Anda di halaman 1dari 52

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR TABEL
BAB I
TENTANG BLOT
1.1 Pengantar
1.2 Keuntungan Teknik Blot
1.3 Macam-Macam Metode Blong
BAB II
WESTERN BLOT
2.1 Kelebihan Western Blot
2.2 Alat dan Bahan
2.3 Langkah-langkah Western Blot
BAB III
WESTERN BLOT PERSIAPAN SAMPEL
3.1 Sampel
3.2 Persiapan Protein Lysate dari Jaringan dan Kultur Sel
3.2.1 Prosedur Teknis Ekstraksi Protein Denaturasi Protein
3.2.2 Pengukuran Konsentrasi Protein
3.2.3 Denaturasi Protein
BAB IV
WESTERN BLOT PERSIAPAN BUFFER
4.1 Persiapan Buffer yang Dibutuhkan
BAB V
WESTERN BLOT PERSIAPAN PEMBUATAN GEL
5.1 SDS-PAGE Elektroforesis
5.2 Contoh Prosedur Pembuatan Gel untuk SDS-PAGE

BAB VI
WESTERN BLOT ELEKTROFORESIS
6.1 Gel Elektroforesis
6.1.1 Prosedur Elektroforesis
6.2 Transfer Protein/Blotting
6.2.1 Prosedur Transfer Protein/Blotting
6.3 Deteksi Protein dengan An bodi
6.3.1 Prosedur Teknis Deteksi Protein dengan An bodi
6.4 Deteksi Protein Target
6.4.1 Deteksi secara Kolorimetri
6.4.2 Deteksi secara Chemiluminescence
6.4.3 Deteksi secara radioak f
6.4.4 Deteksi secara Fluorescen
BAB VII
WESTERN BLOT ANALISIS HASIL
7.1 Image-J
BAB VIII
WESTERN BLOT TROUBLE SHOOTING
8.1 Tidak Ada Band
8.2 Gambaran Band Tidak Jelas (Sinyal Lemah)
8.3 Extra Band
8.4 High Background
8.5 Diffuse Band
8.6 Band Berwarna Pu h (ECL method)
8.7 Bin k-Bin k dan Gelembung pada Membran
8.8 Kesalahan yang sering dalam Western Blot
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN 1 Resep Buffer
LAMPIRAN 1 Resep Buffer
LAMPIRAN 2 Resep SDS-PAGE Gel
LAMPIRAN 3 Contoh Hasil Pengambilan Gambar western Blot
INDEX

DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Hasil western blot (Ronny, et. al. 2016)
Gambar 2.2 Prinsip deteksi protein target menggunakan an. bodi spesifik
Gambar 2.3 Western blot workflow

Gambar 3.1 Hasil ekstraksi protein berupa endapan dan supernatan


Gambar 3.2 Kurva standar untuk pemeriksaan Bradford
Gambar 3.3 Sample Buffer
Gambar 3.4 Blok pemanas untuk denaturasi protein sampel

Gambar 5.1 Posisi separating gel dan stocking gel pada gel SDS-PAGE
Gambar 5.2 Separating buffer dan stacking buffer, temed dan acrylamide di
dalam box es
Gambar 5.3 Peralatan untuk membuat home made gel
Gambar 5.4 Karet penahan bagian bawah
Gambar 5.5 Holder kaca yang digunakan untuk membuat home made gel
Gambar 5.6 Garis lurus pembatas antara separating gel dan stocking gel
menggunakan spidol
Gambar 5.7 Garis batas antara separating gel dan stacking gel

Gambar 6.1 Contoh protein marker dan sampel pada SDS-PAGE


Gambar 6.2 Elektroforesis SDS-PAGE
Gambar 6.3 Alat elektroforesis SDS-PAGE
Gambar 6.4 Bagian sudut alat elektroforesis SDS-PAGE dalam keadaan
terkunci
Gambar 6.5 Sampel protein (berwarna biru) pada separating gel
Gambar 6.6 Sampel protein (berwarna biru) berada pada bagian bawah gel
Gambar 6.7 Alat transfer protein wet blot
Gambar 6.8 Alat transfer protein semi dry blot
Gambar 6.9 Alat transfer protein dry blot
Gambar 6.10 Kasa (sponge pad) dibasahi dengan 1x transfer buffer
Gambar 6.11 Filter paper diletakkan diatas kasa
Gambar 6.12 Gel hasil elektroforesis SDS-PAGE
Gambar 6.13 Bagian stacking gel dibuang menggunakan scraper plas k
Gambar 6.14 Cara meletakkan gel pada filter paper
Gambar 6.15 Cara melepaskan kaca dari gel yang menempel
Gambar 6.16 Cara memegang membran PVDF
Gambar 6.17 Cara meletakkan membran PVDF diatas gel
Gambar 6.18 Proses rolling untuk menghilangkan udara yang terjebak diantara
membran dan gel
Gambar 6.19 Proses rolling pada kasa filter
Gambar 6.20 Kaset berisi sandwich membran gel dalam posisi terkunci
Gambar 6.21 Cara memasukkan kaset berisi sandwich membran gel ke dalam
alat blotting
Gambar 6.22 Posisi kaset sandwich membran gel dari atas alat blotting
Gambar 6.23 Proses transfer protein/blotting
Gambar 6.24 Hasil proses transfer protein/blotting
Gambar 6.25 Proses Ponceau S staining
Gambar 6.26 Hasil Ponceau S staining
Gambar 6.27 Proses blocking membran menggunakan blocking solution
Gambar 6.28 Tahap pewarnaan imunologi dengan an bodi
Gambar 6.29 Prinsip deteksi protein pada western blot
Gambar 6.30 Salah satu pe gel documentation machine
Gambar 6.31 Infrared detection system machine
Gambar 6.32 Deteksi menggunakan film nega f (secara radioak f)
Gambar 6.33 Deteksi protein target dengan chemiluminescence
Gambar 6.34 Chemiluminesence reagent biasanya terdiri dari reagen A dan B

Gambar 7.1 Tampilan so ware Image-J


DAFTAR TABEL

Tabel 3.1 Lokasi protein dan lysis buffer yang cocok


Tabel 5.1 Rekomendasi persentase gel terhadap ukuran protein yang akan
dianalisis
BAB I
TENTANG BLOT

1.1 Pengantar
Blot adalah suatu teknik mentransfer bagian protein yang telah diseparasi,
RNA atau DNA dari gel ke lembaran pis atau matriks membran supaya bagian
protein tersebut menjadi dak bergerak dan dapat diukur.

1.2 Keuntungan Teknik Blot


Akses yang lebih besar dan mudah kepada protein terikat di permukaan
lembaran membran dibandingkan kepada molekul/protein yang masih berada
di dalam gel atau matriks.
Lebih sedikit larutan reagen dan bodi/pereaksi yang dibutuhkan.
Waktu yang dibutuhkan untuk melakukan perwarnaan dan pencucian DNA,
inkubasi, mencuci menjadi lebih.
Penyimpanan dapat sampai berbulan bulan sampai dianalisis.

Matriks dapat berupa Nitrocellulase (NC), Polyvinylidene difluoride (PVDF),


Diazabenyloxymethyl (DBM) dan Diazophenylthioeter (DPT).

1.3 Macam-macam Metode Blong


1. Southern Blot
Southern blot pertama kali dikemukakan oleh Southern (1975). Teknik ini
mentransfer DNA ke kertas nitrocellulose.
2. Northern Blot
Northern blot merupakan teknik yang sama dengan Southern Blot, namun
menggunakan kertas DBM dan biasanya mendeteksi RNA.
3. Eastern Blot
Eastern blot ditemukan oleh Reinhard dan Malamud (1982), adalah proses
transfer bidirectional dengan menggunakan aliran pelarut protein dari gel ke
NC berdasarkan isoelektrik.
4. Western Blot
W. Neal Burne memperkenalkan dan menamai western blot sebagai respon
terhadap penamaan teknik southern blot yang pertama kali ditemukan.
BAB II
WESTERN BLOT

Western Blot (WB) adalah suatu teknik analisis sampel protein yang
digunakan pada riset biologi molekular. Western Blot digunakan untuk mendeteksi
protein spesifik dengan menggunakan prinsip reaksi gen-an bodi. An bodi (mono
dan poliklonal) dapat diperoleh secara komersial atau dibuat secara khusus untuk
mendeteksi suatu/beberapa epitope dari protein. Teknik untuk mendeteksi protein
spesifik pada sampel jaringan. Teknik ini menggunakan gel elektroforesis untuk
memisahkan protein berdasarkan panjang polipepda atau berdasarkan struktur 3D-
nya. Protein kemudian ditransfer memakai nitrocellulose atau PVDF, dimana
mereka kemudian akan dilacak dengan menggunakan bodi yang spesifik kepada
protein target. Western blot dapat mendeteksi suatu protein dalam kombinasinya
dengan sangat banyak protein lain, dapat memberikan informasi mengenai ukuran
dan ekspresi protein tersebut.

Gambar 2. Hasil western blot (Ronny, et. al. 2016)

2.1 Kelebihan Western Blot


Dapat mendeteksi protein dalam jumlah kecil seperti clock protein.
Dapat digunakan untuk mendeteksi respon imunologis dari sampel yang
infeksius seperti virus atau bakteri.
Lebih spesifik dibandingkan dengan ELISA.
Sebagai penyimpanan sampel protein pada membran. Membran WB
memiliki kemampuan untuk mengikat protein secara kuat sehingga dapat
menyimpan sampel protein dengan baik untuk diproses kembali untuk
deteksi protein yang berbeda.
Visualisasi mudah, menggunakan beberapa alat seperti x-ray dan scanner.
Gambar 2.2 Prinsip deteksi protein target menggunakan bodi spesifik

Bodi pertama (primary antibody) spesifik akan mengikat protein target. Anti bodi
pertama akan diikat oleh antibodi kedua (secondary antibody) untuk proses
visualisasi.

2.2 Alat dan Bahan


Alat : Bahan
1. Elektroforesis Lysis buffer
2. Blotting Polyacrylamide gel
3. Reader Running buffer
Transfer buffer
TBST/PBST
Blocking solution
Chemiluminescence agent.

2.3 Langkah-langkah Western Blot


Proses western blot membutuhkan beberapa langkah khusus, yaitu :
1. Tahap persiapan
2. Elektroforesis (SDS-PAGE)
3. Transfer protein/Blotting
4. Deteksi protein dengan antibodi
5. Blocking membrane
6. Deteksi protein target

Gambar 2.3 Western blot workflow


BAB II
WESTERN BLOT PERSIAPAN SAMPEL

3.1 Sampel
Persiapan sampel western blot meliputi pembuatan lysis buffer dan
persiapan lysate dari jaringan atau kultur sel.
1. Lysis buffer
Lysis buffer memiliki kemampuan yang berbeda-beda untuk melarutkan
protein. Kemampuan antibodi untuk mendeteksi protein target harus menjadi
pertimbangan utama dalam memilih jenis lysis buffer yang akan dipakai.
Tabel 3.1 Lokasi protein dan lysis buffer yang cocok
Lokasi protein Buffer yang sesuai
Seluruh sel NP-40
Sitoplasma (soluble) Tris-HCl
Sitoplasma (terikat pada sitoskeleton) Tris-Triton
Protein membran NP-40 atau RIPA
In sel RIPA
Mitokondria RIPA

2. Protease inhibitor
Pada saat proses lisis berlangsung, dimulai juga proses proteolysis. Hal ini
dapat dihambat dengan cara menempatkan sampel dalam es atau suhu 4 0C dan
menambahkan protease inhibitor: Apro nin (10 mg/mL). leupep n, NaV
(Sodium Vanadate), PMSF.

3.2 Persiapan Protein Lysate dari Jaringan dan Kultur Sel


3.2.1 Prosedur Teknis Ekstraksi Protein Denaturasi Protein
1. Jaringan / Tissue
Mempersiapkan jaringan (sampel) sebesar 1x2 mm
- Dipotong menjadi ukuran kecil menggunakan gunung atau cutter;
menggunakan nitrogen cair dikeringkan dan ditumbuk; menggunakan gun
extractor
- Sampel yang telah dipotong lebih kecil dimasukkan kedalam microtube 1,5
mL
- Ditambahkan 200 L lysis buffer, dihomogenkan menggunakan homogenizer
- Disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan maksimal (15.000 rpm/13.300
rpm)
- Dipindahkan supernatan kedalam microtube 0,5 mL baru
Supernatan
- Dimasukkan sebanyak 15 L kedalam microtube 0,5 mL
- Ditambahkan 15 L sample buffer (dengan perbandingan 1:1)
- Dipanaskan pada suhu 95-1050C selama 5 menit. Setelah selesai, langsung
disimpan diatas es selama 2-3 menit.
- Sampel siap untuk di-loading ke gel dalam proses elektroforesis.
Prosedur sederhana ekstraksi protein :
- Tambahkan RIPA buffer (with protease inhibitors) kedalam sampel jaringan,
dan homogenasi secara baik.
- Pindahkan kedalam microtube 1,5 mL, dan inkubasi 30 menit diatas es.
- Sentrifugasi 10 menit 40C dengan kecepatan 10.000 G
- Pindahkan supernatan kedalam microtube 0,5 mL baru
- Ukur konsentrasi dengan FBS
- Simpan sampel di freezer -800C

Gambar 3.1 Hasil ekstraksi protein berupa endapan dan supernata

2. Kultur sel (invitro sampel)


- Persiapan lysis solution disesuaikan dengan jumlah well dalam plate (100
L per well untuk 24 well; 200 L per well untuk 12 well; 500 L per well
untuk 6 well plate)
- Lysis solution terdiri dari lysis buffer (dengan 1 mM DTT, phosphatase
inhibitor dan protease inhibitor) dan 2x sample buffer.
Misal dibutuhkan: 2.500 L lysis solution = 1.250 L lysis buffer + 1.250
L sample buffer
Prosedur :
- Cuci plate dua kali menggunakan 1 x PBS
- Scrap menggunakan p atau scrap cell dan resuspensi dengan
menggunakan lysis solution
- Dipanaskan pada suhu 95-1050C selama 5 menit. Setelah selesai, langsung
disimpan diatas es selama 2-3 menit (snap freeze)
- Sampel siap untuk di-loading ke gel dalam proses elektroforesis.

3.2.2 Pengukuran Konsentrasi Protein


Pengukuran konsentrasi protein dapat dilakukan dengan menggunakan:
1. Bradford assay
Uji Bradford adalah suatu uji untuk mengukur konsentrasi protein total
dengan secara kolorimetri dalam suatu larutan. Coomassie Brilliant Blue (CBB)
yang berikatan dengan protein dalam suatu larutan yang bersifat asam sehingga
memberikan warna (kebiruan). Perubahan warna tersebut dapat diukur
absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang
465-595 nm
- Reagen Bradford: 0,01 g Coomise Brilian Blue (CBB) G-250 dilarutkan dalma
5 mL etanol 95% (v/v), lalu ditambahkan 10 mL asam fosfor 85% (v/v).
Simpan dalam botol gelap dan pada 40C. Stok biasanya membutuhkan
pengenceran 5 kali.
- Larutan standar protein: 0,01 g BSA (Bovine Serum Albumin) dalam 10 mL
H2O steril sehingga diperoleh larutan stok BSA dengan konsentrasi 1.000 ppm
dan kemudian dilakukan serial dilusi untuk menjadi protein standar. Dari
larutan stok tersebut dilakukan pengukuran terhadap standar protein terlarut
dengan konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 dan 100 ppm.
Gambar 3.2 Kurva standar untuk pemeriskaan Bradford

2. Metode Lowry
Ada beberapa metode yang biasa digunakan dalam rangka penentuan
konsentrasi protein, yaitu metode Biuret, Lowry, dan lain sebagainya. Masing-
masing metode mempunyai kekurangan dan kelebihan. Pemilihan metode yang
terbaik dan tepat untuk suatu pengukuran bergantung pada beberapa faktor seperti
misalnya, banyaknya material atau sampel yang tersedia, waktu yang tersedia
untuk melakukan pengukuran, alat spektrofotometer yang tersedia (VIS atau UV).
Reagen pendeteksi gugus-gugus fenolik seperti reagen Folin dan Ciocalteu
telah digunakan dalam penentuan konsentrasi protein oleh Lowry (1951) yang
kemudian dikenal dengan metode Lowry. Dalam bentuk yang paling sederhana
reagen Folin Ciocalteu dapat mendeteksi residu rosin (dalam protein) karena
kandungan fenolik dalam residu tersebut mampu mereduksi fosfotungsat dan
fosfomolibdat, yang merupakan konstituen utama reagen Folin Ciocalteu, menjadi
tungsten dan molibdenum yang berwarna biru. Hasil reduksi ini menunjukkan
puncak absorbsi yang lebar pada daerah merah. Sensivitas dari reduksi ini
menunjukkan puncak absorbsi yang lebar pada daerah merah. Sensivitias dari
metode Folin Ciocalteu ini mengalami perbaikan yang cukup signifikan apabila
digabung dengan ion-ion Cu.
Larutan Lowry ada dua macam yaitu larutan A yang terdiri dari
fosfotungstat-fosfomolibdad (1:1) dan larutan Lowry B yang terdiri dari Na-
Karbonat 2% dalam NaOH 0,1 N, tembaga sulfat dan Na-K-tartat 2%. Cara
penentuannya seperti berikut: 1 mL larutan protein ditambah 5 mL Lowry B,
dihomogenkan dan dibiarkan selama 10 menit. Kemudian ditambah 0,5 mL
Lowry A dihomogenka dan dibiarkan 20 menit. Selanjutnya diama OD-nya.
Dalam metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu (II)-protein
akan terbentuk sebagaimana metode Biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II)
akan tereduksi menjadi Cu (I). ion Cu (I) kemudian akan mereduksi reagen Folin-
Ciocalteu, kompleks fosfomolibdat fosfotungstat (phosphomolybdotungstate),
menghasilkan heteropoly molybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aroma k
(rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif
yang dapat dideteksi secara kolorimetri.
Metode Lowry mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi lain
(Folin-Ciocalteaufenol) yang bereaksi dengan residu tyrasine dan tryptophan
dalam protein. Reaksi ini menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca di antara
500-750 nm, tergantung sensitivitas yagn dibutuhkan. Akan muncul puncak kecil
di sekitar 500 nm yang dapat digunakan untuk menentukan protein dengan
konsentrasi tinggi dan sebuah puncak besar disekitar 750 nm yang dapat
digunakan untuk menentukan kadar protein dengan konsentrasi rendah.
Berawal dari pemanfaatan alat spektrofotometer yaitu untuk mengukur
jumlah penyerapan zat suatu senyawa. Penyerapan cahaya pada senyawa larutan
tersebut, dalam spektrofotometri dapat digunakan sebagai dasar atau pedoman
dalam penentuan konsentrasi larutan atau senyawa secara kuantitatif. Dalam hal
ini penggunaan KMnO4 bertujuan untuk memudahkan dalam pengenalan dan
latihan awal spektrofotometri. Kekuatan warna biru terutama bergantung pada
kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya. Keuntungan metode Lowry adalah
lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret.
Beberapa zat yang bisa mengganggu penetapan kadar protein dengan
metode Lowry ini, diantaranya buffer, asam nukleat, gula atua karbohidrat,
detergen, gliserol, tricine, EDTA, Tris, senyawa-senyawa kalium, sulfhidril,
disulfida, fenolat, asam urat, guanin, xanthine, magnesium dan kalsium.
Interferensi agen-agen ini dapat diminimalkan dengan menghilangkan interferens
tersebut. Sangat dianjurkan untuk menggunakan blanko untuk dapat dieliminasi
dengan penambahan SDS atau melakukan preparasi sampel dengan pengendapan
protein.
3. Bicinchoninic Acid (BCA) assay
Bicinchoninic Acid assay (BCA assay), dikenal juga Smith assay, karena
dinamakan berdasarkan penemunya, Paul K. Smith. BCA adalah biochemical
assay untuk mendeteksi konsentrasi total protein (0,5 g/mL sampai 1,5 mg/mL),
hampir mirip dengan lowry protein assay, Bradford protein assay atau Biuret
reagent. Perubahan warna dari larutan sampel dari warna hijau sampai ke ungu
dan perubahan ini diukur dengan metode kolorimetri.
Stok campuran larutan BCA A, adalah sebagai berikut dengan komponen yang
sangat alkalis dengan pH 11,25:
- Bicinchoninic acid
- Sodium carbonate
- Sodium bicarbonate
- Sodium tartrate
- Copper (II) sulfate pentahydrate

Ada 2 reaksi utama:


1. Ikatan peptida dalam protein akan mereduksi Cu2+ dari copper (II) sulfate
menjadi Cu+ (reaksi ini sangat bergantung pada suhu). Jumlah Cu2+
menentukan jumlah protein yang terdapat dalam larutannya. Selanjutnya 2
molekul bicinchoninic acid berikatan dengan ion Cu+ membentuk komplek
yang berwarna ungu dan dapat terukur pada panjang gelombang 562 nM.
2. Bicinchoninic acid CU+ complex dipengaruhi dalam protein oleh adanya
cysteine/cystine, tyrosine, dan tryptophon side chains. Pada suhu yang tinggi
(37-600C), konsentrasi absorption spectra.

3.2.3 Denaturasi Protein


Cairkan sampel beku diatas es dicampurkan dengan sample buffer dan
-ME (-Mercaptoethanol) dengan ratio 19:1. Contoh: Sample buffer 950 L + -
ME 50 L.

Gambar 3.3 Sample buffer

Sesuaikan konsentrasi sampel protein dan samakan dilusi pengalinya sebelum


dipanaskan pada blok pemanas (heat block).
Antibodi biasanya mengenali sebagian kecil dari protein target. Bagian ini
kemungkinan berada dalam lipatan protein yang berbentuk 3D. Untuk
memudahkan deteksi protein menggunakan antibodi, maka lipatan-lipatan protein
itu harus dibuka dengan menggunakan suhu tinggi.
Untuk proses denaturasi protein, tambahkan loading buffer dengan Sodium
Dodecyl Sulfate (SDS) dan dipanaskan hingga 95-1000C selama 5 menit. SDS
berikatan dengan protein dan akan memberikan muatan negatif pada semua
protein. Untuk memutus rantai ikatan SS (disulfida) sehingga protein lebih soft
dan mudah terurai proses elektroforesis. Untuk melihat pepindahan protein di
dalam gel maka ditambahkan pula pewarna (contoh; Bromophenol Blue).

Gambar 3.4 Blok Pemanas untuk denaturasi protein sampel

Ada perbedaan suhu antara blok pemanas dengan suhu real yang terukur
pada termometer, seperti contoh pada gambar. Setelah selesai inkubasi pada blok
pemanas, segera dinginkan sampel diatas es dan simpan pada 4 0C sampai akan
digunakan saat elektroforesis (snap freeze).
BAB IV
WESTERN BLOT-PERSIAPAN BUFFER

4.1 Persiapan Buffer yang Dibutuhkan


Buffer yang harus dipersiapkan dengan seksama:
- Running buffer (x 10 solution, Tris 0,5 mM, Glycine 192 mM, SDS 0,1%)
Tris 30,3g + Glycine 144 g + SDS 10 g + ddH2O hingga 1 liter
*SDS : Sodium Dodecyl Sulfte
- Running solution
Running buffer (x 10) 100 mL + ddH2O 900 mL
- Transfer buffer (x 5 solution)
Tris 14,075 g + Glycine 65,625 g + ddH2O hingga 1 LIter
- Transfer solution
Transfer buffer (x5) 160 mL + Methanol 200 mL + ddH2O 640 mL
- TBS (x10, pH 7,5)
Tris 24,22 g + NaCl 87,66 g + ddH2O hingga 986 mL + HCl 14 mL
- PBS (x1)
PBS 1 tablet + ddH2O 200 mL
- TBS-T (Tween 20 0,1%) / PBS-T
TBS (x 10) 100 mL + ddH2O 900 mL + Tween 20 1 mL
PBS (x 1) 200 mL + Tween 20 0,2 mL
Tween 20 = Polyoxythylene Sorbitan Monolaurate
Setelah penambahan Tween 20, homogenkan, dan tunggu 30-60 menit hingga
gelembung udara.
- RIPA buffer
25 mM Tris-HcL ph 7,6, 150 mM NaCL, 1% NP-40, 1%, Sodium
deoxycholate, 0,1% SDS
Na Cl 150 mM 4,3875 g
EDTA 1 mM 0,14612 g
SDS 0,1% 0,5 g
Tris-HCl (1M) ph 7,6 25 mM 12,5 mL
Na-deoxycholate 1% 5,0 g
NP-40 1% 5,0 ml
ddH2O 482,5 mL
RIPA buffer working solution
RIPA buffer 10 mL
Protease inhibitor cocktail 1 tab
0,2 M PMSF (DMSO) 50 l

- Ponceau S Staining solution (Ponceau S 0,1% + 5% Acetic acid)


Ponceau S 0,05 g + Acetic acid 2,5 mL + ddH2O 47,5 mL
BAB V
WESTERN BLOT-PERSIAPAN PEMBUATAN GEL

5.1 SDS-PAGE Elektroforesis


Tahap kedua dari western blot adalah proses yang bertujuan untuk
memisahkan protein menurut berat molekulnya menggunakan alat elektroforesis.

Siapkan buffer yang dibutuhkan:


- Running buffer (1x 10 solution)
- Transfer buffer (x5 solution)
- TBS/PBS, TBS-T/PBS-T

Proses pemisahan protein dilakukan dengan cara menempatkan protein


pada gel elektroforesis. Gel dapat dibuat dengan bermacam-macam konsentrasi
sesuai dengan berat molekul protein target yagn dicari.
Pembagian elektroforesis gel dibagi menjadi dua bagian :

Gambar 5.1 Posisi separating gel dan stacking gel pada gel SDS-PAGE

Ada 2 jenis gel yang dikenal untuk eksperimen western blot:


1. Precast gel: dibuat oleh pabrik dan siap digunakan.
2. Home made gel: Gel yang disiapkan dan dibuat sendiri oleh peneliti.

Prosedur teknis membuat gel :


3. Semua gel yagn digunakan terdiri dari 2 bagian. Susun semua material yang
dibutuhkan dengan rapi seperti pada gambar.
Gambar 5.2 Separating Buffer dan stackign buffer, temed dan acrylamide di
dalam box es

4. Bersihkan kaca dengan menggunakan metanol/propanol untuk menghilangkan


yang menempel yang dapat menurunkan kualitas dari gel. Susunlah kaca
sesuai dengan tatanan yang diperlukan dengan menata kaca bagian kecil dan
besar dengan bagian kecil menghadap ke depan. Mohon di cek dengan pasti
jangan sampai bocor. Posisi holder kaca, dan karet penahan harus presisi, jika
tidak akan bocor dan gel menjadi miring kebocoran. Kunci dengan rapat

Gambar 5.3 Peralatan untuk membuat home made gel

Gambar 5.4 Karet penahan bagian bawah

Gambar 5.5 Holder kaca yang digunakan untuk membuat home made gel

5. Gel western blot memiliki 2 bagian :


1) Stacking gel
Berada pada bagian atas dari gel. Fungsinya untuk
mengkonsentrasikan protein dalam satu pita (band) sehingga seluruh protein
sampel akan mulai terpisah secara bersamaan.
2) Separating gel
Berada pada bagian bawah gel. Berfungsi untuk memisahkan protein
berdasarkan berat molekulnya. Protein dengan berat molekul tinggi akan
berada pada bagian atas gel sementara protein dengan berat molekul
rendah akan tertarik lebih cepat.
Peneliti disarankan untuk mencari informasi mengenai besaran protein target
dan memilih persentase gel yang akan dibuat sesuai dengan berat molekul protein
target.
Tabel 5.1 Rekomendasi persentase gel terhadap ukuran protein yang akan dianalisis
Ukuran protein Persentase gel
4-40 kDA 20%
12-45 kDA 15%
10-70 kDA 12,5%
15-100 kDA 10%
25-100 kDA 8%

6. Tes menggunakan air untuk mendeteksi kebocoran dan setelah itu buang air
keluar dan masukkan sisir gel, kemudian gambar garis lurus menggunakan
spidol setinggi 1 cm di bawah dari bagian bawah sisir gel (pada gambar-garis
berwarna merah)

Gambar 5.6 Garis lurus pembatas antara separating gel dan stacking gel
menggunakan spidol

7. Buat dan siapkan campuran untuk separating gel, masukkan TEMED dan
10% APS terakhir setelah posisi kaca gel siap. Setelah tercampur dengan baik,
masukkan ke dalam antara kedua kaca sampai setinggi garis batas. Kemudian
masukkan 3 ml isopropanol/metanol/air untuk membuat bagian separating
menjadi garis lurus. Tunggu selama 5-10 menit sampai sisa campuran
separating gel di dalam gelas kimia membeku. Buang keluar isopropanol/
metanol/air. Selanjutnya tambahkan TEMED dan 10% APS ke campuran
stacking gel. Campur dengan baik dan masukan kedalam kaca antara sampai
memenuhi batas atas kemudian masukan sisir gel sesuai dengan keinginan
(sisir untu 10, 15, 20 sumur sampel) dan kembali tunggu sampai sisa
campuran stacking gel didalam gelas kimia membeku (sekitar 5-15 menit).
Gambar 5.7 Garis batas antara separating gel dan stacking gel

8. Setelah selesai keluarkan dari kaset penjepit dan bungkus dalam tissue basah
dan masukan kedalam plastik dan disimpan dalam 40C sampai digunakan
(lama penyimpanan yang dianjurkan 3-6 hari).

5.2 Contoh Prosedur Pembuatan Gel untuk SDS-PAGE


Contoh persiapan gel 10%
1. Separating gel 10% dibuat dengan cara :
- Siapkan gelas kimia 50 mL
- Masukkan 2,87 mL air mili-Q
- Masukkan 2,31 mL polyacrilamide 30%, homogenkan
- Masukkan 1,75 mL resolving buffer, homogenkan
- Masukkan 70 L SDS 10%, homogenkan
- Masukkan 50 L APS 10%, homogenkan
- Masukkan 8 L TEMED, homogenkan
- Segera tuang larutan kedalam plate pembentuk gel menggunakan
mikropipet 1 ml (dijaga jangan sampai terbentuk gelembung udara)
sampai batas garis yang terdapat pada plate
- Perlahan tambahkan air diatas larutan gel dalam plate agar permukaan gel
tidak bergelombang.

2. Biarkan gel memadat selama kurang lebih 30 menit (ditandai dengan


terbentuknya garis transparan diantara batas air dan gel yang terbentuk)
setelah itu, air yang menutupi separating gel dibuang.
3. Setelah separating gel memadat, stacking gel 5% disiapkan dengan cara yang
sama pada prosedur diatas dengan volume larutan:
- Air Mili-Q 1,71 mL
- Polyacrilamide 30% 0,51 mL
- Stacking buffer 0,75 mL
- SDS 10% 30 L
- APS 10% 25 L
- TEMED 4 L
4. Kemudian tuang stacking gel.
5. Pasang sisir tempat memasukkan sampel, kemudian biarkan beberapa lama
hingga gel memadat.
6. Lepas sisir
7. Gel dalam plate dipasang pada alat elektroforesis
8. Tuang 1x running buffer sebanyak 800 mL.
BAB VI
WESTERN BLOT-ELEKTROFORESIS

6.1 Gel Elektroforesis


Loading/isi lubang-lubang pada SDS-PAGE dengan jumlah protein yang
sama (setelah diukur menggunakan tekni Bradford atau berdasarkan kesesuaian
jumlah lysis buffer yang digunakan). Pada lubang pertama, isi dengan protein
marker yang akan menunjukkan berat molekul protein.

Gambar 6.1 Contoh protein marker dan sampel pada SDS-PAGE

6.1.1 Prosedur Elektroforesis


Injeksi sampel dan running :
1. Pasang gel kedalam dudukan elektroforesis, masukkan 1x running buffer
sampai menutupi permukaan gel sesuai batas yang dianjurkan.
2. Sampel (hasil denaturasi protein) dimasukkan 10-15 L kedalam sumur SDS
gel yang telah disiapkan.
3. Atur voltase kontrol running SDS-PAGE selama 30 menit dengan tegangan 80
V teruskan sampai semua sampel terkumpul pada batas bawah stacking gel.
4. Setelah sampel memasuki batas separating gel, naikkan voltase secara
bertahap ke 100 V, 120 V hingga 150 V dan lanjutkan selama 1 jam sampai
sampel menyentuh dasar gel.

Gambar 6.2 Elektroforesis SDS-PAGE

Prosedur teknis elektroforesis SDS-PAGE:


1. Pasangkan gel kedalam alat elektroforesis dalam posisi yang benar dan
keluarkan sumur sampel. Kunci dengan benar dan rapi.
Gambar 6.3 Alat elektroforesis SDS-PAGE

2. Periksa setiap sudut kunci dan pastikan terkunci dengan baik dan tidak bocor,
Setelah memastikan tidak ada yang bocor, masukkan sampel 5-15 L setiap
sumurnya masukkan ladder protein sebanyak 3-5 L pada sumur yang paling
kanan atau kiri sebagai marker. Tutup dan sambungkan listrik pada voltase 80
V selama 20 menit.

Gambar 6.4 Bagian sudut alat elektroforesis SDS-PAGE dalam keadaan


terkunci

3. Setelah menyentuh bagian separating gel (sekitar 20 menit), naikkan voltase


ke 150 V, dan lanjutkan elektroforesis selama 1 jam sampai menyentuh bagian
bawah dari gelas gel.

Gambar 6.5 Sampel protein (berwarna biru) pada separating gel

4. Jalankan elektroforesis sampai garis sampel menyentuh bagin bawah dari gela
gel

Gambar 6.6 Sampel protein (berwarna biru) berada pada bagian bawah
6.2 Transfer Protein/Blotting
Membran yang dipakai untuk western blot bisa berupa Nitrocellulose (NC)
membrane atau Polyvinylidene difluoride (PVDF).
Catatan untuk sediaan PVDF: Sediaan membran disimpan PVDF dalam keadaan
tidak aktif. Untuk mengaktifkannya, membran PVDF direndam dalam larutan
metanol selama 1 menit kemudian dicuci dengan menggunakan transfer buffer.
Transfer protein dapat dilakukan dengan tiga cara:
1. Wet blot

Gambar 6.7 Alat transfer protein wet blot

2. Semi dry blot

Gambar 6.8 Alat transfer protein semi dry blot

3. Dry blot

Gambar 6.9 Alat transfer protein dry blot

6.2.1 Prosedur Transfer Protein/blotting

Gel hasil SDS-PAGE


- Ditransfer menggunakan alat Blotting dengan membuat sandwich dengan
urutan sebagai berikut :
Katoda (-)
Sponge pad (kasa)
Filter paper (kertas saring)
Gel
Membrane (sebelumnya dibasahi dengan metanol pa. dan transfer
buffer filter paper)
sponge pad
Anoda(+)
Keterangan :
Sponge pad, filter paper, dan membrane direndam terlebih dahulu dalam
transfer buffer.
- Nyalakan alat blotting selama 30 menit, 200 mA

Keberhasilan proses transfer dapat dicek dengan menggunakan Ponceau S


staining, setelah proses transfer protein dari gel ke membran selesai, staining
bersifat reversible. Ponceau S dapat dihilangkan dengan mencuci membran
menggunakn 0,1 NaOH selama 1 menit.
Prosedur teknis transfer protein/blotting:
1. Basahi kasa dengan 1x transfer buffer yang sudah diencerkan dari 10x
transfer buffer ditambah denga metanol 20% (lihat lampiran)

Gambar 6.10 Kasa (sponge pad) dibasahi dengan 1 x transfer buffer


2. Letakkan urutan dengan benar, filter paper (2 lembar), dan basahi kembali
dengan 1 x transfer buffer.

Gambar 6.11 Filter paper diletakkan diatas kasa


3. Setelah selesai proses elektroforesis (garis sampel menyentuh bagian bawah
gel), buka gelas kaca, pisahkan kaca dan potong gel di perbatasan stacking gel
dan separating gel.

Gambar 6.12 Gel hasil elektroforesis SDS-PAGE

4. Buang dengan hati-hati bagian stacking gel menggunakan scraper plastik.

Gambar 6.13 Bagian stacking gel dibuang menggunakan scraper plastik.


5. Balikkan permukaan kaca dengan gel menghadap ke permukaan membran,
tekan ke bawah bagian gel perlahan sampai menyentuh permukaan filter
paper yang sudah dibasahi oleh 1x transfer buffer.

Gambar 6.14 Cara meletakan gel pada filter paper


6. Secara perlahan gerakan kaca menjauh dari gel sampai seluruh permukaan gel
menempel pada filter paper.

Gambar 6.15 Cara melepaskan kaca dari gel yang menempel

7. Buka membran PVDF dengan hati-hati, jangan sentuh bagian membran,


pegang membran menggunakan pembungkusnya.

Gambar 6.16 Cara memegang membran PVDF


8. Pegang dengan menggunakan kedua tangan dan letakan tepat diatas gel

Gambar 6.17 Cara meletakkan membran PVDF diatas gel

9. Letakkan kembali kertas filter (2 lembar), gunakan roller untuk memastikan


tidak ada ruangan udara yang terjebak diantara membran dengan gel,
membran dengan filter paper, pastikan setiap menaruh layer siramkan 1x
transfer buffer diatasnya.

Gambar 6.18
Proses rolling untuk menghilangkan udara yang terjebak diantara
membran dan gel

10. Terakhir letakkan filter paper di lapisan yang paling atas dan lakukan rolling
lagi (lakukan dengan perlahan namun merata saat melakukan rolling)

Gambar 6.19 Proses rolling pada kasa filter

11. Lipat dengan baik dan kunci (jangan sampai sandwich membran dan gel
keluar dari kaset). Review jangan sampai terbalik susunan sandwich
membran.

Gambar 6.20
Kaset berisi sandwich membran gel dalam posisi terkunci
12. Masukkan kaset yang sudah berisi sandwich membran gel ke tempat di dalam
alat blotting. Hati-hati dengan arah memasang, pastikan negatif di arah negatif
dan positif di arah positif. Gunakan stylus magnetic untuk menyebarkan
peningkatan temperatur selama blotting dan jangan lupa memasukkan es pada
tempat yang sudah disediakan.

Gambar 6.21
Cara memasukkan kaset berisi sandwich membran gel ke dalam alat blotting

13. Tampak dari atas, setelah disusun berurutan. Masukkan 800 mL 1x transfer
buffer dan siap untuk di-running pada 200 mA selama minimal 1 jam.

Gambar 6.22 Posisi kaset sandwich membran gel dari atas alat blotting

14. Posisi alat diatas magnet styler, dan biarkan menyala

Gambar 6.23 Proses transfer protein/blotting

15. Pisahkan gel dan membran, pastikan marker sudah berpindah ke membran
PVDF dan gel terlihat bening transparan

Gambar 6.24 Hasil proses transfer protein/blotting


16. Inkubasi dengan Ponceau S staining bisa dengan atau tanpa mixer selama 1-5
menit. Kemudian cuci dengan air bersih sebanyak 1 kali 5 menit.

Gambar 6.25 Proses Ponceau S. staining

Gambar 6.26 Hasil Ponceau S staining

17. Gunting membran seukuran yang diinginkan untuk menghemat penggunaan


antibodi saat inkubasi dengan antibodi primer dan antibodi sekunder.
Kemudian cuci dengan menggunakan TEST/PBST sebanyak 3 kali selama 5
menit.

6.3 Deteksi Protein dengan Antibodi


1. Antibodi pertama (primary antibody) dilarutkan ke dalam blocking solution
(dapat dibuat dari susu skim ataupun BSA). Inkubasi membran dengan
antibodi pertama dapat dilakukan selama 1 jam pada suhu ruangan ataupun
overnight pada suhu 40C.
2. Setelah inkubasi, membran dicuci dengan cairan TBST/PBST sebanyak 3 kali,
masing-masing selama 5 menit.
Campuran blocking solution dengan antibodi pertama dapat disimpan pada
suhu 40C selama 2 minggu untuk dapat digunakan kembali.

Kemudian, lakukan inkubasi membran dengan antibodi kedua (secondary


antibody) sesuai dengan hasil optimasi atau rekomkendasi pengenceran yang
perusahaan pembuat. Inkubasi dilakukan selama 1 jam dalam suhu ruangan
diikuti dengan tahap pencucian dengan TBST/PBST selama 5 menit sebanyak
3 kali. Antibodi kedua ini biasanya berikatan dengan molekul fluoresce atau
enzim seperti Alkaline Phosphatase (AP) atau Horseradish Peroxidase (HRP).
Cara deteksi yang paling sering digunakan adalah dengan menggunakan enzim
AP atau HRP.

6.3.1 Prosedur Teknis Deteksi Protein dengan Antibodi


1. Proses blocking membran dengan menggunakan blocking solution khusus
dengan konsentrasi 1-5% dalam TBST/PBST pada suhu ruangan selama 60
menit.

Gambar 6.27 Proses blocking membran menggunakan blocking solution

2. Setelah selesai proses blocking, cuci membran dengan TBST/PBST selama 5


menit dan dilakukan berulang sebanyak 3 kali.
3. Tambahkan primary antibody solution (dilusi sebanyak 1.000 sampai 2.000
kali, tergantung kepada keterangan antibodi dari perusahaan), kemudian taruh
dalam mesin pengocok atau shaker dan inkubasi 4 semalam (overnight)
4. Cuci dengan buffer TBST atau PBST (0,1%) selama sebanyak 3 kali 5
menit.
5. Kemudian langkah selanjutnya tambahkan secondary antibody solution
(secondary antibody sangat kuat sehingga dilusinya harus lebih besar 10.000
sampai 15.000 kali dilusi), kemudian diinkubasi pada suhu ruangan selama 1
jam.
6. Cuci dengan buffer TBST/PBST selama sebanyak 3 kali 5 menit.
7. Deteksi pita protein dengan mereaksikan dengan chemiluminescence reagent
dibawah mesin pendeteksi, bisa menggunakan sistem panjang gelombang,
sistem pendeteksian infrared, atau menggunakan film negatif.
Gambar 6.28 Tahap pewarnaan imunologi dengan antibodi

6.4 Deteksi Protein Target


Membran dideteksi dengan berbagai cara seperti kolorimetri,
chemiluminescence atau fluorescence.

Gambar 6.29 Prinsip deteksi protein pada western blot

Chemiluminescence akan muncul saat substrat kimia dikatalisasi oleh


enzim (AP atau HRP), dan menghasilkan cahaya sebagai produk tambahan.
Cahaya ini akan ditangkap oleh x-ray film atau Charge-coupled Device (CCD)
imager.
Keuntungan sistem chemiluminescence dibandingkan dengan metode lain
adalah sistem deteksi yang cepat dan sensitif.

6.4.1 Deteksi secara Kolorimetri


Bergantung pada inkubasi western blot membran dengan menggunakan
substrat yang bereaksi dengan reporter enzyme (contohnya peroksidase) yang
akan berikatan dengan secondary antibody. Reaksi tersebut akan merubah
pewarna terlarut menjadi warna yang berbeda dan akan mewarnai membran.
Dengan mencuci dengan buffer maka akan membersihkan membran dari pewarna.
Konsentrasi protein akan diukur secara densitometri atau spektrofotometri.

6.4.2 Deteksi secara Chemiluminescence


Bergantung pada inkubasi dengan substrat yang berluminasi ketika
diekspos pada reporter antibodi sekunder. Dibutuhkan kamera dan mesin khusus
(CCD kamera) yang dapat mengangkat gambar digital dari western blot membran
atau film negatif.
Gambar 6.30 Salah satu tipe gel documatation machine

Gambar 6.31 Infrared detection system machine

6.4.3 Deteksi secara Radioaktif


Penggunaan film negatif dalam western blot perlahan mulai ditinggalkan
karena kesulitan dalam mendapatkan perhitungan kuantifikasi yang akurat.
Mendeteksi menggunakan radioaktif tidak memerlukan substrate enzyme,
tetapi dengan menggunakan media film x-ray, sudah mulai banyak ditinggalkan
karena sampah yang berbahaya bagi kesehatan yang ditimbulkan akibat
penggunaan metode ini.

Gambar 6.32 Deteksi menggunakan film negatif (secara radioaktif)

6.4.4 Deteksi secara fluorescence


Probe yang sudah dilabel fluorescence agent kemudian dieksitasi oleh
cahaya dan emisi eksitasinya di deteksi oleh fotosensor seperti CCD kamera.
Teknik fluorenscence secara kuantifikasi kurang sensitif dibandingkan
chemiluminescence.
Contoh hasil visualisasi dari western blot dapat dilihat dari gambar berikut
ini :
Gambar 6.33 Deteksi protein target dengan chemiluminescence
(Ronny, et al. Endocrinology, 2016)

Gambar 6.34 Chemiluminesence reagent biasanya terdiri dari reagen A dan B


BAB VIII
WESTERN BLOT-ANALISIS HASIL

7.1 Image-J
Setelah mendapatkan gambaran protein level ekspresi, kita harus
menghitung density protein yang kita teliti. Salah satu dari sekian banyak software
analisis data foto western adalah Image-J. Software ini gratis, dan mudah dalam
pengoperasiannya.
Image-J (http://rsb.info.nih.gov/ii/) adalah salah satu quantitative image
analysis tool yang handal dan sangat berguna dalam dunia riset. Freeware yang
dikembangkan dengan basis bahasa pemrograman java ini memiliki jumlah
pengguna yang terbilang banyak dan latar belakang keilmuannya pun beragam,
sebut saja bio science, material, fluid mechanics adalah beberapa contohnya.

Gambar 7.1 Tampilan software Image-J

Tampilan menu utama:


Image-J ini dikembangkan pertama kali oleh institusi riset kesehatan
ternama di Amerika yaitu Nacional Institute of Health (NIH). Aplikasi ini juga
mendukung multi operation system platform (Linux, Mac, dan Windows/32 dan
64 bit).
Image-J dapat digunakan untuk fungsi-fungsi dasar pengolahan citra yang
sangat berguna, seperti: binary operation, first order image processing seperti
histogram, image measurement, fast fourier transform (FFT) serta masih banyak
lagi yang lain.
Tidak terbatas pada tersedianya fungsi-fungsi dasar pengolahan citra,
terima kasih pada banyaknya pengembang aplikasi ini, tidak sedikit fungsi-fungsi
pengolahan citra tingkat lanjut pun tersedia, seperti particle image velocimetry
(PIV) yang banyak digunakan oleh orang-orang yagn menekuni bidang
eksperimental mekanika fluida.
Link untuk mendownload Image-J:
http://rsb.info.nih.gov/ii/download.html
BAB VIII
WESTERN BLOT-TROUBLE SHOOTING

Masalah yang sering dihadapi pada saat western blot :


1. Tidak ada band
2. Gambaran band tidak jelas (sinyal lemah)
3. Extra band
4. High background
5. Diffuse band
6. Band berwarna putih
7. Bintik-bintik gelembung pada membran

8.1. Tidak ada Band


Permasalahan Saran
Antibodi Antibodi memiliki kemampuan yang rendah untuk
mengikat protein target.
Disarankan untuk meningkatkan protein (2-4 kali lipat
lebih tinggi daripada konsentrasi awal)
Antibodi kehilangan aktivitas.
Konfirmasi dengan Dot Blot
Jumlah protein yang Tambahkan jumlah protein yang ditaruh di dalam gel.
tidak cukup Konfirmasi kebeadaan protein dengan metode lain.
Gunakan kontrol positif (protein rekombinan, cell line
atau sel yang diberi perlakuan khusus).
Hasil transfer buruk Basahi PVDF membran dengan metanol, atau
nitrocellulosemembrane dalam transfer buffer.
Sebagian protein Tambah waktu transfer.
tertinggal pada saat Protein dengan berat molekul tinggi membutuhkan waktu
transfer lebih lama untuk ditransfer ke membran.
Untuk memastikan proses transfer telah berjalan
maksimal, warnai membran dengan Ponceau S, Amido
Black atau Indian Ink.
Over transfer Kurangi volt atau waktu transfer untuk protein dengan
berat molekul rendah.
Titik isoelektrik >9 Gunakan buffer lain yang mengandung pH tinggi seperti
CAPS (pH 10,5).
Antibodi kedua yang Konfirmasi host species dari antibodi dan pe IgG dari
tidak sesuai antibodi pertama
Penyimpanan Cek tanggal kadaluwarsa.
antibodi terlalu lama Pesanan bodi yang baru
Penyimpanan Ikuti petunjuk penyimpanan antibodi yang diberikan
antibodi yang tidak perusahaan.
tepat
Kontaminasi Sodium Pastikan buffer tidak mengandung Sodium Azide karena
Azide dapat mengganggu signal HRP.
Waktu inkubasi Tambah waktu inkubasi hingga 12 jam dalam suhu 40C
antibodi pertama
terlalu singkat

8.2 Gambaran Brand Tidak Jelas (Sinyal Lemah)


Permasalahan Saran
Ikatan antibodi dan Kurangi jumlah pencucian dengan TBST.
protein lemah Kurangi konsentrasi NaCl pada blottingbuffer yang
digunakan untuk tahap pencucian membran (target 0,15-
0,5 M)
Jumlah antibodi Reaksi antibodi terhadap protein target rendah.
tidak cukup Tambah konsentrasi antibodi (2-4 kali konsentrasi awal)
Jumlah protein tidak Tingkatkan jumlah protein total
cukup
Konjugat tidak aktif Campurkan enzim dan substrat di dalam tube.
Jika tidak ada warna terbentuk, berarti reaksi lemah.
Buat campuran baru atau pakai reagen yang baru
ECL lemah atau Ganti dengan ECL baru
sudah lama disimpan
Susu skim dikenali Kurangi konsentrasi susu dalam blocking solution atau
antibodi sebagai ganti dengan 3% BSA.
protein target
8.3 Extra Band
Kemungkinan masalah Saran
Ikatan tidak spesifik pada Kurangi konsentrasi antibodi.
primary antibody Kurangi jumlah protein yang akan diisi ke dalam
gel.
Gunakan antibodi yagn bersifat monospesifik
Ikatan tidak spesifik pada Buat kontrol menggunakan secondary antibody
secondary antibody saja, jika masih ada band maka ganti secondary
antibody.
Gunakan secondary antibody monospesifik
Ikatan tidak spesifik dari Tambahkan 0,1-0,5 Tween 20 pada larutan
primary atau secondary primary atau secondary antibody.
antibody Gunakan 2% susu skim pada blotting buffer.
Sesuaikan konsentrasi antibodi dengan cara
menaikkan atau menurunkan konsentrasi.
Tambahkan jumlah tahap pencucian.
Tambahkan konsentrasi NaCL pada blotting
buffer yang digunakan untuk melarutkan antibodi
dan untuk pencucian.
Tambahkan konsentrasi Tween 20 pada blotting
buffer yang digunakan untuk tahap pencucian
(0,15-0,5%).
Agregasi pada sampel Tambahkan konsentrasi DTT untuk memastikan
berkurangnya ikatan disulfida (20-100 mM DTT)
Panaskan di water bath 5-10 menit sebelum
dimasukkan pada gel.
Lakukan sentrifugasi singkat
Degradasi dari protein yang Kurangi pembekuan atau pencairan sampel.
akan dianalisis Tambahkan protease inhibitor pada sampel
sebelum penyimpanan.
Buat sampel baru.
Kontaminasi reagen Cek apakah buffer terkontaminasi.
Buat reagen baru.

8.4 High Background


Kemungkinan masalah Saran
Ikatan non spesifik dari Gunakan bodi monospesifik.
primaryantibody Tingkatkan konsentrasi susu skim pada blocking
buffer (5%).
Kurangi konsentrasi antibodi
Ikatan non spesifik dari Buat kontrol menggunakan secondary antibody
secondary antibody saja, jika masih ada band maka ganti secondary
antibody.
Blocking tidak cukup Mulai dengan konsentrasi susu skim 5%, 0,1-
0,5% Tween 20, 0,15-0,5 M, 25 mM Tris (pH
7,4).
Tambahkan waktu inkubasi
Sesuaikan konsentrasi.
Blocking overnight pada suhu 40C akan
mengurangi efisiensi blocking karena kerja
detergen terganggu pada suhu rendah

Susu skim mengandung Ganti dengan 3% BSA


protein target
Susu skim mengandung bio Ganti dengan 3% BSA
endogen yang tidak cocok
dengan avidin/streptavidin
Proses pencucian tidak Tambahkan tahap pencucian.
cukup Tingkatkan konsentrasi Tween20 pada wash
buffer (0,1 0,5%)
Ikatan tidak spesifik pada Tambahkan konsentrasi NaCl pada larutan
primary antibody primary antibody dan blotting buffer yang
digunakan untuk pengenceran primary antibody
dan tahap pencucian (rekomendasi 0,15 0,5 M).
Kurangi waktu exposure
Jika sinyal protein target terlalu tinggi, tunggu 5-
10 menit dan foto ulang.

8.5 Diffuse Band


Kemungkinan masalah Saran
Jumlah protein terlalu Kurangi jumlah protein yang ditaruh di dalam gel.
banyak di dalam gel

8.6 Band Berwarna Putih (ECL method)


Kemungkinan masalah Saran
Sinyal yang terbentuk Kurangi konsentrasi dari antibodi atau protein
terlalu banyak

8.7 Bintik-bintik dan Gelembung pada Membran


Kemungkinan masalah Saran
Kontaminasi reaksi Periksa buffer untuk kemungkinan kontaminasi
bakeri.
Buat buffer baru.
Larutan tidak cukup pada Pastikan membrane terendam seluruhnya pada
proses inkubasi dan proses pencucian dan inkubasi antibodi
pencucian
Adanya gelembung udara Perlahan singkirkan gelembung udara. Terutama
yang terperangkap pada pada tahap transfer.
membran
Kecepatan pengocokan yang Perhatikan kecepatan proses pengocokan dengan
tidak sama menggunakan rocker atau shoker.
Agregasi HRP Gunakan filter untuk menyaring agregat
Exposure terlalu lama Kurangi waktu exposure

8.8 Kesalahan yang sering dalam Western Blot


Ada kemungkinan bahwa secondary antibody bereaksi dengan protien yang
tidak diinginkan. Sehingga hasil false positif.
Teknik yagn tidak optimal dapat menyebabkan adanya gelembung udara
pada saat transfer protein dari gel ke membran bisa menimbulkan gangguan
pada proses inkubasi dan gambaran band yang tidak jelas.
Jika waktu transfer terlalu singkat, protein dengan berat molekul tinggi
akan tertinggal di gel.
Konsentrasi metanol yang terlalu tinggi pada transfer buffer akan
menurunkan efisiensi dari proses transfer protein dari gel ke membran.

Prosedur teknis elektroforesis SDS-PAGE (invitrogen) :


1. Pasangkan gel ke dalam tangki dalam posisi yang benar dan keluarkan sisir
sumur sampel. Kunci dengan benar dan rapi.

Gambar 6.35 Alat elektroforesis SDS-PAGE


2. Periksa setiap sudut kunci dan pastikan terkunci dengan baik dan tidak bocor.
Setelah memastikan tidak ada yang bocor, masukkan sampel 5-15 L setiap
sumurnya dan masukan ladder protein sebanyak 3-5 L pada sumur yang
paling kanan atau kiri sebagai market. Tutup dan sambungkan listrik pada
voltase 80 vlt selama 20 menit.
3. Setelah menyentuh bagian separang gel (sekitar 20 min), naikkan voltase ke
150 V, dan lanjutkan elektroforesis selama 1 jam sampai menyentuh bagian
bawah dari gelas gel.

Gambar 6.36 Sampel protein (berwarna biru) pada separang gel


4. Jalankan elektroforesis sampai garis sampel menyentuh bagian bawah dari
gelas gel.

Gambar 6.37 Sampel protein (berwarna biru) berada pada bagian bawah gel
DAFTAR PUSTAKA

Abcam. General western blot protocol, Guidance for running an efficient and
accurate experiment.

Bayer, E. A. and Wilchek, M. 1980. The use of the avidin-biotin complex as a tool
in molecular biology. Method Biochem Anal 26, 1-45.

Blake, M. S, et.al. 1984. A rapid, sensitive method for detection of alkaline


phosphatase-conjugated anti-body on Western Blots. Anal Biochem 136, 175-
179.

Chaiet, L. & Wolf, F.J. 1964. The properties of streptavidin, a biotin-binding


protein produced by Streptomyces. Arch Biochem Biophys 106, 1-5.

Gallagher, S. Curr. 2008. Immunoblotting and immunodetection. Protoc. Cell Biol,


10.8.1-10.8.28.

Guesdon, J-L. et. al. 1979. The use of avidin-biotin interaction in


immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem 27, 1131-1139.

Hawkes, R. et. al. 1982. A dot-immunobinding assay for monoclonal and other
antibodies. Anal Biochem 119, 142-147

Hsu, S. M., et. al. 1981. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in


immuno-peroxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled
antibody (PAP) procedures. J Histochem Cytochem 29, 577-580.

Kurien, B. T. & Scofield, R. H. 2003. Protein blotting: a review. J Immunol


Methods 274 , 1-15.

Ronny, et. al. 2016. Thyroid Hormone S mula on of Autophagy Is Essential for
Mitochondrial Biogenesis and Activity in Skeletal Muscle. Endocrinology.
157(1):23-38.

Thermo Scientific Fisher. Western Blot Protocol.

Tsang, V. C, et. al. 1985. Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot (EITB). In


Enzyme-Mediated Immunoassay. T.T. Ngo and H.M. Lenhoff, eds. (New York:
Plenum press), pp. 389-414.

V Wautot., et. al. 2000. Expression analysis of endogenous menin, the productivity
multiple endocrine neoplasia type 1 gene, I cell lines and human tissue.
International Journal of Cancer, 85(6), 877-881.
LAMPIRAN 1 Resep Buffer
Type Lysis Buffer
Tris-HCl Buffer 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 Untuk membuat bahan
dasar running dan
transfer buffer
Tris-Triton buffer 10 mM Tris, pH 7,4 Biasanya digunakan
100 mM NaCl untuk tujuan spesifik
1 mM EDTA mengekstraksi
1 mM EGTA sitoskeletal protein
1% Triton X-100
10% glycerol
0,1% SDS
0,5% deoxycholate
NP-40 150 mM NaCl Sitoplasma, protein
1% NP-40 (atau Triton-X) membran atau
50 mM Tris pH 8.0 keseluruhan protein sel
RIPA buffer (Radio 150 mM NaCL Buffer ini merupakan
immuno Precipitation 1% NP-40 (atau Triton-X) pilihan untuk mengambil
Assay) 0,1% SDS seluruh protein sel atau
50 mM Tris pH 8,0 protein membran. Tetapi
dapat mengganggu
interaksi protein,
sehingga tidak dapat
dipakai untuk prosedur
imunopresipitasi
LAMPIRAN 1 Resep Buffer
SDS PAGE Electrophoresis Buffer:
Running Buffer (10x) 35 mM SDS (10,08 g)
250 mM Tris (30,3 g)
1,92 M Glycine (144 g)
25 mM Tris (3,03 g)
192 mM Glycine (14,4 g)
20 mM Tris pH 7,5 (20 ml, of a 1 L solution)
150 mM NaCl (30 mL of a 5 M Solution
Blotting Buffer 25 mM Tris
190 mM Glycine
20% Metanol
Ukur dan sesuaikan pH 8,3
Washing Buffer 25 mM Tris pH 7,4
3,1 mM KCl
140 mM NaCl
0,05 Tween 20
Blocking Solution 10 mL of T-TBS 1x tambahkan 0,5 g susu skim
Stripping Buffer 10 mL -mercaptoethanol
200 mL SDS 10%
137 mL Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8
Tambahkan H2O hingga volume menjadi 1 L.
LAMPIRAN 2. Resep SDS-PAGE Gel
Tabel Formula SDS PAGE Gel :
A. Separating Gel (total 5 ml)
7% 8% 9% 10% 12,5% 15%
30% Acrylamide 1,16 mL 1,33 mL 1,50 mL 1,66 mL 2,08 mL 2,50 mL
H2O 2,48 mL 2,32 mL 2,15 mL 1,98 mL 1,57 mL 1,15 mL
1,5 M Tris (pH 8,8)/ 1,25 mL 1,25 mL 1,25 mL 1,25 mL 1,25 mL 1,25 mL
Resolving Buffer
10% SDS 50 L 50 L 50 L 50 L 50 L 50 L
10% APS 50 L 50 L 50 L 50 L 50 L 50 L
TEMED 5 L 5 L 5 L 5 L 5 L 5 L

B. Stacking gel

1 stack 2 stack 3 stack 4 stack


(2 ml) (4 ml) (6 ml) (8 ml)
30% Acrylamide 340 L 680 L 1.020 L 1,36 L
H2O 1,36 mL 2,72 mL 4,08 mL 5,44 mL
1,5 M Tris (pH 8,8)/ 250 L 500 L 750 L 1 mL
Resolving Buffer
10% SDS 20 mL 40 mL 60 mL 80 L
10% APS 20 L 40 L 60 L 80 L
TEMED 2 L 4 L 6 L 8 L
LAMPIRAN 3 Contoh hasil pengambilan Gambar Western Blot

1.

Kekurangan :
Mencuci kurang bersih dan lama, masih ada unspecific bounding protein
di sekitar pita protein.
Konsentrasi antibodi primer yang kurang tinggi.

2.

Kekurangan :
Exposure yang kurang lama, sehingga gambar kurang tajam
Dilusi antibodi pertama dan kedua yang kurang tinggi.

3.

Kekurangan :
Mencuci kurang lama dan frekuensinya kurang
Blocking buffer yang tidak optimal (bisa susu atau yang lain)
Antibodi ini seharusnya hanya ada 1 tetapi muncul ada 2 pita (antibodi
kurang spesifik)
4.

Contoh hasil western blt membran yang baik.


INDEX

A N
Alkaline Phosphotase (AP), 30 Nitrocellulose (NC), 1, 19
Northen blot, 1
B
Bca, 8 P
Bicinchoninic acid assay, 8 Polyvinylidene difluoride (PVDF), 1, 19
Blot, 1 Precast gel, 11
Primary antibody, 30
C Protein marker, 17
Charge-coupled Decice (CCD), 32 Protealysis, 5

D R
Diozobenzyloxymethyl (DBM), 1 Reporter enzyme, 32
Diazophenylthioeter (DPT), 1
Dry blot, 21 S
E Secondary antibody, 30
Eastern Blot, 1 Semi dry blot, 20
F Separating gel, 13
folin ciocalteu, 7 Smith assay, 8
H Snap freeze, 6, 9
Home made gel, 11 Southern blot, 1
Horseradish Peroxidase (HRP), 30 Stacking gel, 13
I U
Image-J, 36 Uji Bradford, 6
L
Lowry, 7 W
Lysis buffer, 5 Western blot, 2
Lysis solution, 6 Wet blot, 20