Anda di halaman 1dari 11

LAPORAN RESMI PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

Karakterisasi Mikroba dengan Reaksi-reaksi Biokimia

Oleh:

Nama : Putu Pradnya Candra Asih

NPM : 2013210185

Kelas : A

Tanggal Praktikum: Senin, 6 Oktober 2014

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PANCASILA

JAKARTA

2014
I. Pendahuluan
1.1 Latar Belakang
Reaksi-reaksi biokimia bagi mikroorganisme dapat dikatakan sebagai sidik
jari biokimia (biochemical fingerprints), sebagaimana sidik jari manusia yang
menjadi pembeda antara satu orang dengan orang lainnya. Satu spesies
mikroba akan memiliki sidik jari atau karakter biokimia identitas yang berbeda
dengan spesies mikroba lainnya. Pada tingkat genus, terdapat beberapa
karakter makro dan mikroskopik serta karakter biokimia identitas yang secara
umum dimiliki oleh spesies-spesies yang termasuk dalam genus tersebut.
Serangkaian uji-uji biokimia dapat mencerminkan aktivitas metabolisme
enzimatik mikroorganisme.
Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia biasanya dilihat dari interaksi
metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan reagen-reagen kimia. Kemampuan
bakteri menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan sumber
energi dapat digunakan untuk identifikasi. Identifikasi bakteri dapat dilakukan
dengan beberapa uji antara lain uji dalam melakukan fermentasi, uji dalam
mengdegradasi asam amino triptofan, uji dalam mengoksidasi glukosa, uji dalam
medekarboksilasi lisin, dan uji dalam menguraikan hidrogen peroksida.
Seperti halnya organisme lain, bakteri mempertahankan hidupnya melalui
penyesuaian diri terhadap lingkungan demi kelanjutan generasinya. Untuk itu,
bakteri mampu merombak bahan kimia yang ada dilingkungannya sebagai
sumber energi dan zat pembangunan. Setiap jenis spesies bakteri memiliki
karakterisasi sifat biokimia dan fisiologi yang khas. Sifat-sifat ini dapat dijadikan
acuan dalam proses identifikaasi. Oleh karena itu, untuk mengetahui karakter
dari setiap spesies bakteri dilakukan beberapa metode biokimia untuk
mengetahui sifat dan karakteristik dari berbagai jenis spesies bakteri dan juga
berfungsi untuk determinasi patogen-patogen penyebab penyakit, serta seleksi
dan isolasi mikroba fermentatif yang potensial dalam industri makanan, sehingga
dapat meningkatkan kualitas dan cita rasa makanan.

1.2 Rumusan Masalah


1. Apa saja uji-uji umum yang dilakukan untuk mengetahui aktivitas biokimia
suatu bakteri?
2. Hasil apa yang ditunjukkan dari uji-uji kimia tersebut terhadap bakteri
Staphylococcus aureus?

1.3 Tujuan
1. Mengetahui beberapa uji biokimia untuk mengkarakterisasi mikroorganisme.
2. Melakukan beberapa uji biokimia dalam mikrobiologi dan menganalisis
hasilnya.

1.4 Manfaat
1. Dapat melakukan teknik uji biokimia yang umum dilakukan untuk mengetahui
aktivitas biokimia mikroorganisme.
2. Dapat menganalisis karakteristik dari berbagai spesies bakteri.
3. Dapat membedakan hasil-hasil senyawa yang terlihat pada media yang telah
diberikan pereaksi uji biokimia.

II. Tinjauan Pustaka


Keberadaan bakter patogen salam sediaan farmasi, makanan, minuman dan
alat-alat kesehatan harus dihindari agar pengguna produk terlindung dari efek yang
merugikan yang disebabkan oleh produk yang dikonsumsi. Pemeriksaan bakteri
patogen bertujuan untuk menentukan apakah suatu produk mengandung bakteri
patogen yang tidak diperbolehkan terdapat dalam suatu sediaan farmasi, makanan
dan minuman, serta alat kesehatan. Beberapa cara mengidentifikasi bakteri patogen
adalah sebagai berikut:
1. Identifikasi bakteri Escherichia coli
Untuk mengidentifikasi adanya bakteri Escherichia coli dalam sampel,
perlakuan pertama adalah menghomogenkan sampel dalam larutan pengencer
yang sesuai sehingga didapatkan hasil pengenceran 10-1. Selanjutnya, dibuat
pengenceran bertingkat sehingga diperoleh pengenceran 10-2 dan 10-3. Dari hasil
pengenceran 10-1, dipipet masing-masing 1 ml untuk diinokulasikan ke dalam 3
buah tabung yang telah berisi media MacConkey Broth (MCB) dan tabung
Durham. Langkah ini juga dilakukan untuk sampel dengan pengenceran 10-2
dan 10-3. Kesembilan tabung yang telah diinokulasi diinkubasi pada suhu 35-
37C dalam 24-48 jam. Gas yang terbentuk dalam tabung Durham diamati.
Setiap tabung yang positif, yaitu timbul gas, diinokulasikan ke dalam media
Escherichia coli broth (ECB) dan diinkubasi pada suhu 44C selama 24 jam.
Apabila timbul gas, biakan diinokulasikan pada permukaan media padat selektif,
yaitu Eosin Methylene Blue Agar (EMBA), kemudian diinkubasi pada suhu 37C
selama 24 jam. Juka bagian tengan koloni yang tumbuh pada media EMBA
menunjukan kilap logam dan bintik biru kehijauan, koloni diinokulasikan pada
media Nutrient Agar (NA) dan diinkubasi pada suhu 37 selama 24 jam. Langkah
selanjutnya adalah pengujian konfirmasi, yaitu uji IMVIC, dengan
menginokulasikan biakan bakteri pada media NA ke dalam indol, metil merah,
Voges Proskauer, dan sitrat (IMVIC). Hasil uji konfirmasi Escherichia coli posotof
jika IMVIC menunjukkan hasil berikut.

Uji indol Positif


Uji metil merah Positif
Uji Voges Proskauer Negatif
Uji sitrat Negatif

Uji Indol
Dari biakan murni Nutrien Agar miring, diinokulasikan 1 sengkelit biakan
ke dalam media trypton broth, kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 18-
24 jam. Sebanyak 0,2-0,3 ml pereaksi indol ditambahkan ke dala tabung. Warna
merah tua pada permukaan media menunjukkan reaksi indol positif.

Uji Metil Merah


Dari biakan murni Nutrien Agar miring, diinokulasikan 1 sengkelit biakan
ke dalam media Methyl Red-Voges Proskauer (MR-VP), kemudian diinkubasi
pada suhu 37C selama 48 jam. Dengan menggunakan pipet, 5 ml biakan
dipindahkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 5 tetes merah metil, dan
dikocok sampai homogen. Warna kuning menunjukkan reaksi negatif dan warna
merah menunjukkan hasil positif.

Uji Voges Proskauer


Dari biakan murni Nutrien Agar miring, diinokulasikan 1 sengkelit biakan ke
dalam media Methyl Red-Voges Proskauer (MR-VP), kemudian diinkubasi pada
suhu 37C selama 48 jam. Dengan menggunakan pipet, 1 ml biakan dipindahkan
ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 0,5 ml larutan -naftol dan 0,2 ml larutan
kalium hidroksida, kemudian dkocok sampai homogen dan didiamkan selama 2-4
jam. Warna merah muda hingga merah tua menunjukkan reaksi positif,
sedangkan warna tidak berubah menunjukkan reaksi negatif.

Uji Sitrat
Dari biakan murni Nutrien Agar miring, diinokulasikan 1 sengkelit biakan ke
dalam media Simmons citrate, kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 48-
96 jam. Warna biru menunjukkan reaksi positif, sedangkan warna tidak berubah
menunjukan reaksi negatif.
2. Identifikasi Bakteri Salmonella typhii
Sampel yang akan diperiksa terlebih dahulu, dihomogenkan, dan dilakukan
pra-pengayaan dengan larutan lactose broth (LB), yaitu dengan memindahkan
25 ml sampelsecara aseptis ke dalam botol yang berisi 225 ml media Lactose
Broth (LB), kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam. Sebanyak 10
ml biakan pra-pengayaan dipidahkan ke dalam media pengayaan yang terdiri
atas 100 ml media Tetrathionate Briliant Green Agar (TBGB) dan 100 ml media
Selenite Cysteine Broth (SCB), kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 24
jam. Bakteri Salmonella typhii diindentifikasikan dengan menginokulasikan 1
sengkelit biakan pengayaan pada cawan Petri yang berisi media Briliant Green
Agar (BGA)dan Bismuth Sulfite Agar atau perbenihan selektif lainnya, seperti
Salmonella Shigella Agar (SSA), Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLDA), dan
Hektoen Enteric Agar (HEA). Perbenihan kemudian diinkubasi pada suhu 37C
selama 24 jam. Koloni yang tumbuh pada media diduga merupakan Salmonella
typhii jika menunjukkan ciri-ciri sebagai berikut.
Pada BGA, koloni berwarna merah muda hingga merah atau bening hingga
buram dengan lingkaran merah muda sampai merah.
Pada BSA, koloni berwarna coklat, abu-abu sampai hitam, dan kadang-
kadang dengan kilap logam. Warna media disekitar koloni mula-mula coklat,
kemudian menjadi hitam jika masa diinkubasi ditambah. Pada beberapa galur,
koloni berwarna hijau dengan daerah di sekelilingnya berwarna lebih gelap.
Pada SSA, koloni tidak berwarna sampai merah muda, bening sampai buram.
Pada XLDA, koloni berwarna merah muda dengan bintik hitam di tengah.
Pada HEA, koloni berwarna biru hijau dengan atau tanpa bintik hitam di
tengah.

Langkah berikutnya adalah uji konfirmasi. Pada uji ini, dipilih 2-5 koloni spesifik
dari media selektif dan diinokulasikan pada media Nutrien Agar (NA), kemudian
diinkubasi pada suhu 37C selama 20-24 jam. Koloni pada nutrien agar
kemudian diinokulasikan dengan metode tusukan dan goresan untuk
mengerjakan uji-uji berikut.

Penanaman pada Media Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

Koloni dugaan Salmonella dipindahkan ke perbenihan miring TSIA dengan cara


menggores pada bagian miring dan menusuk pada bagian tegakperbenihan,
kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 24-48 jam. Perubahan yang terjadi
diamati. Pada bagian tegak Salmonella akan:

Memfermentasi glukosa, warna media berubah dari ungu menjadi kuning.


Tidak memfermentasi sakarosa, warna media tetap ungu.
Membentuk H2S, warna media berubah dari ungu menjadi hitam

Pada bagian miring Salmonella akan:

Memfermentasi laktosa dan sakarosa, warna media menjadi kuning.


Tidak memfermentasi laktosa dan sakarosa, warna media tetap merah atau
tidak berubah.

Uji Voges Proskauer

Koloni dugaan Salmonella dimasukkan masing-masing 1 sengkelit ke


dalam 2 tabung reaksi yang masing-masing berisi 0,2 ml perbenihan Voges
Proskauer(VP). Tabung ke-1 diinkubasi pada suhu kamar dan tabung ke-2
diinkubasi pada suhu 37C selama 24-48 jam. Selanjutnya, pada tiap tabung,
diteteskan 2 tetes larutan kreatin, 3 tetes larutan -naftol, dan 2 tetes pereaksi
KOH. Pengocokan dilakukan tiap kali pereaksi ditambahkan. Pengamatan
dilakukan selama 15 menit, terbentuknya warna merah jambu sampai merah tua
menunjukkan reaksi positif, sedangkan jika tidak berubah, menunjukkan reaksi
negatif.

Uji Indol

Koloni dugaan Salmonella diinokulasikan sebanyak 1 sengkelit ke dalam


media indol dalam tabung, kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam.
Selanjutnya, ditambahkan 1 ml pereaksi indol. Terbentuk gelang merah
menunjukkan reaksi positif, sedangkan bila tidak berwarna atau kuning
kecoklatan, menunjukkan reaksi negatif.

3. Identifikasi bakteri Staphylococcus aureus


Sampel yang akan diperiksa dihomogenkan dan diencerkan dengan larutan
Pepton Dilution Fluid (PDF) hingga didapatkan pengenceran 10-1. Sebanyak 2,0
ml larutan sampel hasil pengenceran 10-1 diambil dan dimasukkan ke dalam
tabung reaksi yang berisi 18,0 ml media Trypticase Soy Broth (TSB), lalu
diinkubasi pada suhu 37C selama 24-48 jam. Biakan dalam TSB kemudian
diinokulasikan dengan menggunakan sengkelit pada lempeng media Baird
Parker Agar (BPA). Perkaluan yang sama diberikan juga untuk kontrol positif
dengan menggoreskan Staphylococcus aureus pada media yang sama. Semua
biakan diinkubasi pada suhu suhu 37C selama 24-48 jam dengan posisi cawan
terbalik. Koloni yang diduga merupakan Staphylococcus aureus adalah koloni
spesifik yag berwarna hitam mengkilat dengan lingkaran cerah di sekelilingnya.
Selanjutnya, koloni dugaan yang spesifik dipilih dari biakan BPA untuk
dilakukan uji konfirmasi, yaitu uji koagulase. Kurang lebih 10 koloni dengan
dugaan Staphylococcus dipilih dari biakan BPA dan diinokulasikan ke dalam
Brain-Heart Infusion Broth (BHIB). Biakan diinkubasi pada suhu 37C selama 20-
24 jam. Sebanyak 0,1 ml dari setiap biakan dalam BHIB dipipet dan dipindahkan
ke dalam tabung reaksi steril. Selanjutnya, ditambahkan 0,3 ml plasma kelinci
pada masing-masing tabung. Tabung kemudian diinkubasi pada suhu 37C
selama 4-6 jam. Diamati adanya reaksi penggumpalan plasma. Penggumpalan
menunjukkan koagulase Staphylococcus aureus positif.

4. Identifikasi bakteri Bacillus subtillis

Uji Katalase
Terdapat pembentukan gelembung-gelembung gas oksigen bebas yang
menunjukkan reaksi positif. Bakteri Bacillus subtillis berarti mampu menguraikan
hidrogen peroksida dengan menghasilkan enzim katalase.

Uji Methyl Red


Dari biakan murni Nutrien Agar miring, diinokulasikan 1 sengkelit biakan
ke dalam media Methyl Red-Voges Proskauer (MR-VP), kemudian diinkubasi
pada suhu 37C selama 48 jam. Dengan menggunakan pipet, 5 ml biakan
dipindahkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 5 tetes merah metil, dan
dikocok sampai homogen. Warna kuning menunjukkan reaksi negatif dan warna
merah menunjukkan hasil positif. Bacillus subtillis saat ditambahkan merah metil
berwarna coklat kehitaman yang berarti reaksi negatif.

Uji Voges Proskauer


Dari biakan murni Nutrien Agar miring, diinokulasikan 1 sengkelit biakan
ke dalam media Voges Proskauer (VP), kemudian diinkubasi pada suhu 37C
selama 48 jam. Dengan menggunakan pipet, 1 ml biakan dipindahkan ke dalam
tabung reaksi, ditambahkan 0,5 ml larutan -naftol dan 0,2 ml larutan kalium
hidroksida, kemudian dkocok sampai homogen dan didiamkan selama 2-4 jam.
Warna merah muda hingga merah tua menunjukkan reaksi positif, sedangkan
warna tidak berubah menunjukkan reaksi negatif. Bacillus subtillis memberikan
warna coklat kehitaman saat ditambahkan pereaksi Barrits A dan Barrits B yang
menunjukkan hasil negatif.

Beberapa uji biokimia yang umum, diantaranya adalah:

1. Reaksi Fermentasi Karbohidrat (Gula-gula)


Media gula-gula digunakan untuk mengidentifikasi bakteri yang mampu
memfermentasikan karbohidrat menjadi bermacam-macam zat, seperti
alkohol, asam, dan gas tergantung pada macamnya gula dan spesies bakteri.
Terbentuknya asam pada uji ini ditandai dengan berubahnya warna indikator
pada medium. Media yang sebelumnya berwarna merah (merah fenol) atau
biru (biru bromtimol) berubah warna menjadi kuning. Untuk melihat
pembentukan gas, yaitu dengan terlihatnya udara dalam tabung
peragian/fermentasi (tabung Durham). Media gula-gula mempunyai tutup
yang berwarna tertentu untuk mengenali isi gulanya, yaitu:
- Media gula laktosa dengan tutup berwarna kuning
- Media gula laktosa dengan tutup berwarna ungu
- Media gula maltosa dengan tutup berwarna merah
- Media gula manitol dengan tutup berwarna hijau
- Media gula sakarosa dengan tutup berwarna biru

2. Uji IMVIC (Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Simmons citrate)


a. Indol
Media indol digunakan untuk melihat kemampuan bakteri mendegradasi
asam amino triptofan secara enzimatik. Triptofan terkonversi menjadi
indol, asam piruvat, dan amonia dengan adanya enzim triptofanase yang
dimiliki oleh bakteri tertentu. Indol yang terbentuk dapat dideteksi dengan
menambahkan pereaksi Kovacs (mengandung p-dimetilsminobenzoat,
butanol, dan HCl) ke dalam media. Uji indol dikatakan positif ditandai
dengan terbentuknyalapisan (cincin) berwarna merah ceri yang
merupakan senyawa kompleks yang menunjukkan bakteri memiliki enzim
triptonase yang dapat menghidrolisis asam amino jenis triptofan yang
memiliki gugus samping indol. Jika warna media setelah ditetesi pereaksi
Kocvacs tetap kuning, berarti reaksi indol negatif.

b. Methyl Red
Media ini digunakan untuk mendeteksi bakteri yang memiliki kemampuan
untuk mengoksidasi glukosa menghasilkan produk asam berkonsentrasi
tinggi yang stabil sehingga menyebabkan pH media turun hingga di
bawah 4,4 yang ditandai dengan pembentukan warna merah (reaksi
positif) setelah direaksikan dnegan indikator merah metil. Rekasi Methyl
Red ini dapat digunakan untuk membedakan organisme enterik yang
dapat mengoksidasi glukosa. Uji merah metil untuk Escherichia coli
adalah positif.

c. Voges Proskauer
Uji Voges Proskauer digunakan untuk membedakan lebih jauh antara
organisme enterik seperti Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, dan
Klebsiella pneumoniae. Uji ini bertujuan untuk melihat kemampuan
organisme untuk memproduksi hasil akhir yang bersifat netral (bukan
asam) seperti asetilmetilkarbinol dari asam organik yang dihasilkan oleh
metabolisme glukosa. Hasil uji positif jika media yang ditetesi dengan
pereaksi Barrtis (-naftol dan KOH 40%) membentuk warna merah
mawar.

d. Media agar Simmons citrate


Uji Simmons citrate digunakan untuk melihat kemampuan organisme
enterik berdasarkan kemampuan memfermentasi sitrat sebagai sumber
karbon. Media Simmons citrate mengandung indikator biru bromtimol
yang akan berubah menjadi biru pada reaksi positif dan akan tetap
berwarna hijau bila reaksi negatif.

3. Media TSIA (Triple Sugar Iron Agar)


Media TSIA digunakan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam
memfermentasi gula-gula membentuk asam saja, basa saja, asam dan basa,
dengan disertai atau tidaknya pembentukan gas. Uji ini dapat membedakan
kelompok-kelompok atau genus-genus dalam Enterobacteriaceae dii mana
seluruhnya merupakan basil gram negatif yang dapat memfermentasikan
glukosa dengan memproduksi asam. Media TSIA mengandung tiga macam
gula-gula (triple sugar) yaitu laktosa 1%, sukrosa 1%, dan glukosa 0,1%,
indikator asam-basa merah fenol, dan natrium tiosulfat serta fero sulfat.
Adanya pembentukan asam akan merubah warna media yang semula
berwarna jingga kemerahan menjadi kuning, sedangkan jika basa yang
terbentuk maka media akan berubah menjadi merah. Adanya pembentukan
gas ditandai dengan adanya gelembung/pecahnya agar di daerah tusukan,
dan jika gas yang dihasilkan adalah H2S, maka akan terbentuk endapan
hitam fero sulfida (Fe + H2S FeS) di daerah tusukan.

4. Media LIA
Media LIA digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme
dalam dekarboksilasi lisin membentuk amin kadaverin yang bersifat basa
sehingga merubah warna media yang mengandung indikator bromkresol
ungu dari berwarna coklat menjadi berwarna ungu (reaksi positif). Reaksi ini
dapat disertai dengan ada atau tidaknya pembentukan gas (adanya
gelembung/pecahnya agar di daerah tusukan atau adanya endapan hitam
FeS).

5. Uji Katalase
Uji katalase digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme
untuk menguraikan hidrogen peroksida dengan menghasilkan enzim
katalase. Produksi katalase dapat dtentukan dengan menambahkan substrat
H2O2 ke dalam biakan agar miring TSA (Trypticase Soy Agar) yang telah
diinkubasi. Jika terdapat katalase, reaksi kimia yang telah disebutkan di atas
ditunjukkan dengan adanya gelembung-gelembung gas oksigen bebas. Ini
menunjukkan uji katalase positif, tidak adanya pembentukan gelembung gas
menunjukkan hasil uji katalase negatif.

III. Metodologi
Sebelum melakukan uji reaksi-reaksi biokimia terhadap bakteri, disiapkan alat-
alat berupa tabung reaksi bersih, tabung Durham, rak tabung reaksi, jarum Ose
bundar dan lurus, pembakar spiritus, pipet tetes. Disiapkan juga bahan-bahan yang
meliputi suspensi biakan bakteri Escherichia coli, Salmonella typhii, Bacillus subtillis,
Klebsiella pnemoniae, Staphylococcus aureus, dan Pseudomonas aeruginosa
berumur 24 jam dengan kerapatan 25% T, media gula-gula (glukosa, laktosa,
maltosa, manitol, sakarosa), Media MRPV (Methyl Red-Voges Proskauer), Media
agar Simmons citrate, Media agar LIA (Lysine Iron Agar), Media agar TSIA (Trple
Sugar Iron Agar), Media TSA (Trypticase Soy Agar). Bahan berupa pereaksi dan zat
warna yang terdiri dari pereaksi Kovacs, pereaksi merah metil, pereaksi Barrits A (-
naftol), pereaksi Barrits B (KOH 40%), hidrogen peroksida 3%, p-aminodimetilanilin
oksalat.

3.1 Reaksi Fermentasi Gula


Sebelum masuk ke Laboratorium Mikrobiologi praktikan memakai jas
laboratorium yang bersih lengkap dengan masker, penutup kepala, dan sarung
tangan, kemudian mensterilkan diri sendiri sebelum memulai pekerjaan dengan
cara mencuci tangan dengan sabun di wastafel, lalu tangan dibersihkan lagi
dengan alkohol 70%. Bersihkan pula meja laboratorium dengan alkohol 70% dan
diletakkan 2 lampu spiritus yang telah diberi jarak sekitar 20 cm. Pengerjaan
dilakukan di antara 2 lampu spiritus agar dicapai media yang steril. Teknik
pengerjaan ini disebut teknik aseptis.
Disiapkan alat-alat berupa tabung reaksi bersih, tabung Durham, rak
tabung reaksi, jarum Ose bundar dan lurus, pembakar spiritus, pipet tetes, dan
bahan-bahan yang berupa bakteri Escherichia coli, Salmonella typhii, Bacillus
subtillis, Klebsiella pnemoniae, Staphylococcus aureus, dan Pseudomonas
aeruginosa berumur 24 jam dengan kerapatan 25% T, dan media gula-gula
berupa, glukosa, laktosa, maltosa, manitol, dan sakarosa.
Diinokulasikan suspensi bakteri Escherichia coli, Salmonella typhii, Bacillus
subtillis, Klebsiella pnemoniae, dan Staphylococcus aureus sebanyak masing-
masing 1 sengkeit ke dalam setiap media gula-gula. Hati-hati dalam
pengocokan, jangan sampai menimbulkan gas di dalam tabung Durham
sehingga menimbulkan reaksi positif palsu. Diinkubasikan bakteri yang telah
diinokulasi selama 18-24 jam pada suhu 35-37C. Diamati hasil inkubasi
beruapa ada atau tidaknya pembentukan asam yang ditunjukkan dengan
perubahan warna media dari merah menjadi kuning dan ada atau tidaknya
pembentukan gas berupa gelembung pada tabung Durham.

3.2 Uji IMVIC (Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Simmons citrate)
Disiapkan alat-alat berupa tabung reaksi bersih, tabung Durham, rak
tabung reaksi, jarum Ose bundar dan lurus, pembakar spiritus, pipet tetes, dan
bahan-bahan yang berupa bakteri Escherichia coli, Salmonella typhii, Bacillus
subtillis, Klebsiella pnemoniae, Staphylococcus aureus, dan Pseudomonas
aeruginosa berumur 24 jam dengan kerapatan 25% T, dan pereaksi, berupa
pereaksi Kovacs, Methyl Red, Voges, Proskauer, dan Simmons citrate.
a. Indol
Diinokulasikan suspensi bakteri sebanyak satu sengelit ke dalam
media indol. Diinkubasikan bakteri yang telah diinokulasi selama 18-24 jam
pada suhu 35-37. Setelah diinkubasi, diteteskan pereaksi Kovacs
sebanyak 6-8 tetes. Diamati hasilnya, bila hasil positif maka akan terbentuk
lapisan cincin berwarna merah ceri pada permukaan media.

b. Methyl Red
Diinokulasikan suspensi bakteri sebanyak satu sengelit ke dalam
media Methyl Red (MR). Diinkubasikan bakteri yang telah diinokulasi
selama 18-24 jam pada suhu 35-37. Setelah diinkubasi, diteteskan
pereaksi methyl red 6-8 tetes ke dalam tabung reaksi yang berisi media.
Diamati hasilnya, jika berubah menjadi warna merah, maka reaksi positif,
bila tetap berwarna kuning maka reaksi negatif.

c. Voges Proskauer
Diinokulasikan suspensi bakteri sebanyak satu sengelit ke dalam
media indol. Diinkubasikan bakteri yang telah diinokulasi selama 18-24 jam
pada suhu 35-37. Setelah diinkubasi, diteteskan pereaksi Barrits A (-
naftol) 12 tetes dan pereaksi Barrits B (KOH 40%) sebanyak 4 tetes ke
dalam tabung yang berisi media. Dihomogenkan dan dibiarkan selama 15
menit. Dilihat hasilnya, bila berwarna merah maka reaksi positif.

d. Simmons citrate
Diinokulasikan suspensi bakteri sebanyak satu sengelit dengan cara
gores zig-zag dan tusuk ke dalam media agar miring Simmons citrate.
Diinkubasikan bakteri yang telah diinokulasi selama 18-24 jam pada suhu
35-37. Setelah diinkubasi, diamati hasilnya, bila media agar Simmons
citrate berwarna biru maka reaksi positif.
3.3 Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
Diinokulasikan bakteri dari suspensi bakteri yang telah disediakan
sebanyak satu sengkelit dengan cara digores dan ditusuk pada media agar
miring TSIA. Diinkubasikan selama 18-24 jam pada suhu 35-37. Diamati hasil
inkubasi dengan melihat perubahan warna, endapat hitam, fero sulfida didaerah
tusukan dan lereng dan pembentukan gas yang terjadi.

3.4 Uji LIA (Lysine Iron Agar)


Diinokulasikan bakteri dari suspensi bakteri yang telah disediakan
sebanyak satu sengkelit dengan cara gores dan ditusuk pada agar miring LIA.
Diinkubasikan selama 18-24 jam pada suhu 35-37. Diamati hasil inkubasi
dengan melihat perubahan warna. Bila media berwarna ungu maka uji LIA
positif.

3.5 Uji Katalase


Diinokulasikan bakteri dari suspensi bakteri yang telah disediakan
sebanyak satu sengkelit dengan cara gores dan ditusuk pada agar miring TSA.
Diinkubasikan selama 24-48 jam pada suhu 37. Diteteskan pereaksi hidrogen
peroksida 3% sebanyak 3-4 tetes di sepanjang permukaan lereng agar miring
TSA yang telah ditumbuhi bakteri uji. Diamati media yang diuji, apakah
ada/tidaknya gelembung/ busa pada biakan.

IV. Hasil Praktikum dan Pembahasan

Hasil Pengamatan

Reaksi Gula-gula IMVIC TSIA LIA


Na
Ka
ma I S
Gluko Sakar M V L tal
Ba Laktosa Maltosa Manitol n i Lereng Tusukan
sa osa R P er Tu G as
kte d t H2
e suk a e
ri A G A G A G A G A G A B A B G H S
n an s
s a s a 2
g
S
S.
aur
eu + - + - + - + - + - + + - - - - - - - - + + - - -
s
E.
coli + + + + + + + + + + + + - - + - + - - - +
B.
su
btill + - - - + - - - + - - + - - + - + - - - + + - - -
is
S.
typ + - - - + - + - + - - + - + - + - + - - + + - + -
hii

1. Pada uji fermentasi yang dilakukan kelompok 6 pada bakteri Staphylococcus


aureus didapatkan hasil positif pada media gula glukosa, laktosa, maltosa,
manitol, dan sakarosa berupa perubahan warna indikator yang tadinya berwarna
merah menjadi berwarna kuning. Hal ini menandakan adanya kegiatan
fermentasi karbohidrat menjadi asam oleh bakteri Staphylococcus aureus. Tidak
terdapat gelembung udara pada media gula-gula (glukosa, laktosa, maltosa,
manitol, dan sakarosa), yang menandakan tidak adanya karbohidrat yang
difermentasi menjadi gas.
2. Pada uji indol, didapatkan lapisan cincin berwarna merah ceri pada media. Hal
ini menandakan bahwa bakteri Staphylococcus aureus memiliki asam amino
triptofan dan mampu mendegradasi asam amino triptofan menjadi indol, asam
piruvat, dan amonia.
3. Pada uji Methyl Red (MR), media Methyl Red berwarna merah yang
menandakan reaksi positif. Hal ini menandakan bahwa bakteri memiliki
kemampuan untuk mengoksidasi glukosa sehingga menghasilkan produk asam
berkonsentrasi tinggi yang stabil sehingga menyebabkan pH media turun hingga
di bawah 4,4.
4. Pada uji Voges Proskauer, media berwarna kuning yang menandakan reaksi
negatif. Hal ini berarti bakteri tidak memiliki kemampuan untuk memproduksi
hasil akhir yang bersifat netral, melainkan bersifat asam.
5. Pada uji Simmons citrate, media tetap berwarna hijau dan tidak berubah menjadi
warna biru. Hal ini menunjukkan reaksi negatif, yang berarti bakteri tidak memiliki
kemampuan untuk memfermentasi sitrat sebagai sumber karbon.
6. Pada uji dengan media TSIA, tidak ada perubahan warna yang terjadi. Hal ini
menandakan bahwa reaksi negatif terhadap pembentukan asam dan basa.
Begitu pula, tidak terdapat gelembung dan endapan fero sulfida di daerah
tusukan. Hal ini menandakan bahwa bakteri tidak memiliki kemampuan dalam
memfermentasi gula-gula dalam bentuk asam saja, basa saja, atau asam dan
basa serta tidak mampu membentuk gas.
7. Pada uji LIA tidak terdapat perubahan warna menjadi ungu, pembentukan gas
H2S maupun endapan berwarna hitam fero sulfida. Hal ini menandakan bahwa
bakteri tidak memiliki kemampuan untuk mendekarboksilasi lisin membentuk
amin kadaverin yang bersifat basa yang mampu merubah warna media menjadi
ungu. Namun, terdapat jejak bakteri pada lereng dan di daerah tusukan.
8. Pada uji katalase tidak ditemukan adanya pembentukan gelembung-gelembung
gas yang menunjukkan hasil uji katalase negatif. Hal ini menunjukkan bahwa
bakteri Staphylococcus aureus tidak memiliki kemampuan untuk menguraikan
hidrogen peroksida dengan menghasilkan enzim katalase.
9. Menurut Bergeys Manual of Determinative Bacteriology Ninth Edition bakteri
Staphylococcus aureus (subsp. anaerobius) bereaksi positif pada media maltosa
dan bereaksi negatif pada media manitol dan -laktosa. Pada Staphyolococcus
aureus (subsp. aureus) bereaksi positif terhadap maltosa, manitol, dan -laktosa.

V. Kesimpulan
1. Cara-cara yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri dengan reaksi-reaksi
biokimia adalah dengan media gula-gula, uji IMVIC (Indol, Methyl Red, Voges
Proskauer, dan Simmons citrate), media TSIA, media LIA, dan uji katalase.
2. Hasil yang ditunjukkan pada bakteri Staphylococcus aureus pada reaksi gula-
gula adalah positif terbentuk asam pada media gula glukosa, laktosa, maltosa,
manitol, dan sakarosa. Pada media indol dan Methyl Red reaksi positif
ditunjukkan dengan terdapatnya lapisan cincin berwarna merah ceri pada media
indol dan perubahan warna merah pada media Methyl Red. Pada media Voges
Proskauer dan Cimmons citrate reaksi negatif. Pada uji TSIA positif asam pada
lereng dan positif asam pada tusukan. Pada uji LIA positif asam pada lereng dan
tusukan. Pada uji katalase reaksi negatif.

VI. Daftar Pustaka


1. Radji, Maksum Dr. M. Biomed. 2010. Buku Ajar Mikrobiologi Panduan
Mahasiswa Farmasi dan Kedokteran. Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta. hal.
273-282
2. Holt G., John, dkk. -. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology Ninth
Edition. A Waverly Company. hal. 544
VII. Lampiran

Keterangan (dari kiri ke kanan):

1. Media IMVIC, TSIA, LIA, TSA dengan bakteri Staphyolococcus aureus


2. Media IMVIC, TSIA, LIA, TSA dengan bakteri Staphyolococcus aureus
3. Media gula-gula dengan bakteri Staphyolococcus aureus