Escherichia coli.

Alimentos donde se pueden encontrar E. coli

Jugos
Carne
Verduras

Procedimiento

1. De cada tubo con caldo EC con gas provenientes de la evaluacin de coliformes

fecales por la tcnica del NMP, se siembran por duplicado 0.1mL en cajas de
Petri.
2. Se adiciona 15mL de agar L-EMB mantenido a 45C. se homogeneiza la
muestra.
3. Se incuban las cajas a 35C durante 18-24hrs.
4. De cada caja con L-EMB se transfieren dos colonias sospechosas (planas y
centro oscuro con o sin brillo metlico) a slant de agar para mtodos estndar
para la realizacin de pruebas bioqumicas.

Preparacin de soluciones y medios de cultivo.

Eosin-azul de metileno de Levine (L-EMB, DIFCO 0005 EMSC 1.01342.0500)

Se suspenden 36g del polvo en 1L de agua destilada. Se calienta agitando frecuentemente y

se deja hervir durante 1min. Se esteriliza en autoclave a 121C durante 15min.

Agar para mtodos estndar (BIOXON 134)

Se suspenden 23.5g del polvo en 1L de agua destilada. Se calienta agitando frecuentemente

y se deja hervir durante 1min. Se esteriliza en autoclave a 121C durante 15min.

REFERENCIA

Hitchins D. Anthony and et al., (1992). Escherichia coli and the coliform bacteria. FDA.
Bacteriological Analytical Manual. 7th edition. AOAC International. Pp 27-47.
 Salmonella spp.

Alimentos donde se pueden encontrar

Salmonella spp.
Productos crnicos
Lcteos
Huevo

Procedimiento.
1.- Se pesa spticamente 25 g de la muestra en un vaso estril de licuadora.
2.- Se adicionan 225 ml de caldo lactosado y se licua durante un minuto.
3.- Se deja reposar durante 60 min a temperatura ambiente.
4.- Se mezcla bien y se determina el pH. Se ajusta a pH 6.8 con NaOH 1N o HCl 1N
estriles.
5.- Se incuba durante 24 h a 35 C
6.- Se agita suavemente y se transfiere 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml de
caldo tetrationato.
7.- Se incuba de 18 a 24 h a 35 C
8.- Se mezcla el tubo con caldo tetrationato y se estra en agar MacConkey y agar
Salmonella Shigella (SSA).
9.- Estas placas se incuban durante 24 h a 35 C
10.- Se examinan las placas para investigar la presencia de colonias tpicas de Salmonella,
de acuerdo con las siguientes caractersticas:
Agar Salmonella-Shigella (SSA): colonias translcidas, ocasionalmente opacas. Algunas
colonias presentan centro negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas.

Agar Mac-Conkey: Son colonias incoloras y transparentes.

11.- Se procede a la identificacin bioqumica. Se seleccionan al menos dos colonias tpicas
de cada medio selectivo, que se encuentren bien aisladas.
12.- Se toca levemente el centro de cada colonia y se inoculan dos tubos, uno con agar
triple azcar hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estra en la superficie
inclinada y por puncin en el fondo.
13.- Se incuba durante 24 h 2 h a 35 C.
14.- Se observa el crecimiento en los tubos y se consideran presuntivamente positivas para
Salmonella las colonias que presenten las siguientes reacciones.
Agar TSI: en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentacin de la
glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo ms intenso que el medio
original debido a la no fermentacin de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayora de los
casos se observa coloracin negra a lo largo de la puncin debido a la produccin de cido
sulfdrico.
Agar LIA: se observa intensificacin del color prpura en todo el tubo por la
descarboxilacin de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan
claramente color amarillo en el fondo del agar. La mayora de las cepas de Salmonella
producen cido sulfdrico en este medio con enegrecimiento a lo largo de la puncin.
Informe de resultados
Se informa: presencia o ausencia de Salmonella en ______g o _____ ml de muestra.
Preparacin de soluciones y medios de cultivo
Caldo lactosado (MERCK)
Se pesan 13.0 g del polvo y se disuelven en 1 litro de agua desmineralizada (pH final a 25
C: 6.9 0.2), se esteriliza en autoclave a 121 C durante 15 min.
Caldo tetrationato (BIOXON)
Se pesan 46 g del medio deshidratado y se disuelven en 1 litro de agua destilada y se
calienta hasta ebullicin. Se distribuye en porciones de 10 ml en tubos de ensayo.
Si se va a usar el mismo da, agregar 20 ml de solucin yodo-yoduro por litro o la cantidad
proporcional a usar.
Solucin yodo-yoduro
Se disuelven 6.0 g de cristales de yodo y 6.0 g de yoduro de potasio en 100 ml de agua
destilada. Conservar en frasco color mbar.
Agar MacConkey (BIOXON)
Se pesan 50 g del medio deshidratado y se disuelven en 1 litro de agua destilada. Se mezcla
bien hasta que se obtenga una suspensin uniforme. Se calienta suavemente agitando
frecuentemente y se deja hervir durante 1 min. Se esteriliza en autoclave a 121 C sin
exceder de 15 min. Se deja enfriar entre 45 y 50 C y se distribuye en cajas petri
empleando 20 ml por placa.
Agar para Salmonella y Shigella (Agar SS, BIOXON)
Se pesan 60 g del medio deshidratado y se disuelven en un litro de agua destilada. Se
mezcla bien y se calienta suavemente agitando frecuentemente dejando hervir durante 1
min. No se esteriliza en autoclave. Se deja enfriar entre 45 y 50 C y se distribuye en cajas
petri empleando 20 ml por placa.
Referencias
NOM-114-SSA1-1994. Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Salmonella en
alimentos.
Amador L.R. Avils R.D., Guadalupe E.M., Fernndez R:E., Mota de la G.L., Quiones
R.E., Rodrguez M.R. (1990). Manual de pcticas de Laboratorio de Microbiologa
Sanitaria. Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas. Instituto Politcnico Nacional. 87-114.

Staphylococcus aureus.
Alimentos donde se puede encontrar
S. aureus
En cualquier alimento manipulado

Preparacin de la muestra.

Se prepara la muestra de acuerdo al procedimiento descrito en la tcnica de Mesoflicos aerobios

(NOM-110-SSA1-1994)

PROCEDIMIENTO.

1. Utilizando diferentes pipetas de 1mL para cada dilucin, se deposita 0.1mL sobre la
superficie de las placas de agar sal manitol (o agar Baird Parker MERCK)
2. Se distribuye el inculo sobre la superficie del agar con varillas estriles de vidrio en
ngulo recto, utilizando una para cada dilucin.
3. Las placas se mantienen en su posicin hasta que el inculo sea absorbido por el agar.
4. Se invierten las placas y se incuban de 45 a 48 h a 35C.
5. Se seleccionan las placas que tengan entre 15 y 150 colonias tpicas de Staphylococcus
aureus; si no es posible, se seleccionan las placas de la diluciones ms altas aunque tengan
ms de 150 colonias.
6. Cuando las placas tengan menos de 15 colonias tpicas tambin se pueden utilizar y al
informe se debe agregar la nota de valor estimado.
7. Las colonias tpicas son negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de dimetro de 1 a 2
mm y muestran zona opaca y un halo color claro alrededor de la colonia.
8. A las colonias tpicas se les hace la prueba de coagulasa seleccionando las colonias de
acuerdo al siguiente cuadro:
 No. Col. Sospechosas en placa No. De col. Por probar
Menos de 50 3
51 a 100 5
101 a 150 o ms 7

9. Se selecciona el nmero de colonias adecuado y se siembra cada uno en tubos de 0.5 mL de

caldo de infusin cerebro-corazn.
10. Se incuban a 35C durante 24h.
11. Prueba de la coagulasa. A 0.2ml del cultivo anterior se agrega 0.2ml de plasma de conejo
diluido volumen a volumen con solucin salina estril. Se incuba en bao de agua de 35 a
37C y se observa durante 6h a intervalos de 1h; si no hay formacin de cogulo, se observa
a las 24h. Se considera positiva la prueba si hay formacin de cogulo. Para comprobar la
coagulabilidad del plasma de conejo se aade una gota de cloruro de calcio al 5% a 0.5ml
de plasma reconstituido empleado, formndose un cogulo en 10-15 seg.

Clculos

Se hace el clculo del contenido de microorganismos en el producto tomando en cuenta el nmero

de colonias totales, el nmero de colonias confirmadas, la dilucin y el volumen inoculado (0.1ml).

Ejemplo: Si la caja tiene 80 colonias en la dilucin 1:1000. Se toman 5 colonias para la prueba, si
de stas dan positivas 4, el clculo se realiza como sigue:

(80x4)/5=64x1000x10=640000

Expresin de resultado.

De acuerdo al ejemplo, se informa como: Staphylococcus aureus 640 000 UFC/g

Preparacin de diluciones y medios de cultivo

Agar de sal y manitol (BIOXON)

Se pesan 111g del medio deshidratado y se disuelven en un litro de agua destilada. Se mezcla bien y
se calienta agitando frecuentemente dejando hervir durante un minuto hasta disolucin completa. Se
distribuye en porciones de 0.5ml en tubos de ensayo colocando tapones en los tubos. Se esteriliza
en autoclave a 121C durante 15 minutos.

Solucin salina.

Se pesa 0.85g de cloruro de sodio y se disuelven en un poco de agua destilada, posteriormente se

diluye a 100ml. se esteriliza en autoclave a 121C durante 15 min.

Referencia

NOM-115-SSA1-1994. Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus

en alimentos.
PSEUDOMONAS

INTRODUCCIN

La leche cruda se puede contaminar fcilmente por un amplio grupo de microorganismos ya sea por los
diferentes mtodos de recoleccin, almacenamiento y transporte debido a su composicin nutricional y a su alto
porcentaje de agua dentro de su composicin qumica, Razn por la cual el almacenamiento se realiza a bajas
temperaturas con el fin de aumentar la vida til. La leche y los productos derivados de sta pueden contener
microorganismos psicrotrficos, que secretan enzimas como proteasas que se mantienen activas an despus
de procesos de pasteurizacin. Estas enzimas causan degradacin en gran parte de las casenas presentes en la
leche, trayendo como consecuencias prdida de la calidad de quesos, incrementos en la cantidad de nitrgeno
y tecnolgicamente se produce una reduccin de la estabilidad trmica de la leche.

Recuento de Bacterias Psicrotrficas

De cada muestra tomada efectuar diluciones decimales en agua peptonada al 0.1% p/v, para mantener las
condiciones isotnicas (2). Para tal efecto adicionar 0,5 mL de la muestra en 4,5 mL del diluyente para obtener
la dilucin 10-1. Realizar el procedimiento por duplicado.
A partir de las diluciones sembrar alcuotas de 0,1 mL en superficie de agar cetrimida. Incubar en aerobiosis a
21C durante 48 horas y realizar el recuento de microorganismos psicrotrficos.

Pruebas Bioqumicas:

*PRUEBA DE CATALASA
La catalasa es una enzima que descompone al perxido de hidrgeno en oxgeno y agua, esta enzima
es similar a la estructura de la hemoglobina. Excluyendo al gnero Streptococcus y algunos otros la
mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas tienen catalasa.

*PRUEBA DE OXIDASA

El reactivo de la oxidasa ms recomendado es la solucin acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-

fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos txico y mucho ms sensible que el correspondiente compuesto
dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod), pero es ms caro. Este reactivo tie las colonias oxidasa positivas de
color lavanda que vira gradualmente a prpura-negruzco intenso.

Realizacin de la prueba:

1. Mtodo en placa directa

Tomar una asada del cultivo presuntivo e inocular en cajas de AN (Agar Nutritivo). Incubar a 21

Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no invertirla.
Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reaccin se produce en unos 10-15
segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos.

2. Mtodo indirecto sobre papel

Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri.

Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.
Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado.
La reaccin de color positiva se produce a los 5-10 segundos.


BIBLIOGRAFIA

Red de Revistas Cientficas de Amrica Latina y el Caribe, Espaa y Portugal

Sistema de Informacin Cientfica Redalyc
Nova. Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca
revistanova@unicolmayor.edu.co. ISSN (Versin impresa): 1794-2370. COLOMBIA.
2007 Catherine Mrquez G. / Karen Piramanrique C. / Ana Karina Carrascal C. / Bernardo Clavijo D. / Balkis
Quevedo
DETERMINACIN CUANTITATIVA DE PROTEASAS DE BACTERIAS PSICROTRFICAS
AISLADAS DE LECHE CRUDA
Nova, ao/vol. 5, nmero 007. Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca Bogot, Colombia pp. 14-24.
http://www.joseacortes.com/microbiologia/pruebasbioq/oxidasa.htm
Departamento de Microbiologa y Gentica. Universidad de Salamanca