DETERMINAO DA ATIVIDADE DAS TRANSAMINASES ASPARTATO-

AMINOTRANSFERASE (AST) E ALANINA-AMINOTRANSFERASE (ALT)

NO SORO SANGUNEO HUMANO
1. INTRODUO

As transaminases so enzimas descobertas por Needham (1927) e caracterizadas

definitivamente por Braunstein e Kritzman (1937). Elas participam da reao de
transferncia reversvel do grupo -amino de aminocidos para o grupo -cetnico de -
cetocidos (particularmente para o cido -cetoglutrico), produzindo o -ceto-anlogo
do aminocido doador do grupo amino, alm de cido glutmico. Abaixo podemos
observar as reaes catalisadas por duas importantes transaminases, aspartato
aminotransferase (que produz o cido oxaloactico) e alanina aminotransferase (que
produz cido pirvico). comum a todas as transaminases a exigncia da coenzima
piridoxal fosfato.

Essa reao enzimtica se verifica praticamente entre todos os aminocidos, com

exceo da lisina e da treonina. Em cada caso individual trata-se de uma transaminase
diferente, especfica para os aminocidos que ser desaminado. As mais bem estudadas,
tanto em condies normais como patolgicas, so as transaminases da alanina e do
cido asprtico, dos tecidos hepticos, muscular e cardaco.
2. MTODOS DE DETERMINAO DA ATIVIDADE ENZIMTICA DE
TRANSAMINASES

2.1. MTODO FOTOCOLORIMTRICO DE REITMAN-FRANKEL MODIFICADO

O mtodo baseia-se na transferncia do grupo amnico do cido asprtico para o

cido -cetoglutrico, formando cido glutmico e cido oxaloactico, para determinao
da atividade da AST. Por outro lado, a ALT catalisa a transferncia do grupo amnico da
alanina para o cido -cetoglutrico, formando cido glutmico e cido pirvico.

Aps a incubao dos substratos com a enzima presente no soro sanguneo,

adiciona-se a soluo de 2,4-dinitrofenilhidrazina, formando-se assim as hidrazonas
correspondentes dos -cetocidos, as quais se coram em meio alcalino. A comparao
da intensidade de cor feita com uma soluo padro de piruvato.

A reao final se resume no seguinte:

COOH COOH
H O
I 2 I
C = O + H2N - NH - C6H3 C = N - NH - C6H3
I I
R R

-cetocido + fenilhidrazina hidrazona correspondente

Nesse processo, uma unidade fotocolorimtrica de transaminase corresponde a um

micrograma de cido pirvico liberado por mL de soro em 60 minutos, nas condies
especficas da tcnica.

1 UF = 1 g/mL/60 min

Estas unidades no so comparveis, em termos numricos, s unidades obtidas

pelo mtodo espectrofotomtrico.

2.2. MTODO ESPECTROFOTOMTRICO

Nesse mtodo, o cido -cetoglutrico mais o cido asprtico (no caso da AST) so
incubados formando-se, em um perodo de tempo fixado previamente, determinada
quantidade de cido oxaloactico em funo da quantidade de enzima presente.
Simultaneamente, o meio de incubao contm malato-desidrogenase e NADH,
transformando-se, ento, aquele -cetocido em cido mlico e o NADH se oxidando a
NAD+. A extenso desta ltima transformao , em ltima anlise, proporcional
transaminase presente e pode ser medida no espectrofotmetro, no comprimento de
onda de 340 nm, no qual a forma reduzida NADH apresenta absorvncia elevada e a
forma oxidada NAD+ praticamente no absorve (Tcnica de Karmen, Wroblewski e La
Due).

A unidade Karmen de transaminase definida como a quantidade de enzima que

causa um decrscimo de extino de 0,001 por minuto no sistema, desde que a
incubao seja realizada em condies definidas (temperatura ambiente, pH 7,4).
Para dosagem da ALT, em que resulta o cido pirvico, utiliza-se a lactato-
desidrogenase como enzima acoplada.
 3. PROTOCOLO DO MTODO DE REITMANN-FRANKEL MODIFICADO

Preparar 2 tubos tipo Eppendorf conforme a tabela abaixo:

Reagente e amostra BA ( L) A ( L)
Soro sanguneo 20
Soluo de substrato da AST ou da ALT 200 180

Agitar bem os tubos e incubar a 370C por 10 minutos.

Aps a incubao, prosseguir conforme a tabela abaixo:

Curva padro Amostra

BCP 1 2 3 4 BA A
Reagentes e amostras
( L) ( L) ( L) ( L) ( L) ( L) ( L)
Soro sanguneo + substrato - - - - - 200 200
(aps a incubao a 370C) (j (j
pipetado) pipetado)
Soluo de piruvato 22 - 10 20 30 40 - -
mg%
Soluo de substrato da 200 190 180 170 160 - -
AST ou da ALT
Soluo de 2,4- 200 200 200 200 200 200 200
dinitrofenilhidrazina

Agitar bem os tubos e manter em temperatura ambiente por 15 minutos.

Adicionar 0,5 mL de NaOH 2 M em todos os tubos (curva padro e amostra).
Agitar bem e deixar em repouso em temperatura ambiente por 5 minutos.
Aps esse tempo de repouso, transferir 250 L para um poo de uma microplaca
de 96 poos.
Ler as absorvncias dos tubos da curva padro e das amostras em
espectrofotmetro em 490 nm.
Descontar das Abs dos tubos da Curva padro o valor obtido para o tubo branco
da curva padro (BCP). Descontar da Abs da amostra o valor obtido para o tubo branco da
amostra (BA).

4. TAREFAS

Calcular a quantidade de piruvato em cada tubo da curva padro;

Calcular os fatores de calibrao parciais (F.C.P.) e o fator de calibrao mdio
(F.C.M.);
Calcular a quantidade de piruvato no tubo A em g pelo mtodo matemtico;
Traar a curva padro pelo mtodo manual, colocando os valores das
absorvncias no eixo das ordenadas (Y) e os valores das quantidades de piruvato (em
g) no eixo das abscissas (X).
Determinar a quantidade de piruvato no tubo A em g pelo mtodo grfico;
Calcular o valor do fator direto para a anlise;
Calcular a atividade de AST e ALT pelo mtodo matemtico, pelo mtodo grfico e
pelo mtodo do FD, expressando o resultado em unidades fotocolorimtricas (UF).
5. VALORES NORMAIS

AST: 8 a 40 unidades fotocolorimtricas (UF).

ALT: 5 a 35 unidades fotocolorimtricas (UF).

6. INTERPRETAO
A concentrao das transaminases no soro sanguneo eleva-se acentuadamente
aps processos que implicam na destruio de tecidos.
As transaminases do soro aparecem elevadas em inmeras condies patolgicas,
tais como pancreatite aguda (onde a -amilase tambm est elevada no soro), necrose
heptica (ambas as transaminases aparecem elevadas), e no infarto do miocrdio
(somente a AST aparece elevada). A elevao da ALT, no ltimo caso, somente se
verifica em condies de necroses muito extensas e se explica pelo fato de o msculo
cardaco conter concentrao relativamente baixa desta enzima. Outra diferena se
reflete no tipo de curva de variao da taxa com o tempo. No caso do fgado, a elevao
muito menos rpida, porm retorna ao normal em tempo muito mais prolongado, que se
pode estender a semanas ou meses. Enquanto, em mais de 95% dos casos de infarto do
miocrdio, a sua taxa atinge valores de centenas aps as primeiras doze horas, tendendo
a retornar ao normal aps 3 a 5 dias com relativa rapidez.

7. REAGENTES
A) Soluo tampo fosfato 0,1M pH 7,4
Fosfato dissdico anidro 11,925 g
Fosfato monopotssico anidro 2,177 g
Zefirol 1 mL
gua destilada q.s.p 1000 mL
Conservar essa soluo na geladeira.

B) Soluo Padro de Piruvato

Piruvato de sdio 22 mg
Soluo tampo fosfato q.s.p 100 mL
Conservar essa soluo na geladeira.

C) Soluo de 2,4-dinitrofenilhidrazina
2,4-dinitrofenilhidrazina 20 mg
Soluo de cido clordrico 1N q.s.p 100 mL

D) Soluo de Hidrxido de Sdio 0,4N

Hidrxido de Sdio 16 g
gua destilada q.s.p. 1000 mL

E) Substrato para SGOT

cido Asprtico 13,3 g
cido alfa -Cetoglutrico 146,0 g
Soluo de Hidrxido de Sdio 1N 107,5 mL
Soluo de Tampo Fosfato q.s.p. 500,0 mL
Ajustar o pH a 7,4 e conservar a soluo na geladeira .

F) Substrato para SGPT

cido alfa-Cetoglutrico 146,0 mg
L-Alanina 8,9 g
Soluo de Hidrxido de Sdio 1 N 2,7 mL
Soluo de Tampo Fosfato q.s.p 500,0 mL
Ajustar o pH a 7,4 e conservar a soluo na geladeira.

8. BIBLIOGRAFIA

COX, M.M.; NELSON, D.L. Lehninger. Principles of Biochemistry. 6 Ed. Editora Freeman.
Captulo 18.
VOET, D.; VOET, J.G. Bioqumica. 3 Ed. Editora Artmed. Captulo 26.
BERG, J. M.; TYMOCZKO, J. L.; STRYER, L. Biochemistry. 5th edition. Chapter 24. New
York: W. H. Freeman and Company, 2002.
BURTIS, C.A.; ASHWOOD, E.R.; BRUNS, D.E. TIETZ Fundamentos de Qumica Clnica.
6 edio. Captulo 19. Rio de Janeiro: Elsevier Editora Ltda, 2008.
DICK, Tuiskon. Introduo Bioqumica Prticas II. Editora Meridional EMMA, 2
edio, 1970.
 Relatrio N 4

Nome:________________________________No. Carto:__________Data:__________

DETERMINAO DA ATIVIDADE DAS TRANSAMINASES

1. MTODO:___________________________________________________________

2. OBJETIVOS:_________________________________________________________
______________________________________________________________________

3. RESULTADOS:

3.1. Curva Padro:

Quantidade
Absorvncia absoluta de F.C.P F.C.M.
Tubos
_______ nm piruvato _______ (unidade) _______ (unidade)
Padres
_____ (unidade)
ALT AST ALT AST ALT AST ALT AST
1
2
3
4
* Fazer o grfico da Curva Padro!!

3.2. Amostras:
Quantidade Concentrao
Absorvncia ________ (unidade) ________ (unidade)
Amostra
_______ nm Mtodo Mtodo Mtodo Mtodo
Matemtico Grfico Matemtico Grfico
ALT
AST

Valor do Fator Direto: ALT: ________________ AST: ____________________

Atividade __________ (unidades fotocolorimtricas UF)

Amostra
Mtodo Matemtico Mtodo Grfico Mtodo do Fator Direto
ALT
AST

4. DISCUSSO E CONCLUSO:
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________