BAB II

PRAKTIKUM KE IV (PEWARNAAN BAKTERI SECARA GRAM)

A. Tujuan Praktikum

Adapun tujuan praktikum mengenai pewarnaan bakteri secara gram ini antara lain

untuk memahami cara identifikasi dengan metode pewarnaan dan mikroskop.

B. Dasar Teori

Pewarnaan secara gram adalah pewarnaan yang sangat berguna dan paling banyak

digunakan dalam laboratorium mikrobiologi dan klasifikasi bakteri, karena merupakan

tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau

tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada

membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu

gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan

membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang

berada di antara dua lapis membran sel.

Karena kemampuannya membedakan suatu kelompok bakteri tertentu dari kelompok

lainnya, maka pewarnaan ini juga disebut pewarnaan diferensial.

Mikroorganisme terutama bakteri sulit dilihat dengan menggunakan mikroskop cahaya,

karena tidak mengasorbsi ataupun membiaskan cahaya.

Tehnik pewarnaan merupakan cara yang banyak dipergunakan untuk melihat struktur

dan morfologi bakteri. Terdapat beberapa tehnik pewarnaan diantaranya, pewarnaan

sederhana merupakan pewarnaan yang hanya menggunakan satu macam larutan warna

contohnya pewarnaan sederhana dan pewarnaan negative, kemudian pewarnaan diferensial,

merupakan pewarnaan yang menggunakan lebih dari satu macam larutan warna, contohnya

pewarnaan gram, pewarnaan tahan asam, pewarnaan kapsul, dan pewarnaan spora.
 Sebelum melakukan prosedur pewarnaan terhadap bakteri, terdapat beberapa hal yang

perlu diperhatikan, seperti gelas objek dibersihkan dengan menggunakan alcohol 70% untuk

menghilangkan debu atau lemak, kemudian pewarnaan diferensial terlebih dahulu dibuat

preparat, dan fiksasi dapat dilakukan dengan melewatkan preparat ulas diatas nyala api,

adapun tujuan dilakukan fiksasi antara lain untuk melekatkan sel bakteri pada objek glass,

mematikan sel bakteri dan lain sebagainya.

C. Alat dan Bahan

a. Biakan bakteri E. Coli, Streptococus, dan Pseudomonas

b. Mikroskop

c. Larutan Kristal violet

1. Kristal violet 2 gram

2. Etil alcohol 20 gram

3. Ammonium oksalat 0,8 gram

d. Larutan lugol

1. Iodine 1 gram

2. Kl 2 gram

3. Aqua dest 300 ml

e. Alcohol 96 %

f. Larutan safranin

1. Safranin 0,25 gram

2. Alcohol 95 % 10 ml

3. Aqua dest 100 ml

g. Alcohol 70 %

h. NaCl
i. Aqua dest

j. Lampu spritus

k. Jarum Ose

l. Objek glas

m. Pinset (Penjepit kayu)

D. Cara Kerja

1. Pewarnaan sederhana.

Pertama - tama membuat preparat ulas dengan cara :

1) Bersihkan kaca objek dengan menyemprotkan alcohol 70 %, kemudian lap dengan

menggunakan tisu atau kapas.

2) Pindahkan suspense bakteri dengan menggunakan jarum ose keatas kaca objek, dekatkan

dengan api spritus agar kerja berjalan steril.

3) Campur dengan NaCl hingga merata. Oleskan campuran ini diatas kaca objek.

4) Biarkan preparat mengering di udara sebentar.

5) Fiksasi diatas api spritus.

Kemudian,

6) Beri atau tetesi larutan metylen blue, diamkan sebentar sekitar 20-30 detik.

7) Zat warna dituang, kemudian bilas dengan aqua dest mengalir.

8) Preparat dikeringkan di udara,

9) Amati dengan menggunakan mikroskop.

2. Pewarnaan gram.

Pertama tama membuat preparat ulas dengan cara :

1) Bersihkan kaca objek dengan menyemprotkan alcohol 70 %, kemudian lap dengan

menggunakan tisu atau kapas.

2) Pindahkan suspense bakteri dengan menggunakan jarum ose keatas kaca objek, dekatkan

dengan api spritus agar kerja berjalan steril.

3) Campur dengan NaCl hingga merata. Oleskan campuran ini diatas kaca objek.

4) Biarkan preparat mengering di udara sebentar.

5) Fiksasi diatas api spritus.

Kemudian,

6) Beri atau tetesi larutan Kristal violet, diamkan sebentar lalu bilas dengan aqua dest mengalir.

7) Tetesi larutan lugol, diamkan sebentar lalu lunturkan dengan alcohol 96 % goyangkan

sampai tidak ada lagi zat warna mengalir di preparat.

8) Zat warna dibuang bilas dengan aqua dest mengalir.

9) Tetesi dengan larutan safranin diamkan sebentar.

10) Zat warna dibuang dengan membilas dengan menggunakan aqua dest mengalir.

11) Preparat dikeringkan dengan menggunakan kertas saring.

12) Amati dengan menggunakan mikroskop.

F. Pembahasan

Pewarnaan yang dilakukan merupakan pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram.

Dimana pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang hanya menggunakan satu macam

pewarna saja, sedangkan pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang menggunakan

pewarna lebih dari satu macam.

Pada pewarnaan sederhana menggunakan satu macam pewarna metylen blue,

sehingga ketika diamati dengan menggunakan mikroskop maka pada bakteri E.coli akan

terlihat bewarna biru keungu-unguan, pada bakteri Streptococus kelihatan bewarna biru

keungu-unguan, dan pada bakteri ketiga yaitu bakteri Pseudemonas, ketika diamati ternyata

bewarna ungu kebiru-biruan pudar.

 Sedangkan pada pewarnaan gram menggunakan lebih dari satu macam pewarna seperti

Kristal violet, larutan lugol, dan larutan safranin. Pada pewarnaan gram apabilah bakteri

berakhir dengan warna merah maka bakteri tersebut merupakan bakteri gram negative, dan

sebaliknya apabilah tidak bewarna merah berarti merupakan bakteri gram positive.

Pada pewarnaan gram ini, ditemukan bahwa bakteri E. coli setelah diamati dengan

menggunakan mikroskop, terlihat bewarna merah, kemudian bakteri streptococcus tidak

bewarna, hanya ada sedikit warna merah yang merupakan pembiasan cahaya pada

mikroskop, begitu juga dengan bakteri Pseudomonas terlihat bewarna sedikit kemerah-

merahan dan kelihatan merah tambahan yang dihasilkan merupakan biasan cahaya dari

mikroskop.

G. Kesimpulan

Berdasarkan hasil pengamatan, maka dapat disimpulkan bahwa :

a. Bakteri E.coli merupakan bakteri gram negative , karena berakhir dengan warna merah pada

akhir pewarnaan gram.

b. Bakteri Streptococus merupakan bakteri gram positif karena tidak berakhir dengan warna

merah pada akhir pewarnaan gram dan berbentuk kokus yang merupakan cirri daripada

bakteri gram positif.

c. Bakteri Pseudomonas merupakan bakteri gram negative , karena berakhir dengan warna

kemerahan pada akhir pewarnaan gram, serta berbentuk basil yang merupakan cirri daripada

bakteri gram positif.