Cromatografia si electroforeza

I. N oţiu n i teoretice
1. Cromatografia
C rom atografia reprezintă o tehnică d e separare a componentelor unui amestec, între două faze:
una m obilă şi alta staţionară, ca urmare a deplasării fazei mobile de-a lungul celei staţionare şi a antrenării
compo-nentelor am estecului în m işcare, cu viteze diferite, ocupând astfel poziţii diferite de-a lungul fazei
staţionare. În acest mod componentele sunt separate şi apoi identificate.
În funcţie de natura fazelor se disting urm ătoarele tipuri de cromatografie:
Faza mobila F aza staţion ara Denumire
lichid lichid lichid - lichid (LL)
lichid solid lichid - solid (LS)
gaz solid gaz - solid (GS)
gaz lichid gaz - lichid (GL)

Metodele de separare cromatografice se împart în:

- metode bazate pe afinitatea diferită a com ponenţilor (repartiţie de fază, adsorbţie, absorbţie,
schimb ionic, afinitate);
- m etode bazate pe m ărim ea diferită a com ponenţilor (excluziune sferică).
Din punct de vedere practic cele mai utilizate metode de cromatografie sunt: cromatografia pe
coloană, cromatografia pe hârtie, cromatografia în strat subţire, gaz crom atografia .
C rom atografia pe coloană – C oloanele crom atografice sunt confecţionate din sticlă. P entru o
bună rezoluţie se folosesc coloane lungi dar în condiţiile în care se doreşte separarea unei cantităţi m ari de
substanţe se folosesc coloane cu un diam etru m ai m are.
În interiorul coloanei se introduce faza staţionară ce trebuie, într-o prim ă etapă, echilibrată cu
solventul de lucru.
Amestecul ce urm ează a fi separat se pipetează în partea superioara a tubului.
S e conectează rezervorul cu solvent (faza m obilă) la coloană şi se aşteaptă până ce are loc
separarea.
D atorită deplasării fazei m obile de-a lungul celei staţionare are loc antrenarea com pon entelor din
amestec într-o m işcare descendentă, în lungul coloanei astfel încât în tim p vo r ocupa poziţii diferite.
F racţiile sunt colectate în tuburi şi apoi analizate.
 Figura 4.1. C ro m ato grafie p e co lo an ă.

Cromatografia pe hârtie - reprezintă una din cele mai simple metode de analiză. În această
m etodă faza fixă este reprezentată de o suprafaţă de hârtie specială sau hârtie de filtru, iar faza m obilă
(eluentul) de un lichid ce se deplasează de-a lungul fazei fixe datorită forţelor de adeziune şi forţelor
gravitaţionale. S e îm parte în: crom atografie pe hârtie verticală (ascendentă sau descendentă) şi orizontală
(Pfeiffer). În figura 4.2 se poate urm ări diferenţa dintre aceste m etode.

Figura 4.2. Cromatografie pe hârtie verticală ascen d en tă şi d escend en tă

Identificarea com puşilor izolaţi în timpul cromatografiei se face fie cu ajutorul spoturilor martor,
fie calculând tim pul de reţinere al fiecărui component separat (Rj), definit ca raportul dintre distanţa faţă
de linia de start pe care a migrat componentul respectiv (notată cu X j) şi distanţa pe care a migrat eluentul
(notată cu Y ):
Xj
Rj 
Y
T im pul de reţinere depinde de: natura fazei fixe, natura fazei m obile, natura substanţei,
temperatură; se găseşte tabelat pentru diferite substraturi, eluenţi şi substanţe, de regulă pentru
temperaturi de 200C.
 2. Electroforeza
R eprezintă m etoda de separare bazată pe migrarea sub influenţa câm pului electric a substanţelor
încărcate cu sarcin ă electrică.
Eletroforeza poate fi folosită atât în scop analitic (separarea com ponenţilor şi dozarea lor),
preparativ (obţinerea unor com ponenţi în stare pură) dar şi ca metodă de studiu a proprietăţilor
superficiale ale unor celule sau organite celulare.
O particulă încărcata electric, când este dizolvată sau suspendată într-un mediu lichid, sub
influenţa unui câmp electric uniform, atinge o viteză constantă de m igrare. S peciile încărcate pozitiv se
vor îndrepta către catod, iar speciile încărcate negativ către anod. V iteza de migrare a ambelor specii va fi
determinată de forţele care acţionează asupra lor. A ceste forte sunt:
- forţa de atracţie electroforetică: F1  Q E

- forţa de frecare S tokes: F2  6  r v

- forţa de frânare electroforetică: F3  Q  r E

- forţa F4 datorata efectului de relaxare

Im ediat după aplicarea câm pului electric, sum a vectorială a acestor patru forte este egală cu zero
şi viteza electroforetică devine constantă (figura 4.3). Neglijând efectul de relaxare şi ţinând cont de
direcţiile celor trei forte se obţine viteza electroforetică:
E
v
6  
unde: - ε = perm itivitatea absolută a m ediului
- ξ = potenţialul electrocinetic
- E = intensitatea câmpului electric
- η = coeficientul de vâscozitate
M obilitatea electroforetică se defineşte ca raportul dintre viteză şi intensitatea câmpului electric:
v

E
Datorită încărcării electrice nete de la suprafaţa particulelor biologice, în acestă regiune se
organizează, se structurează, un strat dublu electric alcătuit dintr-o zonă compactă de grosime (a) şi una
difuză, în care pentru sim plitate, suprafaţa de dem arcare a particulei faţă de mediu este considerată plană
(figura 4.3).
Când particula este pusă în m işcare de către câm pul electric aplicat, aceasta antrenează o dată cu
ea un strat de lichid mai gros decât cel compact, notat cu (b). Planul care se află la distanţa ba de
particulă se num eşte plan hidrodinamic de alunecare, iar potenţialul în acest plan se num eşte potenţial
electrocinetic (ξ). V aloarea potenţialului electro -cinetic se poate determ ina indirect pe baza m ăsurării
m obilitătii electroforetice a particulei în câmp electric.

Figura 4.3. F o rţele ce acţio n ează asu p ra un ei p articu le în cărcate cu sarcină electrică suspendată într-u n m ed iu lichid . D istribu ţia
ionilor în stratu l du blu electric d e la su p rafaţa u n ei p articule scu fu nd ate într-un electrolit.
Metoda microscopică de electroforeză - acestă metodă este singura tehnică disponibilă pentru
determinarea vitezei electroforetice a particulelor mari, cum ar fi celulele sanguine, microorganisme,
particule coloidale, etc. S e bazează pe observarea directă, la m icroscop a m igrării particulelor suspendate
într-o soluţie tam pon adecvată ca urm are a aplicării unui câmp electric creat de un curent continuu.
P entru această tehnică este necesară o celulă electroforetică (figura 4.4), prevăzută cu doi
electrozi, un sistem de um plere şi golire, ce se poate introduce în câm pul unui m icroscop. C elula poate fi
plană sau cilindrică (capilară).

Figura 4.4. E lectro fo reza m icro sco p ică: cu va electro fo retică fo lo sită şi im agin ea
o b servată la m icro sco p p revăzu t cu m icro m etru o cu lar.

Electroforeza la joasă tensiune – E ste o m etodă ce permite separarea proteinelor plasmatice.

Dispozitivul experimental folosit este prezentat în figura 4.5.
C a suport al electrolitului (al soluţiei tam pon) se foloseşte atât hârtie specială pentru electroforeză
(de tip Whatman) cât şi m em brane de celuloză. D intre avantajele utilizării m em branelor de celuloză
amintim, în primul rând: rezoluţia m ult m ai bună şi un tim p de m igrare m ai m ic.
 Figura 4.5. E lectro fo reza la jo asă tensiune – dispozitiv experimental.

D upă separarea proteinelor urm ează un procedeu de fixare şi colorare. În primul rând, mediul
suport este fixat prin introducere în etanol, m etanol sau acid, ori prin încălzire făcând astfel proteinele
insolubile.
B enzile sunt colorate cu ajutorul unor coloranţi specifici proteinelor (albastru de brom fenol), se
spală în m ai m ulte băi cu acid acetic 2% şi sunt trecute prin vapori de am oniac pentru regenerarea
colorantului (figura 4.6).

Figura 4.6. Electroforeza – m ed iu l sup o rt du p ă p ro ced eele d e fixare şi co lo rare.

D upă aceste procedee benzile sunt scanate cu ajutorul unor densitom etre prin reflexie, transm isie
sau com binate, ce perm it trasarea spectrelor caracteristice probelor oferind totodată cantitatea în g/100ml.
Electroforeza pe un mediu suport acetat de celuloză a serului um an este prezentată în figura 4.7.

Figura 4.7. E lectro fo reza p e u n m ed iu sup o rt acetat d e celu lo ză a seru lu i u m an .

E ste cunoscut faptul că scăderea album inelor survine de regulă în toate disproteinem iile, fiind
însă m ai accentuată în cazul unui deficit în aportul de proteine, în deficitul de sinteză (ciroză hepatică),
sau în pierderi de proteine (sindrom nefrotic, arsuri).
 C reşterea α 1, α 2 – globulinelor se însoţeşte de regulă de o creştere a fibrinogenului şi a
glicoproteinelor şi de o accelerare a V S H -ului. O creştere m arcată a α 2 – globulinelor se întâlneşte în
sindromul nefrotic.
M odificările β – globulinelor au o im portanţă m ai redusă, dar creşterea γ – globulinelor indică
prezenţa unor inflam aţii cronice, sau sugerează o proliferare reactivă sau tum orală a im unocitelor
producătoare de im unoglobuline. S căderea γ – globulinelor survine în sindrom ul nefrotic, m alnutriţie.
T oate aceste m odificări au ca rezultat form e diferite ale spectrlor electroforegram elor analizate
(figura 4.8).

Figura 4.8. T ip u ri d e d isp ro tein em ie: (A ) In flam aţie acu tă, (B ) In flam aţie cro n ică, (C ) S in d rom n efro tic, (D ) E ntero p atie
exu d ativă, (E ) C iro ză h ep atică, (F ) M ielo m m u ltip lu , (G ) H ip o gam aglo b u lin em ie.

Focalizarea izoelectrica (electrofocusing) - reprezintă o m etodă de separare a particulelor cu

puncte izoelectrice diferite într-un gradient de pH sub acţiunea unui câm p electric om o gen.
Punctul izoelectric al unei particule (sau molecule) corespunde valorii pH-ului la care sarcina
electrica netă este nulă.
Dispozitivele de electrofocusing folosesc o coloana în care se realizează un gradient natural de
pH prin utilizarea unor amfoliţi transportori cu urm ătoarele proprietăţi: bună capacitate de tamponare şi
bună conductivitate la punctul izoelectric, masă moleculară mică, solubilitate bună la punctul izoelectric,
absorbţie mică a luminii peste 260nm, nu reacţionează chim ic cu com ponenţii am estecului ce urm ează a fi
descompus.
C ei m ai utilizaţi sunt acizii poliam inopolicarboxilici având m asa m oleculară între 300-1000D şi
puncte izoelectrice situate în domeniul de pH=3-10.