PRAKTIKUM TEKNOLOGI FORMULASI DAN EVALUASI SEDIAAN STERIL

RUANGAN STERILISASI DAN RUANG LAF 29 September 2016

Kelompok 3 Kamis, 0700-1000 FARMASI KPBI 2014

MAISARAH BT MOHD GHAZALI 260110142019

MUHAMMAD AFIQ B AHAMAD SEDEK 260110142009
NURIZZATI BT MOHD NOR 260110142008
ABDULLAH AZIM B ZULKAFLI 260110142007
EU JOHNY 260110142016

ASISTANT: 1. Willybrordus Pramudhita

2. Annisa Claudia

LABORATORIUM TEKNOLOGI
FORMULASI DAN EVALUASI SEDIAAN STERIL FALKUTAS
FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN
JATINANGOR 2016

Nilai Asistant
TUJUAN
Untuk memastikan praktikan mengetahui cara uji pirogen ke setiap sediaan farmaseutikal
dan untuk mengetahui prosedur uji pirogen.

PRINSIP
1. Uji Pirogen
uji yang dilakukan untuk mengetahui apakan suatu sediaan uji bebas pirogenatau
tidak dengan maksud untuk membatasi resiko reaksi demam yang dapat diterima
oleh pasien apabila diinjeksi dengan suatu sediaan farmasi. Uji pirogenitas
biasanya menggunakan kelinci. Pengujian ini ditetapkan di USP pertama kali pada
tahun 1942 dan merupakan pengujian resmi untuk menentukan non-pirogenitas
sediaan farmasi. Sejak diketahui bahwa endotoksin ternyata mampu
menggumpalkan sel darah Limulus, kemudian dikembangkan suatu pengujian
untuk mendeteksi adanya endotoksin dengan menggunakan reagensia yang dibuat
dari sel darah Limulus. (Ansel, 1989)

2. Uji LAL (Limulus Amebocyte Lysate)

Metode yang spesifik untuk bakteri endotoksin, hanya untuk pirogen yang
signifikan pada kebanyakan pabrik farmasutikal dan peralatan medis. Test
didasarkan pada mekanisme primitive pengumpalan darah dari kepiting seperti
Kuda Amerika (Limulus polyphemus). Beberapa enzim diletakkan pada sel darah
amoeba kepiting yang dipicuh oleh endotoksin perpanjangan koagulasi enzimatik
yang diakhiri dengan produksi di gel protenose. (Aulton, 1990)

TEORI DASAR

Pirogenes didefinisikan sebagai produk metabolisme mikroorganisme hidup,

atau mikroorganisme mati menyebabkan respon spesifi khusus pada injeksi. Mereka
terjadi dimanapun mikroorganisme yang diizinkan untuk tumbuh. Terlepas dari sumber
mikroba, mereka tampaknya memiliki sifat yang mirip. Pada kimia, mereka dianggap
sebagai lipopolisakarida, larut dalam air tapi tidak larut dalam pelarut organic. Mereka
dapat menjadi padatan makromolekul filterable dengan berat molekul dilaporkan
serendah 15.000 atau setinggi 4 juta. Karena mereka larut dalam air, baik sterilisasi
dengan panas lembab di bawah tekanan atau filtrasi melalui filter sterilisasi untuk
menghilangkan pirogen, walaupun proses ini menghilangkan mikroorganisme hidup.
Pirogen yang dihasilkan oleh mikroorganisme gram negatif yang paling ampuh. Pirogen
ekstrak kering tampaknya stabil selama jangka waktu yang lama, bahkan larutan
pyrogenic kehilangan sedikit aktivitas mereka selama bertahun-tahun (Turco et al., 1974).

Sifat-sifat pirogen adalah termostabil, sehingga hanya dapat dihilangkan dengan

pemanasan pada suhu 650 o C selama 1 menit, 250 o C selama 15 menit atau 180 o C
selama 4 jam; larut dalam air sehingga tidak bisa memakai penyaring bakteri; tidak
dipengaruhi oleh bakterisida yang biasa; tidak menguap, destilasi biasa yang ikut bersama
percikan air, berat molekul antara 15.000-4.000.000; dan ukurannya umum 1-50
micrometer (Suwandi, 1988).

Sediaan injeksi intravena adalah salah satu sediaan obat yang umum digunakan
terutama dalam praktek di rumah sakit. Sediaan parenteral adalah sediaan steril berupa
larutan, emulsi, atau suspensi atau serbuk yang harus dilarutkan atau disuspensikan lebih
dahulu sebelum digunakan, yang disuntikkan dengan cara merobek jaringan ke dalam
kulit atau melalui kulit atau selaput lendir. Sediaan parenteral terdiri dari injeksi intravena
volume besar dan injeksi intravena volume kecil. Dalam sediaan parenteral volume besar
perlu diadakan uji pirogen untuk mengetahui adanya kontaminasi dalam sediaan
parenteral tersebut. Uji pirogen bakteri adalah uji untuk memperkirakan kadar pirogen
yang mungkin ada dalam atau pada bahan uji (Depkes, 1995).

Endotoksin merupakan suatu produk miroorganisme terutama dari gram negatif

yang terdiri atas suatu senyawa kompleks lipopolysakarida yang pyrogenic, suatu
protein dan suatu lipid yang inert.Pada saat ini endoktoksin diketahui merupakan pirogen
yang paling kuat, namun kehadiran pirogen lain dalam suatu sediaan perlu diperhitungkan
karena manusia tidak hanya dipengaruhi endoktoksin saja tetapi juga pirogen yang lain
(Gennaro et al., 1990).

Uji LAL adalah metode spesifik untuk bakteri endotoksin, hanya untuk pirogen
yang signifikan pada kebanyakan pabrik farmasetikal dan peralatan medis. Test
didasarkan pada mekanisme primitive penggumpalan darah dari kepiting seperti Kuda
Amerika (Limulus polyphemus). Berberapa enzim diletakkan pada sel darah amoeba
kepiting yang dipicuh oleh endotoksin perpanjangan koagulasi enzimatik yang di akhiri
dengan produksi di gel protenose. Test harus dihindarkan dari kontaminasi antimikroba
sebelum dihindarkan, test ini penting untuk memastikan bahwa tidak ada factor campuran
dalam sediaan, peralatan tidak menyerap endotoksin (seperti pada beberapa plastic) dan
sensitifitas dari lisat diketahui (Aulton, Michael, 1990).

Uji pirogen menggunakan kelinci sehat yang telah dijaga dalam keadaan
lingkunagan dan makanan yang tepat sebelum dilakukan uji. Temperature normal atau
temperature control diukur untuk tiap hewan yang akan digunakan. Temperatur ini
digunakan sebagai dasar penentuan setiap kenaikan temperature yang ditimbulakan akibat
dari penyuntikan larutan yang akan diuji. Kelinci-kelinci yang digunakan temperaturnya
tidak boleh berbeda lebih dari 1o, satu dengan yang lainnya, dan temperature tubuh
tersebut diperkirakan tidak akan meningkat. Ringkasan prosedur uji tersebut adalah
sebagai berikut. Jadikanlah alat suntik, jarum dan alat gelas bebas pirogen dengan cara
memanaskan pada temperature 250oC selama tidak kurang dari 30 menit atau dengan
cara lain yang sesuai. Hangatkan produk yang akan diuji sampai temperature 37oC 2oC
(Ansel, 1989).

ALAT DAN BAHAN

Alat
a) Batang pengaduk
b) Beaker glass
c) Botol infus
d) Corong & kertas saring
 e) Kaca arloji
f) Kapas dan kassa
g) Kapas swab
h) Spatel logam
i) Tutup infus (karet)
j) Tutup aluminium

Bahan
a) Infus glukosa
b) Limulus amebocyte lysate (LAL)

PROSEDUR

Uji LAL dilakukan dengan menambahkan 0.2mL larutan uji ke dalam single test vial
(STV) dari pyrotell. Setelah pirotel larut (kira-kira 1 menit), larutan tercampur sempurna
dan STV ditempatkan dengan cepat dalam incubator kering/ waterbath tanpa sirkulasi
pada suhu 370C +1 0C dengan waktu 60+2 menit. Setelah masa inkubasi, STV
dipindahkan dan dibalikkan dengan gerakan yang sangat halus. Jika suatu gel terbentuk
dan bersisa secara utuh didasar tabung setelah dibalikan 1800, berarti tes tersebut positif ;
Konsentrasi endotoksin dalam tabung lebih besar dari sensitifitas pirotel. Uji negative
yang terjadi mengindikasikan bahwa konsentrasi endotoksin lebih kecil dari sensitifitas
pirotel. Walaupun suatu gel sudah terbentuk tetapi pecah/tumpah ketika dibalikkan
menunjukkan tes tersebut negative.

HASIL PENELITIAN

Positif (+) pirogen jika terbentuk gelatin padat yang tetap, berarti contoh larutan
tersebut mengandung sedikitnya sama dengan sensitivitas reagensia yang digunakan.
Hasil Uraian
Hasil dari pengujian pirogen
menggunakan LAL adalah positif
mengandung pirogen.
Terbentuk gelatin padat yang tetap
setelah diputar 180o secara
perlahan
Berarti contoh larutan tersebut
1. mengandung pirogen sama dengan
kedudukan 0
sensitivitas reagensia yang
digunakan.

2.
kedudukan 90

3.
kedudukan 180
PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini, telah dilakukan pengujian uji pirogen ke atas infus
glukosa yang telah dilakukan. Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui adanya pirogen
hidup yang terkandung infus glukosa. Pengujian uji pirogen amat penting dilakukan
dalam industri farmasi bagi memastikan suatu sediaan steril bebas dari pirogen.

Uji pirogen dilakukan terhadap sediaan injeksi termasuk infus dimaksudkan

untuk membatasi resiko reaksi demam pada tingkat yang dapat diterima oleh pasien pada
pemberian sediaan injeksi. Sediaan injeksi yang sudah disterilisasi terkadang masih
mengandung endotoksi karena pada proses sterilisasi produk parenteral (menggunakan
panas), bakteri gram negatif yang masih mungkin ada dalam produk, akan mati dan
terjadi lisis sehingga endotoksin akan terlepas dan tetap tinggal di dalam produk dimana
endotoksin tersebut bersifat stabil terhadap panas.

Endotoksin adalah toksin yang dihasilkan oleh bakteri gram negatif sedangkan
pirogen adalah senyawa yang menyebabkan kenaikan suhu tubuh. Semua endotoksin
bersifat pirogen, tetapi tidak semua senyawa pirogen itu merupakan endotoksin.

Tes Limulus amebocytelysate (LAL) merupakan uji in vitro untuk deteksi dan
analisis kuantitatif endotoksin bakteri. Limulus amebocyte lysate (LAL) test adalah
metode alternatif selain kelinci pirogen test yang difokuskan pada deteksi senyawa
pirogen dalam produk. Pada praktikum kali ini, dilakukan test LAL karena dengan
pengerjaan yang sederhana karena tidak perlu menggunakan hewan percobaan kelinci,
hasil akhir yang cepat, murah, serta praktis. Metode yang digunakan dalam test LAL kali
ini yaitu Metode Gel-Clot dimana prinsipnya yaitu LAL akan menggumpal dengan
adanya endotoksin.

Perlakuan dimulai dengan mempersiapkan alat dan bahan yang digunakan serta
mempersiapkan Laminar Air Flow (LAF) yang akan digunakan. LAF haruslah disiapkan
terlebih dahulu dengan menyalakan lampu UV selama 15 menit dan setelah 15 menit
dinyalakan lampu neon dan blower. Sewaktu di dalam LAF, dimasukkan dimasukkan
cairan infus glukosa yang akan diuji pirogenitasnya ke dalam tabung LAL-gel clot
menggunakan syringe steril sebanyak 0.2 mL (200 mikro liter atau setara dengan 4 tetes)
ke dalam single test vial (STV) hingga seluruh gel terbasahi. Penggunaan syringe steril
dan pengerjaan tersebut dilakukan di dalam Laminar Air Flow untuk mengelakkan
adanya kontaminan dari luar yang dapat mempengaruhi hasil akhir menjadi false negatif
bukan karena adanya pirogen tetapi karena adanya kontaminan sehingga membentuk gel
yang kompak.

Setelah pirotel tersebut larut dan tercampur sempurna, kemudian STV

dipindahkan ke dalam suatu beaker glass yang diisi kapas untuk menghindari goyangnya
tabung LAL karena akan mempengaruhi hasil akhir. Terjadinya goyangan perlulah
dihindari agar hasil yang diperoleh tidak berupa false negatif (pengukuran yang salah)
karena goncangan sedikit saja dapat menghancurkan massa gel yang sudah terbentuk
sehingga dapat disimpulkan hasil yang negatif namun faktanya berupa hasil positif.

Selanjutnya, STV ditempatkan ke dalam inkubator pada suhu 37 oC selama 1

jam dimana endotoksin yang terdapat dalam larutan infus akan mengkatalisis aktivasi
proenzim dalam lisat amubosit Limulus melalui aktivasi enzim (enzim koagulase) yang
menghidrolisis ikatan spesifik dalam suatu protein penggumpal (koagulogen) yang juga
terdapat pada lisat amubosit Limulus dan menghasilkan koagulin/ gel yang kompak.
Perlakuan inkubasi dimasudkan untuk memberikan suhu dan lingkungan optimal agar
enzim dapat bekerja optimal untuk menghasilkan suatu produk yang merupakan gel
kompak.

Enzim yang diaktivasi (enzim koagulase) menghidrolisis ikatan spesifik dalam

suatu protein penggumpal (koagulogen) yang juga terdapat pada lisat amubosit Limulus
dan menghasilkan koagulin. Sekali terhidrolisis, koagulin yang dihasilkan bergabung
dengan sendirinya dan membentuk suatu gumpalan/bekuan seperti gel. Dengan kata lain,
hasil pembacaan bernilai positif (+) jika terbentuk gel kompak padat yang tetap, berarti
contoh larutan infus tersebut mengandung endotoksin (pirogen) dan sedikitnya sama
dengan sensitivitas reagensia (pirotel) yang digunakan. Serta hasil pembacaan dikatakan
negatif (-) jika tidak terbentuk gel padat yang tetap, berarti bahwa contoh larutan uji
tersebut tidak mengandung endotoksin atau lebih sedikit daripada sensitivitas reagensia
(pirotel) yang digunakan.

Setelah diinkubasi selama 1 jam, STV diambil dan diiuji dengan memberikan
pusingan dari menegak ke arah 90 o. Perlakuan ini perlulah dilakukan dengan berhati-hati
agar false negatif tidak terjadi sama sekali yang akan menyebabkan gel rusak dan menjadi
cairan. Namun, hasil yang kami peroleh setelah diberikan pusingan adalah positif dan
menunjukkan infus yang diuji mengandung pirogen. Hal ini mungkin terjadi karena
disebabkan pengaruh dari lingkungan yang mempengaruhi kualitas produk infus glukosa
serta terjadi kesalahan sewaktu melakukan pengujian pirogen ini.

Namun terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi reaksi LAL antara lain
seperti suhu yang tidak terjaga (suhu tidak berada pada rentang 371C) dan pH yang
tidak berada pada rentangnya (pH 6 8).

Food and Drug Administration (FDA) menentukan batas endotoksin berdasarkan

dosis maksimum sediaan obat untuk manusia dan penyesuaian batas endotoksin untuk
semua obat (kecuali intratekal) dari 2,5 EU (endotoksin unit) kg-1 sampai 5,0 EU kg-1.

KESIMPULAN

Pengujian uji pirogen dapat dilakukan dengan menggunakan test LAL metode gel
clot. Berdasarkan pengujian, hasil yang diperoleh adalah positif dan menunjukkan adanya
pirogen dalam infus glukosa.
DAFTAR PUSTAKA
Ansel, Howard C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Penerbit UI Press: Jakarta
Aulton, Micheal. 1990. Pharmaceutical Practice. Oritic Livingston: London, New York.
Depkes RI. 1995. Farmakope Indonesia. Edisi IV. Jakarta: Departemen Kesehatan RI.
Hal.300-301, 908-909
Gennaro,A.R,et al. 1990. Remingons Pharmaceutical Science 18 th Edition.
Pensylvania:Marck publishing company
Suwandi. 1988. Effect of Mulching and Planting Distance of Talaut Variety of Chinese
Cabbage. Buletin Penelitian Hortikultara 16(2):26-33
Turco, Salvatore dan Robert E. 1974. Sterile Dosage Forms. Published in Great Britain
by Henry Kimpton Publishers : London