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EVALUACIN DEL CRECIMIENTO DE Spirulina platensis SOBRE UN

EFLUENTE DE SUERO DE QUESERA

CARLOS ANDRS NIO MARTNEZ


DAVID FELIPE LONDOO MARTNEZ

UNIVERSIDAD DE LA SABANA
FACULTAD DE INGENIERA
PRODUCCIN AGROINDUSTRIAL
CHA
2006
EVALUACIN DEL CRECIMIENTO DE Spirulina platensis SOBRE UN
EFLUENTE DE SUERO DE QUESERIA

CARLOS ANDRES NIO MARTINEZ


DAVID FELIPE LONDOO MARTNEZ

Proyecto de Grado para optar al ttulo de Ingenieros de Produccin Agroindustrial

Director
GERARDO GONZALEZ MARTNEZ
Ingeniero de Alimentos Ph.D.

UNIVERSIDAD DE LA SABANA
FACULTAD DE INGENIERIA
PRODUCCIN AGROINDUSTRIAL
CHA
2006
Nota de aceptacin:

Presidente del jurado

Jurado

Jurado

Cha, Enero 27 de 2006


A Gerardo Gonzlez M. por la ayuda y empeo mostrado para llevar a cabo este
proyecto. A Indira Sotelo D. y Gabriela Cez de Amaya por su aporte cientfico al
desarrollo del trabajo.
CONTENIDO

pg.

INTRODUCCIN ...................................................................................................12

1. JUSTIFICACIN DEL PROYECTO ..................................................................14

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ..............................................................17

3. OBJETIVO GENERAL ......................................................................................18

4. OBJETIVOS ESPECFICOS .............................................................................18

5. REVISIN BIBLIOGRFICA ............................................................................19

5.1 SUERO LCTEO .........................................................................................19

5.2 Spirulina .......................................................................................................20

5.3 NUTRIENTES DE INTERS PRESENTES EN LA Spirulina .......................21

5.4 ETAPAS DEL PROCESO DE PRODUCCIN .............................................22

5.5 PRINCIPALES FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO DE LA


Spirulina .............................................................................................................23

6. DISEO METODOLGICO ..............................................................................25

6.1 MATERIALES...............................................................................................25

6.2 MTODOS ...................................................................................................25

6.2.1 Determinacin de la concentracin de S. platensis en la suspensin


inicial. ............................................................................................................26

6.2.2 Determinacin de la concentracin de S. platensis en los cultivos de


propagacin...................................................................................................26

6.2.3 Acondicionamiento del sustrato............................................................26

6.2.4 Determinacin de la Demanda Qumica de Oxgeno (DQO). ...............26

6.2.5 Determinacin del contenido de fosfatos..............................................27

6.2.6 Determinacin del contenido de nitratos. .............................................27


6.2.7 Crecimiento de la S.platensis en el suero de queso............................ 27

7. RESULTADOS Y ANALISIS .............................................................................28

7.1 CARACTERIZACIN FISICOQUMICA DEL SUSTRATO...........................28

7.2. PROPAGACIN DE LA S. platensis ...........................................................28

7.3 DETERMINACIN DEL CRECIMIENTO DE LA S. platensis EN EL SUERO


DE QUESO ........................................................................................................31

7.4 DETERMINACIN DEL EFECTO DEL CRECIMIENTO DE S.platensis LB


2340 SOBRE LA DQO Y EL CONTENIDO DE NITRATOS Y FOSFATOS... 40

8. CONCLUSIONES ..............................................................................................41

9. RECOMENDACIONES......................................................................................42

BIBLIOGRAFIA .....................................................................................................43

ANEXOS................................................................................................................47
LISTA DE TABLAS

pg.

Tabla 1. Caractersticas qumicas del suero de quesera como agua residual. ..... 15
Tabla 2: Caractersticas de un efluente de almidn de sago..................................... 16
Tabla 3. Composicin qumica del suero dulce y cido.............................................. 19
Tabla 4. Composicin detallada de suero dulce.. ........................................................ 20
Tabla 5. Composicin del Medio de Zarrouk. ............................................................... 23
Tabla 6. Caracterizacin fisicoqumica del suero clarificado para el primer
experimento................................................................................................................ 28
Tabla 7. Crecimiento de la S. platensis en los cultivos de la primera propagacin.
...................................................................................................................................... 30
Tabla 8. Crecimiento de la S. platensis en los cultivos de la segunda propagacin.
...................................................................................................................................... 31
Tabla 9. Concentracin de nitrgeno y fsforo en los tres sustratos del primer
experimento.. ............................................................................................................. 32
Tabla 10. Crecimiento de la S.platensis en los tres sustratos del primer
experimento.. ............................................................................................................. 32
Tabla 11. Caracterizacin fisicoqumica del suero clarificado para el segundo
experimento................................................................................................................ 33
Tabla 12. Concentracin de nitrgeno y fsforo en los tres sustratos del segundo
experimento................................................................................................................ 33
Tabla 13. Crecimiento de S. platensis en los tres sustratos del segundo
experimento................................................................................................................ 35
Tabla 14. Caracterizacin fisicoqumica del suero clarificado para el tercer
experimento................................................................................................................ 35
Tabla 15. Concentracin de nitrgeno y fsforo en los sustratos del tercer
experimento................................................................................................................ 36
Tabla 16. Crecimiento de S. platensis en los tres sustratos del tercer experimento
...................................................................................................................................... 36
Tabla 17. Concentracin de HMF en los sustratos evaluados. ................................. 38
LISTA DE GRFICAS

pg.

Grfica 1. Formacin de HMF en SA y SAI. ................................................................. 39


Grfica 2. Formacin de HMF en el MSL y en el SA. ................................................. 39
LISTA DE ANEXOS

pg.

Anexo A. Preparacin del medio sinttico de Schlosser. ........................................... 47


Anexo B. Ecuacin para el clculo de filamentos de Spirulina mL-1........................ 48
Anexo C. Mtodo de Carrez modificado para determinacin de HMF..................... 49
Anexo D. Conteo en cmara de filamentos de S. platensis en los cultivos de los
experimentos realizados. ......................................................................................... 51
Anexo E. Datos de formacin de HMF. ......................................................................... 53
Anexo F. Anlisis de varianza de dos factores para la prueba de HMF. ................. 55
RESUMEN

El crecimiento de Spirulina platensis LB 2340 fue evaluado sobre diferentes


sustratos orgnicos a base de suero de queso y comparado contra el crecimiento
obtenido en un medio sinttico especfico (Schlosser). Los resultados arrojaron
que, bajo las condiciones de estudio (35C, 150 r.p.m. y 1100 Klx), la Spirulina no
se desarrolla en los sustratos a base de suero debido muy probablemente al
cambio de color presentado en los mismos durante el periodo de incubacin. El
pardeamiento producido podra reducir la cantidad de luz disponible para el
crecimiento de la Spirulina. Este cambio de color se relacion con un proceso de
pardeamiento no enzimtico tipo Maillard en el que se obtiene como producto
intermedio el hidroximetilfurfural (HMF). Estudios de la evolucin de los niveles de
HMF en dos sustratos: a) medio sinttico adicionado con lactosa y b) suero
alcalinizado, as como en dos cultivos correspondientes a los dos sustratos
anteriores inoculados con Spirulina, evidenciaron que existen diferencias
significativas (=0,05) en los niveles de HMF detectados durante el periodo de
incubacin lo cual fortalece la hiptesis de pardeamiento por presencia de lactosa.
Adicionalmente, los resultados demostraron que los niveles detectados de HMF en
el suero alcalinizado no tenan relacin con la presencia de Spirulina o productos
de su metabolismo.
ABSTRACT

Spirulina platensis LB 2340 was cultivated at 35C, 150 r.p.m. and 1100 Klx in two
different substrates obtained from whey. Growing of Spirulina in these media was
compared against growing in a specific synthetic medium (Schlosser). Results
showed that, under the studied conditions, whey substrates did not let Spirulina
grow. This is probably due to a change of color of the substrate during the
incubation time, which reduced the amount of light available for the Spirulina
growth. This change in color was related to a non-enzymatic browing process
known as Maillard reaction, which produces hidroximetilfurfural (HMF).
Additionally, evolution of HMF levels was studied by inoculating two different
substrates with Spirulina: a) synthetic medium added with lactose and b)
alkalinized whey. These results were then compared against evolution of HMF
levels on non inoculated substrates. This study showed that for both substrates
there are significant differences (=0,05) in the levels of HMF, which supports the
hypothesis of browing reaction by the presence of lactose. Furthermore, results
demonstrated that detected levels of HMF in alkalinized whey did not have either
relation with the presence of Spirulina or its metabolic products.
INTRODUCCIN

Segn datos de la FAO suministrados en el 2005, la produccin de leche en el


mundo pas de 504 millones de toneladas en 1994 a 507 millones de toneladas
en el ao 2003. Uno de los principales usos de la leche es para la produccin de
quesos, proceso en el cual se obtienen rendimientos entre el 5 y el 10%,
generndose por lo tanto una gran cantidad de suero. Segn la misma
informacin, en 1994 por ejemplo, la produccin mundial de queso fue de
13.725.000 toneladas, lo cual represent una produccin de suero 5 a 10 veces
mayor, dependiendo del tipo de queso producido. El destino ms importante para
este suero es como materia prima deshidratada en otros procesos de
transformacin y como alimento para animales, estando prohibido en muchos
pases su vertido directo a los cauces de agua debido a su alto poder
contaminante.

Las principales alternativas para el aprovechamiento del suero son su


fermentacin buscando la produccin de alcohol y/o protena (biomasa de
levadura), desmineralizacin, desproteinizacin, secado y la cristalizacin de su
lactosa (Petrenko, 2005). Estas tecnologas requieren de altos niveles de
inversin en capital, lo que las ha restringido a los pases de mayor capacidad
adquisitiva, situados en los subtrpicos. Sin embargo, teniendo en cuenta que
aproximadamente el 0,05% del suero son sales minerales (Giner y Reventos,
2001), el cultivo de microorganismos capaces de utilizarlos se proyecta como una
opcin viable de aprovechamiento.

El cultivo de microalgas y cianobacterias requiere como principales factores de


crecimiento la luz y la temperatura, disponibles en abundancia a lo largo del ao
en los trpicos. La falta de capital para la investigacin de los pases ubicados en
esta zona ha impedido el desarrollo de modelos productivos basados en el
aprovechamiento de residuos por parte de estos microorganismos.

La Spirulina, es una bacteria procaritica fotosinttica (cianobacteria) la cual se


puede encontrar clasificada bien sea como una cianobacteria del gnero Archea o
como una microalga de nombre cientfico Arthrospira (Snchez et. al, 2002). Sin
embargo, a nivel cientfico y comercial se sigue nombrando como Spirulina ya que
con este nombre se dio a conocer. Existen diferentes especies, siendo las
principales la S. platensis y la S. maxima. Debido a su alto contenido de protena
(50-70 % en peso seco), vitaminas y cidos grasos poli-insaturados esenciales
(especialmente el cido -linoleico), el uso de la Spirulina se resalta
industrialmente como un importante recurso nutricional en la produccin y el
enriquecimiento de alimentos para consumo humano, concentrados animales y/o
tratamientos mdicos (Dillon y Phan, 1993).

12
Como sustrato para su cultivo se emplean medios minerales o residuos orgnicos
alcalinizados ricos en nitratos y fosfatos, tales como vinazas de la industria de la
caa o residuos de biodigestores de granjas porccolas (Pedraza, 1989).

Con base en lo anterior, la evaluacin del crecimiento de la Spirulina en un suero


alcalinizado se convierte en una interesante alternativa ya que permitira generar
un producto de alto valor nutricional a partir de un efluente contaminante de la
industria lctea.

13
1. JUSTIFICACIN DEL PROYECTO

Segn datos de la FAOSTAT (2003), en Colombia se produjeron 198.000


toneladas de suero de queso durante el ao 2002. Teniendo en cuenta que el 49%
de la produccin nacional se distribuye entre la costa atlntica y la pacfica
(Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, Colombia, 2005), se deduce que una
parte muy importante de la produccin quesera del pas se localiza en las zonas
bajas, basadas en ganaderas de doble propsito y medianas industrias
transformadoras de mbito local.

Como se puede apreciar en la Tabla 1, el suero de queso es un residuo altamente


contaminante por lo cual su mezcla con las aguas residuales aumenta el DBO5 de
las mismas en aproximadamente 16,5 veces. Por tal motivo, industrialmente se
han buscado diferentes alternativas para su aprovechamiento (tanto en estado
fresco como deshidratado) en la fabricacin de requesn, el enriquecimiento de
quesos frescos, la produccin de bebidas lcteas fermentadas y en la alimentacin
animal directa. El aprovechamiento del suero fresco acarrea ciertos
inconvenientes, principalmente debido a su baja capacidad de conservacin y
dificultad de transporte que imposibilita muchas veces su uso en alimentacin
animal. Adems, su empleo en otros procesos de transformacin para productos
de consumo humano requiere de tratamientos tecnolgicos previos que reduzcan
su alto contenido de minerales (desmineralizacin, concentracin, deshidratacin)
(Vrisseyre, 1980). Por otro lado, la produccin de suero en polvo genera altos
costos energticos que solamente pueden ser asumidos por empresas muy
grandes del sector. Por lo tanto, es indudable que cualquier alternativa para el
aprovechamiento del suero de leche, que logre una reduccin en su poder
contaminante y genere un valor agregado, puede llegar a ser de gran inters para
la industria lctea del pas. Es ah donde el cultivo de microalgas representa la
oportunidad de aprovechar las sales minerales presentes en los efluentes
industriales de los que el suero hace parte, ya que estas permiten reducir la DQO
de los mismos (Phang et al., 2000) generando productos de alto valor agregado,
como pigmentos, cidos grasos y protena tanto para alimentacin humana como
animal.

Las microalgas y/o cianobacterias pueden ser de dos tipos segn su metabolismo,
auttrofas en las que su principal fuente de nutrientes son las sales minerales y
mixotrficas, las cuales presentan adems del metabolismo auttrofo, el
metabolismo hetertrofo, lo que les permite asimilar nutrientes de origen orgnico,
facultndolas para sobrevivir en ausencia de luz.

Existen antecedentes del cultivo de Spirulina para el aprovechamiento de


efluentes de biodigestores de la industria del almidn (Phang et al., 2000), vinazas
de caa (Pedraza, 1989) y efluentes de biodigestores de industrias porccolas
(Lincoln, 1993). La Tabla 1 muestra la composicin de un efluente de biodigestor

14
de una industria de produccin de almidn de sago en Malasia, donde para
optimizar el crecimiento de la Spirulina se enriqueci el efluente con
concentraciones variables de 4 a 13,3 mmolNL-1 en forma de urea, comparadas
con concentraciones de 14 a 28 mmolNL-1 en forma de fitrato de sodio, con la
adicin simultnea de una fuente de fsforo (1,05 y 2,10 mmolL-1 de K2HPO4),
teniendo en cuenta que el nitrgeno y el fsforo son los elementos de mayor
importancia despus del carbono para el crecimiento de la Spirulina (Morales,
2005). Estos estudios demostraron que el efluente de almidn de sago es capaz
de generar eutrificacin al ser vertido a los cauces de agua, siendo adems capaz
de soportar el crecimiento de la Spirulina. En la Tabla 2 tambin se muestra la
composicin del suero, en cuanto a contenido de fsforo, nitrgeno y DQO, los
cuales posiblemente podran soportar el crecimiento de la Spirulina, ya que el
suero de quesera tiene un mayor contenido de nitrgeno y fsforo comparado con
el efluente de almidn de sago. Estas ventajas del suero, se corroboran
comparando la composicin de un efluente de biodigestor de la industria porccola
descrito por Pedraza (1989), en el cual los valores de nitrgeno y fsforo
reportados corresponden al 0.10% y 0.03% respectivamente del efluente fresco.
Tabla 1. Caractersticas qumicas del suero de queso como agua residual
Suero de Aguas residuales Suero de queso +
Parmetro
queso (AR) AR
DBO5 (mgO2L-1) 35000 50000 1300 21400
DQO (mgO2L-1) 60000 90000 33000 33,200
pH 4,7 6,4 7,0 6,0
Conductividad (mSL-1) 4 30 1,3 5,2
Nitrgeno (mgL-1) 122-155 70 100
Fsforo (mgL-1) 300-900 25 280
Grasas 0,85-5,06 gL-1 300 mgL-1 1300 mgL-1
Fuente: Giner y Reventos, 2001

Teniendo en cuenta estos antecedentes, se decidi evaluar el crecimiento de una


cianobacteria como la Spirulina sobre un efluente de suero de quesera con el fin
de determinar si su crecimiento podra reducir la capacidad contaminante del
mismo, comprobando de la misma forma si en estas condiciones la cepa de S.
platensis presenta un metabolismo mixotrfico.

Por ltimo, es importante aclarar que el presente proyecto no pretende abarcar el


aprovechamiento integral de los nutrientes del suero de leche. Lo que se pretende
es estudiar la conveniencia del uso de las sales minerales (listadas en la Tabla 4)
presentes en un efluente del suero de quesera como sustrato para el crecimiento
de la Spirulina, constatando si existen cambios la demanda qumica de oxgeno
(DQO), nitratos y fosfatos de dicho efluente durante el crecimiento de la misma.

15
Tabla 2: Caractersticas de un efluente de almidn de sago.
Efluente de sago Suero de leche
Parmetro Sago Crudo
digerido

pH 4,20 0,00 7,10 1,10 4,7 6,4

DQO (mgL-1) 5130 1280 1340 520 60000 90000

PO4-P (mgL-1) 18,3 2,95 21,0 4,21 300-900

NH4-N (mgL-1) 2,24 0,38 2,87 0,48

NO3-N (mgL-1) 0,62 0,01 40,0 1,33 122-155

Carbohidratos
620 120 690 450
Totales (mgL-1)
Slidos
Suspendidos 2,54 0,21 0.94 0,17 5 7%
Totales (mgL-1)

C:N:P radio (mgL-1) 105:0,12:1 24:0,14:1


Fuente: Phang et al., 2000; Giner y Reventos, 2001.

16
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La actual tecnologa de procesamiento del suero, demanda niveles de inversin


tecnolgica y econmica excluyentes para la mayora de pequeas empresas
procesadoras de leche, lo que junto a los altos volmenes de produccin de suero,
exige por parte de la comunidad cientfica el desarrollo de alternativas de
procesamiento de bajo costo. Es ah donde los cultivos de microalgas a cielo
abierto en pases tropicales desempearan un papel muy importante al revalorizar
los efluentes de esta industria y otras que hoy son parte del problema ambiental
en estos pases.

Pese a que la Spirulina no requiere de medios orgnicos para su crecimiento, no


deja de ser interesante evaluar la viabilidad del uso de un efluente de suero de
queso, rico en minerales, como sustrato para el desarrollo y crecimiento de la
misma. Por lo tanto, se comprobar s la S. platensis podra crecer en suero de
queso alcalinizado y s podra existir una sinergia manifestada en una reduccin
del poder contaminante del suero, manifestada por la reduccin de su materia
orgnica, es decir, la presencia de un metabolismo mixotrfico.

La eleccin de la Spirulina se basa en sus caractersticas tecnolgicas y


alimenticias, ya que en este momento existe un paquete tecnolgico con un
conocimiento amplio sobre su cultivo en medios sintticos a cielo abierto, lo que
unido a su facilidad de cosecha, altos precios en el mercado, y sus cualidades
nutricionales como suplemento alimenticio para poblaciones vulnerables como
nios, mujeres embarazadas y ancianos, la hace un alimento promisorio para
garantizar la seguridad alimentara de los pases en vas de desarrollo.

17
3. OBJETIVO GENERAL

Evaluar el crecimiento de la Spirulina platensis sobre un efluente de suero de


quesera.

4. OBJETIVOS ESPECFICOS

Estandarizar el procedimiento para la obtencin de sustrato a base de suero de


queso parcialmente desproteinizado.

Caracterizar las propiedades fisicoqumicas del sustrato a utilizar en cuanto a


DQO, contendido de nitratos y fosfatos.

Determinar el crecimiento de la S. platensis sobre dos diferentes tipos de sustrato:


alcalinizado sin enriquecer y alcalinizado enriquecido con nitrato de sodio, a
diferentes diluciones.

Evaluar el comportamiento mixotrfico de la S .platensis mediante la


determinacin del efecto del crecimiento de la misma sobre la DQO, contenido de
nitratos y fosfatos de los sustratos utilizados.

18
5. REVISIN BIBLIOGRFICA

5.1 SUERO LCTEO

El suero es el lquido resultante de la coagulacin de la leche durante la


elaboracin del queso. Se obtiene por medio de la separacin de protenas y
grasa. El suero constituye aproximadamente el 90% del volumen de la leche y
contiene la mayor parte de sus compuestos que son solubles en agua (Unidad de
asistencia tcnica ambiental, Colombia, 2004).

Como se mencion anteriormente, uno de los potenciales usos del suero es como
medio de cultivo para la produccin de levaduras debido a su principal fuente de
carbono (lactosa). Entre los productos que se pueden obtener por fermentacin
del suero estn: bacterias lcticas, cido lctico, alcohol, vinagre, cido propinico,
proteasas, pectinasas, penicilina, vitamina B2 y B12, aceite y protena unicelular
para alimento humano y de animales (Spreer, 1991).

La composicin del suero vara de acuerdo con el tipo de leche utilizada durante la
produccin del queso, la tecnologa de elaboracin, el tiempo de almacenamiento
y el tipo de coagulacin utilizada (coagulacin al cuajo, en la que se obtiene el
suero dulce, o coagulacin por acidificacin en la que se obtiene suero cido). En
la Tabla 3 se puede observar como vara la composicin de ambos tipos de suero.
Tabla 3. Composicin qumica del suero dulce y cido.
Composicin Suero dulce Suero cido
Agua (%) 93 - 94 94 - 95
Grasa (%) 0,2 0,7 0,04
Protena (%) 0,8 1,0 0,8 1,0
Lactosa (%) 4,5 5,0 4,5 5,0
Minerales (%) 0,05 4,0
Fuente: http://www.acercar.org.co/industria/manuales/
placteos/02proceso.pdf.

19
Tabla 4. Composicin detallada de suero dulce.

Sales
mgL-1 Vitamnas mgL-1 minocidos mgL-1
minerales

Sodio 54,00 Ac. ascrbico 0,100 Arginina 25


Potasio 161,00 Tiamina 0,036 Histidina 20
Magnesio 8,00 Riboflavina 0,158 Isoleucina 60
Calcio 70,00 Niacina 0,074 Leucina 95
Manganeso 5,75 c. pantotnico 0,383 Lisina 80
Hierro 3,40 Vitamina B6 0,031 Metionina 16
Cobre 0,69 Folacina 1,000 Fenilalanina 35
Zinc 0,13 Vitamina B12 0,277 Treonina 70
Fsforo 46,00 Vitamina C 1,000 Triptfano 17
Cloro 80,00 Ac. lctico 130,000 Tirosina 30
Boro 1,82 Ac. ctrico 160,000 Valina 60
Molibdeno 2,76
Fuente: Centro de Produccin ms limpia (Nicaragua), 2004; Petrenko, 2005.

5.2 Spirulina

La Spirulina es una cianobacteria filamentosa que crece en aguas alcalinas, se


caracteriza por presentar largas cadenas espiraladas de las que deriva su nombre.
Vista al microscopio es un filamento verde septado en el que se identifican las
vesculas de gas que le permiten flotar, adems no requiere de tincin alguna para
ser vista por este medio. A nivel de investigacin se considera que un filamento es
viable cuando tiene ms de tres espirales (Eliach et al., 2004), lo que permite
cuantificar su crecimiento por conteo en cmara de Neubauer. Posee una
concentracin de nutrientes muy elevada, razn por la cual se cultiva en diversos
pases industrializados para la produccin de suplementos alimenticios.

Se encuentra de forma natural en lagos alcalinos de las regiones tropicales, las


principales cepas cultivadas en el mundo provienen del lago Chad en frica y del
lago Texcoco en Mxico, lo que no excluye los aislamientos provenientes de otras
partes del mundo. Dicha cianobacteria podra convertirse en un alimento para
aliviar la situacin de hambruna en aquellos lugares donde se encuentren fuentes
de aguas alcalinas (Fox, 1993).

20
Algunas microalgas y cianobacterias son capaces de presentar un metabolismo
hetertrofo en ausencia de luz, el cual en conjunto con el auttrofo se denomina
mixotrfico. Un ejemplo de ellas son la Chlorella sp. y el Scenedesmus sp (Chacn
et al., 2004). Las microalgas con esta caracterstica son especialmente
recomendables para el tratamiento de aguas residuales, ya que poseen la
capacidad de remover cantidades significativas de nitrgeno y fsforo, absorber
metales y acelerar la inactivacin de bacterias patgenas maximizando su tasa de
crecimiento. En las microalgas mixotrficas se da una sumatoria de los
metabolismos, los cuales optimizan su velocidad de crecimiento (Morales, 2005)

El nitrgeno es el elemento que despus del carbono contribuye con la produccin


de biomasa y la composicin bioqumica de las clulas microalgales. Deficiencias
de este elemento afectan la estructura, el metabolismo celular y la expresin de
genes de las mismas (Loreto et al., 2004). Asimismo, el exceso de este elemento
o de otros nutrientes disminuyen la produccin de metabolitos e incluso inhiben el
crecimiento (Yepez y Morales, 1998).

La Spirulina ha sido utilizada para el aprovechamiento de efluentes de


biodigestores de la industria del almidn (Phang et al., 2000), para el
aprovechamiento de vinazas de caa (Pedraza, 1989) y efluentes de biodigestores
de industrias porccolas (Lincoln, 1993) obteniendo rendimientos mximos de 880
mgL-1, 10460 filamentosmL-1 y 70 gm2 respectivamente finalizados los 30 das
de crecimiento. Para cuantificar el crecimiento en estas investigaciones se trabaj
por peso seco lo que no permite comparar estos resultados con los obtenidos por
conteo celular. Eliach en el 2004 evalu la cintica de crecimiento de la Spirulina
cultivada en medio sinttico Zarrouk con agitacin y sin agitacin, obteniendo
rendimientos de aproximadamente 290,000 filamentosL-1 con agitacin al cabo de
30 das partiendo de una concentracin inicial de 50,000 filamentosL-1.

La principal microalga sustituto de la Spirulina es la Chlorella que se usa para el


aprovechamiento de aguas residuales (Chacn et al., 2004) con el inconveniente
de que su recoleccin se dificulta por ser una microalga unicelular, por el contrario
los mtodos mecnicos de cosecha usados en la recoleccin de la Spirulina son
bastante simples: decantacin y filtrado en lona, razones suficientes para que en
los estudios realizados en la Universidad de Florida para el aprovechamiento de
efluentes de biodigestores se sustituyera la Chlorella por Spirulina (Lincoln, 1993).
Con respecto al cultivo de levaduras, la principal ventaja del cultivo de microalgas
es que estas no necesitan de un ambiente estril para su cultivo reduciendo los
costos que esto implica, adicionalmente sus requerimientos de oxgeno son bajos
por lo que tampoco necesitan de sofisticados sistemas de aireacin, en otras
palabras el cultivo de Spirulina no se condiciona a modernos bioreactores,
pudindose cultivar en pequeos estanques de poca profundidad agitados
manualmente (Becker, 1993).

5.3 NUTRIENTES DE INTERS PRESENTES EN LA Spirulina

21
Protenas y aminocidos: su contenido en protenas oscila entre el 50% y el
70%, dependiendo del tipo de cepa y del sistema de cultivo empleado. La
Spirulina tiene un alto contenido de aminocidos esenciales excepto Lisina.
Asimismo, tiene la ventaja de que sus protenas son de fcil digestin y
asimilacin por el organismo humano (Antenna Technology, 1996).

Lpidos o grasas: el contenido de los lpidos (cidos grasos esenciales) de la


Spirulina esta entre el 5% y el 7% (Antenna Technology, 1996).

cidos grasos: la S. platensis es la nica especie de Spirulina que contiene


exclusivamente cido -linoleico como cido graso tri-insaturado, sin presentar
otros ismeros de linoleico. Dependiendo del sistema de cultivo, el 20% de sus
cidos grasos corresponden a -linoleico (Dubacq y Pham-Quoc, 1993).

Carbohidratos: la Spirulina contiene entre 15 y 25% de azcares por lo que


proporciona energa rpida. (Antenna Technology, 1996).

Vitaminas: la Spirulina es el alimento ms rico en -caroteno o provitamina A,


es tambin la fuente ms importante de vitamina B12 y aporta cantidades
considerables de vitamina B1 (25% de la dieta diaria recomendada) y B2 (30%
de la dieta diaria recomendada). Su contenido en estas vitaminas es muy
superior al de cereales, frutas, verduras y ciertas semillas (Antenna
Technology, 1996).

Minerales: es el alimento ms rico en hierro que se conoce, puede incluso


contener 20 veces ms hierro que otros alimentos considerados como fuente
de este mineral. Este hierro se absorbe hasta dos veces mejor que el que se
encuentra en los vegetales y en la mayor parte de las carnes. Por otro lado, en
la Spirulina tambin hay importantes concentraciones de calcio (1,71mgg-1) y
magnesio (2,57mgg-1), careciendo casi por completo de sodio (Shimamatsu,
2004)

5.4 ETAPAS DEL PROCESO DE PRODUCCIN

Comercialmente la Spirulina se cultiva de forma continua en tanques abiertos, con


forma de pista atltica. Estos tanques son agitados mediante paletas giratorias
que crean una corriente de 0,3 ms-1 y que facilitan el mezclado. La profundidad de
estos vara entre los 0,2 - 0,4 m y la relacin entre longitud y anchura debe ser de
4 a 1 con deflectores en sus extremos para facilitar el flujo de agua (Shimamatsu,
2004).

22
Tabla 5. Composicin del Medio de Zarrouk
simplificado para el cultivo de Spirulina.

Composicin Contenido (gL-1)

NaHCO3 16,8
K2HPO4 0,5
NaNO3 2,5
K2SO4 1,0
NaCl 1,0
MgSO4 * 7H2O 0,02
CaCl2 * 2H2O 0,04
FeSO4 * 7H2O 0,01
EDTA 0,08
Fuente: Shimamatsu, 2004.

El medio de cultivo usado a escala industrial es un medio de Zarrouk simplificado


con la composicin que se indica en la Tabla 5, con un pH que oscila entre 9.5 y
10.5 (Pushparaj et. al., 1997). Cuando se cultiva en forma de bache se cosecha en
promedio cada 30 das. Para ello se filtra al vaco, se prensa la pasta restante y se
seca mediante aspersin, liofilizacin o bandejas (Jourdan, 1999).

5.5 PRINCIPALES FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO DE LA


Spirulina

Temperatura: Al igual que todos los microorganismos, la tasa de crecimiento de la


Spirulina es fuertemente influenciada por la temperatura, dependiendo de la cepa
son ms o menos tolerantes a las altas temperaturas. El rango ptimo est entre
34 y 37 ya que temperaturas superiores reducen su crecimiento (Tomaselli et al.,
1993).

Luz: El rango de luz recomendado para la experimentacin con microalgas es de


4Klx a 12Klx (Morales, 2005). La intensidad de luz afecta el contenido de
ficobiliprotenas y clorofila, influyendo tambin en la tasa de crecimiento. La
concentracin de ficobiliprotenas es responsable del 30% de la masa seca de la
Spirulina, por lo que la disponibilidad de luz afecta el contenido final de protena
total (Garnier y Thomas, 1993). Cuando se aprovechan sustratos de origen
orgnico, la transparencia de los mismos se puede convertir en un factor limitante
para el crecimiento de las microalgas. Los cambios de color en los sustratos
orgnicos estn determinados por procesos de pardeamiento enzimtico y no
enzimtico como la reaccin de Maillard, la caramelizacin de los azcares, la
peroxidacin de los lpidos y la degradacin del cido ascrbico (Davies et al.,
1995)

23
El pardeamiento enzimtico se presenta en sustratos orgnicos procedentes de
estructuras ricas en enzimas (frutas y hortalizas) y la reaccin de Maillard por la
presencia de azcares reductores y aminocidos a distintas condiciones de pH y
Temperatura. Uno de los productos intermedios de la reaccin de Maillard es el
hidroximetilfufural, el cual a altas concentraciones es capaz de inhibir el
crecimiento de microorganismos como Salmonella typhimurium (Ikan, 1996).

Concentracin de Nutrientes: Existen distintos medios sintticos para la


produccin de Spirulina, los principales son el de Paoletti (1985), Zarrouk (1966) y
Schlosser (1982), cuya composicin es muy similar como se puede ver en la Tabla
5 y en el Anexo A. Los medios para el cultivo de Spirulina son muy selectivos
debido a su alto pH (9,5 10,5) y a su contenido de bicarbonato de sodio (Lincoln,
1993), siendo de inters para la industria el uso de medios sintticos preparados
con sales comerciales, ya que los medios desarrollados por Paoletti, Zarrouk y
Schlosser estn elaborados con reactivos analticos de mayor costo. Ejemplo de
esto son los medios desarrollados en la India por Becker (1993).

24
6. DISEO METODOLGICO

6.1 MATERIALES

Spirulina:
Durante los experimentos de crecimiento se utiliz una cepa de Spirulina platensis
LB 2340 (Aislada en 1963 por G. Laporte como M132/2b del lago natron en Chad;
depositada de SAG B 85.79, vesculas de gas; Relativos: SAG B 85.79; NIVA CYA
120), la cual fue comprada directamente al cepario de la Universidad de Texas. La
cepa se recibi en suspensin en tubo de ensayo con 15mL de medio sinttico de
Schlosser, cuya composicin se describe en el Anexo A. La propagacin se llev a
cabo por triplicado inoculando 1mL de la suspensin inicial (cepa original) en
100mL de medio sinttico estril de Schlosser (recomendado por la Universidad
de Texas) en la cabina de flujo laminar y con materiales estriles. Las muestras
inoculadas fueron cuidadosamente tapadas con gasas estriles e incubadas
durante 30 das a 30C (Eliach et al., 2004) con luz continua y agitacin magntica
constante a 150 r.p.m. (Pelizer, 2002) en una Incubadora Celmagl, con
capacidad para 5 erlenmeyers, la cual fue adaptada con una fuente de luz central
incandescente ubicada a 40cm de la superficie a irradiar. Se trabaj con esta
temperatura para tener una baja velocidad de crecimiento de la Spirulina, mientras
se realizaron los ensayos previos para la estandarizacin de la preparacin del
sustrato a base de suero. En esta primera propagacin se busc asegurar un
volumen adecuado de inculo para el siguiente experimento y no se pretendi
determinar la tasa de crecimiento.

Suero de queso:
Con el nimo de evitar la posible interferencia generada por la composicin
variable de sueros procedentes de diferentes plantas de produccin de queso, y
ante la imposibilidad de conseguir un nico proveedor de suero de queso que
garantizara un mejor control sobre la procedencia del sustrato requerido para la
realizacin de los experimentos, se decidi preparar un sustrato estndar
mediante la coagulacin enzimtica con renina. Para esto, se utiliz leche fresca
procedente del ordeo matutino de una vaca Holstein de 36 meses de edad,
primer parto, en la segunda mitad de lactacin, alimentada exclusivamente a base
de pasto Kikuyo (Penicetum clandestinum), y criada en la finca Machuma, ubicada
en Guaymaral, Cundinamarca, Colombia. El tiempo transcurrido entre el ordeo y
la coagulacin enzimtica no excedi nunca las 5 horas. Posterior a la
coagulacin, el suero fue separado del grano mediante malla plstica y mantenido
en refrigeracin a 4C hasta su utilizacin, a la maana siguiente, en los
experimentos de crecimiento.

6.2 MTODOS

25
6.2.1 Determinacin de la concentracin de S. platensis en la suspensin
inicial. La concentracin de S. platensis en la suspensin inicial proveniente de la
Universidad de Texas se determin por cuadriplicado mediante conteo en cmara
de Neubauer de los filamentos observados por microscopio, en una alcuota de
10L. La toma de muestras se realiz en cabina de flujo laminar con materiales
estriles. Para el conteo se utiliz un microscopio de contraste de fases a 25
aumentos y se tomaron nicamente en cuenta aquellos filamentos con tres o ms
espirales presentes en la totalidad de la cuadricula de la cmara. El nmero de
filamentos por mL de la suspensin se determin segn la ecuacin mostrada en
el Anexo B.

6.2.2 Determinacin de la concentracin de S. platensis en los cultivos de


propagacin. Para esta determinacin se sigui el procedimiento descrito en el
numeral 6.2.1. Con el fin de asegurar una buena disponibilidad de S. platensis
para los siguientes experimentos, se realiz una segunda propagacin a partir de
uno de los triplicados utilizados durante la propagacin inicial. Para esto se
tomaron 2.5mL de cultivo de la propagacin inicial y se inocularon en 250mL de
medio sinttico estril Schlosser nuevo, procedimiento realizado en la cabina de
flujo laminar con materiales estriles. Esta propagacin se llev a cabo por
triplicado y las muestras inoculadas fueron incubadas bajo las mismas condiciones
utilizadas para propagar la suspensin inicial. La concentracin de los cultivos fue
determinada cada dos das segn el numeral 6.2.1. La propagacin se detuvo en
el da 22 para utilizar uno de los cultivos como inculo para el siguiente
experimento.

6.2.3 Acondicionamiento del sustrato. El suero obtenido por coagulacin


enzimtica fue extrado del refrigerador y su pH fue ajustado a 6.5 mediante
adicin de NaOH al 20%. Para desnaturalizar las lactoalbminas, el suero fue
sometido a calentamiento en estufa a 92C durante 10 minutos, tenindose
cuidado en reponer la masa de agua evaporada. Con el fin de obtener un coagulo
firme y fcilmente separable por filtracin, se ajust nuevamente el pH del suero
en 4.5 con cido ctrico al 50% para precipitar las lactoalbminas desnaturalizadas
previamente por accin del calor. El suero parcialmente desproteinizado fue
entonces filtrado a vaci con papel de filtro de 40 micras de poro para separar el
precipitado. Inmediatamente despus de la filtracin, se reserv una muestra del
suero clarificado para determinacin de la DQO, el contenido de nitratos y el
contenido de fosfatos. El suero clarificado fue sometido a esterilizacin en
autoclave a 121C durante 30min. Por ltimo se alcaliniz con 13.61 gL-1 de
bicarbonato de sodio (NaHCO3) y 4.03 gL-1 de carbonato de sodio (Na2CO3).

6.2.4 Determinacin de la Demanda Qumica de Oxgeno (DQO). La DQO del


suero obtenido fue determinada mediante un Spectroquant NOVA 60, tomando
como alcuota 3mL de suero clarificado en dilucin 1:100. Se realizaron dos
mediciones por cada experimento.

26
6.2.5 Determinacin del contenido de fosfatos. El contenido de fosfatos del
suero obtenido fue determinado en un equipo HANNA C200 Series Multiparameter
Bench Photometer, tomando como alcuota 10mL de suero clarificado en dilucin
1:100. Los resultados arrojados por el equipo se expresan como mg PO4L-1. A
partir de esta determinacin, se reportaron los resultados como moles de P. Se
realizaron dos mediciones por cada experimento.

6.2.6 Determinacin del contenido de nitratos. El contenido de nitratos del


suero obtenido fue determinado en un equipo HANNA C200 Series Multiparameter
Bench Photometer, tomando como alcuota 10mL de suero clarificado en dilucin
1:100. Los resultados arrojados por el equipo se expresan como mg NO3L-1. A
partir de esta determinacin, se reportaron los resultados como moles de N. Se
realizaron dos mediciones por cada experimento.

6.2.7 Crecimiento de la S.platensis en el suero de queso. Para la realizacin de


estos experimentos se emplearon tres tipos de sustratos estriles: 1) suero
alcalinizado, 2) suero alcalinizado diluido a la mitad y enriquecido con nitrato de
sodio de tal forma que igualar la concentracin de nitrgeno presente en el medio
sinttico de Schlosser y 3) medio sinttico de Schlosser como blanco de
referencia. Se tomaron 500mL de cada uno de estos sustratos y se inocularon con
10mL de S. platensis proveniente de uno de los cultivos obtenidos durante la
segunda propagacin, el procedimiento se realiz en la cabina de flujo laminar con
materiales estriles. . La ecuacin para determinar el volumen total de inculo de
S. platensis a aadir para garantizar una concentracin inicial adecuada en los
cultivos se describe en el Anexo B. Los sustratos inoculados fueron
cuidadosamente tapados con gasas estriles e incubados a 35C, agitacin
magntica a 150 r.p.m y fotoperiodo para simular las condiciones de produccin
reales, en una incubadora Celmag-L adaptada con una fuente de luz fluorescente
circular ubicada a 40cm de la superficie a irradiar. La temperatura se eligi con
base en estudios previos realizados para el crecimiento de Spirulina en diferentes
medios (Pedraza, 1989; Jourdan, 1999; Phang, 2000; y Jimnez, 2003)
considerando que se encuentra dentro del rango ptimo. La concentracin de S.
platensis en los sustratos fue determinada cada dos das tal y como se describi
en el numeral 6.2.1. Debido a la limitacin en cuanto al espacio en la incubadora
(5 puestos), los cultivos con sustrato a base de suero no fueron corridos por
triplicado sino por duplicado, en espera de que resultados favorables demandaran
un tercer ensayo.

27
7. RESULTADOS Y ANALISIS

7.1 CARACTERIZACIN FISICOQUMICA DEL SUSTRATO

La Tabla 6 resume la caracterizacin fisicoqumica del suero clarificado para ser


utilizado como sustrato. Se puede ver que el contenido de fsforo en el suero
clarificado es aproximadamente 8 veces mayor que el contenido en el medio
sinttico de Schlosser para el crecimiento de Spirulina (ver Tabla 9). Igualmente, el
contenido de nitrgeno es mayor que el determinado para el medio sinttico. Por
lo tanto, estos resultados indican que la utilizacin de este sustrato podra generar
algn tipo de inhibicin en el crecimiento de la Spirulina, ya que existen evidencias
que demuestran que el exceso de nutrientes en el sustrato causa alteraciones en
la produccin de metabolitos y hasta inhibicin del crecimiento (Yepez y Morales,
1998; Morales, 2005). Lo anterior se corrobora con un estudio realizado por
Pedraza (1989) para el crecimiento de Spirulina maxima sobre vinazas y efluentes
de biodigestores en el cual se comprueba qu diluciones al 50% de los sustratos
empleados generan incrementos en el rendimiento.
Tabla 6. Caracterizacin fisicoqumica del suero clarificado para el primer
experimento.

Caracterstica del suero clarificado Resultado*

pH antes de su acondicionamiento 5,74


DQO (mgO2L-1) 174500
Fosfatos (mgL-1) 2075
Fsforo (mmolL-1) 21,84
Nitratos (mgL-1) 2171
Nitrgeno (mmolL-1) 35,01
*Promedio de dos mediciones.

7.2. PROPAGACIN DE LA S. platensis

7.2.1 Propagacin de la suspensin inicial. La concentracin inicial de S.


platensis en cada uno de los cultivos de propagacin fue de 274 filamentosmL-1.
Como se puede observar en la Tabla 7, an cuando los medios de propagacin y
las condiciones de incubacin fueron las mismas, nicamente se present
crecimiento de la Spirulina en uno de los tres cultivos propagados, debido muy
seguramente a la baja concentracin inicial de la Spirulina, lo que puede generar
fotoinhibicin por exceso de luz (Morales, 2005). La anterior hiptesis toma fuerza
cuando al realizar la segunda propagacin se duplica la concentracin inicial de

28
Spirulina (555 filamentosmL) y se obtiene crecimiento en los tres cultivos de
propagacin. Despus del da 20 de incubacin se hace necesario diluir las
muestras para el conteo. Las altas desviaciones estndar observadas en los
resultados de estos conteos se pueden deber a la dificultad de separar los
filamentos de Spirulina pese a su dilucin, aunque estas son similares antes y
despus de diluir, indicando que posiblemente las altas desviaciones se deben a
la aplicacin del mtodo de conteo por cmara de Neubauer en microalgas
filamentosas. No se disponen de datos para comparar las desviaciones estndar
obtenidas. Las restricciones de agitacin en la incubadora unido a la cantidad de
pruebas inicialmente previstas impidi el empleo de volmenes de cultivo lo
suficientemente grandes para poder determinar el crecimiento por peso seco. No
se puede correlacionar el conteo con el peso seco, ya que en cada fase de
crecimiento la longitud de los filamentos vara. La correlacin de peso seco y
absorbancia no es aplicable para microalgas filamentosas porque el tamao de las
mismas genera interferencia en la medida. En el Anexo D se presentan la totalidad
de los datos tomados.

7.2.2 Segunda propagacin. Como se mencion anteriormente, durante esta


segunda propagacin se duplic la concentracin inicial de S. platensis (555
filamentosmL-1) logrndose obtener crecimiento en los tres medios de
propagacin, tal y como se muestra en la Tabla 8. Segn los resultados obtenidos,
se puede apreciar cmo el medio de propagacin dos (2) presenta conteos ms
bajos en comparacin con los medios uno (1) y tres (3). Lo anterior pudo obedecer
probablemente a la falta de homogeneidad en la distribucin de la luz
incandescente a lo largo de la incubadora. Como ya se sabe, existen evidencias
del efecto de la distribucin de la luz en la velocidad de crecimiento de la Spirulina
(Garnier, 1993; Sanchz, 2002 y Masojidek, 2003) y por lo tanto este puede ser un
factor importante que no se haba considerado previamente. Por esta razn, se
procedi a realizar una medicin de la intensidad de la luz en cinco puntos
diferentes de la incubadora para verificar si la distribucin era uniforme o no. Los
cinco puntos establecidos para esta determinacin correspondieron a las
posiciones que cada uno de los cultivos poda tener en la incubadora (por motivos
de agitacin magntica): a) esquina superior izquierda, b) esquina superior
derecha, c) centro, d) esquina inferior izquierda y e) esquina inferior derecha. La
intensidad de luz fue medida con un luxmetro Lutron Lx105. Tal y como se
esperaba, los resultados evidenciaron que la distribucin de luz no era homognea
en la superficie de la incubadora sino que por el contrario en las esquinas
superiores tanto izquierda como derecha la intensidad era menor (2450 y 3280lx,
respectivamente) que en las esquinas inferiores tanto izquierda como derecha
(4000 y 3070lx, respectivamente) y en el centro (5670lx).Con base en estas
mediciones, se decidi reemplazar el foco incandescente por uno fluorescente
circular para las pruebas siguientes. La intensidad del foco fluorescente se
determin en los cinco puntos de la incubadora anteriormente mencionados y los
resultados demostraron que efectivamente es un poco ms homognea: 912lx en
la esquina superior derecha, 902lx en la esquina superior derecha, 1362lx en el
centro, 1158lx en la esquina inferior izquierda y 1166lx en la esquina inferior

29
derecha. Por restricciones en la disponibilidad del luxmetro solo se midi la luz al
final del todo el periodo de experimentacin.
Tabla 7. Crecimiento de la S. platensis en los cultivos de la primera propagacin.

Concentracin de Spirulina (filamentosmL-1)

Cultivo de Cultivo de Cultivo de


Da
propagacin 1 propagacin 2 propagacin 3
18 0 7,28 x 104 6,70 x 103 0
20 0 8,42 x 104 1,65 x 104 0
23 0 1,63 x 105 2,48 x 104 * 0
25 0 1,51 x 105 3,27 x 104 ** 0
27 0 2,24 x 105 7,80 x 104 ** 0
30 0 2,07 x 105 2,31 x 104 ** 0
* Muestra para conteo en cmara de Neubauer diluida a la mitad.
**Muestra para conteo en cmara de Neubauer diluida a la tercera parte.

Desafortunadamente, no fue posible determinar si el cultivo de propagacin de


menor rendimiento efectivamente estaba ubicado en la zona de menor irradiacin,
por lo cual no es posible afirmar que dicho resultado sea debido exclusivamente a
la distribucin de la luz. Cabe destacar que la medicin de la intensidad de la luz
en los diferentes puntos de la incubadora se hace como mecanismo para la
bsqueda de interpretaciones vlidas a los resultados experimentales obtenidos
pero no existen evidencias claras, en este trabajo, que permitan relacionar en
forma directa el bajo rendimiento con la baja intensidad. Mayor investigacin es
requerida para determinar la relacin exacta que existe entre estos dos factores.
En el Anexo D se presentan la totalidad de los datos obtenidos durante la segunda
propagacin.

30
Tabla 8. Crecimiento de la S. platensis en los cultivos de la segunda propagacin.

Concentracin de Spirulina (filamentosmL-1)

Cultivo de Cultivo de Cultivo de


Da
propagacin 1 propagacin 2 propagacin 3
2 1,11 x 103 9,07 x 102 1,39 x 103 1,06 x 103 8,33 x 102 1,06 x 103
6 1,03 x 104 3,56 x 103 4,44 x 103 1,23 x 103 3,08 x 104 3,19 x 103
10 3,01 x 104 2,46 x 103 4,44 x 103 1,57 x 103 4,36 x 104 1,24 x 104
13 3,28 x 104 1,03 x 104 8,33 x 103 2,13 x 103 8,06 x 104 1,49 x 104
15 4,56 x 104 8,61 x 103 1,08 x 104 1,90 x 103 8,39 x 104 6,64 x 103
17 6,28 x 104 7,56 x 103 1,08 x 104 1,67 x 103 7,83 x 104 2,18 x 104
20 7,36 x 104 1,32 x 104 2,11 x 104 4,44 x 103 8,75 x 104 1,73 x 104
22* -- -- 9,83 x 104 5,84 x 103
*Solo se realizo el conteo hasta este da porque el cultivo de propagacin 3 se utiliz como inculo
para el siguiente experimento.

7.3 DETERMINACIN DEL CRECIMIENTO DE LA S. platensis EN EL SUERO


DE QUESO

Con base en los resultados de caracterizacin del suero obtenido mediante la


coagulacin enzimtica (Sustrato 1), y con el fin de analizar la posible influencia
del contenido de fsforo sobre el crecimiento de la S. platensis en el sustrato, se
procedi a realizar una dilucin del mismo (Sustrato 2). Dicha dilucin se realiz
tomando 250mL de suero y llevando a 500mL con agua destilada estril para
disminuir la concentracin de fsforo en el mismo. La concentracin de nitrgeno
fue balanceada mediante adicin de nitrato de sodio. La Tabla 9 compara las
concentraciones iniciales de fsforo y nitrgeno en cada uno de los sustratos a
evaluar durante el crecimiento de la Spirulina. Como se puede observar, an
despus de la dilucin la concentracin de fsforo en el suero sigue siendo
aproximadamente 5 veces mayor que la establecida para el medio sinttico de
Schlosser (Sustrato 3). La inoculacin de los tres sustratos se realiz de tal forma
que la concentracin inicial de Spirulina en cada uno de ellos fuera de
aproximadamente 1978 111 filamentosmL-1 con el fin de tener un tamao de
inculo suficiente para el crecimiento en condiciones menos propicias, como las
que se pudieran presentar en el suero, sin pretender que esta concentracin fuera
la ptima para el cultivo de Spirulina, pero garantizando que a esta el inculo
fuera viable. Como se puede apreciar en la Tabla 10, los resultados del
crecimiento de la Spirulina sobre los diferentes sustratos demuestran que, aunque
pareciera haber crecimiento durante los dos primeros das, los sustratos a base
de suero no favorecen el crecimiento de la Spirulina (en el Anexo D se presentan

31
todos los datos). Lo anterior puede obedecer a diferentes factores como: a)
inhibicin del crecimiento de la Spirulina por exceso de fsforo ya que como se
mencion anteriormente su concentracin es varias veces mayor a la del medio
sinttico; b) la presencia de inhibidores del crecimiento de la S. platensis en el
suero, lo cual debe ser verificado con estudios posteriores de inhibicin; c) falta de
luz ya que los sustratos a base de suero se tornan opacos e impiden la
transmisin de la luz; y d) carencia en los sustratos a base de suero de algn
micronutriente esencial para el crecimiento de la Spirulina. Las altas desviaciones
estndar de los resultados obtenidos podran obedecer a la baja concentracin de
Spirulina en el sustrato lo cual debido a las condiciones de muestreo y anlisis,
incrementa notoriamente la probabilidad de obtener muestras no representativas.
Para corregir este error sera necesario incrementar el nmero de conteos en
cmara de Neubauer.

Tabla 9. Concentracin de nitrgeno y fsforo en los tres sustratos del primer


experimento.

Sustrato 1* Sustrato 2** Sustrato 3

mmolP L-1 21,84 10,92 2,87


mmolN L-1 35,01 29,41 29,41
*Suero alcalinizado. El resultado corresponde al promedio de dos mediciones.
**Suero alcalinizado diluido a la mitad y enriquecido con nitrato de sodio. El resultado
corresponde al promedio de dos mediciones.

Tabla 10. Crecimiento de la S.platensis en los tres sustratos del primer experimento.

Concentracin de Spirulina (filamentosmL-1)

Da Sustrato 1* Sustrato 2** Sustrato 3

0 1,98 x 103 111 1,98 x 103 111 1,98 x 103 111


2 2,78 x 103 594 1,25 x 103 1,25 x 103 1,94 x 103 2,46 x 103
5 0 0 2,50 x 103 1,67 x 103
*Suero alcalinizado. El resultado corresponde al promedio del duplicado.
**Suero alcalinizado diluido a la mitad y enriquecido con nitrato de sodio. El resultado corresponde
al promedio del duplicado.

Con el fin de descartar la hiptesis de qu el exceso de fsforo en el suero podra


ser el causante de la ausencia de crecimiento de la S. platensis, se decidi
incrementar el nivel de la dilucin hasta un punto tal que la concentracin de
fsforo del suero igualara la concentracin de fsforo en el medio sinttico. Para
esto se procedi a obtener un nuevo suero, siguiendo el procedimiento descrito en
el numeral 6.2.3, cuya caracterizacin fisicoqumica se detalla en la Tabla 11.
Posteriormente, el suero se diluy hasta aproximadamente la quinta parte para

32
obtener as una concentracin de fsforo equivalente a la del medio sinttico
(Tabla 12). Para los ensayos de crecimiento se utilizaron tres tipos de sustrato a
base de suero: a) suero alcalinizado diluido (Sustrato 1); b) suero alcalinizado
diluido y enriquecido con nitrato de sodio (Sustrato 2) y c) medio sinttico de
Schlosser (Sustrato 3). Por ltimo, los tres sustratos se inocularon de tal forma que
la concentracin inicial de S. platensis en cada uno de ellos fuera de
aproximadamente 1222 314 filamentosmL-1.
Tabla 11. Caracterizacin fisicoqumica del suero clarificado para el segundo
experimento

Caracterstica del suero clarificado Resultado*

pH suero antes del acondicionamiento 4,64


DQO (mg O2L-1) 190000
Fsforo (mgL-1) 465
Fsforo (mmolL-1) 15,00
Nitratos (mgL-1) 1395
Nitrgeno (mmolL-1) 22,51
*Promedio de dos mediciones.

Tabla 12. Concentracin de nitrgeno y fsforo en los tres sustratos del segundo
experimento.

Sustrato 1* Sustrato 2** Sustrato 3

mmolP L-1 2,87 2,87 2,87


mmolN L-1 4,50 29,41 29,41
*Suero alcalinizado diluido a la quinta parte.
**Suero alcalinizado diluido a la quinta parte enriquecido con nitrato de sodio.
Promedio del duplicado.

Como se puede observar en la Tabla 13, los resultados muestran que en el suero
diluido a la quinta parte tampoco hubo un crecimiento continuo de S. platensis (en
el Anexo D se presentan todos los datos). Sin embargo, es de resaltar que en
este experimento aunque no es evidente un aumento en la concentracin de
Spirulina, si fue posible detectar presencia de filamentos durante tres (3) das ms
en relacin con el experimento anterior en el cual se detect presencia de
filamentos nicamente hasta el segundo da de incubacin. Tal y como se
evidencia en los resultados, si se tiene en cuenta que esta vez el contenido de
fsforo fue igualado al del medio sinttico de Schlosser para crecimiento de
Spirulina, no fue el exceso de fsforo el causante directo de la inhibicin del
crecimiento de la cianobacteria en el experimento previo. Por lo tanto, todo parece

33
indicar que deben existir otras fuentes de inhibicin (mencionadas anteriormente)
las cuales deben ser identificadas y estudiadas a mayor profundidad.
Adicionalmente, durante el crecimiento de la Spirulina se observ un cambio
notorio en el color del sustrato, tornndose de amarillo claro a caf oscuro, lo cual
implica un cambio en la disponibilidad de luz para la cianobacteria y por lo tanto
un efecto sobre el crecimiento de la misma. Con el fin de confirmar si dicho
planteamiento podra ser vlido, se procedi a aumentar la disponibilidad de luz
en el sustrato aumentando su transparencia mediante dilucin a la dcima parte.
Para esto, se realiz un tercer experimento con suero nuevo cuya caracterizacin
fisicoqumica se detalla en la Tabla 14. Al igual que en los experimentos
anteriores, para los ensayos de crecimiento se utilizaron tres tipos de sustrato a
base de suero: a) suero alcalinizado diluido (Sustrato 1); b) suero alcalinizado
diluido y enriquecido con nitrato de sodio para mantener la relacin N/P
correspondiente al medio sinttico, tal y como se muestra en la Tabla 15 (Sustrato
2) y c) medio sinttico de Schlosser (Sustrato 3). Por ltimo, los tres sustratos se
inocularon de tal forma que la concentracin inicial de S. platensis en cada uno de
ellos fuera de aproximadamente 1611 411 filamentos mL-1.

Como se puede observar en la Tabla 16 (en el Anexo D se presentan todos los


datos), al igual que en los dos experimentos anteriores no se evidencia un
aumento en la concentracin de Spirulina en los sustratos a base de suero. Cabe
resaltar que esta vez el periodo de permanencia y deteccin de filamentos (en
cmara) en los cultivos fue un poco mayor (11 das de incubacin) debido muy
probablemente a la mayor disponibilidad de luz. Tambin es importante aclarar
que la diferencia de crecimiento observada entre los cultivos de la segunda
propagacin y el blanco tanto de este experimento como de los anteriores
realizados, se debe probablemente al cambio en el fotoperiodo y en la intensidad
de luz, observndose un mayor crecimiento a luz continua y mayor intensidad de
la misma.

34
Tabla 13. Crecimiento de S. platensis en los tres sustratos del segundo experimento.

Concentracin de Spirulina (filamentosmL-1)

Da Sustrato 1* Sustrato 2** Sustrato 3

0 1,22 x 103 314 1,22 x 103 314 1,22 x 103 314

2 556 x 102 642 x 102 6,94 x 102 1,18 x 102 1,11 x 103 1,57 x 103

5 0 5,56 x 102 840 2,22 x 103 2,40 x 103

7 0 0 1,67 x 103 1,11 x 103


*Suero alcalinizado diluido a la quinta parte.
**Suero alcalinizado diluido a la quinta parte enriquecido con nitrato de sodio. Promedio del
duplicado.
Tabla 14. Caracterizacin fisicoqumica del suero clarificado para el tercer
experimento.

Caracterstica del suero clarificado Resultado*

pH suero antes acondicionamiento 5,24


DQO (mg O2L-1) suero ---
Fsforo (mgL-1) suero 390
Fsforo (mmolL-1) suero 12,58
Nitratos (mgL-1) suero 2148
Nitrgeno (mmolL-1) suero 34,65
*Promedio de dos mediciones.

Sin embargo, durante el periodo de incubacin se pudo detectar una reduccin en


la transparencia de los cultivos debido a un proceso de pardeamiento. Los
resultados indican que continua existiendo un factor de inhibicin para el
crecimiento de la cianobacteria en el suero de queso; una de ellas podra ser la
generacin de una reaccin de pardeamiento durante la incubacin de los
cultivos, la cual es facilitada por el alto contenido de lactosa en el suero. Otra
posible causa de inhibicin podra ser la presencia per se de lactosa en el
sustrato, aunque no se han reportado evidencias al respecto.

35
Tabla 15. Concentracin de nitrgeno y fsforo en los sustratos del tercer
experimento.

Sustrato 1* Sustrato 2** Sustrato 3

mmolP L-1 1,26 1,26 2,87


mmolN L-1 3,47 12,92 29,41

Tabla 16. Crecimiento de S. platensis en los tres sustratos del tercer experimento

Concentracin de Spirulina (filamentosmL-1)

Da Sustrato 1* Sustrato 2** Sustrato 3

0 1,61 x 103 411 1,61 x 103 411 1,61 x 103 411

2 2,22 x 103 2,40 x 103 972 1,25 x 103 1,39 x 103 556

4 1,67 x 103 1,43 x 103 1,25 x 103 1,10 x 103 1,39 x 103 1,06 x 103

8 3,33 x 103 3,01 x 103 1,39 x 103 1,30 x 103 6,67 x 103 2,72 x 103

11 0 0 9,17 x 103 5,16 x 103


*Suero alcalinizado diluido a la dcima parte.
**Suero alcalinizado diluido a la dcima parte enriquecido con nitrato de sodio. Promedio del
duplicado.

Con el fin de verificar el posible efecto de la lactosa sobre el crecimiento de la


Spirulina se procedi a realizar un experimento de crecimiento utilizando como
sustrato medio sinttico adicionado con lactosa. Para esto se agregaron 8gL-1 de
lactosa a la solucin B del medio sinttico Shlosser (ver Anexo A), ya que esta no
es alcalina y se evita el pardeamiento durante la esterilizacin. Esta concentracin
de lactosa es equivalente a la del suero diluido a la quinta parte. Posterior a la
esterilizacin, se mezcl con la solucin A del medio sinttico. La razn de hacer
esto fue simular el comportamiento de la lactosa en el suero alcalinizado usado
como sustrato. Adicionalmente, con el nimo de comprobar si la lactosa, o sus
monosacridos, podran generar el mismo proceso de pardeamiento se llevo a
cabo una prueba cualitativa del crecimiento de la Spirulina en suero deslactosado.
Para preparar el suero deslactosado se parti de leche comercial deslactosada y
se acondiciono el sustrato segn el numeral 6.2.3. Se inocularon ambos sustratos
y se incubaron por duplicado bajo las mismas condiciones utilizadas para el
cultivo de Spirulina en los experimentos anteriores. Al cabo de una semana de
incubacin se observ que en ninguno de los medios evaluados haba crecimiento
alguno de Spirulina, pero en ambos se present un pardeamiento muy similar al
observado en los sustratos a base de suero utilizados anteriormente. Esta prueba
cualitativa fortaleci la hiptesis de que la disminucin en la disponibilidad de luz
debido a una reaccin de pardeamiento pudo inhibir el crecimiento de la Spirulina.

36
Teniendo en cuenta las caractersticas bioqumicas del suero, as como tambin
las condiciones de incubacin, la causa ms probable para el pardeamiento de
este podra ser una reaccin de Maillard. Otra posible causa del pardeamiento
podra ser la misma Spirulina o uno de sus metabolitos secundarios, que
probablemente tornaran el sustrato pardo o simplemente serviran como
catalizadores de una reaccin de pardeamiento no enzimtico tipo Maillard. Para
verificar dicho planteamiento, se procedi a evaluar la formacin de
hidroximetilfurfural, uno de los productos caractersticos de la reaccin de
Maillard, en dos sustratos diferentes: a) suero alcalinizado diluido a la quinta parte
y b) medio sinttico adicionado con lactosa. Igualmente, se evalu el proceso de
formacin de HMF en los mismos sustratos inoculados con Spirulina para verificar
el efecto de la cianobacteria sobre el pardeamiento. Para evitar introducir ruidos
en el resultado se seleccion un sustrato a base de suero diluido a la quinta parte
por cuanto el contenido de fsforo es aproximadamente igual al contenido de
fsforo del medio sinttico de Schlosser. La prueba se corri por triplicado para
cada sustrato (inoculado y sin inocular) en tubos de ensayo de 10mL. El contenido
de HMF se determin por el mtodo de Carrez modificado (Anexo C) mediante
espectrofotometra en un equipo CARY 100 conc UV Visible, utilizando celdas
de cuarzo. Las muestras tomadas se midieron por triplicado cada dos das
durante 16 das.

La Tabla 17 resume los resultados del contenido de HMF en los diferentes


sustratos y cultivos evaluados (en el Anexo E se presentan todos los datos). Llama
la atencin el incremento de HMF presentado en el da 11 de incubacin. Sin
embargo, la alta desviacin estndar de los datos no brinda confianza suficiente
para afirmar que efectivamente existe un evento asociado con dicho
comportamiento

Para verificar el efecto de la presencia de Spirulina sobre la produccin de HMF,


se compar la evolucin de la concentracin de este durante 16 das tanto en el
suero alcalinizado (SA) y en el suero alcalinizado e inoculado (SAI). Como se
puede apreciar en la Grfica 1, los dos tratamientos muestran que existe un leve
incremento en los niveles de HMF a lo largo del periodo de incubacin,
especialmente marcado alrededor del da 16, tal y como lo comprueba el anlisis
de varianza (= 0.05). Por otro lado, an cuando los niveles de HMF parecen
incrementarse con el tiempo de incubacin, los resultados demuestran que no
existen diferencias significativas (= 0.05) entre los dos tratamientos evaluados
(Anexo F) lo cual confirma que la Spirulina no afecta la produccin de HMF, es
decir no causa pardeamiento del medio. Este resultado permite establecer que
existen condiciones propicias para la generacin de una reaccin de Maillard y
que el pardeamiento presentado en el suero no obedece a un producto del
metabolismo de la Spirulina.

37
Tabla 17. Concentracin de HMF en los sustratos evaluados.

Contenido de HMF (mgL-1)

Medio sinttico Suero


Medio sinttico Suero
Da con lactosa e alcalinizado e
con lactosa alcalinizado
inoculado inoculado
2 3,22 0,32 4,01 0,38 9,42 1,08 6,02 2,01
4 3,50 1,26 4,49 0,46 7,78 2,36 6,76 2,25
9 7,44 1,42 7,28 1,32 8,39 1,37 6,95 0,98
11 17,05 7,11 13,67 8,57 31,62 21,68 27,78 24,43
14 10,00 2,94 3,43 1,30 6,85 0,90 6,39 0,79
16 9,24 0,80 8,30 1,98 12,43 3,14 10,47 1,59

La Grfica 2 muestra la evolucin durante el periodo de incubacin de los niveles


de HMF tanto en el medio sinttico adicionado con lactosa (MSL) como en el
suero alcalinizado (SA) utilizado como sustrato para el crecimiento de la Spirulina.
Como se puede observar, es evidente que existen diferencias significativas (=
0.05) en los niveles de HMF, tanto entre los dos sustratos evaluados como a lo
largo del periodo de incubacin. Era de esperarse que el medio sinttico
adicionado con lactosa no presentara niveles detectables de HMF, pero los
resultados muestran que existe una formacin de dicho compuesto a lo largo del
periodo de incubacin. Este resultado es atpico dadas las caractersticas del
medio sinttico (compuesto nicamente por sales) y no existen fundamentos
tericos reportados que den una explicacin consistente para la generacin de un
pardeamiento no enzimtico tipo Maillard en ausencia de aminocidos. Mayor
investigacin se requiere para entender el mecanismo de pardeamiento de este
medio sinttico en presencia de lactosa y bajo las condiciones de incubacin
reportadas en este estudio. Lo que si evidencian los resultados es que los niveles
de HMF son significativamente mayores (=0.05) en el sustrato a base de suero
alcalinizado. Con base en los resultados, y teniendo en cuenta las caractersticas
del sustrato a base de suero, se fortalece la hiptesis de un pardeamiento no
enzimtico generado por el contenido de lactosa.

38
Grfica 1. Formacin de HMF en SA y SAI.

60

SA SAI
50
Contenido de HMF (mgL )
-1

40

30

20

10

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Tiempo de incubacin (das)

Grfica 2. Formacin de HMF en el MSL y en el SA.

60
MSL SA
Contenido de HMF (mgL )

50
-1

40

30

20

10

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Tiempo de incubacin (das)

39
7.4 DETERMINACIN DEL EFECTO DEL CRECIMIENTO DE S. platensis LB
2340 SOBRE LA DQO Y EL CONTENIDO DE NITRATOS Y FOSFATOS DE LOS
SUSTRATOS

Dado que no se present crecimiento evidente de Spirulina en ninguno de los


sustratos evaluados en este estudio, carece de sentido determinar la DQO y el
contenido de nitratos y fosfatos al final del periodo de incubacin. Sera lgico
pensar que cualquier cambio presentado en estos valores estara asociado a
causas externas a este estudio como quizs el crecimiento de otros
microorganismos. La ausencia en la disminucin del poder contaminante del suero
y el comportamiento descrito por la S. platensis en los experimentos de
crecimiento significa que, a pesar de que la condicin de luminosidad no fue
propicia para su desarrollo, la cianobacteria estudiada tampoco estuvo en la
capacidad de aprovechar la fuente orgnica de nutrientes presente en el suero, lo
cual indica que muy probablemente el metabolismo de esta cepa no es
mixotrfico. Se requiere mayor experimentacin en este sentido para verificar el
comportamiento metablico de la cepa estudiada.

40
8. CONCLUSIONES

Bajo las condiciones estudiadas, el suero alcalinizado y parcialmente


desproteinizado inhibe el crecimiento de la Spirulina platensIs LB 2340,
probablemente por una reduccin en la disponibilidad de luz generada por un
cambio en el color del sustrato durante el tiempo de incubacin.

El pardeamiento producido bajo las condiciones de incubacin empleadas, estara


asociado a una reaccin de pardeamiento no enzimtico tipo Maillard, la cual
podra estar facilitada por la presencia de lactosa. Mayor investigacin se requiere
para comprobar dicha hiptesis.

El cambio de color de los sustratos a base de suero puede ser retardado


diluyndolos a mayores proporciones, aumentando de esta forma el tiempo de
vida de la Spirulina.

La alta concentracin de fsforo en los sustratos a base de suero no es un factor


inhibitorio para el crecimiento de la Spirulina.

La formacin de hidroximetilfurfural (HMF), producto intermedio de la reaccin de


Maillard, en el suero de queso no parece estar correlacionada con la presencia de
la Spirulina.

La Spirulina no present metabolismo mixotrfico, es decir, aunque probablemente


la cantidad de luz no fue suficiente, no aprovech los nutrientes del suero en
ausencia de la misma.

41
9. RECOMENDACIONES

Realizar estudios posteriores que determinen la influencia de la lactosa sobre el


cambio de color del suero, factor que lo puede inhabilitar para su aprovechamiento
en el cultivo de microalgas y/o cianobacterias.

Investigar de que manera se desarrolla el proceso de pardeamiento en el suero no


alcalinizado, ya que en caso de que este no se de o se de lentamente, puede ser
de inters evaluar el suero como sustrato para el cultivo de otras cianobacterias o
microalgas que crezcan a pH cido y que sean preferiblemente mixotrficas como
lo es la Chlorella sp.

Realizar mayor experimentacin con cultivos de Spirulina incrementando la


disponibilidad de luz cuando se emplee el suero u otros efluentes opacos como
sustratos, aplicando una intensidad de luz ms alta (4000 lx 12000 lx) o
mediante la implementacin de cultivos en superficie tales como los bioreactores
en cascada o el cultivo de microalgas en estado slido. Para todo estudio que se
pretenda realizar sobre el crecimiento o produccin de metabolitos por microalgas
se debe controlar o cuantificar la disponibilidad de luz en toda el rea de cultivo,
para lo que se hace imprescindible tener a la mano un luxmetro.

Evaluar la posible utilizacin del suero en Hidropona, debido a su alto contenido


de nitratos y fosfatos, ya que este actualmente es utilizado como fertilizante de
praderas.

Tratar de explicar por medio de mayor investigacin, la razn por la cual en el


medio sinttico con lactosa y sin inocular probablemente se presenta una reaccin
de pardeamiento tipo Maillard sin generarse cambio de color, ya que adems no
hay fuente de aminocidos (NH2) que favorezcan el desarrollo de la misma.
Determinar si este resultado se debi posiblemente a una interferencia del mtodo
empleado.

Evaluar el crecimiento de la Spirulina en medio sinttico con exceso de fsforo,


con el fin de variar la relacin N/P y determinar que tan capaz es la Spirulina de
adaptarse a sustratos que presenten distintas relaciones N/P como las que se dan
en los medios orgnicos, para conocer de antemano la viabilidad de estos.

42
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46
ANEXOS

Anexo A. Preparacin del medio sinttico de Schlosser.


Modificacin del medio SAG, aplicable para las cepas de Spirulina platensis LB
2340 y Spirulina maxima LB 2342. Para prevenir la formacin de precipitado
durante el autoclavado, dos soluciones son preparadas:
Solucin A
Componente Cantidad
Agua destilada 500 mL
NaHCO3 13,61 g
Na2CO3 4,03 g
K2HPO4 0,50 g
Solucin B
Componente Cantidad
Agua destilada 500mL
NaNO3 2,50 g
K2SO4 1,00 g
NaCl 1,00 g
MgSO4 7 H2O 0,20 g
CaCl2 2 H2O 0,04 g
Solucin PIV 6 mL
Solucin Chu 1 mL
Vitamina B12 (15 g/100 mL H2O) 1 mL
Solucin PIV
Componente Cantidad
Agua destilada 1000 mL
Na2EDTA 0,750 g
FeCl3 6H2O 97 mg
MnCl2 4H2O 41 mg
ZnCl2 5 mg
CoCl2 6H2O 2 mg
Na2MoO4 2H2O 4 mg
Solucin Chu
Componente Cantidad
Na2EDTA 50,0 mg
Agua destilada 1000 mL
H3BO4 618,0 mg
CuSO4 5H2O 19,6 mg
ZnSO4 7H2O 44,0 mg
CoCl2 6H2O 20,0 mg
MnCl2 4H2O 12,6 mg
Na2MoO4 2H2O 12,6 mg

47
Anexo B. Ecuacin para el clculo de filamentos de SpirulinamL-1.

Teniendo en cuenta que el rea del total de la cuadricula de la cmara de


Neubauer es de 9mm2 y su profundidad es de 0.1 mm, el volumen total de esta es
de 0.9 mm3 9x10-4 mL. Por lo tanto:

Conteo.de. filamentos.en.cmara.de.Neubauer
Nmero.de. filamentos.mL1 =
9 x10 4 mL

Para determinar el volumen de inculo a adicionar en los cultivos se aplico la


siguiente ecuacin:

volumen.del.cultivo.a.inocularxconcentracin.inicial .deseada.del.cultivo =
volumen.del.inculo.a.adicionarxconcentracin.del.inculo.a.adiconar

La concentracin inicial de S. platensis de los cultivos fue ajustada entre 1000 y


2000 filamentosmL-1.

48
Anexo C. Mtodo de Carrez modificado para determinacin de HMF.

Material:
Matraces volumtricos
Tubos de ensayo

Reactivos y Soluciones
Ferrocianuro de potasio
Acetato de Zinc grado reactivo
Bisulfito de sodio grado reactivo

Solucin Carrez 1: Disolver 15 g de ferrocianuro de potasio (K4Fe(CN)6 3H2O) en


un matraz volumtrico de 100 mL y aforar con agua destilada.

Solucin Carrez 2: Disolver 30 g de acetato de Zinc (Zn(CH3COO)2 2H2O) en un


matraz volumtrico de 10 mL y aforar con agua destilada.

Solucin de bisulfito de sodio al 0,2%: Disolver 0,2 g de bisulfito de sodio


(NaHSO2) en un matraz volumtrico de 100 mL y aforar con agua destilada.

Solucin de referencia bisulfito de sodio 0,1%: Se prepara partiendo de la solucin


de bisulfito de sodio al 0,2%. Esta solucin se debe utilizar recin preparada.

Preparacin de la muestra: Pesar 5 g de miel (muestra) en un vaso de precipitado


y disolverlos con 25 mL de agua destilada, transferir cuantitativamente a un matraz
volumtrico de 50 mL.

Procedimiento para la determinacin de hidroximetilfurfural:


Adicionar 0,5 mL de solucin de Carrez 1 a la muestra y mezclar.
Adicionar 0,5 mL de solucin de Carrez 2 a la muestra y aforara con agua
destilada. Agregar una gota de alcohol etlico en caso de que se produzca
espuma.
Filtrar a travs de papel de filtro descartando los primeros 10 mL de filtrado.
Agregar 5 mL del filtrado en un tubo de ensayo y adicionarle 5 mL de agua
destilada y 5 mL de la solucin de referencia de bisulfito de sodio. Mezclar y
determinar la absorbancia de la muestra a 284 y 336 nm en celdas de
cuarzo de 1 cm de paso de luz. Si la absorbancia de la muestra es mayor
de 0,36, diluir la solucin de referencia con una solucin de NaHSO3 al 0.1
% y la muestra con agua en la misma proporcin. Corregir el valor de la
absorbancia por dilucin.

Expresin de resultados:

mg de hidroximetilfurfural / 100g de miel = (absorbancia de la muestra 284 nm)


(absorbancia de la muestra a 336 nm) x 14,97 x 5 g de la muestra.

49
Donde 14,97 es el factor = (126/16,830)(1000/10)(100/5)
126 = peso molecular del hidroximetilfurfural
16,830 = absortibidad molar del hidroximetilfurfural a 284 nm
1000 = mgg-1
10 = cLL-1
100 = g de miel reportados
5 = peso nominal de la muestra en g

50
Anexo D. Conteo en cmara de filamentos de S. platensis en los cultivos de
los experimentos realizados.
Tabla 1: Propagacin de la suspensin inicial
Cultivo de propagacin 1 Cultivo de propagacin 2 Cultivo de propagacin 3

Da Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Nmero de Filamentos Nmero de Filamentos Nmero de Filamentos
18 0 0 0 0 66 57 71 68 0 0 0 0
20 0 0 0 0 97 74 63 69 0 0 0 0
23 0 0 0 0 117 150 171 150 0 0 0 0
25 0 0 0 0 100 136 136 172 0 0 0 0
27 0 0 0 0 160 128 280 240 0 0 0 0
30 0 0 0 0 216 180 180 168 0 0 0 0

Tabla 2: Segunda propagacin


Cultivo de propagacin 1 Cultivo de propagacin 2 Cultivo de propagacin 3

Da Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Nmero de Filamentos Nmero de Filamentos Nmero de Filamentos
2 1 0 1 2 2 1 2 0 2 0 0 1
6 12 7 6 12 3 5 5 3 28 24 28 31
10 27 25 30 29 6 3 3 4 35 32 34 56
13 26 38 36 18 10 6 8 6 77 73 86 54
15 50 38 44 32 10 12 9 8 78 82 68 74
17 54 56 66 50 9 11 8 11 62 50 74 96
20 61 59 84 61 21 21 13 21 72 72 69 102
22 86 96 84 88

51
Tabla 3: Crecimiento de S. platensis en suero alcalinizado y suero alcalinizado diluido a la mitad enriquecido con nitrato de sodio
Suero alcalinizado diluido a la mitad Suero alcalinizado diluido a la mitad
Suero alcalinizado Suero alcalinizado Blanco
enriquecido con nitrato de sodio enriquecido con nitrato de sodio
Da

Conteo 1 Conteo 2 Conteo 3 Conteo 4 Conteo 1 Conteo 2 Conteo 3 Conteo 4 Conteo 1 Conteo 2 Conteo 3 Conteo 4 Conteo 1 Conteo 2 Conteo 3 Conteo 4 Conteo 1 Conteo 2 Conteo 3 Conteo 4

Nmero de Filamentos Nmero de Filamentos Nmero de Filamentos Nmero de Filamentos Nmero de Filamentos
2 2 3 2 3 2 3 2 3 2 0 1 0 1 0 3 2 1 5 1 0
5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 3 1 1

Tabla 4: Crecimiento de S. platensis en suero alcalinizado diluido a la quinta parte y suero alcalinizado diluido a la quinta parte
enriquecido con nitrato de sodio.
Suero alcalinizado diluido a la Suero alcalinizado diluido a la
Suero alcalinizado diluido a la
quinta parte enriquecido con quinta parte enriquecido con Blanco
quinta parte
nitrato de sodio nitrato de sodio
Da
Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Nmero de Filamentos Nmero de Filamentos Nmero de Filamentos Nmero de Filamentos
2 1 1 0 0 3 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 3
5 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 2 0 1 0 5 2
7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2 0

Tabla 5: Crecimiento de S. platensis en suero alcalinizado diluido a la dcima parte y suero alcalinizado diluido a la dcima parte
enriquecido con nitrato de sodio hasta igualar la relacin N/P presente en el medio sinttico.
Suero alcalinizado diluido a la Suero alcalinizado diluido a la
Suero alcalinizado diluido a la
dcima parte enriquecido con dcima parte enriquecido con Blanco
dcima parte
nitrato de sodio nitrato de sodio
Da
Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo Conteo
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Nmero de Filamentos Nmero de Filamentos Nmero de Filamentos Nmero de Filamentos
2 2 0 5 1 3 0 0 1 0 1 0 2 1 1 1 2
4 3 0 1 2 1 1 3 1 0 0 2 1 2 0 2 1
8 1 2 2 7 2 0 1 0 2 0 2 3 4 9 4 7
11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13 2 8 10

52
Anexo E. Datos de formacin de HMF.

mgL-1 de hidroximetilfurfural
Medio con
Medio
Dia lactosa e Suero Suero inoculado
con lactosa
inoculado
0 0 0 0
0 0 0 0 0
0 0 0 0
2,91 4,15 8,89 7,05
3,26 3,99 9,05 8,22
2,79 4,04 9,62 1,16
3,00 3,72 8,38 5,64
2 3,14 3,85 8,50 5,76
3,12 3,20 8,14 5,61
3,76 4,44 10,66 6,77
3,62 4,36 10,68 7,13
3,38 4,30 10,90 6,81
5,22 5,17 9,57 8,31
4,62 4,81 8,96 8,15
5,36 5,04 9,79 8,89
2,42 4,17 10,26 5,38
4 2,61 4,07 10,11 10,55
1,86 4,24 4,92 5,95
3,17 4,64 5,52 4,56
3,23 4,47 5,69 4,52
3,04 3,82 5,19 4,56
6,31 7,45 6,50 7,73
5,54 7,65 7,02 8,22
5,40 7,35 7,13 7,77
8,35 5,45 9,51 5,48
9 6,87 5,63 10,11 5,57
8,59 5,99 9,93 6,32
8,97 8,91 8,87 7,11
8,61 8,74 7,51 6,85
8,35 8,35 8,90 7,48

53
mgL-1 de hidroximetilfurfural
Medio con
Medio con
Da lactosa Suero Suero inoculado
lactosa
e inoculado
16,96 10,53 51,09 43,98
17,14 10,80 42,67 40,85
16,91 10,02 35,50 38,32
25,54 24,94 49,80 46,12
11 24,91 24,64 45,71 47,54
25,25 24,73 49,62 46,85
10,64 5,68 3,89 -3,07
7,89 5,73 3,01 -4,12
8,18 5,97 3,29 -6,47
13,45 1,56 7,22 6,03
13,09 2,17 7,34 6,60
12,85 1,62 6,32 6,77
11,04 3,98 8,59 7,70
14 10,14 3,76 6,93 5,48
10,20 3,96 7,37 7,20
6,56 4,23 5,97 6,36
6,27 4,60 5,72 5,20
6,42 5,02 6,20 6,15
10,25 7,19 11,12 11,11
10,00 6,57 12,74 11,38
9,65 11,08 10,90 9,58
9,18 5,69 9,16 12,11
16 9,21 8,03 9,12 12,35
9,42 6,69 9,81 11,56
9,02 11,07 16,90 9,72
7,44 8,58 16,20 8,09
8,99 9,76 15,87 8,35

54
Anexo F. Anlisis de varianza de dos factores para la prueba de HMF.
Tabla 1. Anlisis de varianza entre el suero alcalinizado y el suero alcalinizado e inoculado
Origen de las variaciones Suma de cuadrados de libertad Cuadrado medio Fo Probabilidad Valor crtico para F

Das 7726,79 5 1545,36 18,67 6,46E-13 2,31

Sustrato y Cultivo 84,32 1 84,32 1,02 3,15E-01 3,94

Interaccin 24,33 5 4,87 0,06 9,98E-01 2,31

Error 7947,74 96 82,79

Total 15783,18 107


* El anlisis de varianza se realiz asumiendo las 9 muestras de cada da como independientes

Tabla 2. Anlisis de varianza entre el medio sinttico con lactosa y el suero alcalinizado
Origen de las variaciones Suma de cuadrados de libertad Cuadrado medio Fo Probabilidad Valor crtico para F

Das 4383,21 5 876,64 19,03 4,13E-13 2,31

Sustratos 508,06 1 508,06 11,03 1,27E-03 3,94

Interaccin 797,27 5 159,45 3,46 6,41E-03 2,31

Error 4422,04 96 46,06

Total 10110,58 107


* El anlisis de varianza se realiz asumiendo las 9 muestras de cada da como independientes

55