vas
aerotransportadas, se debe tener cuidado para evitar la generacin de
aerosoles o salpicaduras.
Salvo PRNT de algunos arbovirus, el diagnostico se maneja en
laboratorios BSL2
Se debe realizar el diagnstico serolgico en Gabinetes de
Bioseguridad y contar con buenas prcticas de laboratorio.
El manejo de cepas virales establecidas requiere BSL3 considerando
la carga viral y el agente

Lavador de
ELISA en
GBS
Deteccin de anticuerpos IgM
Fcil manejo y menores No identifica serotipo en
requerimientos de infraestructura infecciones por dengue
Menor costo Requiere confirmacin
Deteccin de infecciones recientes Clasifica un caso como probable
Posibilidad de procesar un gran Considerar posibles falsos
nmero de muestras negativos en infecciones
Disponibilidad de reactivos comerciales secuenciales por niveles de IgM
Deteccin en suero y LCR bajos o no detectables

Estimation of Dengue Virus IgM Persistence Using Regression Analysis

Prince, H.E.; Matud, J.L.. Clin Vaccine Immunol December 2011 vol. 18 no. 12 2183-2185
-Infeccin primaria: 179 das (155-215, 95% IC)
-Infeccin secundaria: 139 das (119-167, 95% IC)

Estudios de Persistencia de IgM Dengue en Argentina

2005: 30 % (30/100) Positivos IgM dengue MAC-ELISA en el rango de 390-490 das posteriores (Salta y
Jujuy). Morales M.A.et al . I Congreso Panamericano de Zoonosis, V Congreso de Zoonosis, II Congreso Bonaerense de
Zoonosis, La Plata, 10-12 de Mayo de 2006
2009-2010: Se realiz el seguimiento en 34 casos confirmados por lab. 18% present reactividad IgM a
ms de 12 meses S Lpez de Caillou et al, Jornadas de Residentes de Epidemiologa 2012. Libro de resmenes
MAC- ELISA para Flavivirus y Alphavirus
Alta versatilidad mediante el cambio de algunos
reactivos especficos es factible direccionar la
vigilancia laboratorial y el diagnstico de acuerdo a
los escenarios epidemiolgicos

La Red de Laboratorios de Argentina cuenta con 65

laboratorios provinciales y a 12 de ellos se les ha
4. Anticuerpo monoclonal
transferido esta metodologa. anti-flavivirus marcado (6B 6C-1)

3. antgeno flavivirus
El INEVH produce y distribuye antgenos
2. muestra de suero
producidos en diferentes sustratos y trabaja en la
produccin local de los anticuerpos monoclonales 1. anti-IgM

Fase slida (placa de ELISA)

Cmo elegir un reactivo
comercial?
Es clave observar la composicin del
Considerar cul ser la
panel empleado para la evaluacin
Aplicacin del test.
Sensibilidad
Especificidad
Indices de concordancia con la
tcnica de referencia
Variabilidad intra operador
Variabilidad inter laboratorio
Facilidad en la implementacin
Reproducibilidad y variabilidad
interlote
Costo

http://www.who.int/tdr/publications/tdr-research-publications/diagnostics-
evaluation-3/en/
Evaluacin Multicntrica TDR/PDVI de reactivos
comerciales para Dengue (1 Ronda )

350 MUESTRAS 5 KITS ELISA 4 TESTS RPIDOS

181 confirmed dengue Sensibilidad: 21-61%
Sensibilidad: 62-99%
169 challenge panel Especificidad: 77-91%
Especificidad: 80-98%
7 laboratories
2 reference labs
CDC
Mahidol
5 Evaluation Labs
Cambodia
Vietnam
Argentina
Cuba
Malaysia

QUIEREN SABER CUAL ES

LA SENSIBILIDAD DE UN
TEST RAPIDO CUYO EID 2009 15(3):436-440
PRODUCTOR ANUNCIABA
100% Se?
Reactivos Comerciales Evaluados por
CDC, la Agencia Nacional de Salud
Pblica de Canada y CARPHA del
Caribe para IgM CHIKV.
1) ELISA A. 95% concordancia entre los 3 centros evaluadores,
requiri re-testeos por resultados en zona gris.

2) ELISA B..100% and 98% concordancia con CDC y CARPHA.

3) ELISA C.. Alta performance en CARPHA, pero en CDC fue

inconsistente entre lotes. Los productores hicieron ajustes y CDC
volvi a evaluar, logrando 97% concordancia

4) Dos tests rpidos y tres CHIKV MAC-ELISAs evaluados en CDC

tuvieron sensibilidad <50%
La circulacin simultanea de diversos virus de la misma
familia determina la necesidad de confirmar IgM y evaluar
cruces serolgicos en un porcentaje de los casos

BROTE DE SLEV EN EL AREA METROPOLITANA DE BUENOS AIRES, 2010

Los primeros resultados positivos se

obtuvieron por un kit comercial para IgM
Dengue, en 9/9 pacientes con cuadro
neurolgico, todos NS1 negativos
Deteccin de Anticuerpos IgG:
IHA, ELISA , Neutralizacin

Distingue infeccin primaria y Par serolgico

Reactividad cruzada entre Flavivirus
secundaria
No identifica serotipo en infecciones
Identifica serotipo en infecciones 1 secundarias (Pecado original)
Manejo de cultivos celulares y stocks
90% reduccin de placas: mayor virales adecuadamente cuantificados
especificidad BSL2/BSL3
$$

Antgenos recombinantes/ otros protocolos que

reduzcan los cruces serolgicos en las tcnicas de
ELISA?
Diagnstico, estudios seroepidemiolgicos,
inmunogenicidad vacunal, etc
Qu cepas usar en las neutralizaciones?
 La PRNT en el INEVH para Flavivirus se se realiza empleando
stocks virales de DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, SLEV, WNV,
YFV y ZIKV (en ocasiones se amplia incluyendo Ilheus y
Bussuquara).

La PRNT de Alphavirus incluye CHIKV, VEEV, EEEV, WEEV, MAYV y

UNAV. Requiere BSL3

Se emplean cultivos de 48 hs e incubacin variable de acuerdo al

virus hasta la coloracin con Rojo Neutro/Cristal violeta y lectura
de las UFP virales

Es una prueba biolgica que mide anticuerpos

neutralizantes que perduran toda la vida y permite
detectar infecciones remotas en una nica
muestra, por ej. Inicio de un embarazo
Requiere un mnimo de 10 das para la obtencin
de resultados
Los resultados serolgicos dependen
del tipo de infeccin

DEN-1 DEN-2 DEN-3 DEN-4 FA ZIK WN SLE DEN-1 DEN-2 DEN-3 DEN-4 FA ZIK WN SLE

S1 <20 20 <20 <20 <20 80 <20 <20 S1 320 160 1280 320 40 1280 320 640

S2 <20 40 <20 20 <20 320 <20 <20 S2 640 2560 10240 640 l60 2560 1280 320

CONFIRMADO ZIKV CONFIRMADO FLAVIVIRUS

La interpretacin de resultados en encuestas
de prevalencia en poblaciones humanas o
animales constituye un desafo en el caso de
arbovirosis

ESTUDIOS RECIENTES DE INFECCIN EXPERIMENTAL EN EQUINOS Y AVES

MUESTRAN LA EXISTENCIA DE PECADO ORIGINAL TAMBIEN EN ANIMALES

ES COMPLEJA LA INTERPRETACIN DE RESULTADOS EN ESTUDIOS

ECOLGICOS Y DE SEROPREVALENCIA EN HUMANOS EN LOS QUE SE
EVALAN UNA NICA MUESTRA YA QUE PODEMOS ENCONTRAR
INFECCIONES SECUENCIALES O CRUCES SEROLGICOS
 Diferenciacin de respuestas serolgicas
homotpicas y heterotpicas.
Cmo interpretar?
Respuestas homotpicas: individuo positivo (Ttulos > 10) slo frente a
nico virus en el panel
Respuestas heterotpicas: individuo positivo (Ttulos > 10) para dos o
ms de los agentes estudiados
Tradicionalmente, se ha considerado que el virus infectante era aqul que presentaba ttulos superiores en
2diluciones factor 2 o ms. Actualmente hay evidencias que llevan a cuestionar el criterio

Analicemos lo que puede suceder al estudiar una muestra de una embarazada con sospecha de infeccin por ZIKV
PRNT90

ZIKV DENV-1 DENV-2 DENV-3 DENV-4 SLEV WNV YFV Interpretacin

80 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 ZIK (RESPUESTA HOMOTIPICA)
320 40 <10 <10 20 <10 <10 <10 ZIK (RESPUESTA
HETEROTPICA)
1280 640 320 80 80 <10 <10 640 FLAVIVIRUS (RESPUESTA
HETEROTIPICA)
 Experiencia en la deteccin de los flavivirus West Nile,
Dengue, Saint Louis Encephalitis, Ilheus, Bussuquara, y
Yellow Fever en Alouatta caraya del Nordeste de Argentina
Seventy animals had antibodies for one or more flaviviruses for a total antibody
prevalence of 64.8% (70/108). Monotypic (13/70, 19%) and heterotypic (27/70, 39%)
patterns were differentiated. Specific neutralizing antibodies against WNV, SLEV,
DENV-1, DENV-3, ILHV, and BSQV were found. Unexpectedly, the highest flavivirus
antibody prevalence detected was to WNV with 9 (8.33%) monotypic responses. All
samples tested by (RT)-nested PCR were negative for viral genome.

Fig 1. Study sites in Chaco and Corrientes

provinces, Northeastern Argentina.

Morales MA, Fabbri CM, Zunino GE, Kowalewski MM, Luppo VC, et al. (2017)
Animales con respuesta inmune heterotpica
Criterio de Mayor ttulo: Podemos diferenciar si son
infecciones secuenciales o cruces serolgicos?
27 animales con serologa indeterminada

Cmo interpretamos estos resultados??

Estos aspectos pueden generar una subestimacin o
sobreestimacin en las prevalencias de infeccin
especialmente en regiones donde circulan varios
virus de una misma familia
 para concluir
No existe la tcnica de diagnstico
serolgica perfecta e ideal, pero contamos
con una importante batera de
herramientas diagnsticas.
Los algoritmos diagnsticos no pueden
basarse nicamente en herramientas
moleculares ya que su periodo de
aplicacin se limita a la fase aguda y no
proveen informacin de perfil inmunolgico

Es importante intensificar las capacidades

de produccin de insumos crticos para la
implementacin de mtodos serolgico en
arbovirus, desarrollar nuevas metodologas
que superen las limitaciones actuales y
contribuir a su validacin.
Agradecimientos:

- Red Nacional de Laboratorios de Argentina y a las mltiples instituciones

nacionales e internacionales con las que realizamos trabajos colaborativos.

- Personal del Laboratorio del Departamento Investigacin y a toda la

Institucin que con su trabajo posibilitan el buen funcionamiento del
sector Arbovirus en el INEVH.

Preguntas?
INEVH Dr. Julio I. Maiztegui, ANLIS
Monteagudo 2510
(2700) Pergamino, Argentina
TE: 02477-433044/ 429712-14
FAX: 02477-433045
Maria Alejandra Morales
morales.mariaalejandra@yahoo.com.ar