Microtechnique

Microtechnique:
methods of handling and

preparing material for
microscopic observation and
Teknik
study pemrosesan
(http://www.merriam-
sampel untuk
webster.com/dictionary/micro
technique)
pengamatan dengan
mikroskop
rina_susilowati@ugm.ac.id
rina_susilowati@ugm.ac.id 2017 1
Kapan anda perlu
menggunakan
mikroskop?
Jenis mikroskop yang
digunakan
Persiapan sampel
Analisis
Tujuan dan desain

penelitian
Jenis mikroskop
Mikroskop cahaya 2000x
Bright field microscope
Dark Field microscope
Phase contrast microscope - DIC
Fluorescence microscope
Confocal laser scanning fluorescence microscopy
Mikroskop elektron
Scanning Electron microscope (SEM) 3D surface structure - 25.000x
Transmission Electron microscope (TEM) ultrastructure - 400.000x
Mikroskop lain
Scanning probe microscopy
Atomic Force Microsope
Scanning Tunneling microscope
Mikroskop cahaya:
Kohler illumination
Pencahayaan optimum untuk visualisasi
obyek dengan mikroskop cahaya
Resolusi mikroskop cahaya terbaik sekitar 2 m
Numerical aperture
Kemampuan lensa untuk menangkap cahaya yang datang dari
spesimen dan menggunakannya untuk menghasilkan gambar
Numerical Aperture
(NA) = sin()
Indeks refraksi
= 1 untuk udara;
= 1.51 minyak
atau gelas
www.motifolio.com
Numerical aperture
www.olympusmicro.com
Lensa mikroskop
A. Lensa obyektif
plan: menghasilkan gambar datar
Apo penyimpangan kromatik minimum
perbesaran 10x, 20x , 40x; numerical aperture 0,40; 0,70; 0,85.
ketebalan gelas penutup yang digunakan sebaiknya 0,17 0,01 mm
B. Lensa okular dengan perbesaran 10x
C. Kondenser dengan numerical aperture 1.25
Minyak imersi
Penggunaan minyak imersi antara spesimen dan lensa obyektif
meningkatkan NA dan meningkatkan resolusi
resolusi/resolusi/ /rsolusi/ n putusan atau kebulatan pendapat berupa permintaan atau tuntutan yang ditetapkan oleh rapat (musyawarah, sidang); pernyataan tertulis, biasanya berisi tuntutan tentang suatu
hal: rapat akhirnya mengeluarkan suatu -- yang akan diajukan kepada pemerintah
Mikroskop cahaya
Brightfield vs Darkfield microscope
Gambar terang dan

latar belakang
gelap
Gambar gelap
dan latar Mikroskop
belakang terang fluoresens
Pengamatan obyek
sel hidup
fluoresens/fluoresens/ /fluorsens/ n 1 unsur yang dapat memancarkan (memantulkan) cahaya bila mendapat
pencahayaan; 2 Fis pemancaran sinar elektromagnetik yang disebabkan oleh aliran suatu bentuk energi ke dalam sebuah benda
pemancar
Mikroskop cahaya
Brightfield vs Darkfield microscope
Menggunakan
kondenser khusus .
Kondenser biasa Hanya cahaya yang
dipantulkan oleh
obyek yang dapat
memasuki lensa
obyektif.
fluoresens/fluoresens/ /fluorsens/ n 1 unsur yang dapat memancarkan (memantulkan) cahaya bila mendapat
pencahayaan; 2 Fis pemancaran sinar elektromagnetik yang disebabkan oleh aliran suatu bentuk energi ke dalam sebuah benda
pemancar
Mikroskop Phase contrast
Meningkatkan kontras
antara struktur di dalam
sel yang memiliki
perbedaan indeks
refraktif
Frits Zernike, a Dutch
Sangat bermanfaat dalam physicist and
mathematician, built the
mengamati obyek yang first phase contrast
transparan, tidak microscope in 1938.
berwarna misalnya
sampel sel atau zeiss-campus.magnet.fsu.edu
organisme hidup
Phase contrast microscopy
Mikroskop Phase contrast
www.genengnews.com
Inverted microscope
Sumber cahaya dan kondenser ada
di atas panggung mengarah ke
bawah
Bermanfaat untuk mengamati sel
atau organisme hidup yang ada di
dasar wadah (misal kultur sel)
Dikembangkan tahun
1850 oleh J Lawrence
Smith
Differential interference contrast
(DIC) microscopy
Deteksi perbedaan indeks refraksi dan perbedaan ketebalan
obyek
Phase contrast vs DIC microscopy
Mikroskop fluoresens
Confocal laser scanning
fluorescence microscope
Marvin Minsky
Mikroskop elektron
Menggunakan elektron untuk menyinari obyek
Panjang gelombang berkas elektron lebih pendek dari
cahaya sehingga meningkatkan resolusi
Tujuan & desain penelitian
Eksplorasi
Deskriptif (kualitatif):
Semi kuantitatif: skor dengan kriteria tertentu, tidak perlu
dibuat rerata
Konfirmasi
Kuantifikasi: contoh jumlah sel beta pankreas, jumlah
glomerulus ginjal, jumlah sel Purkinje cerebellum, volume
perlemakan hepar, panjang pembuluh darah
desain penelitian & statistik
kuantifikasi/kuantifikasi/ n Ek pernyataan jumlah satuan dalam angka; perihal penjumlahan
Tujuan & desain penelitian
Eksplorasi
Tidak tepat
Deskriptif (kualitatif) (imprecise)/
Semi kuantitatif variasi banyak
Konfirmasi Tidak
Kuantifikasi Bias
desain & statistik
Bias
kuantifikasi/kuantifikasi/ n Ek pernyataan jumlah satuan dalam angka; perihal penjumlahan
Pengambilan sampel untuk pengamatan
dengan mikroskop
Seluruh bagian obyek harus memiliki

Unbiased stereology, Howard and Reed
kemungkinan yang sama untuk diamati

Acak vs acak sistematis
Sampel yang diambil?
Swab, brush, cells in body fluid, biopsy or necropsy (as
soon as possible from the moment of death)
Berapa banyak?
Pemeriksaan
Fiksasi kimiawi struktur dengan
pengecatan rutin
Imunohistokimia/
Jaringan Fiksasi
in situ
pembekuan
hibridization
Segar Isolasi protein dan

DNA
Persiapan sampel
Persetujuan komisi etik Pisau/ gunting yang tajam
Ijin penggunaan fasilitas Tempat penyimpanan
Formulir pengambilan Metode fiksasi
sampel Label
SOP
Sesuai kebutuhan/
ketersediaan
penyimpanan
Keamanan bagi pekerja
laboratorium dan
lingkungan amazon.com
Penyiapan jaringan untuk
pembuatan sediaan awetan irisan
Fiksasi
blok parafin
Dehidrasi
Clearing
Penanaman pada parafin
Pengirisan
Pengecatan
Penutupan irisan jaringan dengan gelas penutup
Pengamatan dan analisis
Penyimpanan spesimen dan data
Fiksasi
Tujuan
Metode
Kimiawi
Contoh
paraformaldehyde,
glutaraldehyde
Bufer
Suhu
Dehidrasi & clearing
Dehidrasi: Ethanol, isopropanolol,
acetone, methanol
Konsentrasi meningkat
Clearing agents: Toluene, xylene
Penanaman / Embedding
Titik lebur Paraffin 39C hingga 68C
Perhatikan orientasi
protocolsonline.com http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/imaages2/62520.jpg
Label
Pengirisan
Sliding microtome
Rotary microtome
Ultramicrotome
Freezing microtome
Cryostat
Vibratome
Penempelan pada gelas obyek
Albumen
(white eggs + glycerol)
Silanized slides e.g 3-

aminopropyltrietoxysilane
(APES)
Poly-l-lysin
Chrome gelatin
Label!
Pengecatan / pewarnaan
Suatu obyek berwarna karena menyerap
radiasi elektromagnetik sehingga gelombang
yang tidak diserap itulah yang terlihat sebagai
warna obyek tersebut
inst.bact.wisc.edu
Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Cat
Dyes nomenclature: CI (colour index)
number
by society of dyers and colourist in
1971 based on chemical
constitution
e.g. Methyl Blue CI 42780,

haematoxylin CI 75290
Haematoxylin CI 75290
Larut dalam air dan etanol
Tidak berwarna bila tidak ada kontak
dengan udara
Oksidasi mengubah haematoxylin
menjadi haematein pada udara atau
bahan pengoksidasi misalnya NaIO3 Flavonoids from heart
wood Haematoxylum
(sodium iodate) campechianum L
Merah pada pH <1,
Kuning pada pH 1-5 http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/imgapr08/image003.jpg
Biru keunguan pada pH >6
Sering digabungkan dengan logam
Haemalum (+ alumunium)
mengecat nuklues menjadi
biru keunguan
Iron hematoxylin nukleus
berwarna hitam http://www.ihcworld.com/royellis/problems
/images/kl22.jpg
Eosin
Derivat fluorescein
Pewarna merah
Larut dalam air dan kurang larut dalam etanol
Eosin Y
C20H6Br4Na2O5
Cat yang mirip CAS#17372-87-1
Eosin Y C.I. 45380
Eosin B MW: 691.91
Phloxin Synonyms: Acid Red
Phloxin B 87
Erythrosin Y Stains grade: Eosin
Erythrosin B Yellow > 90%
Rose Bengal
http://www.2spi.com/catalog/chem/images/2568.jpg
Pengecatan lemak
Pengecatan lemak: Tidak dapat
didehidrasi karena akan
melarutkan lemak
Solvent dyes
Mount in aqueous medium
Solvent Dyes Lipid colour

Sudan IV Red
Sudan Black Black
Oil Red O Red
Histokimia enzim
Fiksasi suhu dingin (pembekuan)

Contoh enzim acetylcholine-esterase,
phosphatase, enteropeptidase
Berikan substrat dan deteksi produk
Pengecatan saat sel atau organisme
masih hidup (Vital staining)
Contoh: Biru tripan (Trypan blue)
Contoh: Mitochondria dicat dengan

Janus Green B pada kultur
Sel saraf dengan methylene blue
BrDU
Section of pancreas from a rat injected with the vital
dye trypan blue.
Note that 3 macrophages (arrows) have engulfed and

accumulated the dye in the form of granules. H&E
stain. Low magnification.
Junqueiras Basic Histology
Dehydration - Rehydration
Bleeding and/or fading of Eosin-Y after

coverslipping
Mounting medium
www.lawyernursery.com/productinf...ryid%3D1
Resinous media dissolved in xylene

or toluene
Natural Canada balsam
Resin from Abies balsamea
Synthetic resin e.g DPX
Aqueous media
Glycerol
Polyvinylpyrollidone (PVP)
www.mirax.co.kr/bbc_view01.html%...
no%3D147
Gelas penutup
Label!
commons.wikimedia.org/wiki/File:...slip.jpg
http://nationaldiagnostics.com/article_info.php/articles_id/107
Pengamatan dan dokumentasi
Sesegera mungkin
Identifikasi artefak
Atlas
Skala
Presentasi data
Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Informasi struktur 3 dimensi
berubah ketika jaringan diiris
Volume tampak sebagai area
Area permukaan tampak

sebagai garis
Struktur yang memanjang

tampak sebagai profil
Jumlah obyek menjadi tidak

jelas
Unbiased stereology, Howard and Reed
Parameter dan probe
Parameter Volume Luas Panjang Jumlah
Dimensi
probe
titik garis area Volume (disector)

Dimensi
probe
probe adalah bentuk geometri virtual yang

digunakan untuk melakukan penghitungan
Dimensi probe + dimensi struktur geometrik yang
diamati = 3
Hati hati dengan reference trap
Densitas
reference trap
Perangkat lunak hanya membantu
disain penelitian perlu diperhatikan
Perangkat lunak stereology
Image processor software
Contoh: ImageJ
Penyimpanan
Tissue
Blocks
Unstained Sections
Slide boxes
Data http://www.polysciences.com
Soft copy
Log book and hard copy
confirmcancer.com
Presentasi data
Kualitatif
Joswicki et al. Int. J. Mol.

Sci. 2014, 15(9), 16069-
16082;
Kuantitatif
Sperling et al., Nature

Neuroscience 16, 848
850 (2013) confirmcancer.com
Result: 1% failure
Simpulan penelitian pengamatan
sediaan jaringan dengan mikroskop
Tujuan penelitian harus jelas
Teknik yang digunakan harus sesuai dengan
tujuan penelitian tersebut
Pengambilan sampel
Fiksasi
Pengirisan
Pewarnaan
Analisis
Presentasi data
Terima Kasih

Microtechnique

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Microtechnique

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Microtechnique:

methods of handling and

Tujuan dan desain

Resolusi mikroskop cahaya terbaik sekitar 2 m

Gambar terang dan

kuantifikasi/kuantifikasi/ n Ek pernyataan jumlah satuan dalam angka; perihal penjumlahan

Seluruh bagian obyek harus memiliki

kemungkinan yang sama untuk diamati

Segar Isolasi protein dan

Silanized slides e.g 3-

Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

e.g. Methyl Blue CI 42780,

Solvent Dyes Lipid colour

Fiksasi suhu dingin (pembekuan)

Contoh: Mitochondria dicat dengan

Sel saraf dengan methylene blue

Note that 3 macrophages (arrows) have engulfed and

Bleeding and/or fading of Eosin-Y after

Resinous media dissolved in xylene

Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Area permukaan tampak

Struktur yang memanjang

Jumlah obyek menjadi tidak

titik garis area Volume (disector)

probe adalah bentuk geometri virtual yang

Joswicki et al. Int. J. Mol.

Sperling et al., Nature

Anda mungkin juga menyukai