Facultad de Bioqumica, Qumica y Farmacia

Universidad Nacional de Tucumn

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

N 6

Inmunohematologa
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SISTEMAS DE GRUPOS SANGUNEOS

La expresin sistema de grupos sanguneos se asocia histricamente a los

sistemas de antgenos y anticuerpos eritrocitarios; sin embargo, el trmino es
igualmente vlido cuando se aplica a los sistemas de antgenos y anticuerpos
leucocitarios y plaquetarios.
Existen antgenos especficos, comprometidos con una nica lnea celular, como los
sistemas Rh y Kidd, localizados nicamente en la membrana de los glbulos rojos
(GR), y antgenos pluritisulares, presentes en clulas sanguneas, fluidos (saliva,
leche, liquido amnitico) y tejidos, como los sistemas ABO, Lewis (Le), Kell, Lutheran
(Lu), CD55, entre otros.

ANTGENOS ERITROCITARIOS
Se definen como antgenos (Ag) eritrocitarios a estructuras moleculares, localizadas
en la membrana del glbulo rojo, capaces de ser reconocidas por el sistema inmune
de individuos que carezcan de ellos, produciendo anticuerpos (Ac) especficos.
Estas molculas tienen distintas composiciones bioqumicas.
Antgenos glucdicos. Se forman por la adicin de glcidos sobre precursores
especficos (cadenas cortas de carbohidratos), como los grupos ABO, Hh, Lewis, Ii.
En otros, los oligosacridos se asocian a lpidos como el Ag P (glicoprotenas), o a
protenas como el Ag Lu o Ag del sistema Kell (glicoprotenas).
Antgenos proteicos. Hay Ag que forman parte de las protenas integrales de
membrana del eritrocito, la glucoforina A y B, y la banda 3, dando lugar a los Ag del
sistema MN, SsU y Diego respectivamente. Otros forman parte de protenas
estructurales como la protena Rh, Colton, Duffy (que atraviesan varias veces la
membrana del GR), o participan en el transporte de urea como los Ag del sistema
Kidd. Hay protenas que se encuentran ancladas a la membrana por lpidos como el
glicosilfosfatidilinositol (GPI), como los Ag Cromer, que son protenas reguladoras de
la activacin del complemento, denominadas factores de la aceleracin de la
declinacin (FAD, CD55).
Hay Ag que se expresan dbilmente en sangre de cordn, como los Ag del sistema
ABO (presenta un tercio de la expresin del adulto), Le, P1, Lu; otros tienen
expresin normal (como en el adulto), Ag de los sistemas Rh, Kell, Kidd, Duffy, MNS;
y Ag que tienen una expresin intensa como el i del sistema Ii.
Segn la clasificacin del comit de nomenclatura de la International Society Blood
Transfusion (ISBT), actualmente se definieron 308 Ag eritrocitarios que se
distribuyen en 30 sistemas, 3 colecciones y 2 series.
Sistemas de grupo sanguneo: sistema formado por uno o ms Ag controlados por
un nico locus o por un complejo de genes homlogos estrechamente ligados que
no recombinan durante la meiosis. A esta categora pertenecen 272 Ag. Por ejemplo
el sistema Rh est formado por 48 Ag.
Colecciones: grupo de Ag relacionados serolgica, bioqumica o genticamente,
que al momento de la clasificacin no pueden adquirir el rango de sistema. Por
ejemplo Cost, ER, Lec y Led. A esta categora pertenecen 6 Ag.
Series 700: son Ag de baja incidencia (<1%, Ag privados) que no pueden ser
incluidos en las categoras anteriores. A esta categora pertenecen 19 Ag.
Series 900: Son Ag de muy alta incidencia (>90%, Ag pblicos), los que no
pertenecen a algn sistema o coleccin. A esta categora pertenecen 11 Ag.
Con el fin de estandarizar la terminologa de los grupos sanguneos, la ISBT
denomina actualmente con letras maysculas el sistema al que pertenece, y se
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enumera secuencialmente cada Ag por orden de descubrimiento. Por ejemplo, el

sistema KELL: KEL1, KEL2 (antes cellano o k), KEL3, KEL4, KEL5.
Existen Ag que pueden ser usados como marcadores antropolgicos porque son
privativos de poblaciones de determinado origen tnico, por ejemplo el Ag Diego, de
poblaciones indgenas asiticas y sudamericanas.

ANTGENOS Y ANTICUERPOS PLAQUETARIOS

Existen varios Ag en la membrana plaquetaria, algunos se comparten con otros tipos
celulares. Los ms significativos se clasifican en tres grupos:
Ag del sistema ABO y asociados: H, I, i y P
Ag HLA de clase I
Ag plaquetoespecficos
A menudo se transfunden plaquetas sin tener en cuenta la compatibilidad ABO, en
algunos casos los Ac ABO de tipo IgG de ttulo elevado del receptor (generalmente
del grupo O) podran reaccionar con las plaquetas del donante por el Ag ABO,
reduciendo la sobrevida. Los Ac antiplaquetarios ms destacados son los dirigidos
contra los Ag HLA de clase I, compartidos por plaquetas y leucocitos, pues son los
ms relevantes en la refractariedad plaquetaria postransfusional.
El papel de los Ac antiplaquetarios se asemeja al de los Ac antieritrocitarios, ya que
pueden provocar trombocitopenia aloinmune neonatal, prpura trombocitopnica
autoinmune, trombocitopenias inmunes inducidas por droga y prpura
postransfusional tarda.

ANTGENOS Y ANTICUERPOS GRANULOCITARIOS/NEUTROFLICOS

Los Ag granulocitarios especficos, expresados en la membrana de los neutrfilos,
se denominan HNA (Human Neutrophil Alloantigens).
Las reacciones transfusionales febriles, no hemolticas, a menudo se asocian a Ac
contra el Ag HLA1 presente en granulocitos y comn a varias clulas nucleadas.

DETECCIN DE REACCIONES ANTGENO-ANTICUERPO

ERITROCITARIAS

Las determinaciones de Ag del GR y el estudio de Ac en suero se basan

principalmente en pruebas que tienen como punto final la aglutinacin de los GR. La
hemoaglutinacin es la agregacin visible de GR mediada por Ac. En ocasiones, la
unin Ag-Ac activa la va clsica del sistema del complemento, y el resultado final es
una hemlisis in vitro, lo cual se considera un resultado positivo.

ANTICUERPOS DE LOS GRUPOS SANGUNEOS

La formacin de Ac en respuesta a un estmulo antignico se denomina
sensibilizacin. Esta puede ser aloinmune si el Ag proviene de otro individuo (por
embarazo, transfusin, transplante de mdula sea), o bien autoinmune si se trata
de una sensibilizacin contra un Ag propio, sin evento inmunizante previo. Segn el
tipo de reaccin en que estn involucrados, de hemoaglutinacin o hemlisis, se
habla de Ac aglutinantes o hemolticos. Los primeros son aquellos capaces de
producir una reaccin visible de hemoaglutinacin en medio salino.

ANTICUERPOS AGLUTINANTES Y NO AGLUTINANTES

Un factor muy importante es el tipo de inmunoglobulina a la que pertenecen los Ac
reaccionantes. Se dice que un Ac es aglutinante cuando aglutina GR en solucin de
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NaCl 0,15 M (solucin fisiolgica). Si los Ac son del tipo IgM la aglutinacin se
produce directamente. Por su tamao molecular y la distribucin de los lugares de
reaccin con los Ag, pueden unirse fcilmente con varios hemates y producir su
aglutinacin (Figura N1).

FIGURA N1: Hemoaglutinacin con Ac IgM

Molcula IgM Hemates aglutinados por una IgM

Los Ac no aglutinantes se fijan a la superficie de los GR sin llegar a la formacin de

los grumos (aglutinados) que hacen visible la reaccin. La sensibilizacin de GR
por Ac de tipo IgG, generalmente no produce aglutinacin (Figura N2). Existen
excepciones que estn relacionadas al nmero y al grado de exposicin de los
determinantes antignicos como las aglutininas del ABO, el anti-D frente a GR con
fenotipos - - D - -, ccDee.

FIGURA N2: Sensibilizacin de eritrocitos con Ac IgG

Molcula IgG Hemates sensibilizados por molculas de IgG

La molcula de IgG es demasiado pequea para unirse a ms de un GR a no ser

que se introduzca alguna modificacin tcnica.

REACCIONES DE HEMOAGLUTINACIN
La especificidad y la reversibilidad son las caractersticas principales de la reaccin
Ag-Ac y las bases sobre las cuales reposan las tcnicas de inmunohematologa.
Especificidad: a cada determinante antignico le corresponde un Ac especfico, lo
que implica una estrecha complementariedad entre las estructuras reactivas del Ag y
del Ac.
Reversibilidad: se produce una reaccin bimolecular en equilibrio qumico, en la cual
es posible disociar el complejo Ag-Ac, suministrndole la energa necesaria. La
separacin de los Ac se conoce como elucin.
La reaccin de hemoaglutinacin tiene 2 etapas: sensibilizacin y aglutinacin.
1-Sensibilizacin: El Ac se une al Ag eritrocitario superficial, quedando el GR
cubierto de Ac.
Ag +Ac Ag-Ac

Esta etapa est influenciada por las siguientes variables:

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Temperatura: cada sistema Ag/Ac tiene una temperatura ptima. Las IgM
reaccionan mejor a 4C y las IgG, a 37C.
Afinidad entre Ag y Ac.
pH: el ptimo es entre 6.5 y 7.6.
Concentracin relativa del Ag y del Ac: Puede ocurrir ausencia o disminucin de
aglutinacin con grandes cantidades de Ac o Ag; situacin denominada fenmeno
de prozona y postzona respectivamente y que puede llevar falsos negativos o
reacciones dbiles (Figura N3).

FIGURA N3: Fenmeno de prozona y postzona

Con grandes concentraciones de Ac existe mayor probabilidad de que los dos sitios
de unin al Ag se unan a determinantes en una misma clula. Ante el exceso de Ag
la situacin es similar.
Fuerza inica del medio: Al disminuir la fuerza inica del medio, disminuye la nube
de iones que rodea a los GR favoreciendo la unin Ag-Ac.
Tiempo de incubacin: es el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio de
reaccin entre Ag y Ac.
2- Aglutinacin: ocurre cuando una molcula de Ac enlaza GR adyacentes
formando una red, haciendo visible macroscpicamente la reaccin. Este fenmeno
depende:
Proximidad de los GR: La superficie de los GR tiene cargas elctricas negativas
debidas a los carboxilos del cido silico unido a la glicoprotena de la membrana. Si
los GR estn en suspensin en un medio que contiene iones libres, los cationes
forman una envoltura de cargas positivas alrededor de aquellos convirtindolos en
partculas cargadas de electricidad del mismo signo, que experimentan una fuerza
de repulsin entre ellas. Esta fuerza de repulsin se denomina potencial Zeta. Se
forma entonces una doble capa compuesta por las cargas superficiales del GR y la
nube de cationes (Figura N4).

FIGURA N4: Potencial Z de los eritrocitos

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Ecuacin de Pollack
q Z: potencial zeta
Z=f q: densidad de carga superficial del eritrocito
D D: constante dielctrica del medio
: fuerza inica del medio.
Concentracin de puntos antignicos o densidad del Ag: Es decir de la cantidad de
Ag por GR.
ANTGENO COPIAS POR GR
A 1.000.000
D 9.900-33.000
E 17.900-27.500
Kell 3.500
Fy 7.000-17.000
Naturaleza del Ac interviniente: Se refiere a la clase de inmunoglobulina
involucrada. En condiciones isotnicas, los GR no pueden aproximarse a menos de
50-100 . En el caso de las lgM, el tamao de estas molculas permite la
aglutinacin directa, en medio salino isotnico. Las molculas de IgG, de menor
tamao, no llegan a cubrir esa distancia y sensibilizan sin formacin de la malla. En
este caso, se hace necesaria la utilizacin de distintas metodologas que disminuyan
la distancia entre los GR favoreciendo la aglutinacin.
IgM (SF)
n Ag-Ac (Ag-Ac)n
IgG
(Albmina, enzimas, Coombs)

MTODOS PARA DETECTAR AC NO AGLUTINANTES

Para potenciar las reacciones de aglutinacin y facilitar as la lectura e interpretacin
de los resultados se emplean diversos mtodos, que pueden consistir simplemente
en una centrifugacin controlada en cuanto a tiempo y velocidad, para favorecer la
formacin de aglutinados visibles en el momento de efectuar las lecturas. Los
mtodos a los que se puede apelar para observar aglutinacin con Ac no
aglutinantes son:

a) - Mtodos basados en modificaciones fsico - qumicas.

Afectan principalmente el potencial zeta disminuyndolo de tal forma que sea factible
la aproximacin de los GR para formar el aglutinado. Son los siguientes:
Aumento de la constante dielctrica del medio
Esto se logra agregando macromolculas como albmina, la cual se polariza en el
campo elctrico creado por los GR disminuyendo las fuerzas de repulsin entre los
mismos y alterando la tensin superficial intercelular. Todo esto favorece la
aglutinacin de GR recubiertos de Ac. Tiene escasa participacin en la etapa de
sensibilizacin.
Tratamiento enzimtico de los GR
Las enzimas proteolticas bromelina, ficina, papana y tripsina disminuyen la carga
superficial negativa de los GR por clivaje de las molculas de cido silico de las
cadenas polisacridas, con lo que disminuye q (densidad de carga superficial), y
decrece el potencial zeta. La menor repulsin entre las clulas favorece entonces su
aglutinacin. Tambin produce el clivaje de protenas que incrementan la tensin
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superficial de las clulas. Aunque estas enzimas exaltan la aglutinacin mediada por
algunos Ac (anti-Rh, anti-K, anti- Kidd), desnaturalizan ciertos Ag eritrocitarios, en
especial los M, N, S, Fya, Fyb. Es decir que las enzimas cambian la estructura
bioqumica de un Ag y su localizacin en la membrana eritrocitaria. Algunos Ag son
destruidos y otros se exaltan en la membrana eritrocitaria. Esta propiedad se utiliza
para identificar mezclas complejas de Ac y para caracterizar la especificidad del Ac
cuando su identificacin no es evidente en las pruebas serolgicas comunes.
Polietilenglicol (PEG)
Es un polmero lineal hidrosoluble usado como aditivo para aumentar la captacin de
Ac; concentra los Ac promoviendo su incorporacin y potenciando la reaccin.
Polybrene
Es un policatin de amonio cuaternario (bromuro de exadimetrina) que neutraliza la
carga negativa de los GR produciendo una agregacin reversible. Este acercamiento
de GR favorece la unin de Ac tipo IgG. Si se adiciona citrato (polianin) se
restablece la carga del GR: si el aglutinado se disocia la prueba es negativa, pero si
persiste la prueba es positiva.
Reactivos de baja fuerza inica
La fuerza inica es uno de los factores ms importantes que determinan la tasa y la
cantidad de captacin de Ac por parte de los GR. El uso soluciones de baja fuerza
inica, como SOSBI (solucin salina de baja fuerza inica) o LISS, disminuye el
tiempo de incubacin (de 60 minutos a 10-15 minutos) pues aumentan hasta en
1000 veces la afinidad entre Ag y Ac, y potencian las reacciones de los Ac sin
incrementar las reacciones inespecficas.

b) - Mtodos inmunolgicos.
Utilizan suero antiglobulina humana (SAGH), conocido tambin como suero de
Coombs o reactivo de Coombs, el cual reconoce la fraccin Fc de inmunoglobulinas
humanas. Si en una reaccin hubo correspondencia entre Ag eritrocitarios y Ac no
aglutinantes (sensibilizacin de GR), el agregado de la antiglobulina humana
reconocer los Ac fijados a la superficie eritrocitaria formando puentes entre clulas
adyacentes, permitiendo visualizar la aglutinacin.
El suero de Coombs se obtiene por inmunizacin de animales (generalmente
conejos) con suero humano. Este reactivo puede ser:
--- Poliespecfico: el que se emplea de rutina contiene dos Ac, anti-IgG y anti-C3d
(componente del complemento).
--- Monoespecfico: presenta los Ac por separado anti-IgG, anti-C3d, anti-C3b.
Cuando se tiene una reaccin positiva con el reactivo poliespecfico, luego debe
investigarse mediante los reactivos monoespecficos, el tipo de Ac y/ o fraccin de
complemento unido a los GR.

CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS

REACTIVOS HEMOCLASIFICADORES
Llamados tambin antisueros, permiten determinar el grupo sanguneo. Los
reactivos a los que nos vamos a referir son los ms utilizados en las tcnicas de
rutina del Banco de Sangre como por ejemplo anti-A, anti-B, anti-AB, anti-D, etc.
Pueden ser:
Policlonales: mezcla de Ac contra distintos epitopes de una misma molcula que se
obtiene por inmunizacin de animales o de personas sensibilizadas por
transfusiones o embarazos.
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Monoclonales: Ac dirigido contra un nico epitope que se obtienen a partir de

hibridomas.
Actualmente los reactivos hemoclasificadores que se emplean para determinar el
grupo sanguneo del sistema ABO son de origen monoclonal y son los siguientes:
anti-A, anti-B, anti-AB.
El reactivo hemoclasificador monoclonal para detectar el Ag D del sistema Rh es el
anti-D, y puede ser monoespecfico, conteniendo Ac tipo IgM, o poliespecfico,
conteniendo mezcla de IgM ms IgG (llamado blend).
Antes de emplear estos antisueros hay que realizar la valoracin de los reactivos
mediante mtodos que son semicuantitativos y que consisten en determinar los
siguientes parmetros:
Titulo y score.
Avidez
Especificidad.
a)- TTULO: es la inversa de la mxima dilucin en la que se observa aglutinacin
macroscpicamente. Al titular un Ac se puede saber hasta qu dilucin mantiene
actividad inmunolgica.
b)- SCORE o PUNTAJE: es la sumatoria de los valores asignados a la aglutinacin
de cada tubo de la titulacin, mide la intensidad de reaccin.
c)- AVIDEZ: es el tiempo en el cual se observa aglutinacin al reaccionar un Ac con
su correspondiente Ag.
d)- ESPECIFICIDAD: es la capacidad que tiene un Ac de reaccionar solamente con
su correspondiente Ag.
El ttulo, el score y la avidez pueden variar por las condiciones de almacenamiento,
contaminacin, ruptura de cadena de fro, etc.

Preparacin de las suspensiones de GR

Centrifugar 5 minutos a 3000 rpm una muestra de sangre anticoagulada con EDTA.
Eliminar el sobrenadante. Lavar los GR 3 veces con solucin fisiolgica o hasta que
el sobrenadante quede lmpido.
Para una suspensin de:
GR al 5% mezclar 50 L de GR lavados + 1 mL de solucin fisiolgica.
GR al 10% mezclar 100 L de GR lavados + 1 mL de solucin fisiolgica.

MTODO DE TITULACIN Y SCORE DE REACTIVOS PARA EL SISTEMA ABO

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Dilucin
1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512
final
Sol. Fisiol. - 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L
Antisuero
a titular
(anti-A, 100L 100L
anti-B
anti-AB)
GR 5% 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L
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Se hacen diluciones dobles progresivas en solucin fisiolgica del antisuero a titular.

A cada tubo se agrega una suspensin de GR al 5% que presenten la especificidad
antignica correspondiente al antisuero a ensayar. Es decir que si se titula:
- antisuero anti-A se usa una suspensin de GR A al 5%
- antisuero anti-B se usa una suspensin de GR B al 5%
- antisuero anti-AB se usa una suspensin de GR A GR B GR AB al 5%
Centrifugar los tubos 1 minuto a 1000 rpm.
Finalmente, se realiza la lectura siendo el ttulo la inversa de la dilucin del ltimo
tubo que presenta aglutinacin.

Resultados:
Segn normas internacionales los antisueros para el sistema ABO deben tener un
Ttulo 128. Este dato, aunque tiene valor indiscutido, es muy vago: dos reactivos
pueden tener un mismo ttulo pero aglutinar con intensidad diferente. Entonces es
importante considerar el score, que se calcula como la sumatoria de los valores
asignados a cada tubo de la titulacin de acuerdo a la intensidad de aglutinacin.
Aglutinado grumo nico ++++ : 10
Aglutinado 2 - 3 grumos +++ : 8
Aglutinado hasta 10 grumos ++ : 5
Aglutinacin fina + : 2
Si dos o ms reactivos de diferente marca, presentan el mismo ttulo, tiene mayor
sensibilidad el que presente mayor score.
Segn normas internacionales los antisueros para el sistema ABO debe tener un
Score 50.

MTODO DE TITULACIN Y SCORE DE REACTIVOS PARA EL SISTEMA Rh

Como fue indicado antes, es fundamental conocer la naturaleza del reactivo a titular
de tal forma de respetar las condiciones en que ste produce aglutinacin. Las
tcnicas que se describen a continuacin se utilizan en la evaluacin del anti-D
blend.
Investigacin de IgM (en medio salino):

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Dilucin
1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512
final
Sol. Fisiol. - 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L
Anti-D 100L 100L

GR 5% 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L

Se hacen diluciones dobles progresivas en solucin fisiolgica del antisuero a titular.

A cada tubo se agrega una suspensin de GR O Rh (D) positivo al 5%.
Centrifugar los tubos 1 minuto a 1000 rpm.
Finalmente, se realiza la lectura siendo el ttulo la inversa de la dilucin del ltimo
tubo que presenta aglutinacin.
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Investigacin de IgM ms IgG

Se procede en forma idntica al caso anterior, pero luego del agregado de los GR se
adiciona a cada tubo una gota de solucin de bromelina o albmina al 6%. Se incuba
10 minutos a temperatura ambiente, luego se centrifuga 1 minuto a 1000 rpm y se
lee la aglutinacin.

Investigacin de IgG
Es necesario hacer un tratamiento previo del anti-D a titular con 2-Mercaptoetanol,
reactivo capaz de disociar las molculas de IgM en fracciones que no tienen
actividad inmunolgica. Para ello, en un tubo de hemIisis se colocan 2 gotas de
anti-D ms 2 gotas de 2-Mercaptoetanol, se incuba 15 minutos a 37 C.
Se procede a titular realizando las diluciones doble progresivas del anti-D tratado y
se contina en forma idntica al caso anterior. Si no se dispone de bromelina se
puede hacer una prueba de Coombs indirecta.

Resultados:
Segn normas internacionales los antisueros para el sistema Rh deben tener un
Ttulo 32, y un Score 50, que se determina como fue explicado para el sistema
ABO.

AVIDEZ DE LOS REACTIVOS PARA LOS SISTEMAS ABO Y Rh

En una placa de vidrio colocar 1 gota de antisuero y a 1 cm de distancia colocar

50L de una suspensin de GR al 10% que presenten la especificidad antignica
correspondiente al antisuero a ensayar. Es decir:
- antisuero anti-A se usa una suspensin de GR A al 10%
- antisuero anti-B se usa una suspensin de GR B al 10%
- antisuero anti-AB se usa una suspensin de GR A GR B GR AB al 10%
- antisuero anti-D se usa una suspensin de GR O Rh (D) positivo al 50%
Mezclar con una varilla y disparar simultneamente el cronmetro. Medir el tiempo
de aglutinacin.

Resultados:
Segn normas internacionales los antisueros para el sistema ABO deben tener una
Avidez 8 segundos, y para el sistema Rh, 30 segundos.

ESPECIFICIDAD DE LOS REACTIVOS PARA EL SISTEMA ABO

En tres tubos de hemlisis se enfrentan 100L de anti-A con 100L de suspensiones

de GR A, GR B y GR O al 5%, respectivamente. Mezclar suavemente.
Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm y leer.
Se procede a repetir de igual manera para los antisueros anti-B y anti-AB.

Resultados:
Si el antisuero aglutina slo los GR del grupo para el que presenta especificidad, el
resultado es el adecuado. Por ejemplo el anti-A solo debe aglutinar GR A.
Tubo Anti-A Anti-B Anti-AB
GR A 5% + - +
GR B 5% - + +
GR O 5% - - -
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ESPECIFICIDAD DE REACTIVOS PARA EL SISTEMA Rh

En un tubo de hemlisis se enfrentan 100L de anti-D con 100L suspensin de GR

O Rh (D) positivo al 5% (Genotipo Fisher-Race: DCe/dce, Nomenclatura Wiener:
R1r). En otro tubo de hemlisis se enfrentan 100L de anti-D con 100L suspensin
de GR O Rh (D) negativo al 5% (Genotipo Fisher-Race: dce/dce, Nomenclatura
Wiener: rr).
Mezclar suavemente. Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm y leer.

Resultados:
El antisuero debe aglutinar slo los GR O Rh (D) positivo.

DETERMINACIN DE GRUPOS SANGUNEOS

Las reacciones de hemoaglutinacin pueden ser realizadas en tubo o en placa.

Ambas tcnicas son de igual naturaleza, aunque la reaccin en tubo es ms sensible
ya que la centrifugacin a bajas revoluciones por minuto de los tubos favorece la
aproximacin de GR sensibilizados y su aglutinacin.

TIPIFICACIN DEL SISTEMA ABO

Consideraciones del Sistema ABO

Debido a que el sistema ABO involucra la presencia de Ag en GR (aglutingenos) y
de Ac naturales en plasma (aglutininas) (Figura N5), la tipificacin del mismo se
realiza mediante un mtodo directo que detecta los aglutingenos, y un mtodo
indirecto o inverso que identifica las aglutininas plasmticas.

FIGURA N5: Sistema ABO

Plasma Ac

Prueba directa en placa o portaobjeto

Tcnica menos precisa que en tubo, pero es de utilidad cuando se desea conocer
con urgencia el grupo sanguneo.
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Muestra: sangre entera anticoagulada con EDTA o suspensin de GR al 40% en

solucin fisiolgica.
Reactivos: Anti-A, Anti-B, Anti-AB
Tcnica:
1. Colocar 1 gota de cada uno de los antisueros en un portaobjeto limpio y seco.
2. Colocar 50uL de la suspensin de GR a 1 cm de distancia.
3. Mezclar utilizando una varilla diferente para cada reactivo, extender y balancear la
placa suavemente en forma circular durante 2 minutos observando presencia o
ausencia de aglutinacin.

Prueba directa en tubo

Muestra: suspensin de GR 5%
Reactivos: Anti-A, Anti-B, Anti-AB
Tcnica:
Marcar 3 tubos: A, B y AB
1- Agregar 1 gota de cada antisuero en el tubo correspondiente.
2- Colocar 50L de la suspensin de GR 5% en estudio a cada tubo.
3- Mezclar suavemente. Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
4- Resuspender suavemente el botn celular observando la presencia o ausencia de
aglutinacin.

Interpretacin de la prueba directa

GR vs. Antisuero
Grupo sanguneo
Anti-A Anti-B Anti-AB
- - - O
+ - + A
- + + B
+ + + AB

Prueba inversa
Como las aglutininas a investigar no tienen gran avidez, la tcnica no se realiza en
placa sino en tubo, pues tiene mayor sensibilidad.
Muestra: suero del paciente.
Reactivos: suspensin de GR A, B y O al 3-5%, comerciales o preparados en el
laboratorio.
El uso de GR O tiene por objeto controlar la especificidad de la aglutinacin, al
carecer de Ag para el sistema ABO, estos GR no deben aglutinar (control negativo).
Si hubiera aglutinacin, la reaccin no es vlida.
Tcnica:
1. Rotular tres tubos como A, B y O.
2. Colocar 100 L de suero del paciente en cada tubo.
3. Agregar 50 L de la suspensin de GR A en el tubo A, 50 L de GR B en el
tubo B y 50 L de GR O en el tubo O.
4. Mezclar suavemente y centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
5. Resuspender suavemente los GR observando la presencia o ausencia de
aglutinacin. En algunos casos se observa hemlisis, lo cual se interpreta como un
resultado positivo.
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Interpretacin de la prueba inversa

Suero del paciente vs.
Grupo sanguneo
GR A GR B GR O
+ + - O
- + - A
+ - - B
- - - AB

La importancia de realizar ambas pruebas para cada paciente tiene por objeto
obtener un dato confiable 100%. Si existe una discordancia entre los resultados
obtenidos en ambas pruebas, puede considerarse: empleo de material sucio,
contaminacin de los reactivos, uso de una concentracin inadecuada de GR. En
estos casos hay que repetir ambas pruebas, y si persiste la discordancia, verificar el
control de calidad de los reactivos; de ser necesario tomar una nueva muestra al
paciente. Otra causa de discordancia puede deberse a la presencia de subgrupos.
Entre los individuos de grupo A, se encuentran varios subgrupos, de todos ellos se
distinguen 2 categoras: A1 (80%) y A2 (18-20%), que pueden diferenciarse usando
lectinas especficas de grupo sanguneo: Dolichos biflorus (anti-A1) y Ulex
europaeus (anti-H).
En las anemias hemoliticas autoinmunes, la prueba inversa puede dar positivo tubo
que contiene GR O por la presencia de anticuerpos anti-I en el suero del paciente,
el cual reacciona con el Ag I, presente en la mayora de los GR. En este caso hay
que preincubar a 37C el suero y los GR y realizar la prueba a 37C.
En pacientes con quimioterapia, donde se daa la membrana del GR, pueden no
coincidir la prueba directa con la inversa.

TIPIFICACIN DEL SISTEMA Rh

Consideraciones del Sistema Rh

El Sistema Rh est formado por 49 Ag, no todos con la misma distribucin y
frecuencia; los ms importantes son D, C, E, c y e.
En la prctica de rutina, el estudio del sistema Rh queda limitado a la investigacin
del Ag D, por ser el ms frecuente y el ms inmunognico.
El Ag D est compuesto por aproximadamente 37 epitopes o mosaicos antignicos,
y puede presentar variaciones cuantitativas y cualitativas (Figura N6).
----Variaciones cuantitativas del Ag D: la calidad antignica es normal pero la
densidad antignica est disminuida, es decir que no todos los individuos tienen la
misma cantidad de Ag D y no todos ellos reaccionan con la misma potencia frente al
anti-D. Antiguamente se lo conoca como Ag D dbil (Du). Hoy se prefiere el trmino
Ag D debilitado.
----Variaciones cualitativas del Ag D: en este caso existe una variante o faltan partes
de ese mosaico, es decir, faltan determinantes antignicos. Los individuos sin algn
epitope y expuestos a un Ag D completo pueden producir un aloanticuerpo anti-D
dirigido contra la parcela ausente. Este Ag se conoce como Ag D Parcial (variante D)
que puede presentarse con o sin variaciones cuantitativas asociadas, o sea que
podemos encontrar:
Ag D Parcial
Ag D Parcial Dbil
 14

FIGURA N6: Variaciones cuantitativas y cualitativas del AgD

comn

Existen 41 tipos de D parcial, distribuidos en 7 categoras y designados con nmeros

romanos (II, IIIa, IIIc, IVa, IVb, Va, VI), donde la VI es la ms importante de detectar
por ser la ms inmunognica.
Para detectar los Ag D parciales y los Ag D debilitados se requieren modificaciones
metodolgicas en las tcnicas de laboratorio, ya que no son Ag lo suficientemente
intensos para producir aglutinacin en presencia de cualquier antisuero anti-D.
Se considerar deteccin de Ag D dbiles al estudio de Ag D parciales y D
debilitado, ya que con la metodologa a emplear no se los puede diferenciar.

Prueba directa en placa o portaobjeto

Tcnica menos precisa que en tubo, pero es de utilidad cuando se desea conocer
con urgencia el grupo sanguneo.
Muestra: sangre entera anticoagulada con EDTA o suspensin de GR al 40% en
solucin fisiolgica.
Reactivos: Anti-D. Se recomienda el uso de dos reactivos distintos para ampliar el
espectro de deteccin y brindar seguridad.
Tcnica:
1. Colocar 1 gota del antisuero en un portaobjeto limpio y seco.
2. Agregar 50 L de sangre entera a 1 cm de distancia.
3. Mezclar utilizando una varilla, extender y balancear la placa suavemente en forma
circular durante 2 minutos observando presencia o ausencia de aglutinacin.
Interpretacin:
Aglutina: prueba positiva presencia de Ag D: paciente Rh (D) positivo
No Aglutina: prueba negativa no implica ausencia de Ag D, pues tambin puede
tratarse de Ag D dbiles que no son detectados por esta tcnica. En este caso es
necesario hacer un estudio de deteccin de Ag D dbiles.

Prueba directa en tubo

Muestra: suspensin de GR del paciente al 5%.
Reactivos: Anti-D. Se recomienda el uso de dos reactivos distintos para ampliar el
espectro de deteccin y brindar seguridad.
Tcnica:
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1- Agregar 1 gota de antisuero en un tubo de hemlisis.

2- Colocar 50L de la suspensin de GR 5% en estudio.
3- Mezclar suavemente. Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
4- Resuspender suavemente los GR observando la presencia o ausencia de
aglutinacin.
Interpretacin:
Aglutina: prueba positiva presencia de Ag D: paciente Rh (D) positivo
No Aglutina: prueba negativa no implica ausencia de Ag D, pues tambin puede
tratarse de Ag D dbiles que no son detectados por esta tcnica. En este caso es
necesario hacer un estudio de deteccin de Ag D dbiles

Determinacin de Ag D dbiles
Muestra: suspensin de GR del paciente 5%.
Reactivos:
--- Anti-D blend.
--- SAGH poliespecfico anti-IgG.
Tcnica:
Identificar un tubo como D y otro como C (control).
1- Agregar 1 gota de anti-D al tubo D y 1 gota de solucin fisiolgica al tubo C.
2- Colocar 50L de la suspensin de GR 5% en estudio a cada tubo.
3- Mezclar suavemente y centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
4- Resuspender suavemente los GR observando la presencia o no de aglutinacin.
Aglutina: prueba positiva presencia de Ag D: paciente Rh (D) positivo
No Aglutina: prueba negativa continuar el estudio
El tubo C no debe aglutinar.
5- Incubar 30 minutos a 37C
6- Mezclar suavemente y centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
7- Resuspender los GR observando la presencia o no de aglutinacin.
Aglutina: prueba positiva presencia de Ag D: paciente Rh (D) positivo
No Aglutina: prueba negativa continuar el estudio
El tubo C no debe aglutinar.
8- Lavar los GR 3 veces con solucin fisiolgica.
9- Despus del ltimo lavado, descartar totalmente el sobrenadante sobre papel
absorbente y agregar 1 gota del SAGH.
10- Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
11- Resuspender los GR suavemente observando la presencia de aglutinacin.
Interpretacin:
Aglutina: presencia de Ag D dbil paciente Rh (D dbil) positivo.
No Aglutina: ausencia de Ag D paciente Rh (D) negativo
En ambos casos el resultado solo es vlido si el tubo C no presenta aglutinacin.

Nota: Si la suspensin de hemates se prepara con una solucin de baja fuerza

inica (LISS), la incubacin a 37 C se reduce a 15 minutos.
Los reactivos anti-D deben contener Ac que detecten la categora DVI (por ser la
ms inmunognica de los Ag D parciales).

Importancia de la deteccin de Ag D dbiles

En el acto transfusional tener en cuenta que:
Pacientes receptores y embarazadas D dbil positivo: se consideran como Rh (D)
negativo.
 16

Donantes y recin nacidos D dbil positivo: se consideran como Rh (D) positivo.

Causas de error en la determinacin de grupos sanguneos

Resultados falso negativo

No se agreg el antisuero
No se agreg el suero del paciente.
Proporcin inapropiada de suero y de GR
Centrifugacin insuficiente.
Incubacin a ms de 20 -24C.
Interpretacin o registro incorrecto de los resultados

Resultados falso positivo

Centrifugacin excesiva
Uso de reactivos, GR o solucin salina contaminada.
Uso de material de vidrio sucio.
Interpretacin o registro incorrecto de los resultados.

PRUEBA DE COOMBS

Conocida tambin como Prueba de Antiglobulina Humana, permite detectar e

identificar inmunoglobulinas y/o componentes del complemento unidos a GR que no
pueden ser detectados por otros mtodos. Tambin se define como una prueba que
permite reconocer anticuerpos no aglutinantes. Hay 2 tipos: directa e indirecta.

PRUEBA DE COOMBS DIRECTA (PCD)

Fundamento: llamada tambin prueba de antiglobulina directa, detecta Ac y/o
componentes del complemento fijados in vivo en los GR del paciente mediante el
suero de Coombs. Es decir que la PCD se emplea para demostrar que hubo una
unin de Ac a los Ag eritrocitarios (sensibilizacin) in vivo.

FIGURA N7: Principio de la prueba de Coombs directa

GR sensibilizados SAGH Aglutinado

y lavados del paciente

Muestra: sangre entera anticoagulada con EDTA. Los GR deben ser lavados 3
veces con solucin fisiolgica, y a partir del pellet de GR se prepara una suspensin
al 3-5% en solucin fisiolgica.
Reactivo: SAGH poliespecfico
Tcnica:
1- Identificar un tubo de hemlisis como P (paciente) y otro como C (control).
2- En cada tubo colocar 50 L de la suspensin de GR en estudio.
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3- Solo al tubo P agregar 1 gota de SAGH.

4- Centrifugar ambos tubos 1 minuto a 1000 rpm.
5- Desprender los GR suavemente y ver la presencia o ausencia de aglutinacin.
Interpretacin:
-- Aglutina: PCD positiva el paciente tiene GR recubiertos (sensibilizados) in vivo
con Ac tipo IgG, complemento o ambos. Se debe realizar la PCD con SAGH
monoespecfico (anti-IgG, anti-C3d y anti-C3b).
-- No Aglutina: no se puede aseverar que la PCD sea negativa, pues el
complemento en algunas ocasiones tarda en reaccionar por lo que se dejan los
tubos incubando 10 minutos a temperatura ambiente, luego se centrifugan 1 minuto
a 1000 rpm y se desprenden los GR suavemente para ver la presencia o ausencia
de aglutinacin. Si no aglutina, la PCD es negativa. Si aglutina la PCD es positiva y
se procede a identificar que fraccin de complemento tienen los GR haciendo la
PCD con SAGH monoespecfico.

Aplicaciones de la PCD
Diagnstico de:
Anemias hemolticas autoinmunes (fras y calientes).
Enfermedad hemoltica fetoneonatal (incompatibilidad D, E, Kell, Kidd).
Anemias hemolticas inducidas por frmacos
Reacciones hemolticas postransfusionales (hemlisis aloinmune que sigue a una
transfusin incompatible).

PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA (PCI)

Fundamento: llamada tambin prueba de antiglobulina indirecta, detecta Ac y/o
componentes del complemento presentes en el suero del paciente que son fijados in
vitro a los GR durante un tiempo de incubacin (Figura N8).
Hay situaciones en que un paciente puede desarrollar Ac anti-eritrocitarios
(generalmente IgG, pero tambin hay aglutinantes) en respuesta a un estmulo
antignico (paciente sensibilizado). Estos Ac pueden permanecer circulando en el
suero del paciente sin ocasionarle ningn trastorno, a menos que se enfrente
nuevamente con su correspondiente Ag. Para ponerlos en evidencia, se utiliza la
PCI.

FIGURA N8: Principio de la prueba de Coombs indirecta

Muestra GR GR SAGH Aglutinado

(suero conocidos sensibilizados
con Ac/C3)
Como se ve, en la prueba indirecta la sensibilizacin de los eritrocitos ocurre in vitro y es
visualizada por el agregado del reactivo de Coombs.
 18

Muestra: suero del paciente.

Reactivos:
-- Mezcla de GR 0 Rh (D) positivos al 3-5% en solucin fisiolgica o en LISS. Para
asegurar la deteccin de todos los Ac clnicamente significativos, se emplea un pool
comercial o fabricado en el laboratorio de GR testigos o conocidos que expresen los
Ag ms corrientes de los principales sistemas de grupo sanguneo.
-- SAGH poliespecfico
Tcnica:
1- En un tubo de hemlisis colocar 100 L del suero del paciente y 50 L de la
suspensin de GR.
2- Incubar 30 minutos a 37C si la suspensin de GR se hizo en solucin fisiolgica.
Pero si fue hecha en LISS, incubar 10 minutos a 37C.
3- Lavar 3 veces con solucin fisiolgica. Despus del ltimo lavado, descartar
totalmente el sobrenadante sobre papel absorbente.
4- Agregar 1 gota del SAGH.
5- Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
6- Resuspender los GR suavemente observando la presencia de aglutinacin.
Interpretacin:
-- Aglutina: PCI positiva el paciente tiene Ac irregulares en el suero. Se debe
realizar la titulacin del Ac haciendo diluciones doble progresivas del suero en
solucin fisiolgica. Tambin se puede identificar el o los Ac detectados mediante el
uso de paneles de GR identificadores.
-- No Aglutina: PCI negativa

Aplicaciones de la PCI
Deteccin de Ac irregulares en suero de embarazadas, de donantes de sangre y de
pacientes con clnica de anemias hemolticas.
Identificacin de Ac irregulares.
Determinacin de Ag eritrocitarios a travs de antisueros especficos (Ag D dbiles,
Ag Kell).
Pruebas de compatibilidad pretransfusional.
Pruebas de compatibilidad conyugal.

Observaciones:
Ventajas de utilizar LISS o SOSBI
Aumenta la sensibilidad de la prueba de Coombs en la deteccin de la mayora de
los Ac de significacin clnica.
Permite detectar Ac en baja concentracin y de baja afinidad que con la tcnica
convencional pueden perderse en los lavados previos a la adicin del reactivo de
Coombs.
Permite reducir el tiempo de incubacin de la prueba de Coombs de 30-45 minutos
a 10 minutos.
Desventajas de utilizar LISS o SOSBI
La solucin LISS debe ser sometida a un estricto control de la osmolaridad para
evitar la fijacin inespecfica de complemento.
Los GR resuspendidos en LISS no pueden ser utilizados luego de las 24hs desde
su preparacin.
 19

Causas de error en la prueba de Coombs

Falsos positivos
1. Sensibilizacin eritrocitaria in vitro por efecto de Ac naturales o del complemento
cuando se mantiene la sangre durante cierto tiempo a 4C antes de su anlisis.
2. Lavado insuficiente de los GR.
3. GR autoaglutinados
4. Sobrecentrifugacin.
Falsos negativos
1. Tiempo insuficiente de la prueba que no permite alcanzar la aglutinacin
eritrocitaria.
2. Omitir incubacin de 10 minutos a temperatura ambiente para demostrar la
presencia de complemento.
3. Cuando el Ac es de naturaleza IgA, tener en cuenta que los SAGH normalmente
empleados carecen de anti- lgA.
4. SAGH de mala calidad debido a mala conservacin o contaminacin bacteriana.
5. Lavado inadecuado de los GR, lo que facilita la neutralizacin del SAGH por las
inmunoglobulinas plasmticas o el complemento.
6. Cantidad de molculas de IgG y C3d presentes en la membrana del GR por
debajo del umbral de deteccin del SAGH (150-500 molculas por clula).

Titulacin del SAGH

1. Preparacin de GR sensibilizados con anti-D de origen inmune (anti- IgG):

Realizar un pool de 3 muestras de GR O Rh(D) positivo. De all tomar 500 L
de GR lavados y mezclarlos con 500 L de suero humano con aloanticuerpos de
especificidad anti-D (de embarazada o donantes, con un ttulo entre 64 y 256).
Incubar 60 min a 37C.
Homogeneizar cada 5 minutos, para que los GR entren en contacto con los Ac
del suero.
Sacar una alcuota de 300uL de GR presuntamente sensibilizados, lavarlos 3
veces con solucin fisiolgica y realizar una suspensin al 3%.
De esa suspensin tomar 50 L y agregarle 100 L de SAGH. Centrifugar y leer.
Se debe obtener una aglutinacin tal que permita visualizar reacciones dbiles,
lo ideal es obtener una intensidad de 2+.
2. Realizar diluciones doble progresivas en S.F. del SAGH
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Dilucin
1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512
final
Sol. Fisiol. - 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L
SAGH 100L 100L - - - - - - - -

Suspensin
de GR
sensibiliza-
50L 50L 50L 50L 50L 50L 50L 50L 50L 50L
dos al 3%
.
3. Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm, leer y determinar ttulo en el tubo con la mayor
dilucin de SAGH que presente aglutinacin macroscpica.
 20

INVESTIGACIN DE CRIOAGLUTININAS.

Las anemias hemoliticas autoinmunes (AHAI) constituyen un grupo de citopenias en

las que hay una destruccin de GR por mecanismos inmunolgicos. Se denominan
autoinmunes por la presencia de Ac dirigidos contra los propios Ag eritrocitarios.
Las caractersticas serolgicas de los Ac implicados permite clasificarlos en:
AHAI por Ac calientes.
AHAI por Ac fros: - enfermedad de las aglutininas fras.
- hemoglobinuria paroxstica a frigore.
En la enfermedad de las aglutininas fras, los Ac responsables son aglutinantes
(IgM), y actan a una temperatura menor a 37C, siendo su rango ptimo entre 0C y
10C. Su especificidad est dada contra los Ag del sistema eritrocitario I i. Estos Ag
se hallan en casi todos los GR. El Ag I se encuentra en grandes cantidades en los
GR del adulto, mientras que por el contrario los Ag i son abundantes en los GR del
recin nacido. El cambio i por I tiene lugar en los primeros 18 meses de vida.

Mtodo:
Muestra:
----Suero del paciente obtenido a 37C para evitar el atrapamiento de los Ac en el
cogulo a bajas temperaturas. El tubo con sangre sin anticoagulante recin extrado
se coloca rpidamente en bao a 37C 2 horas. Separar el suero con pipeta pasteur
y centrifugar en otro tubo.
----Suspensin de GR del paciente al 5% en solucin fisiolgica.
Reactivos:
----Suspensin de GR fenotipo OI (adulto) al 5% en solucin fisiolgica
----Suspensin de GR fenotipo Oi (beb) al 5% en solucin fisiolgica.
Tcnica:
1- Realizar diluciones doble progresivas del suero del paciente en solucin
fisiolgica en tres hileras de 12 tubos cada una.
2- Enfrentar los tubos de la primera hilera con la suspensin de sus propios GR.
3- Enfrentar los tubos de la segunda hilera con la suspensin de GR OI.
4- Enfrentar los tubos de la segunda hilera con la suspensin de GR Oi.
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Dilucin
1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1028 1/2048
final
Sol.Fisiol. - 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L
Suero del - - - - - - - - - -
100L 100L
paciente

GR al 5% 50L 50L 50L 50L 50L 50L 50L 50L 50L 50L 50L 50L

5- Incubar 18 a 24 horas a 4C (tcnica de sedimentacin).

6- Sacar los tubos de la heladera de a uno por vez y observar inmediatamente la
presencia de aglutinacin ya que es reversible.
Interpretacin
Se considera positividad patolgica cuando el ttulo es igual o superior a 1/64.
 21

Nota: para preparar las suspensiones deben lavarse los GR tres veces con solucin
fisiolgica precalentada a 37C.

BIBLIOGRAFIA

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Publications. 2nd edition. 2002
Williams Hematology. Kenneth Kaushansky, Marshall A. Lichtman, Thomas J.
Kipps, Uri Seligsohn, Josef T. Prchal. 8th edition. 2010
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Laffan, S. Mitchell Lewis.11th edition. 2011
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Lpez Larrea S., Gonzlez Rodrguez S. Editorial Mdica Panamericana. 3a edicin.
2004.
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Henrys Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. Richard A.
McPherson, Matthew R. Pincus. 22th edition. 2011