RESUME

Auxins reverse plant male sterility caused by

high temperatures

Kelompok 1

Rahmi Masita (0910910064)

Rikza Hakin (0910910066)

S. Fatiyatur Rahmah (0910910070)

PENDAHULUAN

Proses reproduksi tumbuhan diancam oleh perlukaan temperature tinggi (High

Temperature/ HT)yang disebabkan oleh global warming. Penggunaan tanaman menunjukkan
peningkatan temperature yang secara prinsip mempengaruhi fase awal dari perkembangan
anthera, menyebabkan perkembangan premature melalui meiosis sel-sel induk dan penahanan
proliferasi dan degradasi premature sel-sel dinding anthera. Sterilitas dari jantan yang utuh
bisa dihasilkan dari temperature yang meninggi selama 4 hari atau lebih panjang ketika
mereka terjadi selama fase awal perkembangan anthera, karena gagalnya butir polen.
Sterilitas jantan disebabkan oleh aborsi perkembangan polen yang diobservasi secara luas
diantara spesies tumbuhan stress temperature yang lain seperti tomat, dan Arabidopsis. Auxin
adalah fitohormon yang mengatur banyak proses perkembangan dan fisiologis. Dia juga
diketahui bahwa HT menstimulasi elongasi hipokotil termediasi auxin pada Arabidopsis.
Triptofan aminotransferase yang mengkode gen TAA1/TIR2 termasuk pada satu dari
beberapa jalur biosintetik auxin yang dibutuhkan untuk elongasi. Ekspresi gen ini secara
positif diatur dengan peningkatan temperature pada hypokotil, kotiledon, dan akar. Dua
sitokrom Arabidopsis P450s, CYP79B2 dan CYP79B3, diimplikasikan pada jalur lain dari
triptofan yang tergantung biosintesis auxin via intermediate indole-3-acetaldoxine (IAOx),
juga memainkan peranan pada elongasi hipokotil. Tambahannya, ekspresi YUCCA flavin
monooksigenase diimplikasikan pada biosintesis IAOx dengan perbedaan jalaur yang secara
sementara dan spasial dikontrol pada perkembangan anthera. Pada Arabidopsis, double atau
triple mutan yang termasuk yuc2 dan yuc6, secara komplet kehilangan fertilitas jantan dan
membentuk stamen yang pendek kekurangan butir polen. secara menarik, fenotip mutan ini
sama dengan perlukaan HT pada perkembangan reproduksi jantan, dimana HT secara umum
meningkat kan level auxin pada jaringan lain tertentu. Penelitian ini menggunakan Barley dan
Arabidopsis untuk menguji efek peningkatan suhu pada ekspresi auxin endogen dan gen
YUCCA seperti aplikasi auksin exogen untuk melawan sterilitas jantan yang disebabkan HT.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Peningkatan Temperatur Mereduksi Auksin Endogen dan Respon Auksin pada Anther
yang sedang Berkembang
Hubungan antara suhu tinggi dengan respon auksin pada tanaman diukur level auksin
endogen dan aktivitas sinyal transduksi auksin tersebut. Tanaman yang digunakan ada dua
jenis, yaitu barley dan Arabidopsis. Pada Barley diketahui bahwa suhu tinggi dapat
menyebabkan pengurangan level auksin pada sel-sel anther. Padahal, pada tanaman kontrol,
auksin terakumulasi secara melimpah pada sel-sel penyusun anther seperti sel parietal,
epidermal dan sel-sel spora serta pada sel-sel rachis yang berada di sekitar pembuluh vascular
(vascular bundle). Ada dua perlakuan yang dilakukan pada tanaman barley ini, yaitu tanaman
yang dipapar suhu tinggi (31C) selama 3 hari dan selama 5 hari. Tanaman barley yang diberi
perlakuan HT (High Temperature) selama 3 hari menunjukkan pengurangan level auksin
yang sangat signifikan, sehingga hanya tersisa 52,9% di sel-sel anther tersebut. Sedangkan
tanaman barley yang diberi perlakuan HT selama 5 hari, level auksin yang tersisa hanya
39,4%.
Tanaman Arabidopsis yang digunakan pada penelitian ini ialah tanaman Arabidopsis
rekombinan yang mengekspresikan -glucuronidase dengan gen DR5-GUS dan ARF19-GUS.
DR5-GUS merupakan gen yang mengkode respon tumbuhan terhadap respon sintesis.
Sedangkan ARF19-GUS merupakan gen yang mengkode respon tumbuhan terhadap auksin
endogen. Tanaman Arabidopsis diberi dua macam perlakuan, yaitu pemberian suhu 31C dan
33C selama 7 hari. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tanaman yang terkena suhu tinggi
mengalami pemendekan stamen. Stamen pada Arabidopsis yang terkena HT 33C lebih
pendek dibandingkan dengan Arabidopsis kontrol dan terkena HT 31C. Sinyal transduksi
auksin juga berkurang seiring dengan peningkatan suhu tinggi. Sebaliknya pada bagian lain
dari tanaman Arabidopsis selain anther, yaitu gynoecium misalnya, peningkatan suhu
menyebabkan terjadinya peningkatan level auksin endogen dalam sel-sel gynoecium tersebut.

Efek Temperatur Tinggi Pada Ekspresi Gen Biosintesis Auxin Yucca

Untuk mempelajari HT pada ekspresi auxin tertentu tekait gene, maka digunakan
stereomikroskopi untuk membedah anthera Arabidopsis pada langkah 9. RT-PCR dari
YUCCA gen YUC2 dan -6 menunjukkan represi yang signifikan sehari setelah temperature
dinaikkan sampai 33OC. Setelah 3 hari dari 33OC, ekspresi YUC6 direduksi lebih banyak.
Ekspresi TAA1/TIR2 direduksi setelah 3 hari. Pada kontrol tanaman, ekspresi auxin diinduksi
gene IAA1 menjadi lemah pada langkah 9. Namun, ekspresi IAA1 menurun sekitar 50%
dibawah kondisi HT. Walaupun diberi perlakuan HT selama 3 hari, tidak dapat dideteksi
banyak perubahan pada ekspresi Reseptor auxin gene TIR1 atau ARF6 dan 8 yang mana
termasuk dalam produksi asam jasmonat dan pematangan bunga, pada anthera di langkah 9.
Dibawah kondisi normal gen YUCCa barley unigene Nos.31993 dan 5729 di HarVEST :
versi Barley 1.68 Assembly No. 35, menunjukkan peningkatan ekspresi selama
perkembangan awal panicles, tapi peningkatan pengaturan dari ekspresi No.31993 tidak
dideteksi dan beberapa ekspresi No.5729 dihambat sampai 60% level normal dengan
peningkatan temperature (Gambar 4B dan C).
 Studi Arabidopsis yang lalu telah dilaporkan bahwa auxin berdampak pada
pematangan polen, pertumbuhan filament, dan dehiscence anthera. Auxin banyak
dibiosintesis pada perkembangan sel-sel anthera pada bunga langkah 8-11, dengan respon
auxin memulai untuk muncul setelah tahap 9. Biosintesis auxin gen YUC2 dan -6 adalah
terekspresi secara kuat pada sel-sel anthera, inaktivasi mereka memulai untuk stamen yang
pendek, dan jarang memproduksi banyak polen. Pada perkembangan sel-sel anthera
Arabidopsis dan Barley, ekspresi gene biosintesis auxin rentan pada peningkatan
temperature. Ekspresi direduksi pada gen ini mungkin karena anthera yang spesifik auksin
telah habis dan pengurangan respon auxin.

Hasil sebelumnya juga menunjukkan HT yang menginduksi ekspresi auxin merespons

gene pada perkecambahan barley tapi tidak di panicles. Tambahan, gambar 1-3 menunjukkan
efek berlawanan dari HT pada kedua level auxin endogen dan sinyal auxin diantara
perkembangan sel-sel anthera dan jaringan lain, khususnya sekitar sel-sel vascular, mereka
menurunkan sebelumnya dan meningkatkan setelahnya. Efek HT pada level auxin muncul
pada jaringan tanaman yang berbeda. Selanjutnya transport auxin dan persepsi mutan
menunjukkan reduksi pada panjang filament tapi hanya mendesak efek moderat pada
pematangan polen dan dehiscence anthera pada Arabidopsis. Demikian juga, aplikasi auxin
yang mentransport inhibitor tidak berdampak pada pewarnaan DR5-GUS di anthera. Hasil ini
menunjukkan biosintesis auxin endogen pada perkembangan anthera adalah factor utama
yang responsible untuk HT yang menyebabkan aborsi polen dan reduksi auxin. Berdasarkan
hal tersebut, tumbuhan toleran HT mungkin diperoleh dari pengontrolan gene biosintesis
auxin yang spesifik pada anthera.

Untuk menguji bagaimana pemberian auksin eksogenus dapat mempengaruhi luka

akibat HT pada perkembangan awal anther, diaplikasikan 10^-6, 10^-5, atau 10^-4 M IAA
(alami) atau NAA(sintetik) atau 2,4-diklorophenoxyacetic acid. kontrol atau larutan yang
mengandung auksin yang juga mengandung 0,1% DMSO dan ,1% Tween 20. larutan barley
pada pagi hari ke 18, 191, 21, dan 23. Pada tahap selanjutnya, anther tumbuhan kontrol
tumbuh sebesar 2,99+/-0,05mm. Sedangkan anther tumbuhan yang dipapar suhu tinggi hanya
tumbuh sebesar 1,48/-0,04mm dan tidak mengandung bulir pollen (gmbar 5) dan tingkat
pengaturan biji. Terlepas dari komponen auksin yang digunakan, pemberian auksin
mengembalikan panjang anther sebesar 1.82.5mm, bulir polen dewasa dan tingkat
pengaturan biji. meskipun anther berkembang secara normal dengan pemberian 10^-4M 2,4-
D, tetapi terdapat efek negatif berupa premature blighting dari daun dan rusaknya biji yang
telah masak. Dua pemberian auksin pada hari 19 dan 21 telah cukup untuk mengembalikan
perkembangan anther dibawah kondisi suhu tinggi. Telah diamati repressi transkripsionaldari
hubungan gen-gen yang berpengaruh termasuk faktor replikasi DNA MCM5 dan proliferasi
sel. Gambar 7. Apex masing-masing Arabidopsis inflorescens dispray satu kali dengan 10-7
atau 10-6 M solusi IAA atau NAA mengandung 0.1% DMSO hanya setelah peningkatan
temperature sampai 31OC. tujuh hari setelah temperature dinaikkan, perlukaan HT dihasilkan
secara significant mereduksi perpanjangan stamen, dimana tumbuhan yang diberi perlakuan
auxin, reduksi ini bisa ditekan tergantung dosis yang digunakan (gambar 7). Hasil ini secara
jelas menunjukkan bahwa reduksi auxin specific jaringan jantan bisa dibalikkan dengan
aplikasi auxin exogen. Fenomena ini dikonserved tidak hanya pada monocotil dan juga
dikotil.

METODE

Tanaman dan Kondisi Pertumbuhan

Tanaman Barley yang akan diberi perlakuan ditumbuhkan pada growth cabinet pada
suhu 20C (siang hari) dan 15C (malam hari), dengan fotoperiodisme selama 16 jam.
Perlakuan HT (High Temperature) dimulai pada saat tanaman memasuki fase daun lima, yaitu
pada saat ujung daun kelima muncul. Tanaman tersebut kemudian ditumbuhkan pada suhu
30C (siang) dan 25C (malam) selama 3-5 hari. Tanaman lain yang digunakan ialah
Arabidopsis thaliana yang ditumbuhkan pada suhu 23C dalam growth chamber dengan lama
fotoperiodisme 16 jam. Kondisi cahaya diatur dengan intensitas 6080 E/m2 per sekon.
Untuk mempelajari efek temperature terhadap perkembangan organ reproduksi, dipantau
infloresense primer yang ditranfer ujung tanaman dalam growth chamber pada suhu 31 dan
33 C.
Aplikasi Auksin
Semua ujung dari tanaman Barley disemprot dengan 6 ml larutan kontrol, yaitu 107,
106, 105, atau 104 M larutan yang mengandung auksin (0,1% DMSO dan 0,1% Tween
20. Auksin alami, IAA atau auksin sintetik, NAA, diberikan pada waktu pagi hari. Pada
perlakuan untuk tanaman Arabidopsis, tidak dilakukan penambahan Tween 20. Selain itu,
untuk tanaman Arabidopsis juga disemprot dengan larutan auksin 0,1 ml pada pagi hari
sewaktu suhu dinaikkan. Panjang stamen dan morfologi polen diobservasi pada bunga yang
telah dewasa 7-11 hari setelah dilakukan peningkatan suhu. Sepuluh hingga 12 tanaman
ditanam dalam satu pot dan dalam tiap perlakuan digunakan 3 pot tanaman tersebut. Tiap seri
dari penelitian ini dilakukan dengan tiga kali ulangan.
Distribusi IAA diuji pada perkembangan panicle awal setelah diperlakukan dengan
atau tanpa HT selama 3 hari. IAA dideteksi dengan antibody monoclonal IAA : panicles
diprefix selama 2 jam pada EDAC di temperature ruang, ditransfer ke FAA 24 jam pada 4 OC,
didehidrasi dengan ethyil alcohol, dicuci dengan buthyl alcohol, dan ditempelkan di paraffin,
diiris dengan microtome, dan ditaruh di MAS yang melapisi gelas objek, setelah dikeringkan
semalaman pada 42OC kemudian dideparafinasi dengan xylene dan dihidrasi dengan ethanol.
Diinkubasi dengan PBS mengandung Tween 20, glisin dan BSA selama 45 menit pada 22 OC,
sample dibilas dengan larutan garam biasa dan dicuci dengan PBS yang mengandung BSA
untuk menghilangkan larutan Tweennya. Setelah antibody monoclonal ditambahkan pada
masing-masing gelas objek, sample diinkubasi semalaman pada chamber lembab di
temperature ruang. Setelah hibridisasi, sample dicuci berseri, dua kali dengan larutan garam
tinggi, kemudian satu kali dicuci dengan larutan garam biasa. Alexa 488 yang terkonjugasi
kambing antibody IgG tikus ditempatkan pada masing-masing gelas objek dan diinkubasi
selama 4-6 jam pada chamber lembab di temperature ruang. Setelah dicuci dengan larutan
garam biasa dua kali selama 15 menit, diberi reagean anti luntur ditutup dengan gelas
penutup dan diamati dengan mikroskop fluorescent. Intensitas sinyal fluorescent diukur
dengan Image J software.