Kecacatan Serotipe Virus PMS A Endemik di KPK,

Pakistan Secara In-vitro

LATAR BELAKANG

Virus serotipe A pada penyakit kaki dan mulut (FMDV) dianggap memiliki beragam
antigenik diantara berbagai lokasi geografis yang menyebabkan beragam pola
resistensi dan sensitivitas. Infektivitas virus dihitung berdasarkan dosis infektivitas
kultur jaringan dosis-50 (TCID-50 ) dan unit pembentuk plak (PFU). Virus dalam
suspensi (6 106 partikel / ml) diinaktivasi dengan menggunakan sumber Cobalt-60
pada sel BHK-21 yang ditanam di 96 piring sumur. Virus menunjukkan inaktivasi
lengkap pada pH 3, 5, 9 dan 11 dan dosis radiasi gamma 10kGy. Hasilnya
menunjukkan bahwa kenaikan suhu (baik panas lembab dan kering) dan sinar UV
serta peningkatan waktu paparan dengan iradiasi UV dosis yang sama secara
signifikan menurunkan infektivitas virus (p <0,05). Faktor fisik ini adalah alternatif
yang lebih baik untuk inaktivasi virus daripada bahan kimia, yang beracun bagi
kesehatan dan terakumulasi dalam produk hewani.

PENGANTAR

Virus serotipe A (FMDV-A) antimikroba dan penyakit mulut (FMDV)

beragam secara antigenik di antara berbagai lokasi geografis di seluruh dunia.
Keanekaragaman ini bertanggung jawab atas pola sensitivitas dan resistensi variabel
antar daerah. Analisis filogenetik sekuens pengkode protein variabel (VP-I) dari virus
serotipe A FMD dari Pakistan dan Afghanistan selama tahun 2002-2009 menunjukkan
bahwa dua genotipe yang dapat dikenali berbeda (I dan II) memiliki empat garis
keturunan yang termasuk dalam topotipe Asia, dalam serotipe A [ 14, 19, 23, 24].
Meskipun, A-Iran05 adalah garis keturunan serotipe A yang paling sering diamati di
dalam negeri namun yang lain juga ditemukan seperti A-Pak09. Serotipe A-Iran05
setelah analisis menunjukkan tujuh varian berbeda [12] dan masih berkembang
dengan tingkat 1,2 10-2 per tahun [12].
Inaktivasi tingkat industri virus biasanya melibatkan berbagai pendekatan fisik
termasuk perlakuan suhu atau paparan iradiasi pengion (gamma rays) [8], jadi metode
ini juga dapat diterapkan untuk inaktivasi virus secara in vitro [9]. FMDV juga dapat
diaktivasi pada pH asam dan pH [9]. Kontras, lampu UV lebih disukai karena
memiliki banyak manfaat, karena memerlukan sedikit ruang dan biaya operasional
daripada metode desinfeksi [2]. Selain itu, sinar UV juga bisa digunakan untuk
desinfeksi air tanah, pakan dan makanan yang terkontaminasi dan permukaan kontak
dan juga udara [8]. Namun, pola inaktivasi oleh sinar UV dapat bervariasi, tergantung
pada komposisi medium yang diperlakukan dimana virus ditangguhkan mis. serum
melindungi inaktivasi virus dengan sinar UV [7]. Sinar UV terutama menargetkan
RNA dari virus dan menyebabkan pembentukan dimmer pirimidin yang
menghentikan transkripsi dan terjemahan RNA serta replikasi virus [10].
Penelitian in vitro saat ini dirancang untuk menilai pertumbuhan dan replikasi
FMDV-A sebagai respons terhadap penerapan berbagai variabel yaitu suhu, pH,
radiasi UV dan gamma. Studi ini menguraikan prosedur yang digunakan secara
komersial atau ditetapkan oleh OIE, karena inaktivasi virus serotipe A yang beredar di
KPK, Pakistan.
BAHAN DAN METODE PENELITIAN

Penelitian ini dilakukan di BSL-II, Laboratorium Pusat Penelitian Penyakit Kaki dan
Mulut, Institut Penelitian Veteriner, Peshawar, Pakistan

2.1 Sumber dan budaya FMDV-A

Sampel dikumpulkan dari lapangan, sampel dibawa ke laboratorium serologi Pusat
Penelitian FMD, Peshawar untuk serotipe dengan Deteksi Antigen FMDV ELISA
(Serotipe FMDV O, A, C, Asia-1, (Stasiun Penelitian Penyakit Exotic, Institut
Nasional Kesehatan Hewan, Pertanian dan Makanan Nasional Organisasi Riset,
Josuihoncho Kodaira, Tokyo, Jepang) seperti yang telah dijelaskan sebelumnya.
Secara singkat, sampel jaringan dimasukkan ke dalam penggiling jaringan dan setelah
triturasi, lisat dikumpulkan dalam tabung falcon dan melewati membran nitroselulosa
(diameter 0,2m) dengan menggunakan semprit filter (Sartorius, Gottingen, Jerman)
Filtrat kemudian dikumpulkan dalam tabung eppendorff (Eppendorff, Hauppauge,
NY) dan serotipe dilakukan dengan menggunakan ELISA [15].

2.2 Perbanyakan sel BHK-21

Labu Roux (Corning, USA) yang mengandung monolayer sel darah merah Baby
Hamester-21) diperoleh dari laboratorium kultur sel dari pusat penelitian. Sel tumbuh
dalam media GMEM (Glasgow MEM BHK 21, Biowest, Riverside, MO, AS)
dilengkapi dengan Serin Janin Calf 5% (FCS), 100 U / ml penisilin dan streptomisin
10 mg / ml (Invitrogen, Cergy- Pontoise, Perancis) dan dipertahankan pada suhu 37 oC
dalam atmosfir 5% CO2 dan kelembaban 95%, seperti yang dijelaskan sebelumnya
(Ali et al 2014).

2.3 Budidaya virus

Untuk pertumbuhan virus, media perawatan yang digunakan adalah GMEM dengan
5% FCS dengan antobiotik 1% dan antimikotik 1%. Suspensi virus disaring melalui
filter 0.2m (Millipore, Billerica Massachusetts, AS) dan dituangkan ke dalam labu
roux yang mengandung monolayer dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 48 jam.
Efek sitopatik (CPEs) diamati pada inokulasi post 48h. Virus tersebut dipanen dan
disaring melalui saringan membran jarum 0.2m. Virus yang dihasilkan dituangkan
ke dalam tabung falcon 50ml dan aliquot disimpan dalam tabung eppendorff dengan
kapasitas 2ml untuk digunakan lebih lanjut dalam penelitian yang dirancang. Semua
prosedur dilakukan di Biosafety Cabinet-II / Class A2.

2.4 Kultur Jaringan Infeksi Dosis-50

TCID-50 virus dihitung dengan metode Spearman dan Karber dan itu adalah 6 10 6.
Virus yang dihasilkan disimpan pada suhu -80 C untuk penelitian lebih lanjut.

2.4.1 Fiksasi pelat

Setelah setidaknya 48h CPE mulai muncul. Sumur ditandai. Pelat itu diperbaiki
dengan menambahkan 100l fixative yaitu pilihan Histo yang mengandung kristal
violet atau Methyl blue di setiap sumur piring. Pelat itu disimpan semalam di kulkas,
dicuci dengan lembut di bawah pita air dan disadap pada kertas adsorben dan diamati
di bawah mikroskop. TCID-50 dihitung dengan menggunakan metode Spearman dan
Karber dengan menggunakan rumus: Log of 50% end point = log pengenceran
terkonsentrasi - (total tidak ada sel dengan CPE - 0,5 / no. Sumur per pengenceran)
faktor pengenceran
2. 5 Inaktivasi FMDV oleh faktor fisik yang berbeda
2. 5.1 Suhu (panas lembab dan kering)
Virus diinaktivasi pada suhu 37C, 57C dan 77C dengan panas kering (panas
yang disediakan dalam oven udara panas) dan panas lembab (panas yang disediakan
dalam bak air) masing-masing 15, 30 dan 45 menit.

2.5.2 Iradiasi UV
Sampel dibiarkan dalam Kabinet Biosafety di bawah sinar UV 258nm selama 15, 30
dan 45 menit.

2.5.3 Perlakuan pH
PH media yang mengandung virus disesuaikan dengan 3, 5, 7, 9, 11 dengan
menggunakan larutan 0,1N HCL dan 0,1N NaOH dan diinkubasi pada suhu 37 C
untuk semalam.

2.5.4 Iradiasi gamma Virus terpapar sumber Co60 dengan laju dosis 6,3146 kGy /
jam. Sampel dalam rangkap tiga diberi dosis iradiasi gamma sebanyak 10kGy, 20kGy,
25kGy, 35kGy, 40kGy, 45kGy dan 50kGy [20].
Kemudian TCID-50 sampel virus yang diobati dihitung seperti yang dibahas di atas.

2.6 Analisis Statistik

Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan perangkat lunak SPSS (versi
16.0) dengan menggunakan perbandingan satu arah ANOVA beberapa kali dengan uji
Post-Hoc. p <0,05 dianggap sebagai perbedaan yang signifikan secara statistik.

HASIL
1. Serotipe virus FMDV-A:
Serotipe FMDV dilakukan oleh ELISA seperti yang dijelaskan sebelumnya [15] dan
serotipe virus diidentifikasi sebagai A dengan nilai OD 2.34.
2. Sel budaya adaptasi virus:
Virus disesuaikan dengan kultur sel pada sel BHK-21 pada tingkat ke-4. Virus ini
tumbuh di media infeksi menggunakan labu Roux pada sel BHK-21.
3. Titrasi biologis virus FMDV-A:
Virus dititrasi secara biologis sebutkan kalimat metode ini dalam bahan dan metode
dan nilai TCID-50 yang dihitung adalah 6 106.
4. Efek panas terhadap kerentanan FMDV-A:
Hasil yang signifikan diperoleh saat FMDV-A terkena berbagai intensitas suhu selama
interval waktu yang berbeda. Nilai TCID-50 dan PFU virus yang signifikan lebih
tinggi diperoleh saat suhu proses FMDV-A meningkat dari 57C sampai 77C dan bila
waktu pemaparan meningkat dari 30 menjadi 45 menit (Tabel 1, 2 dan 3). Suhu yang
lebih tinggi adalah inaktivasi virus (Gambar 2.1 dan 2.2). Demikian pula, ketika
waktu paparan meningkat pada suhu tertentu, inaktivasi juga meningkat (Gambar 3.1
dan 3.2).
Panas lembab ditemukan lebih efisien pada semua suhu dibandingkan dengan panas
kering (Gambar 4.1 dan 4.2). Dengan demikian baik dengan meningkatkan waktu
paparan atau suhu secara signifikan mempengaruhi laju inaktivasi serotipe FMDV A.
Pada suhu yang lebih rendah, waktu pemaparan yang lebih rendah mungkin
diperlukan atau dengan meningkatkan waktu pemaparan untuk suhu tertentu, jumlah
panas yang lebih sedikit akan dibutuhkan.
Tabel 1: Pengaruh suhu pada TCID-50 dan PFU / ml bila waktu tetap konstan.
Tabel 2: Pengaruh waktu pemaparan pada TCID-50 dan PFU / ml virus FMDV-A
pada suhu konstan (panas lembab) (37oC, 57 oC, 77 oC)
Tabel 3: Pengaruh waktu pemaparan terhadap TCID-50 dan PFU / ml virus FMDV-A
pada suhu konstan (panas kering) (37oC, 57oC, 77oC)
5. Efek UV terhadap inaktivasi FMDV-A:
FMDV-A terkena sinar UV dengan panjang gelombang 252nm dalam lemari biosafety
selama 15, 30 dan 45 menit. Virus yang diobati menunjukkan penurunan titer infeksi;
Namun, virus tetap bertahan dan CPE diamati. Tes Post HOC mengungkapkan bahwa
inaktivasi virus berbasis UV adalah fungsi waktu dan intensitas sumber sinar UV
(Tabel 4, Gambar 5.1).

Tabel 4: Pengaruh Waktu Paparan vs Sinar UV pada TCID-50 dan PFU / ml

6. Pengaruh pH asam dan basa pada inaktivasi FMDV-A:
Virus terkena pH asam dan pH seperti yang dijelaskan pada bagian bahan dan metode.
Inaktivasi lengkap virus diamati pada pH asam dan pH 3, 5, 9 dan 11 seperti yang
dikonfirmasi oleh monolayer sel BHK-21 setelah pewarnaan dengan Histochoice. Nol
TCID-50 dan nol PFU diamati per ml; Menariknya, virus pada pH 7 tetap bertahan,
seperti yang ditunjukkan oleh CPE dan plak di piring kultur sel.
7. Efek iradiasi gamma pada inaktivasi FMDV-A:
Kerentanan virus FMDV-A diperiksa setelah iradiasi gamma dengan Co60 dengan
laju dosis 6,3146kGy / jam.
Sampel dalam rangkap tiga diberi dosis 10kGy, 20kGy, 25kGy, 35kGy, 40kGy, 45kGy
dan 50kGy. Hasil menunjukkan inaktivasi lengkap FMDV-A pada semua dosis yang
diuji; dimana, nol TCID-50 dan nol PFU / ml diamati untuk virus tersebut.

HASIL DAN PEMBAHASAN

FMDV-A berkembang terus menerus dan ada kebutuhan untuk menganalisis strain
baru yang muncul secara in vitro untuk memastikan inaktivasi lengkap dan juga
produk hewan bebas FMDV. Inaktivasi FMDV tidak tergantung pada faktor fisik,
melainkan bergantung pada serotipe dan strain virus dan subtipe serotipe tertentu [16].
Pekerja sebelumnya saat mengerjakan pasteurisasi HTST dari Virus saat terkena
sumber sinar UV pada panjang gelombang 252nm, penurunan titer virus diamati
dengan waktu pemaparan yang lebih lama, virus tersebut ditemukan layak dan CPE
diamati setelah inokulasi pada pelat kultur sel. Sebaliknya, inaktivasi FMDV diamati
oleh paparan sinar UV oleh orang lain [16,18]. Adanya serum di media bisa
melindungi virus dari inaktivasi UV seperti yang dilaporkan sebelumnya [7]; sehingga
keduanya mungkin memiliki pola sensitivitas UV yang sama. Ada kemungkinan dosis
radiasi yang lebih tinggi dapat digunakan untuk inaktivasi lengkap karena adanya
lemak dan protein dan rentang pH yang bervariasi pada produk hewani.
Pola sensitivitas strain FMDV-A dilaporkan lebih tinggi daripada virus
serotipe O [13]. Variasi di antara hasil mungkin karena sumber UV atau waktu
pemaparan yang terkait dengan kandungan serum; mungkin melindungi virus dari
inaktivasi sinar UV. Iradiasi gamma juga mengurangi penggunaan bahan kimia untuk
inaktivasi virus untuk produksi vaksin atau untuk sterilisasi makanan dan merupakan
metode yang lebih disukai untuk inaktivasi FMDV karena virus dapat sepenuhnya
dilumpuhkan dengan metode ini. Namun inaktivasi lengkap virus diamati saat dosis
iradiasi mencapai 40-44kGy [20]. Perbedaan hasil mungkin karena laju dosis sumber
iradiasi gamma dan kemungkinan produksi sejumlah kecil panas sambil menyinari
sampel. Terlepas dari inaktivasi yang lengkap, perlakuan iradiasi bisa menjadi metode
pilihan, untuk mencegahsusu yang terinfeksi secara alami, menemukan FMDV yang
hidup dalam susu setelah pasteurisasi HTST dan penguapan pasteurisasi pos pada 65
C selama 1 jam, setelah inokulasi dibuat menjadi hewan percobaan [11, 4].
Sementara, titer infeksi FMDV turun dalam susu saat diamati setelah Pasteurisasi
Ultra Tinggi pada 148 C selama 2-5 detik dalam peralatan aliran kontinu [6].
Perbedaan hasil mungkin karena keragaman strain karena virus serotipe A beragam
secara genetis di antara semua FMDV. Faktor lain juga terlibat dalam perbedaan hasil
termasuk variasi dalam protokol atau bentuk panas yang digunakan serta faktor
pengenceran virus. Selama studi in vivo, variasi antara hasil mungkin terjadi karena
adanya protein atau kandungan lemak pada susu yang diobati mis. protein susu dapat
melindungi FMDV [22].
Dalam penelitian kami, inaktivasi lengkap virus diamati pada suhu 57 C dan
77C untuk semua suhu interaksi (p> 0,005) untuk panas lembab dan kering, serta
inaktivasi vs waktu paparan (seperti yang digambarkan pada Tabel 1, 2 dan 3).
Namun, diamati bahwa pada suhu tinggi, waktu pemaparan yang lebih rendah
diperlukan untuk inaktivasi; Sementara menurunkan suhu pada waktu pemaparan
yang meningkat mungkin memiliki efek yang sama pada inaktivasi virus. Menurut
Laporan OIE (2007), daging harus mencapai suhu inti internal 70 C selama 30 menit
atau lebih lama untuk menonaktifkan FMDV dan 37C selama 8 hari untuk
menonaktifkan FMDV dalam wol dan rambut. Untuk inaktivasi FMDV dalam susu
dan krim untuk konsumsi manusia, pasteurisasi ultra-tinggi diperlukan pada 132 C
untuk satu detik atau dua kali lipat pasteurisasi susu pada suhu 70C paling sedikit 15
detik diperlukan [21] bahaya keselamatan yang terkait dengan penyimpanan bahan
kimia korosif dan juga penggunaannya. Selain itu, bisa digunakan untuk desinfeksi
air, makanan, permukaan kontak dan udara yang terkontaminasi [2.8].
Ditemukan dari hasil bahwa virus FMDV-A termasuk dalam penelitian kami
yang benar-benar tidak aktif pada pH asam dan basa kecuali pada pH 7.0. Dengan
demikian, kulit hewan atau piala harus direndam dalam pH asam 3,0 atau pH dasar
11,0 untuk inaktivasi lengkap FMDV. Seperti, wol dan kulit direndam dalam sodium
hidroksida untuk inaktivasi virus [17]. Namun, masih beberapa mutan tahan asam
telah dilaporkan [5]. Tapi FMDV-A yang beredar di provinsi KPK rentan terhadap pH
asam dan pH. Dengan demikian, standar yang ditetapkan oleh OIE dapat diterapkan
secara efektif pada virus serotipe A di KPK di tingkat industri. Selanjutnya, semprotan
asam juga bisa digunakan untuk sterilisasi permukaan kerja laboratorium yang
terkontaminasi dengan FMDV, serta kendaraan yang digunakan untuk pengangkutan
hewan, untuk mencegah penyebaran virus melalui transportasi. Ini juga akan menjadi
metode pilihan dimana lampu UV tidak bisa diaplikasikan.

KESIMPULAN
Penggunaan bahan kimia beracun bagi kesehatan karena dapat menumpuk di produk
hewani dan dengan demikian dapat dialihkan ke manusia yang mengkonsumsi produk
ini. Selain itu, strain virus bisa tahan kimia dan mungkin lolos dari metode inaktivasi
dengan cara ini. Dalam kasus ini, alih-alih menyediakan makanan gratis atau produk
hewani, mereka akan bertindak sebagai reservoir virus. Disarankan agar strain yang
baru muncul harus dianalisis untuk pola kerentanan mereka terhadap semua variabel
fisik yang ditetapkan oleh OIE ini. Pola iradiasi gamma sensitivitas harus diperiksa
untuk semua serotipe dan strain FMDV. Ini dapat digunakan dalam kombinasi dengan
sarana fisik lainnya untuk inaktivasi seperti inaktivasi termal dan mungkin merupakan
alternatif yang lebih baik untuk proses melelahkan yang telah dilakukan di industri
kita untuk persiapan produk bebas FMDV. Semua sarana fisik inaktivasi virus ini
membuka jalan baru untuk studi mendalam tentang FMDV-A yang beredar di
Pakistan, mengenai pemprosesan makanan industri dan produksi vaksin.
REFERENSI

. [1]. Alexandersen S, Mowat N (2005) Foot-and-mouth disease: host range

and pathogenesis. Foot-and- Mouth Disease Virus. Springer, pp 9-42

. [2]. Altic LC, Rowe MT, Grant IR (2007) UV light inactivation of

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in milk as assessed by
FASTPlaqueTB phage assay and culture. Applied and environmental
microbiology 73:3728-3733

. [3]. Barteling S, Vreeswijk J (1991) Developments in foot-and-mouth

 disease vaccines. Vaccine 9:75-88

. [4]. Blackwell J, Hyde J (1976) Effect of heat on foot-and-mouth disease

virus (FMDV) in the components of milk from FMDV-infected cows.
Journal of Hygiene 77:77-83

. [5]. Brown C, Olander H, Meyer R (1995) Pathogenesis of foot-and-mouth

disease in swine, studied by in- situ hybridization. Journal of
comparative pathology 113:51-58

. [6]. Cunliffe H, Blackwell J, Dors R, Walker J (1979) Inactivation of

milkborne foot-and-mouth disease virus at ultra-high temperatures.
Journal of Food Protection 42:135-137

. [7]. Darnell ME, Taylor DR (2006) Evaluation of inactivation methods for

severe acute respiratory syndrome coronavirus in noncellular blood
products. Transfusion 46:1770-1777

. [8]. Gardner D, Shama G (2000) Modeling UV-induced inactivation of

microorganisms on surfaces. Journal of Food Protection 63:63-70

. [9]. Ghori MT, Muhammad K, Rabbani M (2011) Physical factors affecting

in vitro replication of foot and mouth disease virus (Serotype O). Pak
Vet J 31:313-316

. [10]. Hodges N, Moss S, Davies D (1980) THE ROLE OF PYRIMIDINE

DIMERS AND NON-DIMER DAMAGE IN THE INACTIVATION OF
ESCHERICHIA COLI BY UV RADIATION. Photochemistry and
photobiology 31:571-577