Validacion Metodos Microbiologicos ISO 17025

Aseguramiento de la calidad y validacin
de metodologas para el anlisis microbiolgico

NORMA ISO 17025
Bqca. Alicia I. Cuesta
1
Normas
Sistema de calidad
ETA Alimentos sanos Mtodos analticos
SEGURIDAD e INOCUIDAD ALIMENTARIA
Manejo sanitario
Bqca. Alicia Irene Cuesta 2

Normas
CALIDAD HIGIENICA Sistema de calidad

Alimentos sanos
Y SENSORIAL
Mtodos analticos
VIDA UTIL
Manejo sanitario

Generalidades de la Norma ISO 17025
Los resultados de los mtodos analticos:
Basados en principios de aseguramiento de la calidad.
Validados
Acreditados segn la Norma ISO 17025
Son internacionalmente reconocidos
Considerados de referencia para la evaluacin

de conformidad de los productos de intercambio
en el comercio internacional.
NORMA ISO 17025: 2005
General requirements for competence of calibration and testing laboratory.
Es la norma vigente para acreditar laboratorios.
Esta norma tiene todos los requisitos que deben cumplir

los laboratorios de ensayos si desean demostrar que
poseen:
Un sistema de calidad.
Son tcnicamente competentes
Capaces de generar resultados tcnicamente vlidos.
Hay un reconocimiento mutuo con otros

laboratorios del mundo.

La ley est por encima de las normas
La Norma ISO 17025 no contempla el cumplimiento de :

requisitos regulatorios y
de seguridad relacionados con el funcionamiento del
laboratorio.
La Norma dice :
QU hay que hacer? (Requisito)
El laboratorio dice el
CMO? (cmo se implementa el requisito)

ACREDITACIN (Norma ISO 17025 )
Determinar la competencia tcnica del personal
y la validez tcnica de las operaciones.
Tiene que demostrar competencia
Los resultados de ensayo de un laboratorio

que tiene competencia tcnica
sern
CONFIABLES Y EXACTOS

Particularidades de ensayos microbiolgicos
A diferencia de las ciencias qumicas y fsicas,
en microbiologa se trabaja con
microorganismos que se multiplican por divisin
binaria y crecen exponencialmente.
Los ensayos microbiolgicos incluyen

ensayos de
esterilidad, deteccin, aislamiento, recuento e
identificacin de microorganismos y sus
metabolitos.
Pilares sobre los que se apoya la
COMPETENCIA TECNICA
COMPETENCIA TECNICA
Equipamiento
MTODO
PERSONAL
Ambiente

Laboratorio da resultados confiables y exactos?
Situacin del
laboratorio con Caso 1 Caso 2 Caso 3
respecto a:
capacitado, capacitado, Personal no est

Personal desarrolla bien su desarrolla bien su adecuadamente
tarea. tarea. capacitado
Instalaciones y
condiciones Adecuados y Riesgo de Adecuados y
ambientales suficientes contaminacin suficientes
Equipos cruzada
Validacin de la no est validada Validada Validada

metodologa

Los objetivos de un sistema de calidad son:
PREVENCIN: Evitar que se produzcan errores e

ineficiencias.
DETECCIN: Identificar los elementos causantes de los

errores.
CORRECCIN Y MEJORA: Eliminar las causas de los

errores y mejorar los procesos.
DEMOSTRAR: Evidenciar objetivamente que se ha

cumplido con los requisitos

ENSAYO MICROBIOLGICO
Las operaciones que se realizan dentro del

laboratorio de microbiologa pueden dividirse en
aquellas que son crticas para la calidad de
resultados del ensayo y aquellas que tienen un
menor impacto.
Las operaciones crticas deben ser:

controladas,
monitoreadas y
documentadas.
Aseguramiento de calidad
Norma ISO 17025
PERSONAL
Las personas son el motor de los sistemas de calidad

y por lo tanto este es un punto crtico y que la norma
ISO/IEC 17025 lo trata extensamente.
Tiene que haber motivacin interna para planificar,

implementar y mantener el sistema de calidad!!

Requisitos Personal (Norma ISO 17025):
El personal debe contar con conocimientos, experiencia y competencia de
acuerdo a las tareas y responsabilidades que tenga asignadas.
COMPETENCIA DEL PERSONAL: La competencia involucra conocimientos,
habilidades, comprensin y actitudes. La evaluacin debe ser continua.
El laboratorio debe tener documentado el personal autorizado para cada
ensayo.
PERSONAL AUTORIZADO: personal que posee el reconocimiento formal de
su capacidad para realizar en forma correcta una determinada tarea que se le
ha sido asignada.
Todo el personal tcnico que trabaja en el laboratorio de microbiologa debe
recibir un adecuado entrenamiento de modo de asegurar que ejecuta en forma
idnea las operaciones relacionadas con el ensayo.
La capacitacin es un requisito muy importante del sistema de calidad.
CAPACITACIN DEL PERSONAL: Definicin: proceso continuo y sistemtico
destinado a la formacin, entrenamiento, actualizacin o perfeccionamiento
especfico del personal.
La direccin debe definir y mantener actualizados los perfiles de puestos del
personal directivo, tcnico y de apoyo clave afectado a los ensayos.
PERFIL DEL PUESTO DE TRABAJO: Definicin: Son los requisitos mnimos de
formacin acadmica y experiencia que debe tener el personal para acceder al
puesto de trabajo.
CAPACITACIN DEL PERSONAL
Entrenamiento:
Actividad de ensear las habilidades que una persona
necesita para desarrollar su labor en un determinado
puesto de trabajo.
Tiene carcter eminentemente prctico .
Se relaciona directamente con la tecnologa, tiles,
equipos, etc. que se usan en el puesto de trabajo.
Formacin:
Actividades de incorporacin de conocimientos generales
y especficos necesarios para que el personal pueda
desarrollar su labor en un determinado puesto de trabajo.
Se hace referencia a la formacin acadmica del personal.

Norma ISO17025:2005 punto 5.2.2
La direccin del laboratorio debe formular

las metas con respecto a la educacin, la
capacitacin y las habilidades del personal del
laboratorio.
El laboratorio debe tener una poltica y
procedimientos para identificar las necesidades de
capacitacin del personal y para proporcionarla.
El programa de capacitacin debe ser pertinente a
las tareas presentes y futuras del laboratorio.
Se debe evaluar la eficacia de las acciones de
capacitacin implementadas.

Capacitacin del personal
LABORATORIO MICROBIOLOGIA
Todo el personal tcnico debe recibir un adecuado

entrenamiento que incluyen:
Tcnicas bsicas de microbiologa para la manipulacin
de cultivos y muestras en condiciones de esterilidad
Adecuado criterio para el manejo de material
potencialmente infeccioso.
Conocimiento de normas de bioseguridad, etc.

Requisitos Norma ISO 17025: PERSONAL
COMPETENCIA TECNICA
Descripcin de actividades
Calificacin bsica y responsabilidades del personal
CONDUCCIN TCNICO DE APOYO
Relacin de dependencia
CAPACITACION:
Identificacin de las
necesidades de capacitacin.
Planificacin de la capacitacin. LABORATORIO
Realizacin de la capacitacin
Documentacin.
Norma ISO 17025
INSTALACIONES Y CONDICIONES
AMBIENTALES
Requisitos:
Las instalaciones del laboratorio de ensayo
(incluye fuente de energa, luz y condiciones
ambientales) deben ser capaces de facilitar
la realizacin correcta de los ensayos.

Instalaciones (cont)
Debe haber una efectiva separacin entre reas

vecinas en las que se realizan actividades
incompatibles.
Se deben tomar medidas para prevenir la

contaminacin cruzada.
La ubicacin, el diseo y la distribucin de las
diferentes reas que integran el laboratorio
deben minimizar el riesgo de contaminacin de
las muestras y los cultivos.

MEDIDAS PARA PREVENIR LA CONTAMINACIN CRUZADA.
CRUZADA
En la prctica esto se puede lograr:
Separando las actividades en tiempo y espacio.

espacio
Mediante la construccin del laboratorio segn un

diseo sin camino de regreso se puede obtener una
reduccin significativa del riesgo de contaminacin
cruzada.
Llevando a cabo los procedimientos de una manera

secuencial,
secuencial usando las precauciones apropiadas para
asegurar la integridad de la muestra y del ensayo.
Por ejemplo uso de recipientes hermticamente cerrados.

SEPARACIN DE REAS DEL LABORATORIO:
No es aceptable que
el laboratorio de microbiologa
ocupe una sola sala polivalente.
Requisito: El rea analtica debe estar separada

de la de preparacin de medios de cultivo y lavado
de material.

Separacin de reas del Laboratorio:
Es conveniente separar las siguientes reas:
zona de recepcin y almacenamiento de muestras.

Preparacin, muestreo y pesada de muestras.( importante si se
analizan productos en polvo)
Examen de muestras incluyendo su incubacin.
Manipulacin de patgenos.
Mantenimiento de microorganismos de referencia.
Verificacin de la esterilidad.
Preparacin de los medios y equipos incluyendo su esterilizacin
Descontaminacin.
El rea de Lavado de material ( despus de la descontaminacin)
pueden compartirse con otras partes del laboratorio (precaucin
contaminacin con trazas de sustancias que afecten crecimiento
microbiano).

El diseo del laboratorio depender de los ensayos
que se llevarn a cabo (depende del alcance de las
metodologas)
Ejemplo si adems de realizar ensayos por mtodos

tradicionales se llevan a cabo ensayos empleando tcnicas
de biologa molecular se necesitarn reas adicionales.
El laboratorio debe tomar las medidas necesarias para

reducir al mnimo el riesgo de contaminacin
siempre que dicho riesgo
sea importante para el tipo de ensayos realizados.
realizados

Medidas para de disminuir el riesgo de contaminacin
y facilitar la limpieza y desinfeccin de las diferentes reas.
Medidas relativas a los materiales :
Facilitar la limpieza:
Las paredes, techos suelos y superficies de trabajo del
laboratorio deben ser lisas.
Las superficies de madera de las instalaciones y

accesorios deben estar protegidas y selladas.
Evitar maderas rugosas y sin revestir.

Medidas relativas al diseo:
Espacio disponible:
Las reas del laboratorio deben ser suficientemente espaciosas.
El espacio necesario estar de acuerdo con el volumen de muestras analizadas
y la organizacin interna del laboratorio.
Facilitar la limpieza:
Las uniones entresuelo, paredes y techos deben ser cncavas.
Contar con canillas, adecuadamente ubicadas, para el lavado de manos del
personal.
Ventilacin:
Las reas de trabajo deben estar apropiadamente ventiladas y a una
temperatura adecuada.
Puede hacerse por ventilacin natural o forzada, o mediante el uso de
acondicionadores de aire. En este ltimo caso, los filtros deben revisarse,
mantenerse y reemplazarse peridicamente, acorde al tipo de trabajo que se
realiza.
Otros:
Evitar uso de cortinas y/o persiana internas
En caso de uso incluirlas en el plan de limpieza
Otras medidas :
Ausencia de documentos obsoletos, objetos

o mobiliario innecesario en el rea del laboratorio.
Minimizar la apertura de puertas y ventanas durante la

realizacin del ensayo.
Contar para el lavado de manos del personal con canillas

no manuales, el jabn desinfectante debe estar dispuesto
en dispensadores y toallas descartables para el secado.
Los armario estanteras, equipos deben estar colocados

de forma de evitar acumulacin de polvo.
Ejemplo armarios hasta el techo.

Se debe controlar el acceso y el uso de las reas que afecta la
calidad de los ensayos.
El acceso al laboratorio debe estar restringido slo al personal tcnico

o a personas autorizadas.
CONDICIONES AMBIENTALES
REQUISITO:
El laboratorio debe asegurarse que
las condiciones ambientales, bajo las cuales se realizan los
ensayos microbiolgicos,
no invaliden los resultados de ensayo ni comprometan la calidad
requerida de los resultados.

Ejemplos de
condiciones ambientales no deseables
Condiciones Efecto posible sobre el ensayo Lugar a monitorear

Ambientales
Deficiente esterilidad Contaminacin de las muestras y Sala de siembra y de
biolgica cultivos preparacin de muestras
Suministro elctrico -Variacin de las condiciones de Funcionamiento
interrumpido ensayo. de estufas, congeladores y
o deficiente -Prdida de viabilidad cepas de heladeras
referencia por descongelacin.
-Conservacin inadecuada de la
muestra, reactivos y medios de
cultivo.
Niveles de Interfiere en la pesada de la Sala de preparacin de
ruido o muestra, polvos deshidratados muestras
vibracin excesivos. para preparacin de medios de
cultivos o reactivos
Mayor polvo en Contaminacin de las muestras y Sala de siembra y de
suspensin en el aire cultivos preparacin de muestras

Requisito
El laboratorio debe establecer:
Un programa documentado de limpieza y desinfeccin

que tenga en cuenta los resultados de vigilancia de las condiciones
ambientales y la posibilidad de contaminacin cruzada.
Objetivo:
Organizar las tareas de limpieza y desinfeccin del laboratorio de
microbiologa.
Establecer la frecuencia de realizacin de las mismas
Se detallan las superficies a limpiar y/o desinfectar, el nivel de
limpieza requerido (trapeo hmedo, trapeo mojado, etc.), los
desinfectantes a preparar y su modo de uso.
El personal que realiza la limpieza.

PLAN DE HIGIENE.
Son los procedimientos

operativos empleados durante la
realizacin del trabajo en el
laboratorio.
Tiene como principal objetivo
evitar la contaminacin en todas
las etapas del ensayo
lo que implicara obtener resultados
errneos, la infeccin del personal,
etc.

PLAN DE HIGIENE.
El laboratorio debe trabajar tomando las siguientes precauciones :
Relativo al trabajo propiamente dicho.
Por ejemplo:
Asegurarse que el rea de trabajo est limpia y que no haya corrientes de aire.
Limpiar la superficie de trabajo con un desinfectante adecuado, antes y despus del trabajo.
Durante la siembra y manipuleo estril de muestras no hablar y evitar toser.
Abrir los tubos de ensayo y botellas cerca de la llama.
Trabajar tan rpido como sea posible, evitando movimientos innecesarios.
la manipulacin del material patgeno o txico requiere trabajar en reas cerradas o bajo campanas
de flujo laminar, especialmente cuando se abren las cajas de Petri.
Evitar la formacin de aerosoles. Se pueden formar al abrir las cajas de Petri, los tubos, las botellas o
los frascos, al usar mezcladores, jeringas, centrfugas, etc. y cuando se esterilizan ansas hmedas.
Relativo al rea de trabajo:
Utilizar vestimenta de uso exclusivo en el laboratorio, guardapolvo de color claro, limpio y en buenas
condiciones, no debe ser usado fuera del rea de trabajo del laboratorio.
Dejar en zona de oficinas o externa al laboratorio los abrigos. portafolios, etc. Y en el rea del
laboratorio no comer, beber, fumar.
Relativo a la Higiene del personal tcnico:
Antes y al finalizar la labor en el laboratorio, el personal tcnico debe lavarse las manos con un
producto adecuado (jabn desinfectante).
El personal debe tener uas cortas y limpias, el pelo debe estar recogido, no tener anillos ni pulseras.
Uso de barbijo si es necesario.
El personal que presente infecciones serias en manos o cara no debe realizar exmenes
microbiolgicos.

MONITOREO AMBIENTAL:
La calidad microbiolgica
del aire y las superficies
del laboratorio en microbiologa
Es un indicador de la efectividad
de las tareas realizadas segn el:
Plan de limpieza, desinfeccin y mantenimiento
Plan de higiene.
Procedimiento: MONITOREO AMBIENTAL

Establece :
Metodologa para la toma de muestra.
Lugares de toma de muestra.
Lmites de tolerancia o criterios de aceptacin o rechazo.
Frecuencia de monitoreo.
Acciones correctivas a tomar en caso de desvos de los lmites
establecidos.
Esto se aplica tanto a control ambiental del rea analtica del laboratorio
como para la campana de flujo laminar.

El programa de muestreo para
monitoreo ambiental puede incluir
(dependiendo del ensayo que realiza el laboratorio):
Determinacin cuantitativa de microorganismos

presentes en el ambiente (recuento total o recuento de
determinados tipos de microorganismos como por ejemplo
hongos)
Determinacin cualitativa de algunos patgenos y/o

indicadores dependiendo de los ensayos que realiza el
laboratorio (Ejemplo: Enterobacterias, Coliformes,
Salmonella spp, Listeria monocytogenes, Listeria spp,
Staphylococcus aureus).

MTODOS PARA CONTROL
CALIDAD DEL AIRE:
Mtodo pasivo, por sedimentacin.
sedimentacin
Se realiza el recuento de microorganismos viables que se posan
sobre una superficie de medio de cultivo (tcnica cualitativa).
No existe relacin entre la cantidad de colonias encontradas en por
placa y el volumen de aire.
Mtodo activo, por impacto.
Se realiza el recuento de microorganismos viables retenidos
sobre una superficie de medio de cultivo forzando un
determinado volumen de aire.
Mtodos para control calidad del aire: MTODO PASIVO Y
ACTIVO
Los resultados de ambos mtodos no son comparables (el principio
de muestreo y las unidades en las cuales se expresan son diferentes).
SE RECOMIENDA INTERPRETAR TENDENCIAS Y NO

OBSERVACIONES AISLADAS.(tomar siempre la muestra en un mismo
lugar)

Mtodos para control calidad del aire:
Normas IRAM 14071-1:2002 EXPOSICIN DE PLACAS:
Toma de muestra: durante un tiempo estipulado, se exponen placas de

Petri (o sea se abren las placas) con medio de cultivo no selectivo, en el rea de
trabajo y durante el proceso de siembra.
reas a monitorear o zonas de toma de la muestra: sala
de siembra y sala de preparacin de muestras.
Medio de cultivo usado. Ejemplo PCA.
Tiempo y temperatura de incubacin: Luego de la exposicin al
aire, las placas se cierran e incuban durante Ejemplo 72 horas a 30 C.
Frecuencia de realizacin de los controles. Ejemplo mensual.
Criterio de conformidad: nmero mximo de colonias por tiempo de
exposicin de las placas. Ejemplo durante 15 minutos se permite hasta 15
colonias. Los resultados se expresan como unidades de colonias (ufc) por placa

Mtodos para Control calidad
de superficies:
Tipo de
Mtodo Recoleccin superficie Siembra
Hisopado Hisopo estril Delimitada Siembra directa

Irregular Siembra de
Esponja- Esponja embebida Superficies volumen
trapeado en medio especfico 100cm2 conocido
Caja de
contacto Contacto, presin y Incubacin
o Petrifilm tiempo estndar Plana directa
Normas de consulta: Mtodos para Control calidad de superficies: ISO 18593:2004 Microbiology
of food and animal feeding stuffs -- Horizontal methods for sampling techniques from surfaces
using contact plates and swabs

Instalaciones y condiciones ambientales
Equipamiento necesario
Limpieza y orden
Reglas de acceso
y utilizacin Plan de higiene
de las reas
LABORATORIO
Separacin de
reas donde Monitoreo ambiental
se realizan
actividades incompatibles

Norma ISO 17025
MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
REQUISITO:
la calidad de los medios de cultivo y reactivos
sea apropiada para los ensayos realizados.
Este es un punto crtico!
Cmo se asegura su calidad?

Qu necesita un
microorganismo para crecer?
MEDIOS DE CULTIVO:
Son necesarios para el aislamiento, mantenimiento,
la reproduccin y la identificacin de los
microorganismos.
Contienen sustancias nutritivas
pH adecuado
Deben estar estriles.
Incubacin:
Depende del metabolismo del microorganismo a
cultivar.
La atmsfera empleada.(aerobio, microaeroflico,
anaerobio)
Tiempo.
Temperatura.
Clasificacin de medios de cultivo:
1.Segn su estado fsico: lquidos, semislidos y slidos.
2.Segn su finalidad en microbiologa:

No selectivos: contienen suficientes nutrientes como para
soportar el crecimiento de gran variedad de microorganismos.
Selectivos: permiten el crecimiento de slo un tipo de

microorganismo.
Enriquecido: son medios no selectivos que se le agrega

sustancias como ser sangre, suero, albmina, etc... Para
microorganismos exigentes.
Diferenciales: son medios de cultivo que permiten

establecer diferencias entre diferentes tipos microorganismos.

Los medios de cultivo se preparan:
1. En el laboratorio a partir de sus diferentes

componentes.
2. A partir de productos en polvo deshidratados
comerciales o
3. Pueden adquirirse medios listos para su uso.
La calidad de un medio de cultivo depende de la calidad de

los ingredientes bsicos, la correcta formulacin, calidad
del procedimiento de preparacin, ausencia de inhibidores,
envasado y almacenamiento.
Normas de consulta: ISO 7218:1996(E) Microbiology of

food and animal feeding stuff-General rules for
microbiological examinations y ISO/TS 11133-1:2000

Requisitos de los medio de cultivo
provistos por el fabricante :
Los lotes de medios deben estar debidamente identificados.

(TRAZABILIDAD)
Cada lote recibido debe ir acompaado de evidencias del

cumplimiento de las especificaciones de calidad.
El fabricante debe proveer informacin acerca de las

especificaciones de calidad del medio de cultivo, debe incluir lo
siguiente:
Nombre del medio y lista de componentes, incluido cualquier suplemento.
Fecha de vencimiento del medio.
Condiciones de almacenamiento.
Control de esterilidad.
Control del crecimiento de los microorganismos de inters (target) y de los
microorganismos no deseados (no target) y criterios de aceptabilidad.
Controles fsicos y criterios de aceptabilidad aplicados.

Manejo de los medios de cultivo:
1.El laboratorio debe registrar la fecha :

de recepcin
de apertura del envase.
de caducidad
2. El almacenamiento debe realizarse en las

condiciones apropiadas.
Envases: deben estar hermticamente cerrados.
(especialmente medios deshidratados)
No deben utilizarse medios deshidratados que
presenten apelmazamiento o un cambio de color.

CONTROL DE CALIDAD DEL AGUA DESTILADA
Para la preparacin de medios, soluciones y tampones,

debe utilizarse agua destilada que haya sido sometida a
controles peridicos que aseguren su calidad.
Controles peridicos:
Requisitos del agua destilada:
-Conductividad.
- pH
- Contaminacin microbiana
- Libre de sustancias bactericidas, inhibidoras o
interferentes.
-Se debe llevar un registro actualizado de los mismos.

Procedimiento para preparacin
de medios de cultivo, diluyentes y reactivos
Los medios de cultivo, soluciones y reactivos deben
prepararse, almacenarse y utilizarse de acuerdo
con un procedimiento documentado.
En dicho procedimiento debe haber una descripcin del

equipamiento necesario.
El laboratorio debe colocar una etiqueta indicando la

identificacin y otros datos en los medios de cultivo y
reactivos.(TRAZABILIDAD)
Debe haber un registro de preparacin de medios de

cultivo y reactivos.
LAVADO DE MATERIAL:
Otro aspecto a tener en cuenta es el correcto

lavado del material reciclable.
El laboratorio de debe contar con un instructivo para esta
tarea.
Pasos:
Descontaminacin material de vidrio.
Enjuague y se lavado con agua caliente y detergente
apropiado ( extran neutro diluido al 2%)
Enjuague n de veces con agua corriente y luego un n de
veces con agua destilada. Eliminar el detergente
El material se seca en estufa y se acondiciona para ser
esterilizado.
Control de esterilidad de los medios de cultivo y diluyentes:
Fue efectivo el proceso de esterilizacin de los medios de

cultivo y diluyentes?
PRUEBA: se incuban en estufa de cultivo.
La temperatura y tiempo de incubacin para esta prueba se

corresponden con las condiciones usadas durante el ensayo.
Se realiza este ensayo sobre el 1% de las placas o tubo del

comienzo y 1% de las placas o tubos del final de verter o
distribuir los medios o diluyentes.
Este procedimiento se realiza por cada vez que se esteriliza

un lote de medio de cultivo o diluyente en autoclave o se
esteriliza por filtracin.

Aseguramiento de calidad de los medios de cultivo:
Posibles problemas
Anormalidad Posible causa
Falla en la Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin

solidificacin del Peso incorrecto del agar
medio slido Agar mal disuelto o incompleta mezcla de los ingredientes
Formacin de Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin

precipitado pH medido incorrectamente
Pobre calidad del agua.
Pobre calidad del medio deshidratado.
pH incorrecto Pobre calidad del agua.

pH medido incorrectamente.
Contaminacin externa con qumicos.
Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin

Aseguramiento de calidad de los medios de cultivo:
Posibles problemas
Anormalidad Posible causa
Color anormal Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin

pH incorrecto
Contaminacin externa.
Pobre calidad del agua o del medio deshidratado.
Selectividad pobre Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin
pH incorrecto.
Formulacin inadecuada.
Suplementos agregados incorrectamente Ej: con el medio demasiado
caliente o en alta proporcin.
Medio inhibitorio/ Pobre calidad del agua.
Productividad baja Formulacin inadecuada Ej. ingredientes y suplementos mal pesados.
Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin
Pobre calidad del medio deshidratado

EVALUACIN DE LA CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
El objetivo es definir la: metodologa para evaluar la

PRODUCTIVIDAD y SELECTIVIDAD de medios de
cultivo slido, semislido o lquidos ya preparados y
esterilizados, utilizados en el laboratorio de
microbiologa.
Cultivo de trabajo (segn Instructivo de cultivos de

referencia) Se prepara un cultivo en fase estacionaria
de la cepa a partir de la cepa de reserva almacenadas
en el laboratorio en un caldo no selectivo (por ejemplo
caldo cerebro corazn)

PRODUCTIVIDAD:
Definicin: rendimiento, recuperacin, crecimiento

de un microorganismo que se espera que desarrolle en
el medio de cultivo.
Segn el medio de cultivo, se usa una cepa apropiada de
referencia target para evaluar la productividad
(ver anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000)
EJEMPLO: En un medio de cultivo no selectivo

como por ejemplo el PCA se evala el
adecuado desarrollo de las cepas target o
blanco.
En este caso se usan E. coli ATCC 25922,
S. aureus ATCC 6538 y B. subtilis ATCC 6633

SELECTIVIDAD:
Definicin: la supresin del crecimiento de un

microorganismo que se espera sea inhibido
en el medio de cultivo.
Segn el medio se usa una cepa apropiada de referencia
no-target para evaluar la selectividad
En un medio de cultivo selectivo como por ejemplo Caldo Lauril sulfato (LST)
se evala el desarrollo de las cepas target y no target.
En este caso las cepas target que se usan son
E.coli ATCC 25922, C.freundii ATCC 43864
y las cepas no target Enterococcus faecalis ATCC 29212.

Evala reacciones caractersticas: gas y turbidez.

En medios selectivos y/o diferenciales hay que evaluar:
El crecimiento de las cepas target
Hay que prestar atencin tambin a la

apariencia, tamao y morfologa de las
colonias (especificidad)
El crecimiento de las cepas

no-target debe estar en parte o
completamente inhibido.
PARA EVALUAR CADA LOTE DE MEDIO DE CULTIVO
segn Norma ISO/TS 11133-2:2000
SE PUEDE EMPLEAR LOS SIGUIENTES MTODOS:
a)Pruebas cuantitativas
b) Pruebas semi-cuantitativas
c) Pruebas cualitativas

MEDIO DE REFERENCIA
El uso de un medio de referencia especfico

es obligatorio en los mtodos de cuantitativos
Para las pruebas semi-cuantitativas o cualitativas,

el uso de un medio especfico de referencia
o un medio de cultivo que da una la reaccin positiva"
ayuda al nterpretar los resultados.
El medio de referencia debe ser de conocida buena calidad
(por ejemplo ser un medio listo para el uso
de calidad asegurada por el proveedor)

PRODUCTIVIDAD:
Pruebas cuantitativas: la proporcin de Productividad PR

es definido como sigue:
PR = Ns /No
donde
Ns: es el recuento total de colonias obtenido en el medio de
cultivo a probar (obtenido de uno o ms placas)
No: es el recuento total de colonias obtenido en el medio de
cultivo de referencia definido obtenido de uno o ms placas
que debe ser 100 ufc.

PRODUCTIVIDAD: Pruebas cuantitativas
CRITERIO DE CONFORMIDAD:
Anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000.
All figuran:
Los microorganismos
Tiempo y temperatura de incubacin
Criterios
Medio de referencia que debe usarse segn el medio a
evaluar.
PR debe ser mayor o igual a un valor lmite para que el
medio de cultivo sea conforme.
En general para que los medios no selectivos como el
PCA sea conforme, el PR debe ser a 0,7.

PRODUCTIVIDAD:
Ejemplo Pruebas cuantitativas
Se desea evaluar la productividad del PCA.

El medio de referencia usado es agar tripticasa soya (TSA)
1) Ns ( dil -6):140 ufc
No ( dil -6): :170 ufc
PR = Ns /No
PR= 0,8 esto quiere decir que el medio testeado es conforme
2) Ns ( dil -6):100 ufc

No ( dil -6): 230 ufc
PR = Ns /No
PR= 0,4 esto quiere decir que el medio testeado
no es conforme en cuanto a su productividad.
PRODUCTIVIDAD:
Pruebas semi-cuantitativas.
Se inocula en forma de estras diluciones del

cultivo con ansa calibrada de acuerdo a la figura o
modelo.
Las placas inoculadas se incuban a temperatura
y tiempo que depende del medio de cultivo
evaluado y se observa el crecimiento.
Se evala la productividad del medio teniendo en
cuenta el valor de cada estra con crecimiento.

PRODUCTIVIDAD :
Pruebas cualitativas
Se llevarn a cabo visualmente asignando
un score de crecimiento.
Score para medios slidos:
0 no hubo crecimiento
1 hubo crecimiento dbil
2 hubo buen crecimiento.
Score para medios lquidos:

0 no hubo turbidez
1 hubo turbidez muy tenue
2 hubo buena turbidez

SELECTIVIDAD:
Para llevar a cabo la prueba de la selectividad,

el medio de cultivo selectivo a evaluar y un medio de la
referencia se inoculan con un microorganismo y nivel
apropiado.
Se emplea una suspensin del microorganismo

de no-target que contiene 104cfu a 106cfu por ml se
inocula en la placa o en el tubo de medio.

Certificado de control
de calidad de un medio de Bqca. Alicia Irene Cuesta 63
cultivo no selectivo
Reactivos
EVALUACIN DE LA CALIDAD DE LOS REACTIVOS:

la calidad de los reactivos utilizados sea
apropiada para los ensayos realizados.
Ejemplo: Reactivos usados para revelar pruebas bioqumicas
Realizo controles positivo y negativo utilizando

microorganismos que sean trazables a colecciones de
cultivos nacionales o internacionales reconocidas.

Sntesis
En microbiologa se le da especial nfasis a la calidad de los
medios de cultivo y reactivos, tal que aquella sea apropiada
para los ensayos realizados.
Un punto crtico a tener en cuenta a la hora de implementar y la ISO
17025 y acreditar el laboratorio es la preparacin, esterilizacin y
evaluacin de la calidad de los medios de cultivo empleados para
realizar el ensayo.
Las recomendaciones internacionales de organismos de acreditacin
se basan en la Norma ISO/TS 11133-1:2000 y ISO/TS 11133-
2:2000.
Esto implica una revisin de las prcticas cotidianas realizadas por
el laboratorio y a su vez la seguridad que los medios usados son
adecuados a la finalidad prevista.

Norma ISO 17025
CULTIVOS DE REFERENCIA
Cultivos de referencia: REQUISITO Para acreditar o mantener la

acreditacin de un ensayo, el laboratorio de microbiologa debe contar
con cultivos de referencia.
El nmero y la eleccin del gnero y especie de las mismas depender
de los ensayos que se efectan y las necesidades particulares de estos
ltimos.
El laboratorio debe elaborar e implementar un procedimiento
documentado para el uso y manejo de cultivos de referencia. Es
NECESARIOS PARA DEMOSTRAR TRAZABILIDAD.
Definicin de Material de referencia : Material o sustancia que

posee valores de una o ms propiedades suficientemente
homogneas y bien conocidas para permitir su uso en la calibracin
de aparatos, la evaluacin de un mtodo de medicin o la atribucin de
valores a estos materiales.
( COGUANOR NGR/ISO/IEC 43-1)
Para qu son necesarios
los cultivos de referencia ?
Evaluacin de la calidad de los medios de cultivo.

Realizar controles de calidad interno durante la
ejecucin de los ensayos.
Realizar controles de calidad de reactivos.
Pruebas confirmatorias.
Ejemplo prueba de CAMP
Validar mtodos microbiolgicos.
Aseguramiento de la calidad de los resultados de
ensayo de mtodos microbiolgicos.

Cultivos de referencia:
Definicin:
Trmino colectivo que se refiere
a cepas de referencia, cepas de reserva y cepas de trabajo.
Requisitos:
Clulas microbianas capaces de crecer (VIABILIDAD).

Cepas de referencia: Las colecciones suministran las cepas
con instrucciones para su recuperacin.
Se debe tratar de un cultivo puro .(PUREZA).
Genticamente estables.( ESTABILIDAD)

( mantenimiento de caractersticas genotpicas y fenotpicas)

CEPAS DE REFERENCIA:
PARA DEMOSTRAR
LA TRAZABLIDAD DEBEN OBTENERSE DIRECTAMENTE
DE UNA COLECCIN NACIONAL O INTERNACIONAL DE
CULTIVO DE REFERENCIA RECONOCIDO.
Son microorganismos definidos:
Por lo menos a nivel de gnero y especie.
catalogados.
muy caracterizados.
de origen conocido.
[ISO 11133-1:2000]
Se comercializan liofilizadas.
Los organismos de acreditacin deben considerar vlida

la fuente de dnde provino la cepa.

En la prctica para cumplir con el requisito prevenir
mutaciones, deterioro o alteracin de las caractersticas
tpicas de las cepas de
el nmero de repiques a partir de la cepa de referencia
debe ser limitado
( en general es aceptado hasta 5 repiques a partir de la
cepa de referencia )
Si una cepa se adquiere por cualquier va que no sea la
propia coleccin, NO se puede mencionar utilizando el
nmero que tienen en esa coleccin, sino solamente como
derivada de la cepa de coleccin.

Cepas de coleccin
de referencia
http://www.atcc.org

CEPAS DE REFERENCIA:
Identificacin de la cepa.
Gnero y especie del microorganismo
TIPO y N de coleccin.
REGISTRO DE N de lote.
CEPAS DE REFERENCIA: Fecha de recepcin.
Control de calidad de la cepa de
referencia Conforme (SI/NO).
Fecha de caducidad de la cepa.
Personal responsable.
Reconstitucin de las cepas de referencia:

Las Cepas de referencia ingresan al laboratorio de microbiologa se registran
en planilla segn procedimiento.
Las Cepas de referencia se almacenan entre 0-5 C hasta su uso.
Las Cepas de referencia se reconstituyen y se siembran utilizando el medio
de cultivo, las condiciones de incubacin y el procedimiento indicado en las
instrucciones para cada tipo de microorganismo del organismo proveedor de
las cepas.
En paralelo, a las Cepas de referencia, se les realiza un control de calidad
de pureza y viabilidad y se registra.

Control de calidad
de pureza y viabilidad:
Se realiza a diferentes niveles del proceso. CADA VEZ QUE HAGO UN
REPIQUE.
Su finalidad es asegurarse que las cepas conservan su viabilidad y sus

caracteres bioqumicos.
Frecuencia de realizacin de este control: para las cepas de reserva

almacenadas el laboratorio la establecer en cada caso.
Registro de Control de calidad de pureza y viabilidad de las cepas:

Fecha del control.
Identificacin de la cepa. Gnero y especie del microorganismo. TIPO y N
de coleccin.
Tipo de cepa (Cepa de referencia, reserva o trabajo).
Pruebas a realizar (depende del microorganismo): Coloracin de Gram,
Caractersticas de las colonias en medios selectivos, Pruebas bioqumicas y
serolgicas, etc.
En caso de no presentar las caractersticas establecidas se ejecuta la

Acciones correctivas establecida en el procedimiento.
Cepas de reserva:
Definicin: Cepas idnticas obtenidas mediante
un nico subcultivo de una cepa de referencia.
[ISO 11133-1:2000].
Las cepas de reserva son una serie de alcuotas de
cultivos idnticos obtenidas en el laboratorio por
subcultivo de la cepa de referencia.
CREF
REPIQUE UNICO
Cres Cres Cres Cres Cres Cres
Las cepas de reserva las prepara y conserva el laboratorio.

MTODOS
PARA A)LIOFILIZACIN.
LA PRESERVACIN B) CONGELACIN Uso
Y MANTENIMIENTO A BAJAS de agentes
DE TEMPERATURAS.
Crioprotectores
CEPAS DE RESERVA
obtenidas a partir
de cepas de referencia :
Cepas de reserva: Dentro del laboratorio (ver plano del laboratorio)

Debe haber un lugar destinado a almacenar las cepas de reserva.
Debe estar claramente sealado que se trata de cepas potencialmente
peligrosas y su manipulacin restringida a personal autorizado.

MTODOS PARA LA PRESERVACIN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA
A) LIOFILIZACIN. Definicin: es un proceso de

desecacin desde el estado congelado.
Agentes Crioprotectores:
Leche descremada de calidad microbiolgica
( esterilizacin por vapor fluente) al 10% o 20% P/V.
Pueden adicionarse Aditivos como por ejemplo inositol.
PRODUCTO: se puede conservar en refrigeracin o a
temperatura ambiente por aos.
B) CONGELACIN A BAJAS TEMPERATURAS:

Agentes Crioprotectores:
Leche descremada de calidad microbiolgica
( esterilizacin por vapor fluente) al 10% o 20% P/V.
Pueden adicionarse Aditivos como por ejemplo inositol.
Glicerol al 10%
Caldo BHI con glicerol 20%. Bqca. Alicia Irene Cuesta 76
MTODOS PARA LA PRESERVACIN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA
B) CONGELACIN A BAJAS TEMPERATURAS:

Proceso de congelacin:
Equipamiento o insumos para lograr la congelacin
(Congelador o cmara o uso de Nitrgeno lquido).
Temperaturas de congelacin:
Deseable a -70 o -80 C o menores temperaturas.
A temperaturas ms altas como -20 C no es lo ideal pero
tal vez sea la nica forma posible. Es preferible a -40 C.
Envases: Uso criovial o tubo estril.
PRODUCTO: se puede conservar en a temperatura
congelacin por aos.
Inconveniente: problemas y prdida de las cepas la falta
de suministro de energa, falta de insumos o avera del
equipamiento.
LA PRESERVACIN Y MANTENIMIENTO
DE CEPAS DE RESERVA
MTODOS PARA LA PRESERVACIN Y MANTENIMIENTO DE

CEPAS DE RESERVA !! Es muy importante un buen mtodo de
conservacin de modo de mantener los microorganismos vivos, puros y
la cepa microbiana autntica!!
Para lo cual se debe tener en cuenta los conocimientos bsicos de
Microbiologa.
Proveer condiciones adecuadas para cada tipo de microorganismo.
Las instrucciones del fabricante de los sistemas de preservacin de
cepas disponibles comercialmente deben ser rigurosamente respetados
y observados.
En el caso de descongelamiento de las cepas de reserva no deben
volver a congelarse.
El criovial vencido se elimina del cepario y se registra.
Las cepas liofilizadas una vez reconstituidas no se pueden volver a
usar
FACTORES QUE AFECTAN
LA VIABILIDAD DE LA CEPA
La viabilidad de las cepas, sometidas a un proceso de congelacin
(para su almacenamiento), est determinada por los siguientes factores:
a)Tipo de cepa. Ejemplo las bacterias Gram positivas resisten mejor que las
Gram negativas.
b) El cultivo debe estar en las mejores condiciones posibles antes de ser

expuesto a bajas temperaturas.
Condiciones necesarias antes de ser expuesto a bajas temperaturas:
1. La EDAD DEL CULTIVO puede afectar la capacidad del microorganismo de
sobrevivir.
Cultivos demasiados jvenes o demasiado viejos son menos resistentes al
shock trmico.
Ideal es fin etapa logartmica principio fase estacionaria tiene mayor
probabilidad de recuperacin.
( en bacterias en general es 24 horas de incubacin a 37 C)
2. Las CONDICIONES DE DESARROLLO tambin juegan un papel importante
Ejemplo; Las levaduras que crecen aireadas y agitadas tienen mayor resistencia
a la temperatura que aquellas que desarrollan en un medio slido

Ejemplo: Supervivencia de los microorganismos
almacenados a 20 C en Mast Cryobank
Referencia: Mast Cryobank TM, ETICOR
Microorganismo Supervivencia en
meses
Enterobacter aerogenes 48
Pseudomona aeruginosa 18
Salmonella typhimurium 48
Staphylococcus aureus 48
Listeria monocytogenes 48
Listeria ivanovii 48
Rhodococcus equi 48
Bacillus cereus 24
Clostridium perfringes 48

Cepas de trabajo:
Subcultivos de microorganismos obtenidos a partir de las

cepas de reserva para ser utilizados en los ensayos que lo
precisen.
Obtencin de cepas de trabajo:
Los cultivos de trabajo se obtienen a partir de la Cepas de

reserva sobre un medio slido o lquido no selectivo adecuado
utilizando un ansa estril e incubando en condiciones adecuadas.
Las cepas de trabajo no deben ser subcultivadas.

CEPA DE REFERENCIA
Reconstitucin
Esquema de
Cultivada una sola vez cultivos de
referencia:
*
Obtencin de CEPAS DE RESERVA *Controles de
pureza y pruebas
bioqumicas de la
Conservacin por distintos mtodos cepa.
( liofilizacin y congelacin)
(especificar tiempo y condiciones de almacenamiento) Referencia:
* Gua ENAC-04
Descongelacin/reconstitucin
*
CEPAS DE TRABAJO
(especificar tiempo y condiciones de almacenamiento)
Utilizacin en el control de calidad, validacin, etc de los ensayos

PASOS a seguir para el
manejo de los cultivos de referencia:
PROVEEDOR DE CEPA
Adquisicin de cepa de referencia (C Ref):

LABORATORIO -Requisitos de compra y Registro de la cepa adquirida.
Subcultivo de C Ref:
-Control de pureza y viabilidad (REGISTRO).
Preparacin de la cepa de reserva (Cres)
-Control de pureza y viabilidad peridicos (REGISTRO).
LABORATORIO -Registro de cada frasco de la nueva cepa de reserva
Incorporada al cepario.
CONDICIONES CONTROLADAS DE
ALMACENAMIENTO DE LA CEPA DE RESERVA
Subcultivo la cepa de reserva (C t):
LABORATORIO -Control de pureza y viabilidad (REGISTRO).
USO PARA CONTROLES DE CALIDAD

Norma ISO 17025
EQUIPOS
REQUISITOS: EQUIPOS
El laboratorio debe estar provisto de todos los equipos
necesarios para la correcta ejecucin del ensayo.
Los equipos y su soporte lgico usados en la realizacin del

ensayo y muestreo deben permitir lograr la EXACTITUD
REQUERIDA y cumplir con las especificaciones establecidas
para los ensayos.
Hay equipos cuya exactitud es clave en el impacto sobre la
incertidumbre de los resultados, por lo que es imprescindible que
cumplan siempre con las especificaciones ms relevantes del
mtodo.

Equipos habituales
de un laboratorio microbiolgico :
Material de uso general: Material de vidrio o plstico

(Ejemplo: tubos de ensayo, placas de Petri, etc.),
instrumentos de muestreo, ansas de siembra, etc.
Equipos volumtricos como pipetas, distribuidores

automticos, sembradores en espiral, etc.
Instrumentos de medida: termmetros, cronmetros,

balanzas, medidor de pH, contadores de colonias, etc.
Estufas, autoclaves, baos termostticos, heladeras,

congeladores, campanas de flujo laminar, equipos de
filtracin, etc.

Calibracin.
Definicin: Conjunto
de operaciones que
PERMITEN ESTABLECER,
en condiciones especificadas,
LA RELACIN EXISTENTE ENTRE :
los valores indicados por

el instrumento de medida o
un sistema de medida
o un material de referencia
y
los correspondientes valores conocidos del
mensurando.(valores de una magnitud obtenidos
mediante un patrn de referencia)
Calibracin:
Formas de establecer esta relacin es mediante:

Tablas de correccin
Rectas o curvas de calibracin
otras
CALIBRACION
Elimina el error
CORRECCION Incertidumbre

Ejemplo:
Calibracin de un termmetro
TABLA 1
Qu hago?
Termmetro a calibrar (Tx)
1.Mido n veces a una
Temperatura y completo la Termmetro patrn (Tp)
TABLA 1.
2.Esto lo realizo para Termmetro Termmetro
diferentes temperaturas (Ti) a calibrar patrn
segn los requerimientos. (C) (C)
3. Calculo la correccin e
incertidumbre para cada
punto.
Tx Tp
Bao de agua
El bao se pone a Ti
Certificado de calibracin
de un termmetro
Ejemplo de resultados
Indicacin del Correccin Incertidumbre

termmetro ( C) ( C)
( C)
5.5 -0.4 +0.1
30.0 0.2 +0.2
36.8 0.2 +0.2
42.1 0.0 +0.3

Certificado de calibracin
de un termmetro
Debe figurar:
Descripcin e identificacin del
instrumento que se calibr.
Fecha de calibracin.
Fecha de emisin del certificado de
calibracin nombre del cliente
Metodologa empleada para calibrar.
Rango de calibracin.
Resultados: correccin e incertidumbre
para cada temperatura.

Incertidumbre de la medicin. Definicin: Parmetro
asociado al resultado de la medicin, que caracteriza la
dispersin de los valores que podran ser razonablemente
asignados al mensurando. INDICA LA CALIDAD DE UNA
MEDICIN.
Tolerancia. Definicin: Indica el rango de variabilidad

aceptable para un dado valor. Es un concepto asociado con
la especificacin.
Relacin de exactitud (RE)

RE = Especificacin
Incertidumbre
ISO 100012 recomienda RE>3:1, preferiblemente hasta 10:1

VERIFICACIN.
Definicin: Confirmacin por examen y provisin de

evidencia de que los requerimientos especificados han
sido satisfechos.
Ejemplo: Verificar diariamente una balanza con una pesa calibrada.
Verificacin del instrumento de medicin
VERIFICACIN
Asignar a la
tarea de medicin
Reparar/ ajustar
TOMO
DECISION Usarlo para otro equipo
Declararlo fuera de uso
REQUISITOS: EQUIPOS (cont)
Antes de poner en servicio un equipo se lo debe calibrar o
verificar con el fin de asegurar que responde a las exigencias
especificadas del laboratorio y est conforme a las
especificaciones normalizadas pertinentes.
El equipo debe ser verificado o calibrado antes de su uso.
El laboratorio debe documentar e implementar Programas
para calibracin y/o verificacin limpieza, mantenimiento y
esterilidad de los equipos cuando sea necesario. (Los que
tengan una influencia directa en los resultados de los ensayos).
REQUISITOS PROVEEDORES DE CALIBRACION DE
EQUIPOS:
La calibracin de los equipos debe ser llevada a cabo por
laboratorios de calibracin que demuestren su competencia y
su capacidad de medicin y trazabilidad (Laboratorio acreditado o
aceptado por el organismo de acreditacin).

Tipo de Equipamiento Requisitos Frecuencia sugerida
Recalibrado y plenamente
Termmetro de referencia Cada 5 aos
trazable
Recalibrado y plenamente
Termocupla de referencia Anualmente.
trazable
Frente a un termmetro de
Directrices para calibracin
Termmetro de trabajo
referencia en punto de
congelacin y/o rangos de
Anualmente. de equipos en el laboratorio
temperatura de trabajo
Frente a un termmetro de
de microbiologa.
referencia en punto de
Termocupla de trabajo Anualmente.
congelacin y/o rangos de
temperatura de trabajo
Balanza
Calibracin plenamente
Anualmente.
G-ENAC-04. Gua para la
trazable
Calibracin plenamente Bianualmente/
acreditacin de laboratorios
Pesas de calibracin
trazable Anualmente. que realizan anlisis
Frente a pesa calibrada o
Pesas de control
verificar en la balanza
inmediatamente despus de
Anualmente. microbiolgicos
la calibracin trazable
Calibracin trazable al
Microscopios micrmetro (cuando sea Inicialmente
apropiado)
Calibracin trazable o
Centrifuga verificacin con un Anualmente.
tacmetro independiente
Cronmetro Frente a la hora oficial Anualmente.

REQUISITOS: EQUIPOS (cont)
Es de primordial importancia que el laboratorio cuente con un programa

formal, documentado e implementado de mantenimiento de equipos.
El mantenimiento de los equipos esenciales debe realizarse a intervalos
especificados.
(por el departamento de mantenimiento, por el proveedor, fabricante, etc).
En el documento ISO 7218: 1996 (E), se facilitan directrices sobre el
mantenimiento de los equipos.
PARA CADA EQUIPO UTILIZADO EN LOS ENSAYOS EL LABORATORIO

DEBE TENER:
Identificacin inequvoca y registro del equipo (con su soporte lgico o

software).
Los resultados de las calibraciones y verificaciones.
Las instrucciones actualizadas de uso y mantenimiento del equipo

disponibles (incluido el manual suministrado por el fabricante) para el uso del
personal del laboratorio.

Autoclave
Los controles biolgicos:
Evalan la efectividad de la totalidad del proceso de

esterilizacin.
Contienen esporas
de gnero Bacillus.
En todos los casos los resultados obtenidos de

controles qumicos y biolgicos se deben registrar.

Verificacin de la
temperatura de trabajo:
Registro de control de
Se realiza un monitoreo temperatura:
continuo de las
temperaturas de las estufas,
heladeras, congeladores -Equipo.
usados para la realizacin -N de inventario.
del ensayo. -Instrumento:
Correccin e
La temperatura del bao incertidumbre del
termosttico se registra termmetro.
antes de su uso. -Rango de aceptacin.
-Tolerancia.

Norma ISO 17025
MANIPULACIN DE LAS MUESTRAS
El laboratorio debe tener procedimientos para :

El transporte
La recepcin
La proteccin, el almacenamiento.
La manipulacin
La conservacin o la disposicin final de las

muestras a ensayar.

Requisitos:
MUY IMPORTANTE: El laboratorio debe tener un sistema
para la identificacin unvoca de las muestras a ensayar.
La identificacin debe ser conservada a lo largo de la vida

de la muestra en el laboratorio.
El sistema debe ser diseado y operado de modo tal que

asegure que las muestras no puedan ser confundidas
fsicamente o cuando se haga referencia a ellas en registros u
otros documentos.
El laboratorio debe tener procedimientos e instalaciones

apropiadas para evitar el deterioro, la prdida o dao de
las muestras durante su manipulacin, preparacin y
almacenamiento.

REQUISITOS:
RECEPCIN DE LAS MUESTRAS: Las condiciones de llegada al
laboratorio de las muestras deben ser verificadas por el personal
perteneciente al mismo.
Si la muestra es:
Insuficiente o
se encuentra en mal estado por deterioro fsico, temperatura
inapropiada, envase roto o etiquetado defectuoso.
El laboratorio debe consultar con el cliente antes de decidir si analiza o
rechaza la muestra.
Debe indicar su estado en el informe del ensayo.
Una vez recibidas las muestras se analizarn lo antes posible.
La preparacin de las muestras y porciones de ensayo realizado por el
laboratorio inmediatamente antes del ensayo debe efectuarse conforme a
procedimientos documentados basados en normas nacionales o
internacionales, si es que existen, o a mtodos internos validados.
Los procedimientos de preparacin de las muestras y porciones de
ensayo deben disearse teniendo en cuenta las directrices generales
contenidas en los documentos en ISO 6887 e ISO 7218.

REQUISITOS:
Se debe llevar los registros del desarrollo del trabajo.
Las muestras que se encuentren a la espera de ser analizadas
deben almacenarse en condiciones adecuadas para reducir al
mnimo cualquier modificacin en la poblacin microbiana presente.
Debe existir un procedimiento documentado para la conservacin

y eliminacin de muestras.
Las muestras deben conservarse hasta que se hayan obtenido

los resultados del ensayo, o ms tiempo segn sea necesario.
Cuando se sepa que algunas porciones de muestras de ensayo

del laboratorio estn altamente contaminadas, deben
descontaminarse antes de su eliminacin.

Los tiempos lmites de almacenamiento
dependern del tipo de producto
Referencia: Norma ISO 7218:1996 (E)
Tiempos lmites de
(1) Si no se puede procesar Tipos de Productos
almacenamiento (horas)
en ese tiempo, las muestras Tan rpido como sea
se pueden congelar por posible y
Estables
debajo -18 C. antes de su fecha de
Esto debe ser mencionado en vencimiento
el informe de ensayo. dentro de 24 horas de la
Fresco o refrigerados
recepcin la muestra (1)
Precaucin: En algunos Tan rpido como sea
productos el congelamiento Pasteurizados y posible y
produce un cambio de la productos similares antes de su fecha de
composicin de la flora. vencimiento
Tan rpido como sea
Unidades estables
posible y dentro de 48
daadas
horas

Norma ISO 17025
ENSAYOS INTRALABORATORIOS
ENSAYOS INTERLABORATORIOS
CONTROL DE CALIDAD: Es la combinacin de sistemas, procedimientos,

actividades, instrucciones y estudios que realiza la organizacin para
controlar y mejorar las operaciones llevadas a cabo. Ejemplo: monitoreo
del ambiente, capacitacin del personal, evaluacin de la calidad y esterilidad de los medios
de cultivo, calibracin, verificacin y mantenimiento de equipos
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD: Es un sistema de actividades que

dan confianza que los sistemas de control de calidad funcionan y
permiten con eficacia obtener resultados analticos de alta calidad.
Es un programa de actividades llevadas a cabo por el laboratorio con la
finalidad de verificar que los resultados obtenidos tienen una precisin y
exactitud aceptable
y mejorar en conjunto el funcionamiento del mismo.
Estos programas son planificados y revisados peridicamente
Ejemplo es participacin en ensayos intralaboratorios e interlaboratorios

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD
DE LOS RESULTADOS
Dicho programa debe abarcar todos los ensayos incluidos en el
alcance de acreditacin del laboratorio.
La frecuencia de realizacin de cada uno de estos Programas queda
establecida por el laboratorio.
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS DE
ENSAYO: El laboratorio debe tener procedimientos de control de
calidad para monitorear la validez de los ensayos llevados a cabo.
Son las actividades que se deben realizar para todos los ensayos
acreditados.
Comprenden:
1. Control interno: Un programa de controles peridicos es necesario
para demostrar que se controla la variabilidad (por ejemplo, entre
analistas y entre equipos o materiales, etc.). Permite la evaluacin
continua del trabajo el laboratorio.
2. Control externo (intercomparaciones):
La participacin en Ensayos de Aptitud Interlaboratorio (Proficiency
Testing) permite la evaluacin del sesgo de forma que el laboratorio
pueda demostrar que se mantiene dentro de los criterios de
aceptacin definidos por normas, reglamentos, por el cliente o por el
laboratorio. Bqca. Alicia Irene Cuesta 104
Control interno:
El principal objetivo es asegurar la coherencia de los resultados
obtenidos diariamente y el cumplimiento de los criterios establecidos.
Control de las condiciones de trabajo: proporciona informacin
sobre la buena prctica en la realizacin de los ensayos y sobre la
esterilidad de los medios y materiales auxiliares utilizado. Evala la
posible contaminacin cruzada. Ejemplo: muestras estriles o control de
esterilidad.
ENSAYOS CUANTITATIVOS
Control de la precisin: muestras naturales sin inocular y/o
muestras naturales inoculadas con materiales de referencia.
Control de recuperacin: muestras inoculadas con materiales de
referencia.
ENSAYOS CUALITATIVOS
El Control de la calidad interno debe incluir actividades que
garanticen un adecuado control del lmite de deteccin.

Control interno:
Uso de cepas de referencia: Empleo de cepas de referencia
durante la realizacin del ensayo como control positivo, negativo,
muestras inoculadas para control.
ENSAYOS INTRALABORATORIO: Son las verificaciones de calidad

para evaluar el desempeo de los analistas del laboratorio en un
ensayo.
Mtodos cuantitativos: Se comparan los resultados obtenidos :
Por cada analista perteneciente al laboratorio que realiza por
duplicado el anlisis de la muestra (repetibilidad de cada analista).
Entre analistas del mismo laboratorio para un ensayo
(reproducibilidad entre analistas).
Mtodos cualitativos: verifico que los resultados entre analistas sean
concordantes y conformes.
Se comparan los resultados obtenidos entre analistas del mismo
laboratorio para un ensayo.

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD
DE LOS RESULTADOS
LOS CONTROLES DE CALIDAD INTERNOS NO SON

SUFICIENTES.
No puedo determinar mediante ellos el Valor verdadero!!
Realizo un Control de calidad externo.
Definiciones:
Valor verdadero : valor en consistencia con la definicin de una
magnitud (concepto abstracto, no realizable).
Valor asignado o valor de referencia: es el valor
convencionalmente verdadero.
Exactitud de una medicin: Proximidad entre el resultado de una
medicin y el valor verdadero del mensurando.

Ejemplo:
Precisin. Justeza y Exactitud
Resultados precisos y No justos: Resultados imprecisos y justos:

No exactos No exactos
Resultados imprecisos y No justos: Resultados precisos y justos:

No exactos exactos
Clculo del valor de referencia o valor asignado:
Uso un material de referencia certificado.
Casi nunca son estos los casos en ensayos microbiolgicos.
Se considera que el valor medio obtenido por el conjunto de
laboratorios luego de eliminar los outliers en el propio ejercicio puede
utilizarse como valor de referencia o valor verdadero.
Ensayos de Aptitud Interlaboratorio (Proficiency Testing) :
Los programas de ensayos de aptitud organizados externamente por

un proveedor de ensayos interlaboratorio
CONSTITUYEN UN MEDIO INDEPENDIENTE por el cual un
laboratorio se puede EVALUAR OBJETIVAMENTE
y demostrar la veracidad y precisin de los resultados obtenidos por
sus mtodos analticos.

Ensayos de Aptitud Interlaboratorio (Proficiency Testing) :
Constituye una herramienta para la evaluacin externa de la calidad

de los resultados de ensayo o desempeo del laboratorio.
La participacin en estos ensayos PERMITE AL LABORATORIO
COMPARAR SUS RESULTADOS FRENTE A LOS DE OTROS
LABORATORIOS.
Los laboratorios deben participar regularmente en ensayos de
aptitud relacionados con el alcance de su acreditacin, dando
preferencia a los programas de ensayos de aptitud que utilicen
matrices apropiadas.
Cuando los resultados de los ensayos NO resultan dentro del
intervalo de conformidad o se visualice una tendencia determinada
tomar respectivamente acciones correctivas o preventivas, siguiendo
los lineamientos establecidos en el Procedimiento Reclamos,
sugerencias, no conformidades, acciones correctivas y acciones
preventivas.

STAPHYLOCOCCUS aureus - cereal
Z-score-2=5257ufc/g valor asignado=21000ufc/g Z-
score+2=83891ufc/g
80
Ensayos de Aptitud
70
Interlaboratorio
Mtodos cuantitativos 60
(Proficiency Testing) : 50
40
Valor de Z-score: Clasificacin 30
lzl<2 Satisfactorio
2 < lzl < 3 Cuestionable 20
lzl >3 Insatisfactorio 10
0
rio
io
io
io
io
e
e
bl
bl
or
or
or
or
o
na
na
ct
ct
ct
ct
ct
tio
tio
fa
fa
fa
fa
fa
tis
tis
tis
tis
tis
es
es
sa
sa
sa
sa
sa
cu
cu
in
in
Registro Ensayos de Aptitud Interlaboratorio
Ensayo: Ensayos cualitativos (Proficiency Testing) :
Matriz:
Fecha de Clasificacin
Proveedor del Identificacin Metodologa Resultado
anlisis obtenida
Ensayo de las usada por el obtenido Valor Firma del
de las Analista Satisfactorio
Interlaboratorio Muestras laboratorio por el asignado responsable
muestras /Insatisfactorio
laboratorio

IMPORTANTE!!!
Los datos obtenidos a
travs
del programa el
aseguramiento de la calidad
deben ser registrados en
forma tal
que se puedan detectar las
tendencias
y aplicar tcnicas
estadsticas
para la revisin de los
resultados.

Periodicidad de las actividades
de control de calidad
Se deben establecer considerando diversos factores:

La robustez del mtodo utilizado ( en funcin de los
controles especficos incluidos en el mismo, empleo de
placas duplicadas, mtodo de referencia o de rutina,
datos de validacin, etc)
La frecuencia con la que el laboratorio ejecuta dichos
ensayos.
Los resultados histricos de control de calidad y
aseguramiento de calidad.

Validacin de los mtodos
microbiolgicos
Norma ISO 17025
Objetivos Generales a desarrollar:
Intentaremos contestar las siguientes preguntas:
Qu es validar un mtodo?
Por qu y para qu valido un mtodo?
Cmo valido un mtodo?
Cundo valido un mtodo?

Ejemplo: Un laboratorio dise una nueva metodologa
para la deteccin de E coli O157:H7 basada en el uso de
anticuerpos monoclonales para evaluar la inocuidad y
calidad de alimentos crnicos.
Qu caractersticas tendrn que tener los resultados
que arroja dicho mtodo?
Puedo emplearlo inmediatamente para emitir
resultados que impliquen una decisin de conformidad o
no con las especificaciones alimentarias vigentes?

La respuesta es:
Antes de usar un mtodo debo asegurarme que haya sido validado
Necesito que el mtodo sea:

Adecuado para el propsito.
Los datos que arroja un ensayo le permiten al usuario

tomar decisiones tcnica y administrativamente correctas
para un propsito preestablecido.
La Norma ISO 17025 en el punto 5.4.2 establece que El laboratorio debe

utilizar mtodos de ensayo que satisfagan las necesidades del cliente y sean
apropiadas para el uso previsto
Definiciones:
Validacin: Confirmacin, mediante el aporte de pruebas objetivas, de que
se han cumplidos los requisitos para el uso pretendido o una aplicacin
especfica.[ISO 9000: 2000]
Verificacin: Confirmacin, mediante el aporte de pruebas objetivas, de que

se han cumplido los requisitos establecidos. [ISO 9000:2000]
Demostracin por experimento que un mtodo establecido funciona de
acuerdo con las especificaciones en las manos del usuario.
Por qu y para qu
es necesario
validar un mtodo?
Respuesta:
El laboratorio microbiolgico tiene la responsabilidad de garantizar
que los resultados que l produce son exactos, validos y confiables
de modo de proporcionar informacin til acerca de la inocuidad y
calidad sanitaria de los alimentos.
Si el resultado de un ensayo no es confiable, el ensayo no

presenta ninguna utilidad y sera mejor no realizarlo.
Cuando un cliente recurre a un laboratorio microbiolgico a solicitar

un anlisis, lo hace porque necesita resolver un problema
y no puede hacerlo por s mismo y espera poder confiar en los
resultados.
PARA SABER SI ESE ENSAYO SIRVE PARA LO QUE LO

QUIERO USAR.
PARA CONOCER EL COMPORTAMIENTO DEL MTODO.

Evidencias objetivas: Cmo puedo aportarlas?
En el marco de un adecuado criterio microbiolgico, tengo
dos herramientas fundamentales que permiten sacar
conclusiones:
Diseo de experimentos estadsticamente vlidos.
Anlisis de los resultados usando mtodos estadsticos.
Antes de realizar la validacin se deben especificar:

ALCANCE:
Matriz
Concentracin en la que se aplica.
Se deben declarar los CRITERIOS DE APTITUD PARA
LOS FINES (teniendo en cuenta los requisitos particulares
para un uso especfico previsto).

Buenos resultados del ensayo
Se identifican 6 principios de la prctica analtica, los cuales cuando se

implementan simultneamente conducen a una buena prctica:
1.Las mediciones analticas deben hacerse de forma tal que satisfagan
un requerimiento acordado (un objetivo definido)
2.Deben realizarse utilizando mtodos y equipos que hayan sido
probados para asegurar que son aptos para un determinado
propsito.
3.El personal que realiza las mediciones debe ser competente y
estar calificado.
Debe haber una verificacin independiente (externa) y peridica de
la competencia tcnica del laboratorio.
5. Las mediciones analticas realizadas en un laboratorio deben ser
consistentes con las que se realizan en cualquier otro lugar.
6. Los laboratorios que realicen ensayos deben tener procedimientos
bien definidos de control de calidad y de aseguramiento de la
calidad.

MTODO DE REFERENCIA. Definicin:
Mtodo investigado a fondo, que describe con claridad y

exactitud las condiciones y los procedimientos
necesarios para medir los valores de una o ms
propiedades.
Que ha demostrado tener una exactitud y una precisin
apropiadas para el uso que pretende hacerse del
mismo, de manera que puede utilizarse para evaluar la
exactitud de otros mtodos empleados para realizar la
misma medicin y, en particular, para caracterizar un
material de referencia.
En general se trata de un mtodo normalizado nacional
o internacional.

En nuestro caso ejemplo:
La presencia de E.coli O157:H7 en un alimento puede ocasionar, para

un determinado grupo poblacional, enfermedad y muerte.
Tambin, cuando se desee comercializar, la partida de alimento ser

rechazada en los sitios de control provocando un dao econmico y de
prdida de imagen. PROBLEMAS DE INOCUIDAD Y CALIDAD.
Por lo tanto, este mtodo propio desarrollado por el laboratorio debe

ser capaz de:
Detectar ese microorganismo.

Detectar la presencia del microorganismo en muy pequeas
cantidades.
Dar los mismos resultados cuando lo repito.
Detectar la presencia de ese microorganismo y no de otro.

Validacin Mtodos de
ensayo microbiolgicos
CUALITATIVOS
1 Descripcin detallada del mtodo de ensayo.
Deben ser validados estimando, cuando sea apropiado:
LMITE DE DETECCIN
SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD
DESVIACIN POSITIVA Y DESVIACIN NEGATIVA
EFECTO MATRICIAL EXACTITUD RELATIVA
REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD
Validacin
Mtodos de ensayo microbiolgicos
CUANTITATIVOS
1 Descripcin detallada del mtodo de ensayo.
Deben ser validados estimando, cuando sea apropiado:

LMITE DE CUANTIFICACIN.
EXACTITUD
DESVIACIN POSITIVA Y DESVIACIN NEGATIVA
SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD
LMITE DE DETECCIN
Definicin: Es el nmero mnimo de microorganismos

que pueden ser detectado por el mtodo, pero en
cantidades que no pueden estimarse con precisin.
(Aplicado a anlisis microbiolgicos cualitativos)
Los resultados de los anlisis cualitativos deben
expresarse como : detectado/no detectado en una
cantidad o volumen definidos.
Determino el lmite de deteccin antes de evaluar la
sensibilidad.

Ejemplo: DISEO DE EXPERIMENTO
MTODO MICROBIOLGICO
Matriz naturalmente o artificialmente Mtodo a Mtodo de
contaminada validar referencia
Target 1 - +
Target 2 + +
Target 3 + +
Target 4 + +
Target 5 - +
NO Target 1 + -
NO Target 2 - -
NO Target 3 - -
NO Target 4 - -
NO Target 5 - -

Ejemplo: DISEO DE EXPERIMENTO
MTODO MICROBIOLGICO
Resultado del Resultado Resultado Total

mtodo asignado asignado
a validar POSITIVO* NEGATIVO *
Positivo +/+ (PV) +/- (DP) PV + DP
Negativo -/+ (DN) -/- (NV) DN + NV

Total PV + DN DP + NV N
*por mtodo de referencia o

por inoculacin de cepa de referencia.

Desviacin negativa (DN). Definicin: Ocurre cuando
el mtodo a validar da un resultado negativo sin confirmacin y
el mtodo de referencia da un resultado positivo.
Esta desviacin se convierte en un resultado negativo falso cuando
puede demostrarse que el resultado verdadero es positivo.
DESVIACIN POSITIVA (DP). Definicin: Ocurre cuando:

el mtodo a validar da un resultado positivo sin confirmacin y
el mtodo de referencia da un resultado negativo.
Esta desviacin se convierte en un resultado positivo falso cuando
puede demostrarse que el resultado verdadero es negativo.
FALSOS POSITIVOS: es la probabilidad que el ensayo arroje un

resultado positivo cuando la muestra no contiene el analito.
F + = DPc/ DP + NV = 1- ESPECIFICIDAD
FALSOS NEGATIVOS: es la probabilidad que el ensayo arroje un
resultado negativo cuando la muestra contiene el analito.
F - = DNc/ DN + PV = 1- SENSIBILIDAD

SENSIBILIDAD:
Definicin: Fraccin del nmero total de cultivos o colonias POSITIVOS
que son correctamente asignados con el mtodo
utilizado. [ISO 13843:2000]
Sensibilidad %= PV/(DN c + PV) x100
Capacidad del mtodo de dar positivo cuando las muestras tienen el
analito
Resultado del caso ejemplo: Sensibilidad %= 3/5x100= 60%
ESPECIFICIDAD:
Definicin: Fraccin del nmero total de cultivos o colonias
NEGATIVOS que son correctamente asignados con el mtodo
utilizado. [ISO 13843:2000]
Especificidad %= NV/(DPc + NV) x100
Capacidad del mtodo de dar negativo cuando las muestras no tienen el
analito
Resultado del caso ejemplo: Especificidad %= 4/5x100= 80%

EXACTITUD RELATIVA.
Definicin: Grado de concordancia entre los resultados
del mtodo evaluado y los obtenidos utilizando un mtodo
de referencia reconocido
EXACTITUD RELATIVA %= PV + NV/(PV + NV + DN + DP) x100
Definicin: Nmero mnimo de microorganismos dentro
de una variabilidad definida que puede determinarse en
las condiciones experimentales del mtodo evaluado.
Tengo en cuenta la incertidumbre del mtodo para valores
bajos.
(Aplicado a anlisis microbiolgicos cuantitativos)

Repetibilidad (r). Definicin: Grado de
concordancia entre los resultados de sucesivas
mediciones del mismo mesurando realizadas en las
mismas condiciones de medicin.
Reproducibilidad (R). Definicin: Grado de

concordancia entre los resultados de sucesivas
mediciones del mismo mesurando realizadas en
diferentes condiciones de medicin.
El ensayo se realiza sobre el mismo material de ensayo
pero en diferentes condiciones.

ROBUSTEZ definicin: insensibilidad de un mtodo
analtico a pequeos cambios en el procedimiento. Para
examinar la robustez es aconsejable abusar del mtodo en
un camino controlado.
ESTIMACIN DE LA INCERTIDUMBRE DE MEDICIN

EN MICROBIOLOGA: la incertidumbre de medicin es un
parmetro asociado al resultado de la medicin,
que caracteriza la dispersin de los valores que
podran ser razonablemente asignados al
mesurando.(mtodo cuantitativo)

INCERTIDUMBRE DE MEDICIN Y
CUMPLIMIENTO DE ESPECIFICACIONES
A B C D
A Declaracin de no cumplimiento con la especificacin.

B y C Limitarse a informar los resultados y su incertidumbre
(INDETERMINADO)
D Declaracin de cumplimiento con la especificacin.

Rango de especificacin
En nuestro caso ejemplo:
Ensayo de Deteccin de E.coli O157:H7 en un alimento
Dijimos que:
Necesito un mtodo capaz de detectar ese
microorganismo=Sensibilidad
Necesito un mtodo capaz de detectar la presencia del
microorganismo en muy pequeas cantidades.= Lmite
de deteccin
Realizo muchas veces el mtodo y los resultados del
ensayo se repitan = repetibilidad y reproducibilidad
Necesito un mtodo capaz de detectar la presencia de
ese microorganismo y no de otro = Especificidad

PROTOCOLO DE VALIDACIN
El laboratorio acuerda con el cliente el mtodo a usar
para realizar un ensayo.
El laboratorio debe usar los mtodos y procedimientos
ms apropiados dentro de su alcance para todos los
ensayos.
Caractersticas que se tienen en cuenta para

seleccionar el mtodo de ensayo:
Propiedades analticas: precisin, exactitud,
especificidad, sensibilidad, el lmite de cuantificacin y/o
de deteccin, los efectos matriciales
Facilidad de uso o automatizacin.
Rapidez de anlisis o respuesta.
Costo.
Mtodo normalizado
PROCESO DE VALIDACION
DISEO Y
METODO A VALIDAR EJECUCION DATOS
DE ENSAYOS
METODO VALIDADO
ANALISIS
COMPARACION ESTADISTICO
CON
REQUISITOS
DE USO Bqca. Alicia Irene Cuesta 136
PREVISTO
Definicin de mtodo alternativo:
Es un mtodo de anlisis que demuestra o estima un

analito (un microorganismo, sus componentes o su
producto), para una categora dada de productos, como lo
hace su correspondiente mtodo de referencia.
El mtodo alternativo exhibe atributos apropiados a las

necesidades de los usuarios, por ejemplo:
- la velocidad de anlisis y/o respuesta;
- la facilidad de ejecucin y/o automatizacin;
- las propiedades analticas (la precisin, exactitud, el
lmite de deteccin, etc.);
- la miniaturizacin;
- el reduccin de costo.

Qu mtodos se validan?
LOS MTODOS basados en normas.
LOS MTODOS QUE DISEA O DESARROLLA EL LABORATORIO.
LOS MTODOS NORMALIZADOS EMPLEADOS FUERA DEL

ALCANCE PREVISTO.
Verifico USO MTODOS OFICIALES, MTODOS NORMALIZADOS O

MTODOS DE ORGANISMOS NACIONALES O INTERNACIONALES
RECONOCIDOS.
es recomendable la utilizacin de mtodos normalizados o de

referencia,
siempre y cuando stos estn disponibles
y sean apropiados

Bsqueda de informacin sobre datos de validacin
previa.
CUANDO HAY GRAN INFORMACIN SOBRE UNA

METODOLOGA LOS ENSAYOS PARA VALIDAR
SON RELATIVAMENTE SENCILLOS,
SI LA EXPERIENCIA ES ESCASA LA VALIDACIN

SER EXTENSA.

MTODOS DESARROLLADOS
POR EL LABORATORIO:
Debe ser :
Una actividad planificada (PROCEDIMIENTO)
Ser asignada a personal calificado
Proveer los recursos necesarios.
Los planes deben ser actualizados a medida que avanza

el desarrollo y deben asegurar que la comunicacin sea
eficaz entre todo el personal involucrado.
En este caso, el proceso de validacin es mucho ms

arduo, ya que se debe demostrar que cada paso elegido
responde a lo esperado.
LOS MTODOS NORMALIZADOS
EMPLEADOS FUERA DEL ALCANCE PREVISTO
Mtodos normalizados aplicados a matrices que no se

especifiquen en el procedimiento normalizado.
Ampliaciones y modificaciones de los mtodos

normalizados.
Para demostrar que una versin modificada de un mtodo

cumple las mismas especificaciones que el mtodo
original, deben realizarse comparaciones utilizando
replicados.

Sistemas de ensayo comerciales (kits)
Los laboratorios deben conservar los datos sobre la
validacin de los sistemas de ensayo comerciales (kits)
que utilicen.
Estos datos pueden obtenerse de ejercicios de

intercomparacin o de datos sobre validacin remitidos
por los fabricantes y sujetos a la evaluacin de una
tercera parte (p. ej., AOAC). www.aoac.org
Si no se dispone de datos sobre validacin o si stos no

son plenamente aplicables, el laboratorio ser
responsable de completar la validacin del mtodo.

MTODOS NORMALIZADOS:
Antes de analizar cualquier muestra, los laboratorios

debern verificar su capacidad para cumplir de forma
satisfactoria todos los requisitos establecidos en
dichos mtodos.
El laboratorio debe confirmar que puede operar

correctamente los mtodos normalizados antes de
introducir los ensayos.
Se debe mantener actualizadas las normas.
Si el mtodo normalizado cambia, se debe repetir la

confirmacin.

LA VALIDACIN DE LOS MTODOS DE ENSAYO DEBE:
REFLEJAR LAS CONDICIONES REALES DE ENSAYO.

(USANDO PREFERENTEMENTE MATRICES NATURALMENTE
CONTAMINADAS).
LA EXTENSIN DE LA VALIDACIN NECESARIA DEPENDER

DEL MTODO Y SU APLICACIN.
LA DEBE REALIZAR PERSONAL CALIFICADO PARA ESA

ACTIVIDAD.
EN TODOS LOS CASOS UN PARMETRO PARA LA

VALIDACIN DE ENSAYOS MICROBIOLGICOS ES LA
DESCRIPCIN DEL MTODO DE ENSAYO.

Uso de muestras naturalmente contaminadas
y preparacin de muestras artificialmente
contaminadas en estudios de validacin
Anexo C ISO 16140:2003
1ra opcin: Muestras naturalmente

contaminadas
2da opcin: Contaminacin por mezcla.
3ra opcin: Muestras inoculadas (el nivel de
microflora debe representar la contaminacin de
las muestras naturalmente contaminadas).
4ta opcin: Materiales de referencia

Validar mtodos microbiolgicos requiere:
Comparar con un MTODO DE REFERENCIA.
REFERENCIA
Usar cepas de referencia y cepas de referencia

certificadas.(Material de referencia).
LA EVALUACIN SISTEMTICA DE FACTORES.
Ensayos Interlaboratorios.
Interlaboratorios
La estimacin de la incertidumbre.

El PROTOCOLO INCLUYE:
Primera FASE: Estudios precolaborativos o

validacin interna (estudios comparativos):
Defino la aplicabilidad (concierne al analito de inters y a las
categoras de alimentos a las que se aplica el mtodo).
(TABLA: Clasificacin de categoras de alimentos para
estudios de validacin Anexo A AOAC).
Segunda FASE: Estudios o ensayos colaborativos
Cuando la exigencia es de disponer de mtodos validados
plenamente, se considera habitualmente que la validacin
plena de un mtodo de anlisis comprende un examen de las
caractersticas del mtodo en un estudio del funcionamiento
del mtodo entre laboratorios .

Primera etapa de la validacin Ensayos selectivos
se usan cepas en estudios de( VALIDACION INTERNA):
INCLUSIVIDAD: diferentes microorganismos

pertenecientes al grupo deben ser detectados por
el mtodo.
SENSIBILIDAD
EXCLUSIVIDAD: diferentes microorganismos que

no pertenecen al grupo no deben ser detectados
por el mtodo.
ESPECIFIDAD

Cepas para ensayos de selectividad: ISO 16140:2003 ANEXO G
Categoras de Grupos Target: Eleccin de microorganismos qu
cepas uso?
a) Un grupo Ejemplo Coliformes, Aquellas que dan reaccin tpica en el
levaduras, bacterias acido-lcticas mtodo de referencia.
b) De la Familia Ejemplo Incluir miembros representativos de
Enterobacteriaceae todos los gnero pertenecientes a la
familia
c) Gnero Ejemplo Salmonella spp Incluir miembros representativos si es
posible de todas las especies
pertenecientes al gnero.
d) Especie Ejemplo Listeria Rango de cepas pertenecientes a la
monocytogenes especie
e) Cepa Ejemplo Listeria Rango de fuentes de esta cepa
monocytogenes 1a

Cepas para ensayos de selectividad: ISO 16140:2003 ANEXO G
Categoras de Gruposno Target : Eleccin de microorganismos

a) Un grupo no target Aquellas que dan reaccin negativa
(segn microorganismo target)
b) De la Familia Incluir cepas no pertenecientes a la

familia.
c) Gnero Incluir cepas no pertenecientes al

gnero similar a la cepa target
d) Especie Incluir cepas no pertenecientes a la

especie, incluidas en el gnero
e) Cepa Incluir cepas no target, incluidas en

la especie.

Validacin mtodo cualitativo
Descripcin detallada del mtodo de ensayo.

LMITE DE DETECCIN
SENSIBILIDAD
ESPECIFICIDAD
DESVIACIN POSITIVA Y DESVIACIN
NEGATIVA
EFECTO MATRICIAL
Exactitud relativa
repetibilidad y reproducibilidad

Diseo de un estudio de validacin
mtodo cualitativo :
AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative
and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)
Estudios precolaborativos o validacin interna (estudios

comparativos).
Compara el mtodo a validar con el mtodo de referencia.
Los realiza slo el laboratorio organizador.
1.AMPLITUD MATRICES:
Nmero de matrices a ensayar: teniendo en cuenta Categoras de
alimentos a validar, analizar 20 o ms alimentos de cada categora.
Obtencin de muestras artificialmente contaminadas:
Inoculo una sola cepa (de inters) por matriz.
Segn proceso al que se somete al alimento uso:
-microoganismo estressado Alimentos procesados-
-microoganismo sin estress Alimentos no procesados-
-microoganismo liofilizado-productos en polvo.

mtodo cualitativo :
Estudios precolaborativos o validacin interna

(estudio comparativos).
NIVEL DE INOCULO:
Nivel bajo (lmite de deteccin) 1-5ufc/25g de muestra
Nivel alto 10-50ufc/25g de muestra
CONTROL: Para muestras artificialmente contaminadas.
Cada tipo de alimento se divide en dos, uno para control negativo y otro para
obtener distintos niveles inculo.
CUANTIFICACIN DE LOS NIVELES DE CONTAMINACIN
POR NMP: el mismo da que se analizan las muestras.
Nmero de ensayos por nivel de analito: 20
2. ESTUDIOS DE INCLUSIVIDAD Y EXCLUSIVIDAD: pruebo slo la

cepa.(cultivo puro)
Pruebo 50 o ms cepa target y 30 no target (mtodo a validar y mtodo de
referencia).

mtodo cualitativo :
Estudios o ensayos colaborativos:

IMPORTANTE! Los laboratorios participantes acuerdan y estudian
minuciosamente el protocolo de ensayo.
Nmero de laboratorios:10 laboratorios (con datos vlidos) por tipo de
alimento.
Los laboratorios participantes no conocen los valores de las
muestras.(Muestras a ciegas)
Nmero de matrices a ensayar: teniendo en cuenta Categoras de
alimentos a validar.
Estudios o ensayos colaborativos:
PREPARACIN DE MUESTRAS:
a) Cepas inoculadas: Uso un cultivo puro cepa target.
b) Nivel bajo (lmite de deteccin) 1-5ufc/25g de muestra
Nivel alto 10-50ufc/25g de muestra
CONTROL. (Para muestras artificialmente contaminadas)
EL LABORATORIO QUE ORGANIZA DEBE ASEGURAR LA
HOMOGENEIDAD DE LAS MUESTRAS.
Validacin mtodo cuantitativo
Descripcin detallada del mtodo de ensayo.

EXACTITUD
Desviacin positiva y desviacin negativa
sensibilidad
especificidad

mtodo cuantitativo :
Estudios precolaborativos o validacin interna (estudios

comparativos).
Comparacin del mtodo a validar con el mtodo de referencia.
Aplica lo visto anteriormente para mtodos cualitativos.
(tener en cuenta los estudios de inclusividad y exclusividad slo para
ensayos selectivos)
NIVEL DE INOCULO de las matrices:
se evalan 3 niveles de concentracin de microorganismo (bajo, medio y
alto) que abarquen todo el intervalo a validar.
Y un control sin inocular.
Uso fundamentalmente muestras naturalmente contaminados para ensayos
no selectivo (no realizo el control)
ESTUDIOS DE INCLUSIVIDAD Y EXCLUSIVIDAD: pruebo slo la
cepa.(cultivo puro)
Pruebo 30 o ms cepa target y 20 no target.(mtodo a validar y mtodo de
referencia)
ESTUDIOS O ENSAYOS COLABORATIVOS
Estimacin de desviacin aleatorias y sistemticas del mtodo.
Nmero de laboratorios: 8 laboratorios (con datos vlidos) por tipo de
alimento.
mtodo cuantitativo :
ESTUDIOS O ENSAYOS COLABORATIVOS:

a)Recuento de microorganismos especficos: inoculacin del microorganismo
especfico. SOLO PARA ENSAYOS SELECTIVOS
b) NIVEL DE INOCULO de las matrices:
se evalan 3 niveles de concentracin de microorganismo (bajo, medio y alto)
alto
que abarquen todo el intervalo a validar.
Y un control sin inocular.
Uso fundamentalmente muestras naturalmente contaminados para ensayos no
selectivo (no realizo el control)
Para cada tipo de alimento se analizan por duplicado (dos porciones) el
mtodo a validar y el mtodo de referencia.
Se realizan test para eliminar los outliers.
INDICADORES DE APTITUD:
Anlisis de varianza y t por tipo de alimento y nivel de inculo.
Sr, r, SR, R, RSDr y RSDR por tipo de alimento y nivel de inculo.
RSD es la desviacin estndar relativa.
Es independiente del valor del analito

INFORME DE VALIDACION
El laboratorio debe registrar:
RESULTADOS OBTENIDOS.
Establecer el rango de validacin (es la parte del
intervalo de concentracin de un mtodo de anlisis
que ha sido validado). Todo esto debe ser
documentado y archivado.
PROCEDIMIENTOS USADOS.
Declaracin que el mtodo es apropiado para el

fin previsto.
Toda la informacin referida a la validacin debe

documentarse y archivarse.

Extensin de la validacin
La extensin de la validacin necesaria depender del

mtodo y su aplicacin.
La validacin es siempre un equilibrio entre costos,
riesgos y posibilidades tcnicas.
Cada laboratorio establecer los requisitos que debe
cumplir el mtodo, con objeto de demostrar que son
adecuados para la finalidad establecida.

Validacion Metodos Microbiologicos ISO 17025

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Aseguramiento de la calidad y validacin

de metodologas para el anlisis microbiolgico

Bqca. Alicia I. Cuesta

ETA Alimentos sanos Mtodos analticos

SEGURIDAD e INOCUIDAD ALIMENTARIA

Bqca. Alicia Irene Cuesta 2

CALIDAD HIGIENICA Sistema de calidad

Bqca. Alicia Irene Cuesta 3

Son internacionalmente reconocidos

Considerados de referencia para la evaluacin

Es la norma vigente para acreditar laboratorios.

Esta norma tiene todos los requisitos que deben cumplir

Hay un reconocimiento mutuo con otros

Bqca. Alicia Irene Cuesta 5

La Norma ISO 17025 no contempla el cumplimiento de :

Bqca. Alicia Irene Cuesta 6

Los resultados de ensayo de un laboratorio

Bqca. Alicia Irene Cuesta 7

Los ensayos microbiolgicos incluyen

Bqca. Alicia Irene Cuesta 9

capacitado, capacitado, Personal no est

Validacin de la no est validada Validada Validada

Bqca. Alicia Irene Cuesta 10

PREVENCIN: Evitar que se produzcan errores e

DETECCIN: Identificar los elementos causantes de los

CORRECCIN Y MEJORA: Eliminar las causas de los

DEMOSTRAR: Evidenciar objetivamente que se ha

Bqca. Alicia Irene Cuesta 11

Las operaciones que se realizan dentro del

Las operaciones crticas deben ser:

Las personas son el motor de los sistemas de calidad

Tiene que haber motivacin interna para planificar,

Bqca. Alicia Irene Cuesta 13

Bqca. Alicia Irene Cuesta 15

La direccin del laboratorio debe formular

Bqca. Alicia Irene Cuesta 16

Todo el personal tcnico debe recibir un adecuado

Bqca. Alicia Irene Cuesta 17

Bqca. Alicia Irene Cuesta 19

Debe haber una efectiva separacin entre reas

Se deben tomar medidas para prevenir la

Bqca. Alicia Irene Cuesta 20

En la prctica esto se puede lograr:

Separando las actividades en tiempo y espacio.

Mediante la construccin del laboratorio segn un

Llevando a cabo los procedimientos de una manera

Bqca. Alicia Irene Cuesta 21

Requisito: El rea analtica debe estar separada

Bqca. Alicia Irene Cuesta 22

zona de recepcin y almacenamiento de muestras.

Bqca. Alicia Irene Cuesta 23

Ejemplo si adems de realizar ensayos por mtodos

El laboratorio debe tomar las medidas necesarias para

Bqca. Alicia Irene Cuesta 24

Las superficies de madera de las instalaciones y

Bqca. Alicia Irene Cuesta 25

Ausencia de documentos obsoletos, objetos

Minimizar la apertura de puertas y ventanas durante la

Contar para el lavado de manos del personal con canillas

Los armario estanteras, equipos deben estar colocados

Bqca. Alicia Irene Cuesta 27

El acceso al laboratorio debe estar restringido slo al personal tcnico

Bqca. Alicia Irene Cuesta 28

Condiciones Efecto posible sobre el ensayo Lugar a monitorear