Anda di halaman 1dari 17

MAKALAH

TEKNIK PENELITIAN BIOKIMIA

SODIUM DODESIL SULPHATE-POLYACRILAMIDE


GEL ELEKTROPHORESIS SDS-PAGE

DI SUSUN OLEH:

AMIRAH MUTHIAH A. H31112254


DWI NICHE H31112264
SUHARLINA TAHIR H31112275
DARMAWATI H31112285

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2016
BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi

molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat

dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut

dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam

matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul

bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun

dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul

sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer massa, PCR,

kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode

karakterisasi lebih lanjut.

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang

(crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk

memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau

oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida,

dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang

memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan

poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam

nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang

digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.

DNA dapat ditentukan ukurannya dengan melakukan migrasi didalam gel agarose

atau gel poliakrilamid. Migrasi DNA didalam gel ini biasa disebut dengan

elektroforesis.
1.2 Rumusan Masalah

1. Pengertian elektroforesis dan beberapa jenis elektroforesis.

2. Teknik elektroforesis gel poliakrilamid.


BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Elektroforesis

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul

bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.

Teknik ini dipelopori pada tahun 1937 oleh ahli kimia Swedia Arne Tiselius untuk

pemisahan protein. Sekarang telah meluas ke banyak pemisahan kelas yang

berbeda lain dari biomolekul termasuk asam nukleat, karbohidrat dan asam amino.

Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan

dipisahkan.

Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada

pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang

bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik

dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut

akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul

tersebut tergantung pada muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada

bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang

terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris

lingkungan:

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan

listrik.Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan,

mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA.


2.2 Jenis-Jenis Elektroforesis

1. Elektroforesis Kertas

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas

sebagai fase diam dan partikel yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion

kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang

system pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau

valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi

elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat terlarut.


Gambar Elektroforesis Kertas

2. Pulse-Field Gel Electrophoresis (PFGE)

Pertengahan 1980-an, Schwartz dan Cantor memberitahukan ide

cerdasnya untuk memisahkan campuran DNA berukuran super besar

menggunakan teknik yang dinamakan Pulse-field Gradient Gel Electrophoresis

(PFGE), yang menggunakan pulsa-pulsa pendek medan listrik tegak lurus yang

arahnya berganti-ganti. Teknik PFGE kini digunakan secara luas oleh para ahli

biologi dalam studi genotyping berskala masif, juga analisa epidemiologi

molekular pada patogen.

Ketiga teknik di atas merupakan pintu masuk bagi penelitian-penelitian

lainnya dalam bidang biologi molekular yang kini berkembang sangat pesat. Sulit

dibayangkan sebuah laboratorium biologi molekular dapat menghasilkan sesuatu

tanpa teknik elektroforesis. Tanpa elektroforesis, DNA/RNA yang sedang kita

teliti akan bercampur dengan kontaminan yang tidak kita inginkan, sulit pula

membayangkan cara mengetahui ukuran DNA/RNA/protein yang lebih praktis


selain dengan elektroforesis, bahkan teknik DNA sequencing modern sekalipun

sangat bergantung pada teknik elektroforesis ini.

Gambar proses Pulse-field Gradient Gel Electrophoresis (PFGE)

3. Elektroforesis Gel

Banyak kemajuan pesat yang sedang dibuat dalam biologi molekuler saat

ini tergantung pada kemampuan untuk memisahkan, ukuran dan

memvisualisasikan molekul DNA. Selanjutnya teknik elektroforesis

dikembangkan untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar. Tahun 1955

Smithies mendemonstrasikan bahwa gel yang terbuat dari larutan kanji dapat

digunakan untuk memisahkan protein-protein serum manusia. Caranya yaitu

dengan menuangkan larutan kanji panas ke dalam cetakan plastik, setelah

dibiarkan mendingin kanji tersebut akan membentuk gel yang padat namun rapuh.
Gel kanji berperan sebagai fasa diam (stationary phase) menggantikan kertas

saring Whatman pada teknik terdahulu. Ternyata elektroforesis gel yang

diperkenalkan Smithies memicu para ilmuwan untuk menemukan bahan kimia

lain yang dapat digunakan sebagai bahan gel yang lebih baik, seperti agarosa dan

polimer akrilamida. Dan penemuan elektroforesis gel kanji di awal karir Smithies

membawanya menerima hadiah nobel bidang kedokteran tahun 2007.

Teknik yang paling umum untuk ini tujuannya adalah bahwa standar

elektroforesis gel agarosa. Gel elektroforesis adalah salah satu paling umum

digunakan teknik pemisahan di laboratorium biologi modern. Elektroforesis telah

ditemukan digunakan secara luas dalam tes biologis, dan dalam pemurnian dan

pemisahan protein dan asam nukleat. Pemetaan fisik gen dan sequencing DNA

keduanya tergantung pada pemisahan dengan elektroforesis gel. Elektroforesis gel

konvensional molekul DNA dilakukan dengan menempatkan DNA dalam matriks

padat (yaitu agarosa atau poliakrilamid) dan menginduksi molekul bermigrasi

melalui gel bawah medan listrik statis. Fragmen DNA 100-200 pasangan basa

(Bp) hingga 50 pasang kilobase (kb) secara rutin dipisahkan dengan elektroforesis

gel konvensional teknik. Di atas 50 kb, karena ukuran molekul, tindakan

penyaringan gel adalah hilang, dan fragmen dijalankan sebagai, band yang belum

terselesaikan luas dengan mobilitas anomali tinggi. Meskipun fragmen yang lebih

besar (hingga 750 kb) telah diselesaikan dengan teknik ini, gel yang digunakan

adalah sangat rapuh karena konsentrasi agarosa sangat rendah, dan pemisahan ini

tidak cukup untuk sebagian besar aplikasi. Pemisahan molekul DNA dengan

teknik lain adalah waktu-mengkonsumsi. Kebutuhan untuk analisis molekul DNA

besar dalam pemetaan skala besar.


Pada tahun 1982, Schwartz et al. memperkenalkan konsep bahwa DNA

molekul yang lebih besar dari 50 kb dapat dipisahkan dengan menggunakan dua

medan listrik bolak-balik (yaitu PFGE). Sejak saat itu, nomor instrumen

didasarkan pada prinsip ini telah dikembangkan, dan nilai menggunakan bidang

berdenyut telah ditunjukkan untuk memisahkan DNA dari beberapa kb untuk

lebih dari 10 pasang megabase (Mb).

Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga

12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel

Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-

akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein

dengan ukuran lebih besar. Meskipun aplikasi elektroforesis makin berkembang

luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk

memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom.

Campuran DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka

berbeda-beda.

Gambar Elektroforesis Gel Kanji Gambar Elektroforesis Gel


2.3 Elektroforesis Protein

Elektroforesis protein pada dasarnya dilakukan dngan prinsip serupa

seperti yang digunakan dalam elektroforesis DNA, namun gel yang digunakan

adalah gel poliakrilamid. Seringkali dalam pembuatan gel akrilamid ditambah

sodium dodecyl sulphate (SDS) yang merupakan senyawa untuk mendisosiasikan

protein menjadi subunitnya. Metode elektroforesis yang denmikian disebut SDS-

PAGE sodium dodecyl sulphate polyacrylamid gel electrophoresis). Berbeda

halnya dengan DNA, protein yang dielektroforesis dapat dianalisis dengan

pengecatan menggunakan COOmasie Blue. Senyawa ini biasanya ditambahkan

bersama-sama dengan sampel. Pengecatan protein dapat juga dilakukan dengan

larutan perak nitrat yang lebih sensitif dibanding dengan coomassieblue.

2.3.1 Elektroforesis Gel Poliakrilamid

Akrilamid merupakan suatu monomer, yang jika ada radikal bebas,

biasanya diberikan oleh amonium persulfat dan distabilkan oleh TEMED, terjadi

reaksi berantai sehinnga monomer terpolimerasi menjadi rantai panjang. Jika

dalam reaksi itu bisakrilamid, reaksi menjadi bersambung melintang menjadi gel

yang berpori-porinya ditemtukan oleh panjang rantai dan jumlah sambungan

silang seperti yang terlihat pada gambar.


Gambar alat elektroforesis gel poliakrilamida sederhana. Beberapa sampel dapat
dimasukkan dalam gel poliakrilamida. Pipet mikroliter digunakan untuk
memasukkan larutan ke dalam sumuran. Sampel yang bermuatan negatif akan
bergerak ke anoda, pada bagian bawah gel.

Panjang rantai ini ditentukan oleh konsentrasi poliakrilamid dalam reaksi

ini (3,5%-20%) dan satu molekul sambungan silang terjadi pada setiap 29

monomer akrilamid. Rentang pemisahan yang efektif pada gel poliakrilamid

dengan berbagai konsentrasi dapat diliahat pada tabel berikut:

Bis-akrilamid diberikan dalam konsentrasi 1/30 konsentrasi akrilamid.


Angka yang tertera merupakan ukuran pasang basa dari fragmen DNA untai
ganda yang migrasi bersama pewarna.

Gel poliakrilamid dibuat dengan cara menuangkan antar dua lempeng kaca

yang dipisahkan dengan pembatas dengan ketebalan tertentu. Gel poliakrimalid

dapat berukuran dari 5 cm sampai 50 cm panjangnya tergantung pada

keperluannya dan dilakukan elektroforesis dengan cara vertikal. Sistem ini

menunjukan tiga keunggulan daripada gel agarosa: (1) kekuatan pemisahnya

sangat besar sehingga dapat memisahkan satu pasang basa dalam 500 pasang

basa. (2) sistem ini dapat menampung jumlah sampel lebih besar daripada

agarosa. (3) DNA yang diperoleh kembali dari gel poliakrilamid sangat murni

sehingga dapat digunakan untuk keperluan percobaan mikroinjeksi embrio tikus.


Gambar pembentukan gel poliakrilamid. Jaringan tiga dimensi terbentuk oleh
kopolimerasasi monomer teraktivasi dengan penghubung dari bis akrilamid.
Panaskan dengan SDS
dan merkaptoetanol

Gambar elektroforesis gel poliakrilamida-SDS. Subunit A dan B terikat dengan ikatan


disulfida yang direduksi menjadi SH sehingga menjadi dua polipeptida. Protein
terselubungi SDS menjadi bermuatan negatif. Mobilitas protein dalma gel poliakrilamida-
SDS berbanding terbalik dengan log ukuran molekulnya

Elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara

vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan

urutan DNA (sekuensing).

Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang,

misalnya :

1. Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA, setiap

orang memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu

polisi dalam mengungkap sebuah kasus.


2. Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara

untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR.

3. Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA.

Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan berikut:

1. Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda, mengetahui

susunan sekuens berbagai genom.

2. DNA fingerprinting.

3. Mendeteksi kelainan genetik.

4. Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu.

5. Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme

atau percobaan perlakuan gen.

6. Mempelajari evolusi tingkat molecular.

7. Mengetahui variasi genetik yang ada di alam.

8. Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan protein

tertentu.

9. Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu.

10. Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan DNA

plasmid.

11. Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR.


2.3.2 Teknik elektroforesis gel poliakrilamid.

1. Mempersiapkan sampel

2. Mempersiapkan gel akrilamida


3. Elektroforesis
BAB III

PENUTUP

Kesimpulan

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul

bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.

Gel yang biasa digunakan adalah agarosa dan gel poliakrilamid. Gel poliakrilamid

sering digunakan untuk uji kualitatif protein, meskipun juga digunakan untuk uji

kualitatif DNA. Resolusi dalam memisahkan DNA lebih tinggi jika dibandingkan

gel agarosa sehingga panjang molekul DNA yang berbeda hanya satu nukleotida

dapat dideteksi. Elektroforesis gel poliakrilamid dapat memisahkan protein

dengan ukuran 5200 kDa, sedangkan untuk pemisahan fragmen DNA hanya

dalam rentang ukuran DNA yang sempit yaitu antara 5500 bp.