Mtodos emergentes para determinar contaminacin microbiolgica en

agua potable

Milena Barrera, Sofa Durazno, Andrs Gonzlez, Mateo Muoz, Jhony Tigre, Ing. Juan Cisneros., MSc
Universidad de Cuenca, Facultad de Ciencias Qumicas, Carrera de Ingeniera Ambiental. Asignatura:
Saneamiento Ambiental, Cuenca Ecuador, Fecha de entrega: 31-10- 2017

1. Objetivos ................................................................................................................................ 1
2. Introduccin .......................................................................................................................... 1
3. Marco terico ........................................................................................................................ 2
3.1. La citometra de flujo ....................................................................................................... 2
3.2. Mtodo de microscopa .................................................................................................. 3
3.3. Mtodos basados en PCR .............................................................................................. 4
3.4. Mtodos Enzimticos ...................................................................................................... 4
4. Discusin ............................................................................................................................... 5
5. Conclusiones ........................................................................................................................ 5
Bibliografa ................................................................................................................................. 6

1. Objetivos

Objetivo General
Obtener informacin terica sobre los mtodos alternativos existentes para
detectar e identificar contaminacin microbiolgica en el agua potable.

Objetivos especficos
Conocer la aplicacin de los mtodos de deteccin de contaminacin
microbiolgica en agua potable.
Identificar que mtodos favorecen a la deteccin microbiolgica para agua
potable

2. Introduccin

Los microorganismos son una problemtica a nivel mundial la cual afecta principalmente
en pases de desarrollo los cuales cuentan con inadecuados servicios de saneamiento,
poca inversin en la garanta de la potabilizacin del agua para la poblacin, psimo
control de brotes y la falta de intervencin en sistemas de salud pblica, todos estos
aspectos favorecen a la propagacin, incidencia, morbilidad y mortalidad en conjunto
con las enfermedades relacionadas al consumo de agua. Toda esta falta de control
provoca que las comunidades queden expuestas a enfermedades relacionadas con el
agua, ya que sta al ser un vehculo potencial de agentes patgenos, puede llegar a
infectar a una gran proporcin de la poblacin en un tiempo relativamente corto. (Silva
et al., 2004)
El agua potable puede contaminarse de diversas maneras por la trayectoria que
atraviesa hasta su destino de consumo final, ste proceso puede tardar horas o das;
diversos factores determinan la degradacin del recurso como: el deterioro en las redes

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debido al rebote y al arrastre de agua no tratada por las tuberas deterioradas,
considerando un posible factor de riesgo en la salud de los consumidores. Los
microorganismos pueden ingresar en los sistemas de distribucin de agua potable por
medio de agrietamiento en el canal de distribucin o articulaciones durante los eventos
de presin negativa, las bacterias hetertrofas utilizan el sustrato orgnico como fuente
de carbono, nutriente y energa. (Heibati et al., 2017)
La determinacin de indicadores como: Escherichia coli (E. coli), coliformes fecales,
Enterococcus spp., y los conteos bacterianos son evaluaciones que se realizan
constantemente y de forma rpida. De tomarse en cuenta que aunque el estudio indique
ausencia de E.coli y coliformes, no quiere decir que la muestra quede exenta de la
presencia de otros microorganismos que afecten o sean dainos al ser consumidos por
los seres humanos. (Heibati et al., 2017). Ante la problemtica en la identificacin de
microorganismos presentes en agua potable, se ha descubierto y estudiado nuevas
metodologas que permitan identificar a las diversas comunidades de patgenos
presentes en ste medio, estableciendo una accin inmediata por los beneficios de
visualizacin de resultados en un intervalo corto de tiempo, en comparacin a los
mtodos convencionales.

3. Marco terico

3.1. La citometra de flujo (FCM)

FCM es una tcnica rpida, precisa y replicable aplicada a la cuantificacin de bacterias
al aplicar un mtodo de tincin general de cido nucleico o para el nmero de bacterias
viables al momento de combinar con el proceso de manchas de viabilidad. ltimamente
esta tcnica se ha propagado hacia la creacin de huellas dactilares FCM de
comunidades bacterianas para permitir una caracterizacin ms detallada de
determinadas colonias de bacterias. El anlisis por FCM es un mtodo que tiene un gran
nivel de informacin, elevada precisin y reproductibilidad, y sus costos son competitivos
con respecto a otros mtodos. La tcnica de FCM caracteriza y cuantifica partculas
suspendidas individuales al ser pasadas a travs de una fuente de luz normalmente por
un haz de lser. Las partculas fluorescentes son excitadas por esa fuente de luz y
emiten luz a una longitud de onda ms alta. Las partculas que se deseen caracterizar
pueden ser autofluorescentes (por ejemplo, algas que contienen clorofila) o
fluorescentes, como las bacterias despus de teirse con colorantes fluorescentes. Este
mtodo fue introducida en 1977 por microbilogos para caracterizar bacterias
suspendidas, pero en 1991 fue aplicada por primera vez en anlisis de agua potable
para la deteccin de ooquistes de Cryptosporidium.Los resultados de FCM pueden estar
disponibles dentro de los 15 minutos posteriores al muestreo, lo que permite la accin
inmediata y la identificacin de muestras problemticas para una mayor investigacin o
pasos de remediacin. Adems, el anlisis automatizado de multiplacas, que es una
caracterstica en casi todos los instrumentos modernos de FCM, permite fcilmente la
medicin aproximadamente de 500 muestras en un solo da con un operador y un
instrumento. Esto permite a los investigadores y empresas de servicios pblicos
seleccionar rpidamente un nmero considerablemente mayor de muestras con la
misma o incluso menor mano de obra de la que era factible con los mtodos
convencionales basados en el cultivo. Cada mtodo analtico enfrenta algunos
inconvenientes. Los desafos para la FCM discutidos a continuacin incluyen: (i) las

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dificultades para distinguir entre bacterias viables y no viables, ya que se puede incluir
en el conteo clulas muertas debidas a la cloracin, pero una solucin para este
inconveniente sera la tincin de viabilidad en donde se integrara la membrana y la
actividad metablica de la clula, (ii) problemas en el tratamiento de agregados y
conglomerados bacterianos, el anlisis de FCM detecta clulas individuales o
agregados bacterianos, pero no necesariamente diferencia entre los dos, por lo que
llevar a un recuento insuficiente de bacterias pero este inconveniente se podra
solucionar mediante la sonificacin suave para dividir agregados bacterianos. (Van
Nevel et al., 2017)

3.2. Mtodo de microscopa.

Los mtodos basados en la microscopa de epifluorescencia ofrecen una alternativa ms
rpida para controlar la calidad del agua potable en comparacin con los recuentos de
placas tradicionales, los cuales deben estar expuestos a un tiempo prolongado de
incubacin. Se pueden usar diferentes colorantes fluorescentes en tonalidades verde y
rojo para teir las clulas de tal manera que las clulas con membranas sin daos se
tian de verde y las clulas con membranas comprometidas se tian de rojo.

La hibridacin fluorescente in situ (FISH), es un mtodo molecular que estudia

la estructura, funcin y comportamiento de los cromosomas utilizando sondas
oligonucletidos que se unen especficamente al ADN microbiano en la muestra,
permitiendo la visualizacin de las clulas usando un microscopio de escaneo
lser epifluorescente; permite la deteccin rpida de patgenos como Legionella
pneumophila e indicadores fecales en las muestras de agua potable, consiste en
identificar la fijacin de la muestra, la permeabilizacin mediante la hibridacin
entre las sondas y cidos nucleicos mediante el colorante fluorocromo, al finalizar
la hibridacin las clulas se vuelven uniformemente fluorescente, se continua
con el lavado para eliminar la sonda no incorporada y para finalizar se localiza la
clula caracterstica mediante microscopia o citometra de flujo. Este mtodo
proporciona datos cuantitativos en un tiempo de 6 a 8 horas, puede detectar una
gran variedad de microrganismos de manera simultnea por medio de colorantes
fluorescentes, a su vez se encuentra limitado ya que al identificar clulas blanco
arroja resultados errneos en conjunto con la mala informacin del estado
metablico de las clulas, por lo que se requiere realizar una investigacin ms
profunda.

Mtodo de anlisis de actividad microbiana y funcionalidad de genes por

medio de Trifosfato de Adenosina (ATP), para la estimacin de biomasa y
Carbono Orgnico Asimilable (AOC), para la cuantificacin de crecimiento
bacteriano.
Mtodo Trifosfato de Adenosina (ATP): Permite la cuantificacin de varias
muestras en forma simultnea mediante un lector de micro placas. Este mtodo
es rpido, de bajo costo y fcil de realizar; por lo tanto, es una herramienta ideal
para fines de deteccin.
Carbono Orgnico Asimilable (AOC): Es ampliamente utilizado para evaluar el
crecimiento de bacterias hetertrofas mediante el uso de comunidades
microbianas naturales como inculo y la citometra de flujo, para estimar
los recuentos celulares en muestras de agua. El mtodo se ha usado para probar

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 la influencia de productos con capacidad de desinfeccin sobre el crecimiento
microbiano en los sistemas de distribucin y, para evaluar el potencial de
crecimiento de biopelculas sobre diferentes materiales de tubera.
Este mtodo presenta limitaciones, porque asume que el crecimiento bacteriano
es limitado por el carbono orgnico y cuantifica los nutrientes disponibles en lugar
de bacterias.

ATP y AOC mtodos han sido probados para evaluar la estabilidad biolgica del agua
potable, e implica que la concentracin de clulas y la composicin de la comunidad
microbiana no debe cambiar durante la distribucin de agua. Para el proceso de
cuantificacin, se pueden utilizar conjuntamente con otras tcnicas como la citometra
de flujo, para permitir una mejor comprensin de la respuesta de las comunidades
microbianas a tratamientos especficos o condiciones establecidas, tambin para
predecir los cambios en la estabilidad de su respuesta a diferentes factores. (Douterelo
et al., 2014)

3.3. Mtodos basados en PCR

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es un mtodo utilizado para amplificar u
obtener mltiples copias o fragmentos de ADN. Los mtodos basados en PCR requieren
la extraccin de los cidos nucleicos (ADN/ARN), seguido de la amplificacin del gen o
genes objetivos a travs de PCR y posteriormente debe pasar por un anlisis. Es
importante tomar en cuenta que los amplicones obtenidos a travs de PCR es la base
para todas las tcnicas de identificacin y consecuentes mtodos de secuenciacin.
Algunas de las tcnicas ms usadas basadas en PCR en la deteccin de
microorganismos en agua potable son Mltiple-PCR y anlisis cuantitativo en tiempo
real (q-PCR). Mltiple-PCR usa varias sondas de oligonucletidos para detectar
simultneamente diferentes microorganismos y ha sido usado en investigacin
relacionada con agua potable, para detectar indicadores fecales y patgenos. Q-PCR
es una herramienta sensitiva para detectar y cuantificar microorganismos en muestras
ambientales basadas en cuantificar el nmero de copias de genes objetivos presentes
en una muestra.
sta tcnica puede monitorear la cantidad de producto de PCR obtenido durante la fase
exponencial de la reaccin y establecer un comparativo con la cuantificacin del inculo,
estableciendo la cuantificacin especfica de un organismo. sta tcnica se utiliza para
la identificacin de contaminacin fecal por bacterias patgenas como Helicobacter
Pylori, Mycobacterium avium y Legionella sp., y para la cuantificacin de Giardia y
Cryptosporidium. (Douterelo et al., 2014)

3.4. Mtodos Enzimticos

Las Coliformes totales son Gram negativas, oxidasa negativa, no formadoras de varillas
de esporas, que fermentan lactosa con la produccin de gas a 35 C, despus de 48
horas, en un medio con sales biliares y detergentes. Cuando la prueba de coliformes se
lleva a cabo en las aguas del medio ambiente, varias especies de las cuatro del gnero
Enterobacteriaceae, Escherichia, Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter, dan positivo
como resultado y se les toma como presencia de coliformes. Sin embargo el conteo de
coliformes totales no es necesariamente una medida de la poblacin de bacterias
fecales.

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Las coliformes fecales son tradicionalmente definidas como coliformes que fermentan
lactosa a 44.5 C en un medio con sales biliares. El rango de especies que son
detectados bajo procedimientos experimentales es mucho ms bajo que el de coliformes
totales. Con aguas medioambientales contaminadas solo la E. coli, K. oxytoca y la K.
pneumoniae dan resultados positivos en las pruebas.
La deteccin de actividad -D galactosidasa a 37 C es usualmente un buen marcador
de coliformes en aguas medioambientales, ya que la mayora de estas bacterias
muestran actividad enzimtica. La mayora de Escherichia, Citrobacter, Enterobacter,
Klebsiella y Raoultella son galactosidasas e incluso la Hafnia, Serratia y Yersinia poseen
esta actividad enzimtica por lo que pueden ser detectadas mediante este mtodo.
La deteccin de actividad -D glucuronidasa a 44.5 es, generalmente un buen marcador
de coliformes fecales especficamente para E. coli, ya que en las bacterias Gram
negativas es la que mayor actividad enzimtica presenta. Como apoyo a la deteccin
mediante esta tcnica tambin se pueden usar marcadores fluorescentes que cambian
de color despus de la accin de las enzimas tales como las XGLUC (5-bromo-4-chloro-
3-indoxyl--D-glucuronide) IBDG (indoxil--glucuronide), y MUGLU (4-
methylumbelliferyl--D-glucuronide). (Cabral, 2010)

4. Discusin

La deteccin de coliformes totales y fecales por mtodos enzimticos se considera como

un conjunto de tcnicas que pueden ser empleadas en un tiempo menor en comparacin
a los mtodos tradicionales. Adicionalmente con el uso de marcadores fluorescentes y
el uso de espectrofluorimetros; la deteccin microbiolgica de coliformes puede ser
detectada en minutos. Sin embargo la deteccin mediante estos mtodos en agua
potable o efluentes poco contaminados no es certera y en ocasiones no puede ser
detectada debido a la necesidad de implementacin de mtodos de cultivo; las tcnicas
de glucoronidasa y galatosidasa resultan ser de carcter intensivo conjuntamente con
los mtodos basados en PCR que aunque ofrezcan una cuantificacin fiable, requieren
herramientas complementarias de alta resolucin y costo excesivo.
El mtodo de citometra de flujo (FCM) garantizara a una empresa de agua potable
caracterizar la variabilidad presente como: la fuente, pasos de tratamiento y varias
ubicaciones en la red; caracterizando a corto y largo plazo la variabilidad temporal
definida en: horas, das, semanas o meses dependiendo de la ubicacin; de sta
manera detectando posibles situaciones que generen problemtica en el proceso, no
cabe duda que para la implementacin de este mtodo sera de gran ayuda la
comparacin de datos en funcin de otros mtodos, y as tener una lnea base que
ofrecera resultados confiables y certeros.

5. Conclusiones

El mtodo de microscopa, nos permite la rpida deteccin y enumeracin de

microorganismos presentes en el agua, usando un microscopio de escaneo
lser epifluorescente permitindonos evaluar los riesgos de manera ms
confiable y ayudar a mejorar las actuales estrategias de control.
En general, el ATP y mtodos de cuantificacin de la AOC han sido aprobados
para evaluar la estabilidad biolgica del agua potable e implica que la

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 concentracin de clulas y la composicin de la comunidad microbiana no deben
cambiar durante la distribucin de agua.
Los mtodos enzimticos son de gran ayuda en la deteccin bacteriolgica por
su rapidez de deteccin en relacin a los mtodos tradicionales y a los tipos de
bacterias que estos mtodos ayudan a identificar. Sin embargo a nivel de agua
potable este mtodo es poco fiable debido a que su nivel de deteccin es poco
sensitivo y requiere ms investigacin por la necesidad de la aplicacin de
siembra de cultivos.
Los mtodos basados en PCR ofrecen beneficios por su exactitud e intervalo
corto de visualizacin de resultados, tales como la tcnica mltiple, que identifica
diversos microorganismos de carcter patgeno; y q-PCR, que ofrece resultados
en el mbito de deteccin y cuantificacin en tiempo real, es sensitivo y preciso
para identificar la especie del organismo.
El mtodo de citometra por flujo (FCM) proporciona datos inmediatos dentro de
los primeros 15 minutos de las muestras que llegan a laboratorio, se puede usar
para crear una huella digital citomtrica de flujo nica de la comunidad
bacteriana, mejorando la deteccin de pequeos cambios en la muestra.

Bibliografa

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