Isolasi, Pemurnian dan Evaluasi Agen Antibakteri

Dari Lidah Buaya

ABSTRAK

Ekstrak etanol, metanol dan aseton dari gel Aloe vera dipelajari untuk aktivitas
antimikroba mereka terhadap empat bakteri Gram positif dan Gram negatif dengan
metode difusi agar-agar. Ekstrak tersebut menunjukkan tingkat aktivitas antimikroba
yang bervariasi terhadap patogen yang diuji. Ekstrak etanol dan metanol
menunjukkan aktivitas yang lebih tinggi sedangkan ekstrak aseton, menunjukkan
aktivitas paling sedikit atau tidak terhadap sebagian besar patogen yang diuji. Fraksi
yang diperoleh dari ekstrak dengan Lapisan Tipis dan Kolom Kromatografi dipelajari
untuk sifat antagonisnya menggunakan Teknik Spot Assay. Senyawa dengan aktivitas
antibakteri maksimum yang diisolasi dari ekstrak etanol dan metanol diidentifikasi
sebagai asam p-koumarat (Mol. Wt.165), asam askorbat (Mol. Wt.177), pyrocatechol
(Mol. Wt.110) dan asam cinnamic (Mol wt.148), berdasarkan Spektrometri Massa
Kromatografi Gas. Studi tersebut menunjukkan bahwa aktivitas antimikroba ekstrak
gel A. vera bergantung pada efek sinergis dari senyawa yang berbeda. Dengan efek
antimikroba spektral yang luas dari gel A.vera, dapat direkomendasikan lebih lanjut
dalam pengobatan berbagai penyakit bakteri.

PENGANTAR

Lidah buaya adalah tanaman hias dan obat. Ini digunakan secara terapeutik,
sejak zaman Romawi dan mungkin jauh sebelum (5, 20), sifat yang berbeda dianggap
berasal dari gel daun tak berwarna dan eksudat dari lapisan luar. Aloe memiliki
sejarah penggunaan tradisional oleh penduduk asli Amerika untuk gangguan perut dan
gangguan usus termasuk konstipasi, wasir, kolitis dan usus besar. Dikatakan sebagai
pembersih alami, kuat dalam jaringan penetrasi, menghilangkan rasa sakit yang
berhubungan dengan sendi dan otot, bakterisidal, antibiotik yang kuat, virucidal saat
berhubungan langsung dengan waktu yang lama, fungisida, antiinflamasi, berperan
dalam meningkatkan sirkulasi ke daerah. , memecah dan mencerna jaringan mati dan
melembabkan jaringan. Kulit menyerap lidah buaya hingga empat kali lebih cepat dari
air, tampaknya membantu pori-pori kulit terbuka dan menerima kelembaban dan
nutrisi tanaman. Selain itu, banyak penyusun dalam lidah buaya telah menunjukkan
peningkatan fungsi sistem kekebalan tubuh di dalam tubuh. Lidah buaya juga
memiliki kemampuan untuk merangsang makrofag (6).
Sampai saat ini lebih dari 75 bahan telah diidentifikasi dari gel (11, 12) yang
masing-masing memiliki berbagai mekanisme tindakan, bertindak secara sinergis atau
individual untuk menjelaskan lebih dari 200 konstituen yang berbeda terutama
mucopolysaccharides, enzim, sterol, prostaglandin, lemak asam, asam amino dan
berbagai macam vitamin dan mineral. Ini mengandung beberapa senyawa bioaktif
aktif yang berpotensi termasuk salisilat, magnesium laktat, acemannan, lupeol,
campestrol, -sitosterol, aloin A dan antrakuinon (10). Selain itu lidah buaya
mengandung setidaknya tujuh oksida super dismutases dengan aktivitas antioksidan.
Keampuhan cairan lidah buaya sebagai agen antibakteri terbukti memiliki rentang
yang luas terhadap bakteri gram positif dan Gram negatif. Agen antimikroba gel Aloe
vera dilaporkan dapat membunuh atau mengurangi secara efektif atau menghilangkan
pertumbuhan Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus
pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, jerawat Propionibacterium,
Helicobacter pylori dan Salmonella typhi (16, 23, 24, 27). Komponen daun utuh
diusulkan untuk memiliki sifat antibakteri langsung termasuk antrakuinon dan
saponin (24, 27); Sementara polisakarida dikaitkan dengan aktivitas bakteri langsung
melalui stimulasi leukosit fagositik untuk menghancurkan bakteri (16, 23) .Dengan
meningkatnya pengembangan resistensi antibiotik, penekanan pada penelitian ini
diberikan pada penggunaan lidah buaya sebagai obat alami untuk penghambatan
berbagai infeksi dan untuk mengidentifikasi senyawa yang berbeda.

BAHAN DAN METODE

Koleksi Bahan Tanaman

Daun lidah buaya dikumpulkan dari Departemen Hortikultura, Universitas Allahabad-

Deemed University, Allahabad.

Uji Organisme

Rujukan strain, Staphylococcus aureus (MTCC 2943), Streptococcus pyogenes

(MTCC 442), Bacillus subtilis (MTCC 441), Bacillus cereus (MTCC 1272),
Escherichia coli (MTCC 1687), Pseudomonas aeruginosa (MTCC 1688), Salmonella
typhi MTCC 531) dan Klebsiella pneumoniae (MTCC 530) diperoleh dari IMTECH,
Chandigarh, India yang digunakan dalam penelitian ini.

Persiapan Gel Aloe vera

Daun lidah buaya yang telah diperluas sepenuhnya dipilih dari tanaman, dicuci
dengan air suling dan dikenai sterilisasi permukaan dengan etil alkohol 70% diikuti
oleh 0,1% HgCl2. Penutup parenkim dari daun dikupas dan gel dikeringkan. Bubur
terbentuk dengan bantuan alu dan lesung.

Persiapan Ekstrak

Untuk pembuatan ekstrak etanol dan metanol, gel daun segar dikeringkan dalam oven
pada suhu 80 0C selama 48 jam. lalu bubuk. Dua puluh gram bubuk ini direndam
dalam 200 ml. dari masing-masing pelarut yaitu etanol dan metanol selama 24 jam.
Isinya kemudian disaring melalui kertas saring Whattman no. 1 dan filtrat diuapkan
sampai kering. Ekstrak kering ini selanjutnya diolah dan kemudian dilarutkan dalam
air suling. Ekstrak aseton dibuat dengan cara yang sama kecuali bubuk yang
diekstraksi dilarutkan dalam NaOH 0,15N dan selanjutnya dinetralkan dengan HCl
0,15 N (22).

Aktivitas antibakteri Ekstrak Aloe Vera Gel

Aktivitas antibakteri ekstrak gel lidah buaya diuji dengan teknik Difusi dengan
Mudah, seperti yang dijelaskan oleh Agarry et al. (1). Sumur dengan diameter 5 mm
dipotong pada piring agar nutrisi steril dan disiram dengan kultur kaldu semalam dari
organisme. Sekitar 0,1 ml ekstrak gel A. vera diisi ke masing-masing sumur dan
diinkubasi pada suhu 37 C 0,2 C. Aktivitas antibakteri dalam hal zona
penghambatan (mm) dicatat setelah 24 jam. dari inkubasi. Tindakan antagonis ekstrak
gel A. vera diuji terhadap organisme uji pada rangkap tiga.

Fraksinasi ekstrak

Ekstrak dengan aktivitas antibakteri maksimum difraksinasi dengan menggunakan

kromatografi lapis tipis Silica gel dengan konsentrasi MeOH yang berbeda: EtOAc
(Tabel 2). Senyawa terisolasi pada pelat KLT divisualisasikan dengan menggunakan
H2SO4 / Methanol (1: 9 v / v) diikuti pemanasan pada suhu 800C selama 5 menit.
Setelah menentukan kombinasi pelarut, senyawa diisolasi dengan eluting melalui
kolom silika gel (60-120 mesh).

Evaluasi Aktivitas Antibakteri Senyawa Berbeda

Fraksi yang berbeda yang diperoleh dari kolom kromatografi dibiarkan berdiri pada
suhu kamar sampai pelarut diuapkan. Fraksi kering dilarutkan dalam Di-Methyl
Sulfoxide (DMSO) dan digunakan untuk skrining aktivitas antibakteri terhadap
bakteri patogen terpilih dengan menggunakan Teknik Spot Assay seperti yang
dijelaskan oleh Jack et al. (13). Untuk ini, budaya kaldu semalam disikat dengan
bakteri patogen terpilih dan fraksi yang dilarutkan dalam DMSO diinokulasi dengan
tepat. Pelat diinkubasi pada suhu 37 C 0,2 C selama 24 jam. Adanya zona
penghambatan (menunjukkan aksi antibakteri senyawa) dicatat setelah 24 jam. dari
inkubasi.

Identifikasi Senyawa Antibakteri

Fraksi yang menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap mayoritas patogen terpilih

diidentifikasi lebih lanjut dengan menggunakan penganalisis Kromatografi Massa
Spektrometri Gas (GCMS) (Shimadzu QP-2000). ULBON HR-1 Kolom ekuivalen
dengan OV-1 menyatu dengan kapiler silika 0,25mm X 30M dengan ketebalan film
0,25 mikron digunakan untuk tujuan ini. Suhu awal yang dipertahankan adalah 100
C selama 6 menit. dan kemudian dipanaskan pada kecepatan 10 C per menit sampai
250 C pada energi pemboman 70eV. Carrier gas Helium digunakan pada tingkat 2ml
per menit.

Analisis statistik

Data yang tercatat selama penelitian dianalisis secara statistik dengan menggunakan
Analisis Varians (ANOVA), klasifikasi dua arah dan uji F pada tingkat signifikansi
5% untuk menghitung perbedaan yang signifikan antara organisme, pelarut dan
ulangan.

HASIL DAN DISKUSI

Aktivitas antibakteri ekstrak gel lidah buaya terhadap bakteri patogen terpilih.

Sifat antibakteri gel lidah buaya yang diekstraksi dengan menggunakan pelarut
berbeda menunjukkan tingkat respons yang bervariasi terhadap patogen terpilih
(Tabel 1). Menggunakan ekstrak etanol zona penghambatan berkisar antara 12,66 -
23,33 mm maksimum untuk B. cereus dan minimum untuk E. coli (p <0,05). Ekstrak
metanol menunjukkan aktivitas antibakteri maksimum terhadap B. cereus (22,33 mm)
diikuti oleh S. pyogenes (15 mm) dan paling sedikit untuk S. typhi (9,66 mm);
perbedaan signifikan secara statistik (p <0,05). Ekstrak aseton memberikan nilai zona
penghambatan yang lebih rendah mulai dari 6,00 mm untuk E. coli sampai 7,33 mm
untuk S. pyogenes, sementara tidak ada respon yang diamati untuk P. aeruginosa dan
S. typhi (p <0,05). Umumnya ekstrak menunjukkan aktivitas antibakteri yang lebih
besar terhadap Gram positif dibandingkan dengan bakteri Gram negatif.
Sehubungan dengan patogen individu, ekstrak etanol menunjukkan
penghambatan yang lebih besar daripada ekstrak metanol, sedangkan penghambatan
yang lebih rendah diamati dengan ekstrak aseton (p <0,05). Seperti dalam penelitian
ini, lainnya pekerja telah melaporkan sifat antibakteri ekstrak etanol gel A. vera
terhadap patogen yang dipilih dalam penelitian ini (1, 24). Dalam penelitian yang
dilakukan oleh Martinez et al. (18) tidak ada aktivitas antimikroba yang dilaporkan
menggunakan ekstrak air A. vera.
Seperti yang dinyatakan oleh Cowan (4), hampir semua komponen yang
diidentifikasi dari tanaman yang aktif melawan mikroorganisme adalah senyawa
organik aromatik atau jenuh dan paling sering diperoleh melalui ekstraksi etanol atau
metanol awal. Ini menjelaskan aktivitas antimikroba ekstrak etanol dan metanol yang
lebih tinggi yang diamati dalam penelitian ini. Tindakan antimikroba yang lebih
rendah terhadap bakteri Gram negatif dibandingkan dengan organisme Gram positif
dapat dijelaskan karena adanya lapisan lipopolisakarida tambahan pada bekas.

Senyawa mayor dan minor diidentifikasi dalam ekstrak Aloe vera gel

Dari berbagai kombinasi pelarut yang digunakan (Metanol, Etanol, Aseton, Etil asetat,
Kloroform, Hexane dan Petroleum eter) untuk identifikasi senyawa mayor dan minor
dalam ekstrak gel A. vera, Etanol dan Etil asetat, Metanol dan Etil asetat ditemukan
pada paling efektif dalam pemisahan senyawa yang berbeda. Empat senyawa utama
dan sembilan senyawa minor diidentifikasi berdasarkan titik dan nilai faktor retensi
(Rf) pada kombinasi yang berbeda dari Metanol: Etil asetat dalam ekstrak metanol.
Demikian pula empat senyawa utama dan empat senyawa minor diidentifikasi dengan
kombinasi Etanol yang berbeda: Etil asetat dalam ekstrak etanol (Tabel 2).
Pengamatan terhadap penelitian ini berbeda dengan penelitian Speranza dkk. (1985,
1986), dimana hanya satu titik utama dengan nilai Rf yang berbeda diperoleh melalui
TLC ekstrak metanol Aloe sp. Variabilitas pada nilai Rf senyawa bisa jadi karena
ketergantungannya pada jumlah sampel yang diterapkan, keadaan saturasi ruang,
kelembaban relatif, suhu dan jarak tempuh pelarut depan.

Isolasi senyawa yang berbeda dalam ekstrak gel lidah buaya

Senyawa yang berbeda dalam ekstrak metanol dan etanol gel A. vera diisolasi dengan
eluting dalam sistem pelarut gradien bertahap yang ditentukan dalam KLT, yang
dijelaskan sebelumnya pada Tabel 2. Pada sistem pelarut metanol MeOH: EtOAc
dengan polaritas meningkat (10-85 % MeOH dalam EtOAc, v / v) total 22 fraksi
diperoleh. Demikian pula 16 fraksi ekstrak etanol diperoleh dalam fraksinasi EtOH:
EtOAc (10-80%, v / v). Fraksi dengan nilai Rf yang sama digabungkan dan diberi
label sesuai. Selanjutnya, untuk membedakan fraksi ekstrak metanol dan etanol,
perbedaan dalam sistem penomoran juga diikuti (Tabel 3). Dalam studi serupa yang
dilakukan oleh Cooposamy dan Magwa (3) sistem pelarut MeOH: EtOAc (0-30%)
digunakan untuk mengeliminasi fraksi ekstrak EtOAc yang berbeda. Para penulis
telah melaporkan eluting 48 fraksi dalam penelitian mereka. Selanjutnya, fraksinasi
ekstrak etanol yang dilaporkan oleh Okamura dkk. (21) menghasilkan sembilan fraksi,
yang relatif lebih rendah dari pada penelitian ini. Variasi jumlah fraksi dengan
penelitian ini bisa jadi karena jenis ekstrak, sistem pelarut dan teknik yang digunakan.

Aktivitas antibakteri dari fraksi yang berbeda diperoleh pada Kolom

Kromatografi

Berbagai tingkat aktivitas antibakteri dari berbagai ekstrak gel lidah buaya terhadap
bakteri patogen diamati pada penelitian ini. Dua fraksi yaitu. C dan D yang diperoleh
dari ekstrak etanol gel A. vera menunjukkan aktivitas antibakteri maksimum terhadap
organisme uji (Tabel 3). Aktivitas antibakteri moderat dari enam fraksi (E-J) diamati
pada ekstrak etanol dan tidak ada aktivitas yang diamati dengan delapan fraksi sisanya
(A, B, K-P). Demikian pula dua fraksi (73 dan 74) ekstrak metanol menunjukkan
aktivitas antibakteri maksimum diikuti oleh sepuluh fraksi (16, 40, 46, 48, 113, 114,
123, 125, 126 dan 128) dengan aktivitas sedang dan sepuluh fraksi sisanya 80, 83, 94,
95, 100, 103, 104, 105, 117 dan 127) tanpa aktivitas.
Selanjutnya, fraksi dengan aktivitas antibakteri maksimal yaitu. C, D, 73 dan 74
menunjukkan variasi yang signifikan pada zona penghambatan terhadap bakteri Gram
positif dan Gram-negatif yang diuji (P <0,05). Fraksi C dan D ditemukan memiliki
aktivitas antibakteri maksimum terhadap bakteri Gram positif dibandingkan dengan
bakteri Gram negatif (Tabel 4). Efek fraksi C tidak ditemukan secara maksimal
terhadap Bacillus cereus dan Bacillus subtilis diikuti oleh Streptococcus pyogenes. Di
antara gram negatif Salmonella typhi diamati paling banyak terhambat dibandingkan
dengan Pseudomonas aeruginosa dan fraksinya tidak efektif terhadap sisa gram
negatif yang diuji. Fraksi D terbukti efektif terhadap semua gram positif kecuali
B.subtilis. Sebaliknya, ternyata efektif hanya melawan S.typhi di antara gram negatif.

Fraksi 73 dari ekstrak metanol ternyata memiliki efek penghambatan hanya terhadap
bakteri gram negatif yang diuji dengan aktivitas maksimum melawan S.typhi (9,1
mm) dan minimum terhadap K. pneumoniae (7.1mm). Namun fraksi 74 menunjukkan
aktivitas antibakteri terhadap semua bakteri patogen yang dipelajari kecuali S.
pyogenes (Tabel 4). Dari empat fraksi ekstrak metanol dan etanol, fraksi no 4 diamati
memiliki aktivitas antibakteri spektrum luas. Penelitian serupa dilakukan oleh
Cooposamy dan Magwa (3) pada aktivitas antibakteri dari fraksi ekstrak A. vera gel
yang berbeda. Namun, data tidak dapat dibandingkan karena metode evaluasi aktivitas
antibakteri berbeda dengan penelitian ini.
Senyawa antibakteri dari ekstrak lidah buaya

Fraksi (73, 74, C dan D), menunjukkan aktivitas antibakteri maksimum, diidentifikasi
sebagai Pyrocatechol (Gambar 1), asam Cinnamic (Gambar 2), asam p-koumarat
(Gambar 3) dan asam askorbat (Gbr. 4).

Kehadiran pyrocatechol (Gambar 5) di lidah buaya, sudah dilaporkan oleh Kametani

dkk. (14), sebanding dengan penelitian ini. Selanjutnya, tindakan antimikroba
pyrocatechol diilustrasikan oleh Cowan (4). Pyrocatechol adalah fenol hidroksilasi,
yang dikenal sebagai racun bagi mikroorganisme. Situs dan jumlah gugus hidroksil
pada kelompok fenol dianggap terkait dengan toksisitas relatifnya terhadap
mikroorganisme dan peningkatan hidroksilasi yang selanjutnya menyebabkan
peningkatan toksisitas. Selanjutnya, fenolat juga bertindak dengan mendenaturasi
protein dan mengganggu membran sel. Mereka bertindak sebagai desinfektan, sebagai
agen tuberkulosis, efektif dalam kehadiran bahan organik dan tetap aktif di
permukaan bahkan lama setelah aplikasi. Kehadiran asam sinamat (Gambar 6) dalam
gel A. vera sebanding dengan Database Fitokimia Duke (7). Selanjutnya, aksi
antibakteri asam cinnamic sebanding dengan temuan Kouassi dan Shelef (15). Mereka
menyarankan bahwa asam cinnamic menghambat pengambilan glukosa dan produksi
ATP di sel peristirahatan bakteri. Aktivitas antibakteri asam p-koumarat (Gambar 7)
yang diamati dalam penelitian ini sesuai dengan temuan penelitian lain (2, 19, 29, 30).
Senyawa tersebut dilaporkan dapat meningkatkan fase lag mikroorganisme (2) dan
juga mampu menghambat aktivitas enzimatik mikroorganisme (30). Demikian pula
kehadiran asam askorbat (Gambar 8) dalam gel A. vera dikonfirmasi dengan Database
Fitokimia Duke (7). Aktivitas antibakteri asam askorbat sesuai dengan studi Vilter
(25) dan Fite dkk. (8). Asam askorbat dapat menghambat mikroorganisme dengan
mengganggu selaput sel, aktivitas enzimatik, atau mekanisme genetik (9).
Data yang tak tertandingi dari berbagai fraksi bisa jadi disebabkan oleh efek pelarut
yang digunakan selama analisis sampel. Selanjutnya, sedikit variasi di puncak diamati
dan berada dalam batas yang dapat diterima. Apalagi rentang ketidakcocokan yang
lebih tinggi di fraksi no. D bisa jadi karena adanya kotoran dalam sampel selama
penanganan dan pengolahan.

Karena resistensi antibiotik global oleh bakteri menjadi perhatian kesehatan

masyarakat yang menarik dan perlombaan untuk menemukan agen antibakteri baru
menyala, gel Aloe vera bersama dengan senyawa yang teridentifikasi dengan aktivitas
antibakteri yang menjanjikan dapat digunakan sebagai obat herbal alternatif.
Selanjutnya, senyawa ini juga telah dilaporkan memiliki sejumlah keunggulan lain
pada kesehatan manusia bersamaan dengan sedikit efek samping pada overdosis. Oleh
karena itu, dapat disimpulkan bahwa senyawa yang diisolasi dari ekstrak gel lidah
buaya dapat direkomendasikan untuk percobaan manusia (dalam dosis yang tepat)
terhadap patogen bakteri yang berbeda.