PRACTICA DE LABORATORIO N09

RECUPERACIN DE LOS PRODUCTOS FINALES DE UN BIOPROCESO

INDUSTRIAL
I. INTRODUCCION
La separacin y purificacin de un producto biotecnolgico es una parte crtica del
proceso de produccin. Las operaciones de separacin (downstream processing),
constituyen una parte importante del costo del producto y, en algunos casos, son el costo
principal.

Los caldos de fermentacin son mezclas acuosas complejas de clulas (insolubles)

productos extracelulares solubles, productos intracelulares y sustratos no convertidos.
Las operaciones de separacin para la recuperacin del producto dependen de la
localizacin del producto (intracelular, extracelular), de las propiedades del mismo
(tamao, carga, solubilidad, as como de la escala del proceso y el valor del producto

II. OBJETIVO
- Conocer las tcnicas de separacin de las partculas provenientes de un vio
reactor
- Conocer los mtodos de desintegracin de micro organismos
- Conocer los mtodos de aislamiento y purificacin

III. MARCO TEORICO.

1. Separacin de insolubles
Se utilizan las operaciones de filtracin, sedimentacin (floculacin) y
centrifugacin para la separacin de material insoluble (biomasa) de caldos de
fermentacin en que la biomasa se encuentra en forma no retenida
(inmovilizada).
La seleccin de una u otra operacin depende de la escala de operacin, la
localizacin y la selectividad de los productos. La floculacin y la sedimentacin
se utilizan fundamentalmente en los procesos de depuracin biolgica de aguas
residuales y en la produccin de protenas biolgicamente activas.
En la prctica, se usa frecuentemente la centrifugacin para recuperar productos
intracelulares, y la filtracin cuando el producto deseado es extracelular.La
facilidad de la separacin depende tambin de la naturaleza del caldo de
fermentacin, pH y la temperatura y, en muchos casos, deben aadirse
coadyuvantes de filtracin (como las tierras de diatomeas y las perlitas), agentes
floculantes, etc.
1.1 floculacin y flotacin
En la floculacin se producen grandes agregados que sedimentan mucho ms
rpidamente ya que la velocidad de sedimentacin de una partcula aumenta con
su dimetro (ley de Stokes).
Aplicacin: para clulas aisladas en el rango de tamao de 1 a 10 m que
sedimentan solo muy lentamente y son difciles de precipitar incluso con la
centrfuga.
En la mayor parte de los casos se aade un agente floculante, sal inorgnica,
polielectrolitos orgnicos o hidrocoloides minerales.
 La floculacin depende tanto del agente floculante empleado como de otros
factores como la naturaleza de las clulas, de los constituyentes inicos as como
su concentracin.
La floculacin puede ocurrir reversiblemente si las cargas sobre la superficie de
la clula pueden neutralizarse por iones de carga opuesta, e irreversiblemente si
se forman, entre las clulas, puentes de molculas polimricas cargadas.
Se utilizar la flotacin si no se forma un flculo suficientemente denso, y es el
proceso reverso a la floculacin.
La flotacin se consigue introduciendo gas en el lquido. Las pequeas burbujas
de gas adsorben y atrapan a las clulas y suben a la capa de espuma en la parte
superior del recipiente donde pueden ser recogidas y sacadas del biorreactor.

1.2 Filtracion
Algn tipo de proceso de filtracin es lo ms frecuente se lleve a cabo en la
primera etapa en el proceso de recuperacin.
Los dos principales tipos de filtros son los filtros en profundidad y filtros en
superficie; en ambos casos la fuerza motriz es la presin, sea creada por
sobrepresin o por vaco.

- Filtro a la superficie
Los filtros de superficie funcionan interceptando en forma directa las
partculas ms grandes que el tamao poroso del medio. La suciedad
queda atrapada en el lado ascendente del medio con la capacidad de
almacenamiento limitada por la cantidad de poros del medio. Cuando el
medio es nuevo, su resistencia al flujo es pequea, pero a medida que el
filtro acumula contaminantes, dicha resistencia aumenta rpidamente.
Dependiendo del tamao de las partculas que sean filtradas se
reconocen tres tipos principales de procesos de filtracin:
1. Osmosis reversa, para partculas de 0,0001 a 0,001 m
2. Ultrafiltracin, para partculas de 0,001 a 0,1 m
3. Microfiltracin, para partculas de 0,1 a 10 m
Las posibilidades de los procesos de ultrafiltracin y smosis reversa
se dan generalmente en trminos del peso molecular del tamao de corte.
- Filtro de tabor rotatoria al vaco
Los filtros de tambor del vaco tienen un campo del uso
amplio, entre otros en el refinamiento del mineral,
hidrometalurgia, industria metalurgia, qumica y
farmacutica, transformacin de los alimentos y
tratamientos de agua residuales.
Los filtros de un vaco de tambor rotatorio son un filtro
continuo en donde el componente solido en una pulpa p
una mezcla es separado por una tela filtrante porosa u
tros medios girada a travs de la pulpa o de la mezcla,
con el vaco aplicado a la superficie interna para hacer
los slidos acumular en la superficie con una torta o
capa a travs de las ecuaciones de dibuje el liquido.(
http://www.abhishekfilter.com/spanish/Rotary_Vacuum_Drum_Filter.htm)

1.3 Centrifugacion
La centrifugacin es la separacin de sustancias de diferente densidad mediante
movimiento giratorio.
 La centrifugacin es una operacin unitaria cuyo objetivo es separar elementos
de una mezcla (sean slidos de lquidos o lquidos de lquidos) debido a la
diferencia de densidad, por efecto de la aceleracin centrfuga. Aumentando el
efecto de sedimentacin por gravedad.
A travs de este procedimiento se separan materiales de diferente densidad
aplicando una fuerza superior a la de la gravedad.
En los bioprocesos se utiliza para:
- Separar clulas del caldo de fermentacin
- Eliminar desechos celulares
- Recoger precipitados
- Recuperacin de productos insolubles

Tipos de centrifugacin
- Centrifugacin diferencial: Se basa en la diferencia en la densidad de las
molculas.1 Esta diferencia debe ser grande para que sea observada al
centrifugar. Las partculas que posean densidades similares sedimentarn
juntas. Este mtodo es inespecfico, por lo que se usa como centrifugacin
preparativa para separar componentes en la mezcla (por ejemplo, para
separar mitocondrias de ncleos y membrana) pero no es til para separar
molculas.
- Centrifugacin isopcnica: Partculas con el mismo coeficiente de
sedimentacin se separan al usar medios de diferente densidad. Se usa para
la separacin de ADN con mucha frecuencia.
- Centrifugacin zonal: Las partculas se separan por la diferencia en la
velocidad de sedimentacin a causa de la diferencia de masa de cada una.
La muestra se coloca encima de un gradiente de densidad preformado. Por
la fuerza centrfuga las partculas sedimentan a distinta velocidad a travs
del gradiente de densidad segn su masa. Se debe tener en cuenta el tiempo
de centrifugacin ya que si se excede, todas las molculas podran
sedimentar en el fondo del tubo de ensayo.
- Ultracentrifugacin: Permite estudiar las caractersticas de sedimentacin
de estructuras subcelulares (lisosomas, ribosomas y microsomas) y
biomolculas. Utiliza rotores (fijos o de columpio) y sistemas de monitoreo.
Existen diferentes maneras de monitorear la sedimentacin de las partculas
en la ultracentrifugacin, el ms comn de ellos mediante
luz ultravioleta o interferones.
https://es.wikipedia.org/wiki/Centrifugaci%C3%B3n
2. Aislamiento y purificacion
2.1 CROMATOGRAFA
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin para la caracterizacin de
mezclas complejas, la cual tiene aplicacin en todas las ramas de la ciencia. Es
un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin selectiva, cuyo
objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo
identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Diferencias
sutiles en el coeficiente de particin de los compuestos da como resultado una
retencin diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separacin
efectiva en funcin de los tiempos de retencin de cada componente de la mezcla.
La cromatografa puede cumplir dos funciones bsicas que no se excluyen
mutuamente:
- Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos ms puros y que
puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas sntesis).
 - Medir la proporcin de los componentes de la mezcla (finalidad
analtica). En este caso, las cantidades de material empleadas son
pequeas. (diapos)

2.2 EXTRACCION
La aplicacin ms importante de la extraccin lquido-lquido en procesos
biotecnolgicos se encuentra en la produccin de antibiticos. Se utiliza
una extraccin en mltiples etapas con acetato de amilo o de butilo como
disolvente.
Uno de los equipos ms utilizados en extraccin en continuo en la
industria de antibiticos es el extractor centrfugo de Podbielniak, que
contiene secciones de mezcla y sedimentacin.
Debido a la desnaturalizacin que pueden sufrir las enzimas y otras
protenas en medios orgnicos, se han desarrollado sistemas de separacin
por extraccin utilizando dos fases acuosas inmiscibles. Estas fases
pueden obtenerse disolviendo dos polmeros incompatibles, siendo los
ms utilizados polietilenglicol (PEG) y dextrano. Una de las principales
aplicaciones de estos sistemas es la separacin de protenas.
- Extraccin con solvente orgnico
La extraccin con solventes es una tcnica de tratamiento que
consiste en usar un solvente (un lquido capaz de disolver otra
sustancia) para separar o retirar contaminantes orgnicos
peligrosos de fangos residuales, sedimentos o tierra. (El fango
residual es un material parecido al barro que se forma a partir de
desechos industriales o cloacales; los sedimentos son fragmentos
de rocas y minerales de grano fino que se han depositado en el
fondo de una masa de agua, como un ro o un lago.) La extraccin
con solventes no destruye los contaminantes, sino que los
concentra para que sea ms fcil reciclarlos o destruirlos con otra
tcnica(https://clu-in.org/download/remed/spansolv.pdf)
- Cristalizacin y precipitacin
Es el mejor mtodo para la purificar sustancias slidas y tambin para
separa un soluto solido disuelto en un disolvente liquido.
http://agrega.juntadeandalucia.es/repositorio/10022015/32/es-
an_2015021013_9133810/33_cristalizacin_y_precipitacin_sl.html
 https://es.slideshare.net/hindirana/mezclas-y-sustancias-puras-6020331

2.3 Desecacin
El secado del material bilgico es en muchos casos el mtodo final por el que los
productos son llevados a una forma estable adecuada para su manejoo y
almacenamiento.
La sensibilidad al calor de la mayor parte de los productos biolgicos significa
que los conducen a la eliminacin del agua con elevacin minima de temperatura.
2.4 Rendimiento

IV. CONCLUCION
V. CUESTIONARIO
1. Qu mtodos se emplean para separar partculas a nivel molecular?
Describa brevemente

Floculacin

Flotacin: es el proceso reverso a la flotacin. Esta flotacin se

consigue introduciendo gas en el liquido.

Filtracin: se utiliza para la separacin de biomasa, precipitados amorfos

o productos cristalinos. La filtracin de caldos de fermentacin producidos
en procesos discontinuos de volumen reducido, se suele llevar a cabo en
filtros prensa convencionales de placa y marcos, en los que queda retenida
la biomasa, que se recupera a continuacin.
 Por otra parte, en separaciones a mayor escala se utilizan
fundamentalmente filtros continuos, como el filtro de tambor rotatorio. La
operacin de este tipo de filtros est muy automatizada, por lo que los
costos de mano de obra son bajos.

centrifugacin: es la separacin de sustancias de diferentes

densidades mediante movimiento giratorio.
La centrifugacin, es una operacin unitaria cuyo objetivo es separar
elementos de una mezcla (sean slidos de lquidos o lquidos de lquidos)
debido a la diferencia de densidad, por efecto de la aceleracin centrfuga.
Aumentando el efecto de sedimentacin por gravedad

2. En qu consiste la desintegracin de los microorganismos? qu

mtodos se utilizan? Describe brevemente

Mtodo quimico

- Tratamiento con lcalis o acido: siempre y cuando el producto

sea estable a PH estremos.

- Tratamiento con solvente organico: riesgo de desnaturalizacin

de las proteinas

- Tratamiento con detergentes: solubilizan las membranas

celulares. Son caros, desnaturalizan las proteinas, contaminantes

Mtodo biolgico: los mas utilizados son lisis enzimtica

- Bacterias gram (+): lisozima

- Bacterias gram (-): lisozima +AEDT

- Levaduras:B(1.3)-glucanasa, mananasa, quitinasa, autolisis.

Los tratamientos enzimticos son muy especficos y las
condiciones para la lisis suaves pero son caros
 Mtodos fsicos

- Utrasonidos: ampliamente utilizada en laboratorios pero no es

adecuado a escala industrial ppor su alto costo

- Ciclos de congelacin/ descongelacin: poco efectiva

- Molinos de bolas: se mezclan las clulas con bolas de vidrio y se

someten a una alta velocidad de mezclado en una vasija de
reaccin con refrigeracin.

- Homogeneizadores: el material biolgico se somete a una fuerte

presin hidrosttica y al presin se libera bruscamente
permitiendo que el liquido salga por una valvula.

3. En qu consiste el aislamiento y purificacin de la mezcla de productos

provenientes de un birreactor? Qu mtodos se utilizan describa
brevemente?

Los metodos que son utilizado son:

Cromatografa: es un mtodo fsico de separacin para la caracterizacin

de mezclas complejas, la cual tiene aplicacin en todas las ramas de la
ciencia
Extracion: La aplicacin ms importante de la extraccin lquido-lquido
en procesos biotecnolgicos se encuentra en la produccin de antibiticos.
Se utiliza una extraccin en mltiples etapas con acetato de amilo o de butilo
como disolvente.
Uno de los equipos ms utilizados en extraccin en continuo en la industria
de antibiticos es el extractor centrfugo de Podbielniak, que contiene
secciones de mezcla y sedimentaci

Cristalizacin y precipitacin: a baja temperatura es una forma muy

suave de purificacion. La cristalizacin se utiliza principalmente para
la purificacin de compuestos de bajo peso molecular.
Desecacin: El secado del material bilgico es en muchos casos el mtodo final
por el que los productos son llevados a una forma estable adecuada para su
manejoo y almacenamiento.
 La sensibilidad al calor de la mayor parte de los productos biolgicos
significa que los conducen a la eliminacin del agua con elevacin minima
de temperatura.

VI. BIBLIOGRAFIA