RESUMEN
Key words: bioremediation, biodegradation, oily residues, polycyclic aromatic hydrocarbons, intemperized soil
ABSTRACT
This study evaluates the bioremediation of a tropical soil from tropical climate,
contaminated with weathered oily residues. Three initial concentrations of total
petroleum hydrocarbons (TPH) were tested: 15.3, 19.0 and 29.2 g/kg of soil. The
experiments were conducted over 60 days, by monitoring the following param-
eters: moisture, pH, concentration of total heterotrophic bacteria, total fungi, total
petroleum hydrocarbons and polycyclic aromatic hydrocarbon: benzo(a) pyrene
(BaP) and chrysene (CHR). The initial concentration of TPH inversely influenced
biodegradation: 84, 72 and 55 % respectively, during 60 days. By increasing the
initial concentration of TPH, the degradation of CHR was also influenced; however,
no effect on the degradation of BaP was observed.
22 T.C. Ferreira do Nascimento et al.
Cuantificaciones microbianas
Las cuantificaciones de los grupos microbianos, RESULTADOS Y DISCUSIN
bacterias heterotrficas totales y hongos totales en las
muestras de suelo fueron llevadas a cabo utilizando Los resultados de algunos parmetros de la carac-
la Tcnica Pour Plate. Se agregaron 10 g de suelo terizacin fsica y qumica del suelo se presentan en
a 90 mL de solucin salina (NaCl al 0.9 %) y se el cuadro I. Se trata de un suelo con 28 % de ma-
promovi la agitacin en batidora (Tecnal - TE-420) teriales finos. Considerando que las arcillas y limos
por 15 minutos a 150 rpm. Alcuotas de 1 mL fueron presentan elevada rea superficial, los fenmenos de
sometidas al procedimiento de diluciones decimales adsorcin de los contaminantes en esos materiales
sucesivas, cultivadas en medio de cultivo especfico son bastante favorecidos, lo cual dificulta el proceso
para cada grupo microbiano. Para la cuantificacin de de solubilidad de esas molculas y, por consiguiente,
hongos se utiliz el medio agar Sabraud (Vetec, Ro
de Janeiro, Brasil), con 2 % de glucosa y suplemen- CUADRO I. CARACTERIZACIN FSICA Y QUMICA
tado con ampicilina 50 mg/L (Cimed, Pouso Alegre DEL SUELO
Brasil). Para la cuantificacin de bacterias se utiliz Parmetro Resultado
el medio agar nutriente (Merck, Darmstadt, Alema-
nia), suplementado con nistatina, 50 mg/L (Teuto, pH (en H2O) 6.9 0.2
Anpolis, Brasil). Las placas fueron incubadas en Arcilla (%) 13 1
Limo (%) 25 2
estufa bacteriolgica a 30 1 C, por 48 horas para
Arena Fina (%) 18 1
el crecimiento y conteo de bacterias y por 120 horas Arena Media (%) 28 2
para el crecimiento y conteo de hongos. Despus Arena Gruesa (%) 12 1
de ese periodo los resultados fueron expresados en CRA (%) 32 1
unidades formadoras de colonia por gramo de suelo P total (mg P/kg de suelo) 16 1
(UFC/g de suelo). Todas las determinaciones y ex- N total (mg N/kg de suelo) 680 50
perimentos fueron realizados por triplicado. HTP (mg/kg de suelo) 29179 450
24 T.C. Ferreira do Nascimento et al.
la biodegradacin. Por otro lado, el suelo present un especies de microorganismos capaces de oxidar
porcentaje importante de materiales arenosos, 58 %, hidrocarburos. Muchos ensayos de laboratorio han
que puede favorecer la biodegradacin por una mejor demostrado que la biodegradacin de hidrocarburos
transferencia de masa del oxgeno del aire atmosfrico por microorganismos ha sido llevada a cabo de ma-
y el suelo, debido a la porosidad (Marin et al. 2005, nera ms conforme con temperaturas en el intervalo
Trindade et al. 2005). El pH prximo a la neutralidad de 20 a 35 C (Stempwort y Biggar 2008).
se considera adecuado para la actividad de degrada- Las prdidas abiticas fueron estimadas como
cin de hidrocarburos por bacterias y hongos (Franco menores al 10 % y, en las condiciones establecidas
et al. 2004). La CRA, aproximadamente del 30 %, en esta investigacin, posiblemente son el resultado
es compatible con suelos limosos, as como tambin de la volatilizacin y fotooxidacin, como describe
el pH levemente cido que es coincidente con la la literatura consultada (Imfeld et al. 2009).
presencia de minerales de arcillas, concordando con La evolucin de la biodegradacin de los HTP del
los resultados granulomtricos. suelo disminuy con el aumento de los niveles de
En los cromatogramas fueron detectados com- contaminacin (fig. 1). En 30 das de proceso, la de-
puestos orgnicos en la fraccin de gasolina (HTP gradacin en todos los bioreactores conteniendo 15.3
GRO) 5 %, de diesel (HTP DRO) 5 %, y de lubri- o 19 g/ kg alcanz el mismo nivel, aproximadamente
cantes (HTP ORO) 90 %. La poca concentracin 55 %, indicando que haba una tolerancia de los mi-
de compuestos de cadenas menores indica, con- croorganismos autctonos a estos niveles de conta-
juntamente con la ausencia de compuestos lineares minacin. En este mismo perodo, la biodegradacin
resueltos y a la elevacin de la lnea de base, el de los contaminantes fue 10 % menor en cuanto se
proceso de intemperismo de los residuos, incre- oper con el nivel de contaminacin de 29 g/kg que
mentando la resistencia del residuo y la dificultad alcanz 45 % de remocin solamente a los 60 das
para el biotratamiento. El intemperismo se refiere de proceso. Esta menor actividad microbiana est
al resultado de procesos qumicos, biolgicos y probablemente relacionada con la susceptibilidad de
fsicos sobre el residuo, que pueden afectar el tipo algunas cepas al contaminante. En 60 das, solamente
de compuestos que permanecen en el suelo. Las en los ensayos con suelo conteniendo 15.3 y 19.0 g/
muestras presentaron HTP inicial de 15.3, 19.0 y kg fueron alcanzados HTP residuales por debajo del
29.2 g/kg de suelo y estas elevadas concentraciones lmite de intervencin estipulado por la Legislacin
del contaminante dificultan an mas la biorreme- Brasilea para suelos en reas industriales, que es de
diacin, conforme lo reportado por DelArco y de 5 g/kg de suelo (Brasil 2009).
Frana (2001).
En todos los ensayos de biorremediacin el pH 100
inicial del suelo fue de aproximadamente 6.9 0.1 HTP inicial 15.5 g/kg
90
decayendo a 6.2 0.1 a lo largo de los 60 das del HTP inicial 19.0 g/kg
Biodegradacin (%)
los procesos de biodegradacin de acuerdo con Ra- Fig. 1. Porcentaje de biodegradacin de HTP, en 30 y 60 das
de proceso, en los ensayos de biorremediacin con HTP
mrez et al. (2009). Estos valores de humedad fue- inicial 15.3, 19.0 y 29.2 g/kg de suelo
ron mantenidos ya que se encuentran en la fraccin
ptima que favorece el proceso de biodegradacin
aerbica de hidrocarburos en suelos ya que la hu- El anlisis del perfil cromatogrfico de los estratos
medad en exceso puede dificultar la dispersin del de los suelos permite verificar que, en las tres condi-
oxgeno (Marin et al. 2005). Las temperaturas de los ciones estudiadas, los compuestos en la fraccin de
suelos no fueron controladas para reducir costos de HTP GRO fueron totalmente biodegradados y que
proceso y se mantuvieron en 30 2 C. De acuerdo la degradacin del HTP ORO fue superior a 50 %,
con Oliver y Magot (2005), en temperaturas entre a pesar de ser considerado resistente, indicando la
25 C y 30 C se desarrolla una gran variedad de adaptacin de la microbiota nativa.
BIORREMEDIACIN DE UN SUELO TROPICAL CONTAMINADO CON RESIDUOS ACEITOSOS 25
Trindade et al. (2005) estudiaron la biodegradacin proceso (Pala et al. 2006). La concentracin inicial
de petrleo crudo y petrleo crudo intemperizado en de BHT y HT totales fue similar en todos los ensa-
suelo tropical y verificaron que la facilidad con que yos (Fig. 2a y 2b). En la mayora de los ensayos las
los hidrocarburos pueden ser removidos de los suelos concentraciones de BHT y de HT alcanzaron valores
vara inversamente con el intemperismo del contami- mximos en siete das de proceso, disminuyendo a lo
nante. DelArco y de Frana (2001) trabajaron en la largo del tiempo y alcanzando las menores concen-
biorremediacin con suelo arenoso contaminado con traciones microbianas en 30 das de proceso, pero en
petrleo rabe liviano, en concentraciones de HTP valores comparables a los reportados en la literatura
no superiores a 14 g/kg de suelo, debido a los efectos consultada para suelos impactados con petrleo y sus
inhibidores del contaminante. En el presente trabajo, la derivados (Oliveira y de Frana 2005). El anlisis de
concentracin de hidrocarburos de aproximadamente las figuras 2a y 2b, conjuntamente con la figura 1,
29 g/kg de suelo tropical estudiado no fue inhibidora, permite adems concluir que el suelo impactado no
revelando la importancia de la realizacin de estu- tena concentracin inhibidora de macronutrientes (N y
dios especficos para cada sistema y el potencial de P), que son elementos importantes para la produccin
la microbiota autctona de los suelos. Dado que fue de biomasa y, por lo tanto, biodegradacin en condi-
utilizado suelo de un rea de landfarming para trata- ciones aerbicas, provocada por la agitacin del suelo
miento de residuos aceitosos, la microbiota del suelo en los ensayos. Se verifica adems que la presencia de
ya estaba adaptada, contribuyendo a la remocin de mayores concentraciones del contaminante provoc
los hidrocarburos intemperizados. la reduccin de la concentracin de HT y de BHT
El comportamiento de los micro-organismos revela a lo largo del proceso; sin embargo, el perfil de las
informaciones respecto de la presencia o ausencia curvas se mantuvo. En los ensayos llevados a cabo
de las variables de la biodegradacin y, adems, la con HTP inicial de 29.2 g/kg fueron obtenidas las
interpretacin de los resultados es de un valor con- menores concentraciones de HT, a partir de 30 das
siderablemente importante para el entendimiento del de proceso, sin comprometer la biodegradacin de los
1.00E+09
HTP Inicial 15.3 g/kg
HTP Inicial 19.0 g/kg
1.00E+08
HTP Inicial 29.2 g/kg
BHT (UFC/kg de suelo)
1.00E+07
1.00E+06
1.00E+05
1.00E+04
1.00E+03
1.00E+06
HT (UFC/kg de suelo)
1.00E+05
1.00E+04
1.00E+03
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (dias)
Fig. 2. Evolucin del crecimiento microbiano durante la biorremediacin (a) BHT; (b) HT
26 T.C. Ferreira do Nascimento et al.
contaminantes. Esto corrobora lo expresado por Prez- tratamiento. Se verifica adems, que la biodegrada-
Armendriz et al. (2010) y por Tortella et al. (2005) cin es inversamente proporcional a la concentra-
que reportan hongos filamentosos como microorga- cin inicial del contaminante, probablemente por la
nismos con elevado potencial hidrocarbonoclstico, inhibicin del metabolismo celular y formacin de
principalmente en la degradacin de las fracciones ms intermediarios txicos (Alexander 1999, DelArco
pesadas del petrleo, como aquellas predominantes en y de Frana 2001).
los residuos aceitosos. La reduccin de las concentra- La biorremediacin tambin fue analizada con
ciones de los grupos microbianos monitoreados puede relacin a la biodegradacin de los HAP CHR y BaP
tambin ser atribuida a la reduccin o agotamiento (Cuadro III). El anlisis del cuadro permite veri-
de los nutrientes requeridos para la asimilacin del ficar que el aumento de la concentracin inicial de
carbono (Ballaminut y Matheus 2007). hidrocarburos en el suelo influy negativamente en la
En el cuadro II se encuentran los resultados de biodegradacin del CHR, no siendo observado efecto
las comparaciones mltiples de las medias de biode- en la degradacin del BaP. Los HAP son compuestos
gradacin de HTP en 30 y en 60 das de proceso. En txicos y molculas de inters ambiental en suelos
30 das, el ANOVA indic que la diferencia mnima impactados (Jaques et al. 2007). Su biodegradacin
significativa para la biodegradacin fue 5.34 % con un depende de muchos factores como biodisponibilidad,
desvo estndar de 2.13. La prueba Tukey comprob, muy influenciada por la matriz del suelo y el intempe-
con base en las comparaciones mltiples de las medias, rismo del contaminante. El CHR posee cuatro anillos
para p < 0.05, que la biodegradacin es diferente slo aromticos en cuanto que el BaP posee cinco anillos
entre los dos niveles ms altos de concentracin de condensados y, por lo tanto, mayor peso molecular.
HTP estudiados. Sin embargo, en dicho periodo de Varios estudios comprueban que los HAP de alto
tiempo le suelo no pudo ser clasificado como tratado, peso molecular son menos biodegradables cuando
con base en la legislacin brasilea. son comparados con los de menor masa molecular
(Alexander 1999, Vasconcelos et al. 2011). Otro
hecho que se debe considerar es el intemperismo del
CUADRO II. PRUEBA DE TUKEY, DIFERENCIAS SIGNI-
FICATIVAS ENTRE LOS TRATAMIENTOS suelo que aumenta la adsorcin de contaminantes
REALIZADOS orgnicos hidrofbicos, como los HAP en la matriz
slida, diminuyendo la velocidad y la extensin de
HTP inicial MSB* la biodegradacin. Como consecuencia, despus de
(g/kg de suelo)
30 das 60 das un perodo inicial de tratamiento, la concentracin de
algunos HAP puede tender a estabilizarse en un valor
15.3 54.93 a** 83.83 c** residual, como lo observado para el caso del BaP.
19.0 55.03 a** 71.97 d**
Una de las hiptesis mas aceptadas propone que los
29.2 45.07 b** 55.28 e**
fenmenos de transferencia de contaminantes cons-
Nota: *MSB media significativa de la biodegradacin (p < 0.05) tituyen la etapa limitante del bioproceso (Nocentini
** Letras minsculas distintas, en cada columna, indican medias et al. 2000). En tales situaciones, la concentracin
significativamente diferentes residual del contaminante depende mayormente de
las partculas finas de los suelos y del intemperismo
El ANOVA, realizado con los datos de biodegrada- del contaminante.
cin en 60 das, llev a un valor de diferencia mnima
significativa para la biodegradacin de 7.16 %, con un
desvo estndar de 2.86 %. Complementariamente, CUADRO III. BIODEGRADACIN DEL CRISENO Y DEL
BENZO(A)PIRENO EN FUNCIN DE LA
con el conjunto de datos obtenidos con la prueba de CONCENTRACIN INICIAL DE HTP EN EL
Tukey, es posible verificar que en este periodo de SUELO
tiempo las biodegradaciones porcentuales obtenidas
son estadsticamente diferentes, a un nivel de signifi- HTP inicial Biodegradacin (%)
(g/kg de suelo)
cancia de 5 %. De esta manera, est confirmando que CHR BaP
la concentracin inicial del contaminante influenci
a la biodegradacin de los hidrocarburos, tanto a los 15.3 66 5 (6.9) 37 4 (3.5)
19.0 53 4 (7.3) 29 2 (4.5)
30 como a los 60 das de proceso. Nuestros resultados 29.2 19 2 (7.8) 35 3 (8.1)
corroboran aquellos reportados por DelArco y de
Frana (2001) e indican la importancia del control Nota: Los nmeros presentados entre parntesis son de la
de la concentracin inicial de HTP para el xito del concentracin inicial media del HAP, en mg/kg
BIORREMEDIACIN DE UN SUELO TROPICAL CONTAMINADO CON RESIDUOS ACEITOSOS 27
Tortella G.R., Diez M.C. y Durn N. (2005). Fungal Vasconcelos U., Oliveira F.J.S. y de Frana F.P. (2011).
diversity and use in decomposition of environmental Removal of high-molecular weight polycyclic aromatic
pollutants. Crit. Rev. Microbiol. 31, 197-212. hydrocarbons. Quim. Nova 34, 218-221.
Trindade P.V.O., Sobral L.G., Rizzo A.C.L., Leite S.G.F. Venosa A.D. y Zhu X. (2003). Biodegradation of crude
y Soriano A.U. (2005). Bioremediation of a weathered oil contaminating marine shorelines and freshwater
and a recently oil-contaminated soil from Brazil: a wetlands. Spill Sci. Technol. Bull. 8, 163-178.
comparison study. Chemosphere 58, 515-522. Watson J. S., Jones D. M., Swannell R.P.J. y Van Duin,
USEPA (1996). Soxhlet extraction, v. I-B. Method 3540C. A.C.T. (2002). Formation of carboxylic acids during
United States Environmental Protection Agency, Wash- aerobic biodegradation of crude oil and evidence of
ington DC, 8 pp. microbial oxidation of hopanes. Org. Geochem. 33,
USEPA (1996). Silica gel clean-up, I-B. Method 3630C. 1153-1169.
United States Environmental Protection Agency, Watwood M.E., White C.S. y Dahn C.N. (1991). Method-
Washington DC, 15 pp. ological modifications for accurate and efficient deter-
USEPA (1996). Nonhalogenated Organics by Gas Chroma- mination of contaminant biodegradation in unsaturated
tography/Flame Ionization Detector. Method 8015B. calcareous soil. Appl. Environ. Microbiol. 57, 717-720.
United States Environmental Protection Agency, Zahed M.A., Aziz H.A., Isa M.H. y Mohajeri L. (2010).
Washington DC, 37 pp. Enhancement biodegradation of n-alkanes from crude
USEPA. (1996). Semivolatile Organic Compounds by Gas oil contaminated seawater. Int. J. Environ. Res. 4,
Chromatography/Mass Spectrometry. Method 8270C. 655-664.
United States Environmental Protection Agency, Wash-
ington DC, 72 pp.