Anda di halaman 1dari 12

PERAKITAN VARIETAS UNGGUL Keywords: Spathoglottis Bintang Segunung,

ANGGREK TANAH (Spathoglottis flow cytometry, ovarium


Bintang Segunung) DOUBLE cultured
HAPLOID DENGAN KULTUR 1. PENDAHULUAN
OVARIUM Anggrek merupakan tanaman hias
florikultura bernilai ekonomis tinggi dengan
Agus Setiawan, Aminin, Jaova Layla, ragam bentuk, warna dan aroma (Semiarti
Muhammad Nabil, Monika Bataona, dkk., 2010). Dari 20.000 spesies anggrek di
Endang Semiarti dunia, Indonesia memiliki 5.000 spesies
anggrek alam (Irawati, 2002) yang sangat
Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada
potensial untuk dikembangkan. Berdasarkan
email: agussetiawanpone@gmail.com
persilangan intragenerik yang dilakukan oleh
Kartikaningrum dkk. (2004) diperoleh
Abstract anggrek Spathoglottis unggul yang diberi
A rapid and efficient micropropagation nama Spathoglottis Bintang Segunung dengan
method was esthablished for produced SK Mentan 506Kpts /PD.210/10/2003.
cloning of Orchid Hybrid Spathoglottis Namun anggrek ini bersifat inkompatibelitas
Bintang Segunung from Indonesia. The aim of karena tidak dapat disilangkan (steril)
this research was to optimize effects of 2,4- (Setiawan dkk., 2013), sehingga proses
Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), cold perbanyakan hanya dapat dilakukan dengan
shock, and 6-Benzylaminopurine (BAP) to split pseudobulb. Oleh karenanya varietas ini
plantlet regeneration from ovarium culture belum dapat diproduksi secara massal hingga
and analyse the ploidy using flow cytometry. perlu dilakukan inovasi perbanyakan tanaman
Ovarium explants from shut flower stalk were anggrek secara klon dan atau perakitan
cultured on Vacin and Went (VW) medium varietas anggrek homozigot double haploid.
supplemented with 2,4-D at 5 concentrations Kultur ovarium tanaman dapat dilakukan
(0.01-1 ppm) and cold shock treatment after secara in-vitro menggunakan medium Vacin
cultured at 3 variations 10oC (0, 2, and 4 h) and Went (VW) dengan perlakuan cold shock
and then incubate the explants in room with dan kombinasi Zat Pengatur Tumbuh (ZPT)
24 photoperiodization (25oC). After 10 days, 2,4-Dichlorophenoxiacetic acid serta 6-
while ovarium explants were subcultured on Benzylaminopurine (Svirshevskaya and
VW supplemented with 6-benzylaminopurin Dolezel, 2000; Shalaby, 2007; Bouatrous et
(BAP) (2.5 ppm) for 2 weeks. Further, al., 2010). Kultur ovarium dapat menginduksi
ovarium explants were subcultured again on tanaman haploid (n) yang steril apabila sel
VW medium with filtered coconut water (150 yang berkembang menjadi plantlet adalah sel
ml/L). Regeneration of protocorm-like bodies sel ovul, sehingga harus dihaploidisasi
(PLBs) and subsequent plantlet development menggunakan kolkisin untuk mendapatkan
were observed from on VW+ 1 ppm 2,4-D tanaman fertil double haploid. Namun sel
(Sig= 2%)+ 4h cold shock 10oC (Sig= 2%) somatik juga mampu beregenerasi menjadi
dan 2,5 ppm BAP. The optimized procedure plantlet yang diploid (2n). Ploidi plantlet yang
required about 2 months from cultured of the berkembang dari hasil kultur ovarium
ovarium explant to plantlet formation. The dievaluasi menggunakan metode Flow
peak from the histogram of flow cytometry Cytometry. Dari penelitian ini, diharapkan
showed that ovarium cultured of S. Bintang dapat diperoleh varietas baru Anggrek Tanah
Segunung (CV= 4,35%) and leave of S. hibrid (Spathoglottis Bintang Segunung).
Bintang Segunung (CV= 5,19%) were the Tujuan dari penelitian ini yaitu mengetahui
same triploid. The protocol of this experiment konsentrasi optimal senyawa 2,4-
could produce the uniform plantlets and Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) serta
expected to initiate the regeneration of ovul pengaruh stressing cold shock dalam
cell which need more studying for the medium menginduksi plantlet pada kultur ovarium
optimation. Anggrek Tanah hibrida (Spathoglottis
Bintang Segunung), mengetahui konsentrasi
optimal 6-Benzylaminopurine (BAP) dalam

1
menginduksi embriogenesis Protocorm like- cold shock pada suhu 10oC dengan variasi
bodies (PLB) Anggrek Tanah hibrida penyimpanan 0, 2, dan 4 (jam), kemudian
(Spathoglottis Bintang Segunung) hasil kultur petri disimpan di ruang inkubator dengan
ovarium, dan mengetahui tingkat ploidi sel pencahayaan 24 jam (suhu 25oC).
tanaman hasil kultur ovarium Anggrek Tanah Pengamatan dilakukan setiap hari meliputi
hibrid (Spathoglottis Bintang Segunung) jumlah eksplan yang merekah, membentuk
menggunakan Flow Cytometry. kalus, dan browning.
Proses preparasi kultur ovarium bunga
2. METODE Spathoglottis Bintang Segunung mengacu
pada (Soeradikoesoemo, 2008) menggunakan
Penelititian ini dilaksanakan dari bulan
metode Parafin yang telah dimodifikasi
Desember 2013 sampai Maret 2014 di
dengan pewarnaan tunggal di awal dengan
Laboratorium Genetika, Laboratorium
safranin 1% (dilarutkan dalam alkohol 70%)
Bioteknologi, dan Laboratorium Struktur dan
24 jam setelah eksplan difiksasi dengan FAA.
Perkembangan Tumbuhan (SPT) Fakultas
Biologi UGM, serta Laboratorium Genetika Induksi Embriogenesis Kalus anggrek
Tumbuhan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Spathoglottis Bintang Segunung dilakukan
Indonesia (LIPI), Cibinong, Bogor. Tahapan pada hari ke 10 yaitu dengan melakukan
awal yang dilakukan yaitu koleksi anggrek subkultur eksplan ovarium ke medium VW
Spathoglottis Bintang Segunung, dan dengan kombinasi hormon 6-
karakterisasi bunga Spathoglottis Bintang Benzylaminopurine (BAP) 2 (ppm) selama
Segunung dari Balai Penelitian Tanaman Hias 2 minggu, apabila medium mengalami
(BALITHI) Cianjur. browning maka eksplan disubkultur pada
medium baru. Lalu eksplan disubkultur
Kultur Spathoglottis Bintang Segunung
kembali pada medium VW+150 ml/L air
dilakukan menggunakan ovarium bunga
kelapa tua yang telah disaring dengan kertas
anggrek Spathoglottis dari green house lalu
saring sebanyak dua kali. Kemudian eksplan
disterilisasi menggunakan akuades nonsteril
diamati tiap minggu hingga membentuk
30 ml dan 3 tetes larutan Tween 20 (10 menit)
Protocorm-like bodies (PLB) lalu
dengan penggojokan secara perlahan, proses
beregenerasi kembali menjadi plantlet.
ini dilakukan di Laminar Air Flow (LAF).
Plantlet yang telah mempunyai 3 daun dapat
Larutan kemudian dibuang pada wadah
dipotong lalu disubkultur untuk regenerasi
limbah yang telah diletakkan di dalam LAF,
tanaman utuh.
dan eksplan dibilas menggunakan akuades
steril sambil digojok perlahan selama 3 menit Ploidi plantlet anggrek hasil dari
dengan 3 kali pengulangan. Setelah sisa kultur ovarium secara in-vitro dan tanaman
larutan dibuang kemudian eksplan kontrol dievaluasi menggunakan analisis flow
disterilisasi secara kimiawi menggunakan cytometry yang dilaksanakan di Laboratorium
larutan HgCl (0,2%) selama 10 menit sambil Genetika Tanaman LIPI, Cibinong, Bogor.
digojok secara perlahan, dan selanjutnya Prosedur pelaksanaan ini yaitu sampel
larutan HgCl dibuang pada wadah limbah dan invitroplant anggrek Spathoglottis Bintang
eksplan dibilas kembali menggunakan Segunung di preservasi mengacu pada
akuades steril selama 3 menit sambil digojok penelitian Kolar dan Lucanova (2010) yaitu
dengan 3 kali pengulangan. Eksplan yang sampel disuspensi menggunakan larutan
telah disterilisasi kemudian dipindah ke dalam Buffer Otto (Doleel et al., 2007). Siapkan
petri dish yang telah dilapisi dengan kertas petri dish diameter 3 cm lalu tambahkan
saring steril. Bagian apikal dan basal ovarium larutan buffer Otto I (4.2 gr 0.1 M Citric acid
dipotong kemudian ovarium dibagi menjadi 4 monohydrate dan 1 ml 0.5% (v/v dalam 200
bagian lalu dijadikan sebagai ulangan dan ml akuades) Tween 20) sebanyak 1 mL dalam
ditanam pada medium VW (pH= 5,7-5,8, kondisi dingin, masukkan sampel daun
gellan gum= 2 gr/L, sukrosa= 20 gr/L) dengan sebanyak 20 mg ke dalam petri dish lalu
kombinasi Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) 2,4-D dipotong-potong (maksimal 1 menit)
yang digunakan yaitu 0.,01, 0,05, 0,1, 0,5, dan menggunakan scalpel hingga berukuran 1
1 (ppm) pada medium VW. Setelah itu tiap mm. Saring suspensi ke dalam tube 1,5 mL
petri yang telah ditanami diberi perlakuan menggunakan filter nilon berukuran 30 m.

2
Sentrifuse suspensi pada kecepatan 5.000 rpm kematian sel secara sistemik. Apabila sel telah
selama 5 menit (4oC). Supernatan dibuang mengalami kematian maka tidak akan
namun sisakan sekitar 100 l larutan di atas diperoleh sel yang aktif membelah.
pelet. Homogenasi inti dengan cara menyentil Eksplan ovarium anggrek yang dikultur
bagian bawah tube. Tambah larutan beffer apabila diamati struktur anatomisnya
Otto I (dingin) baru sebanyak 100 l ke dalam (Gambar 1) dikeathui bahwa terdapat banyak
tube. Selanjutnya tambah 1 ml larutan buffer jaringan sekretoris pada bagian ovarium.
Otto II (28.65 gr 0.4 M Na2HPO4.12H2O Keuntungan lain dalam penggunaan cold
dalam 200 ml akuades). Suspensi inti sel shock adalah mampu menghambat ekskresi
kemudian dipindah ke tabung yang akan metabolit sekunder yang mungkin bersifat
digunakan untuk running pada alat flow toksik pada kultur. Hal ini didasari dari
cytometry. Larutan pewarna yang berisi tingginya laju kematian eksplan akibat
Propidium Iodide (50 g/ml)+RNase (50 browning (Tabel 1).
g/ml) sebanyak 1 ml (CyStain PI Absolut P, Parameter yang diamati dalam kultur ini
PARTEC), sampel diinkubasi pada kondisi yaitu jumlah eksplan ovarium yang mampu
gelap selama 5-15 menit, kemudian sampel bertahan tanpa mengalami browning. Hasil
di-running pada alat SyFlow (PARTEC). analisis struktur anatomis ovarium bunga hari
Apabila sampel mengalami browning maka ke-4 eksplan ovarium mengalami
sampel tidak bagus untuk dianalisis pemanjangan sel yang ditandai dengan
menggunakan flow cytometry. struktur menonjol yang keluar dari bagian
Data induksi ginogenesis dari kultur ujung eksplan seperti pada Gambar 2 bagian
ovarium dan induksi embriogenesis PLB A pada medium.
dianalisis menggunakan software SPSS 2.0
untuk menentukan tabel ANAVA dan uji
DMRT pada taraf kepercayaan 5%. Analisis
ANAVA dilakukan untuk megetahui adanya ro
perbedaan perlakuan yang signifikan serta uji se
DMRT untuk menentukan perlakuan yang
paling efektif.
ov
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Kultur Ovarium Bunga Spathoglottis
Bintang Segunung fu
Kultur ovarium anggrek dilakukan
menggunakan medium Vacin and Went (VW) jp
dengan penambahan variasi Zat Pengatur Gambar 1. Struktur anatomis melintang
Tumbuh (ZPT) yaitu 2,4- ovarium bunga anggrek Spathoglottis
Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Bintang Segunung. (se) sel sekret, (ro)
Senyawa 2,4-D merupakan auksin sintetik ruang ovarium, (fu) funikulus, (ov)
yang mampu memacu pemanjangan dan ovulum, (jp) jaringan pengangkut. Bar:
pembelahan sel. Dengan penggunaan ZPT 400 m.
2,4-D mampu mengubah takdir sel menjadi
sel yang aktif membelah terus menerus tanpa VW+cold shock. Struktur ini oleh
diikuti proses diferensiasi sel seperti sel-sel Kartikaningrum (2012) disebut sebagai
penyusun funikulus, dinding dalam ovarium, eksplan yang sedang mekar. Data jumlah
dan sel telur. Perlakuan cold shock pada 10oC eksplan dengan pengulangan 4 kali yaitu
setelah dilakukan penanaman eksplan pada jumlah eksplan yang mekar dan tidak
medium bertujuan untuk menghambat kinerja mengalami browning dianalisis menggunakan
enzim fenolase yang dapat mensintesis software SPSS. Eksplan yang tidak mekar
senyawa fenolik yang menyebabkan namun tidak mengalami browning tidak
browning pada eskplan. Eksplan yang dihitung atau 0 begitu pula dengan eksplan
mengalami browning akan terhambat yang mekar namun browning. Pada perlakuan
perkembangannya lalu menyebabkan ini diketahui bahwa penambahan 2,4-D dan

3
cold shock memberikan hasil yang signifikan menghasilkan jumlah eksplan yang mekar dan
berbeda dengan nilai signifikansi 2%, serta tidak mengalami browning adalah medium
terdapat interaksi diantara keduanya dengan VW+2,4-D (1ppm)+2 jam Cold Shock (Tabel
signifikansi 1.9%. Berdasarkan hasil analisis 1).
diketahui bahwa perlakuan terbaik dalam

Tabel 1. Laju ketahanan eksplan ovarium Spathoglottis Bintang Segunung pada medium VW
dengan perlakuan hormon 2,4-D dan Cold Shock

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)


Cold Shock
0.01 ppm 0.05 ppm 0.1 ppm 0.5 ppm 1 ppm
(10o C)
0 Jam 0.000.00a 0.000.00a 0.000.00a 0.250.50a 0.500.57a
2 Jam 1.000.00b 0.250.50b 0.500.57b 0.250.50b 0.750.50b
4 Jam 0.250.50b 0.250.50*b 0.750.50b 0.50.57*b 1.000.00*b
a
Ket: . Eksplan tidak merekah dan mengalami browning
b
. Eksplan merekah dan mengalami browning
*b. Eksplan merekah dan tidak mengalami browning

Teng et al. (1997) melaporkan bahwa mempunyai ukuran sel yang lebih kecil dengan
dengan induksi kalus melalui eksplan seedling inti yang lebih besar. Pewarnaan safranin akan
dapat dilakukan dengan menggunakan - dapat berikatan pada inti lebih baik dibanding
naphthalenic acid (NAA) dan 6- pada bagian dinding sel, sehingga sel dengan
benzylaminopurine (BAP) dengan rasio ukuran yang lebih kecil namun inti lebih besar
perbandingan 12,2 dan 0,3-1,2. Berdasarkan (sel meristem) akan tervisualisasi lebih gelap
penelitian tersebut plantlet anggrek baru dapat dengan menggunakan mikroskop cahaya.
diperoleh pada bulan ke 3. Berbeda hasil yang
diperoleh dalam penelitian ini, dengan 3.2 Struktur Anatomis Kultur Ovarium
menggunakan eksplan ovarium bunga maka Bunga Spathoglottis Bintang Segunung
regenerasi eksplan membentuk plantlet dapat Eksplan kultur ovarium anggrek
diperoleh pada akhir bulan pertama. Spathoglottis Bintang Segunung dipreparasi
Hal ini berbeda dengan pada proses selama 4 hari secara mikroteknik untuk
mikropropagasi yang dilakukan melalui mengamati struktur anatomisnya (Gambar 2).
seedling (daun, akar, dan batang) yang harus Pada bagian B (Gambar 2) merupakan struktur
menginisiasi pembentukan sel meristematis anatomis ovarium bunga secara membujur dan
dari sel yang telah mengalami diferensiasi pada bagian C-H (Gambar 2) merupakan
terlebih dahulu yang membutuhkan waktu struktur melintang. Struktur sel-sel yang
relatif lama, berbeda dengan eksplan yang mengalami pemanjangan dan pertambahan
bersumber dari ovarium bunga. Pada bagian volume apabila diamati secara kualitatif dapat
ini terdapat banyak sel-sel yang meristematis, diamati pada bagian B dan F (Gambar 2) dan
selain itu sel-sel pada bagian ovarium bunga pada bagian G dan H (Gambar 2)
anggrek Spathoglottis Bintang Segunung menunjukkan pertambahan volume dan
terdapat sel yang bersifat embrionik sehingga struktur yang tidak beraturan pada sel ovulum.
dapat langsung diiniasiasi menjadi plantlet Kultur in-vitro bagian ovarium anggrek
tanpa pembentukan kalus terlebih dahulu atau dapat dilakukan tanpa menyebabkan kematian
dalam waktu yang bersamaan. organ, hal ini dikarenakan pada medium in-
Karakteristik sel meristematik dalam vitro mengandung komposisi persenyawaan
kultur ovarium dapat diamati melalui struktur berupa nutrien lengkap yang mampu diserap
anatomisnya yaitu pada bagian tengah ovarium oleh sel tanpa melalui proses penyerapan
(Gambar 1), sel yang bersifat meristematik menggunakan akar tanaman. Selain itu dalam
terwarnai lebih gelap dengan menggunakan medium juga telah terdapat sumber karbon
pewarnaan safranin. Sel meristematik yang dapat dimanfaatkan langsung oleh

4
tanaman, dalam kondisi ini tanaman bersifat mengalami kematian. Dalam penelitian ini
heterotrof. Namun tidak semua organ tanaman kemungkinan tersebut mampu dicegah dengan
mempunyai respon adaptasi terhadap kondisi perlakuan cold shock.
in-vitro oleh karenanya banyak eksplan yang

A B

fn

C D E

so
sm

F G H

Gambar 2. Karakter struktur morfologis (A) dan (B-H) anatomis eksplan kultur ovarium anggrek Spatgolottis
Bintang Segunung. (fn) funikulus, (sm) sel somatik, (so) sel ovul. (Bar: (A) 2 mm, (B-H) 100 m.

3.3 Induksi Embriogenesis Kalus metabolit sekunder. Oleh karena pada saat eksplan
Spathoglottis Bintang Segunung di kultur pada medium VW+BAP harus selalu
disubkultur ke medium baru saat eksplan
Eksplan ovarium yang mampu bertahan pada mengalami browning. Eksplan yang mengalami
medium VW+2,4-D akan menghasilkan kalus browning tidak akan beregenerasi dan mati.
anggrek. Karakteristik kalus anggrek Subkultur eksplan pada medium VW+air kelapa
Spathoglottis Bintang Segunung adalah kompak dilakukan hingga eksplan membentuk plantlet.
dan berbentuk granula. Eksplan yang telah mampu Kombinasi penanaman eksplan pada medium
beradaptasi kemudian dilakukan subkultur ke VW dengan penambahan senyawa auksi,
medium VW+BAP (2,5 ppm) selama 2 minggu. sitokinin, dan air kelapa tua pada waktu tertentu
Senyawa BAP merupakan senyawa sitokonin secara berurutan ternyata mampu mempercepat
sintetik yang berfungsi dalam proses induksi plantlet pada tanaman anggrek
perkembangan sel dan mempunyai efek yang Spathoglottis Bintang Segunung. Total waktu
endogen. Penyerapan hormon ke dalam sel sangat yang dibutuhkan hingga tanaman mampu
cepat, namun efek dalam metabolisme sel menghasilkan plantlet yaitu minggu ke 6 telah
terhadap sitokinin dapat memacu eksresi mulai mampu terinisiasi fase globular (Gambar 3).

5
Berbeda halnya yang dilakukan oleh Teng et al. pertumbuhan (hormon) yang terdiri dari hormon
(1997) yang membutuhkan waktu 12 bulan untuk auksin, giberilin, zeatin, dan sitokinin.
mampu membentuk plantlet dari induksi kalus Subkultur eksplan pada medium VW+air
tanaman Spathoglottis plicata. kelapa dilakukan hingga eksplan membentuk
Pada Gambar 3 merupakan fase-fase plantlet. Kombinasi penanaman eksplan pada
pertumbuhan dari eksplan kultur ovarium bunga medium VW dengan penambahan senyawa auksi,
S. Bintang Segunung. Fase pertama yaitu eksplan sitokinin, dan air kelapa tua pada waktu tertentu
yang berumur 2-4 hari setelah kultur (hsk) yaitu secara berurutan ternyata mampu mempercepat
seperti pada bagian A dan F (Gambar 3). induksi plantlet pada tanaman anggrek
Karakteristik yang ditunjukkan yaitu terjadinya Spathoglottis Bintang Segunung. Total waktu
pertambahan volume eksplan yang semakin yang dibutuhkan hingga tanaman mampu
membesar. Pada bagian B dan G (Gambar 3) menghasilkan plantlet yaitu minggu ke 6 telah
merupakan eksplan kultur yang berumus 10 hsk mulai mampu terinisiasi fase globular (Gambar 3).
yang sudah siap untuk di subkultur pada medium Berbeda halnya yang dilakukan oleh Teng et al.
VW+BAP. Karaktersistik kalus yang terbentuk (1997) yang membutuhkan waktu 12 bulan untuk
yaitu berwarna kuning kecoklatan. Namun setelah mampu membentuk plantlet dari induksi kalus
eksplan dikultur pada medium VW+BAP tanaman Spathoglottis plicata.
(Gambar 3. C dan H), kalus akan berubah warna Pada Gambar 3 merupakan fase-fase
menjadi hijau serta terjadi pertambahan massa pertumbuhan dari eksplan kultur ovarium bunga S.
namun warna sel akan semakin hijau. Apabila sel Bintang Segunung. Fase pertama yaitu eksplan
telah hijau (Gambar 3. C dan H) maka dilakukan yang berumur 2-4 hari setelah kultur (hsk) yaitu
subkultur pada medium VW+air kelapa. seperti pada bagian A dan F (Gambar 3).
Karakteristik yang ditunjukkan yaitu terjadinya
3.4 Induksi Embriogenesis Kalus Spathoglottis pertambahan volume eksplan yang semakin
Bintang Segunung membesar. Pada bagian B dan G (Gambar 3)
merupakan eksplan kultur yang berumus 10 hsk
Eksplan ovarium yang mampu bertahan pada yang sudah siap untuk di subkultur pada medium
medium VW+2,4-D akan menghasilkan kalus VW+BAP. Karaktersistik kalus yang terbentuk
anggrek. Karakteristik kalus anggrek yaitu berwarna kuning kecoklatan. Namun setelah
Spathoglottis Bintang Segunung adalah kompak eksplan dikultur pada medium VW+BAP
dan berbentuk granula. Eksplan yang telah mampu (Gambar 3. C dan H), kalus akan berubah warna
beradaptasi kemudian dilakukan subkultur ke menjadi hijau serta terjadi pertambahan massa
medium VW+BAP (2,5 ppm) selama 2 minggu. namun warna sel akan semakin hijau. Apabila sel
Senyawa BAP merupakan senyawa sitokonin telah hijau (Gambar 3. C dan H) maka dilakukan
sintetik yang berfungsi dalam proses subkultur pada medium VW+air kelapa.
perkembangan sel dan mempunyai efek yang Umur kultur dalam medium VW+BAP yaitu
endogen. Penyerapan hormon ke dalam sel sangat sekitar 2 minggu. Kalus yang terlalu lama tidak
cepat, namun efek dalam metabolisme sel disubkultur akan mengalami browning serta kalus
terhadap sitokinin dapat memacu eksresi yang berwarna hijau tua akan menurunkan
metabolit sekunder. Oleh karenya pada saat keberhasilan induksi embriogenesis kalus. Pada
eksplan di kultur pada medium VW+BAP harus bagian D dan I merupakan eksplan kultur yang
selalu disubkultur ke medium baru saat eksplan telah Fase skutelar merupakan fase yang paling
mengalami browning. Eksplan yang mengalami mudah dalam mengidentifikasi dan memastikan
browning tidak akan beregenerasi dan mati. struktur globular merupakan PLB atau bukan.
Eksplan yang telah di kultur selama 2 minggu embrio berkecambah yaitu terbentuknya
kemudian di subkulur pada medium VW+air primordial daun dari fase skutelar.
kelapa (150 ml/L) yang telah disaring sebanyak Karakteristik struktur skutelar yaitu pada
dua kali terlebih dahulu. Air kelapa yang bagian apikal globular akan terbentuk struktur
digunakan berasal dari buah kelapa yang telah tua. yang menyerupai daun yang menonjol ke arah
George et al. (2008) mengidentifikasi bahwa air bawah sehingga bentuknya menyerupai
kelapa mempunyai kandungan yang kompleks permukaan atas buah apel. Sedangkan fase
dikarenakan mengandung banyak jenis asam membentuk Protocorm-like bodies (PLB).
amino, asam organik gula (sukrosa, glukosa, dan
fruktosa), gula alkohol, vitamin, serta senyawa

6
A
F

B G

ka
ka H
C

D I sk gl
eb

pd sk
J ak
E pa
pl

da
Gambar 3. Perkembangan kalus anggrek Spathoglottis Bintang Segunung membentuk plantlet.
(ka) kalus, (gl) globuler, (sk) skutelar, (eb) embrio berkecambah, (pd) primordial daun, (pa)
primordial akar, (da) daun, (ak) akar, (pl) plantlet. Bar: 2 mm.

Bentuk PLB yaitu bentuk yang umumnya Bintang Segunung hasil kultur ovarium
juga dikenal sebagai fase globular, skutelar, dan dianalisis menggunakan Flow Cytometry di
embrio berkecambah. Bagian I (Gambar I) Laboratorium Genetika Tumbuhan Puslit.
menampilkan pembentukan fase pertama yang Biologi LIPI Cibinong. Proses analisis flow
dalam induksi plantlet yaitu fase globular. Fase cytometry menggunakan anggrek Spathoglottis
globular ditandai dengan terbentuknya struktur plicata sebagai kontrol positif (diploid= 2n)
membulat dengan arsitektur sel yang seragam ploidi anggrek wild type serta merupakan
tanpa terdapat sel dapat mengubah konformasi spesies induk jantan dari Spathologlittis Bintang
struktur membulat tersebut. Segunung dan anggrek S. Bintang Segunung
yang merupakan tanaman asli yang bagian
3.4 Analisis Ploidi Plantlet Hasil Kultur ovariumnya telah dikultur secara in-vitro.
Ovarium Bunga Spathoglottis Bintang Berdasarkan hasil analisis flow cytometry
Segunung diperoleh tipikal histogram seperti pada Gambar
Pengecekan ploidi tanaman dapat dilakukan 4 dan 5.
secara cepat menggunakan flow cytometry Analisis flow cytometry menggunakan
(Aliyu, 2012). Plantlet anggrek Spathoglottis bagian daun tanaman. Anggrek Spathoglottis

7
plicata digunakan sebagai kontrol ploidi yang suatu tanaman, namun metode ini mempunyai
berfungsi untuk memposisikan letak peak pada batasan dalam pembacaan kromosom. Menurut
sumbu x histogram (FL-1). Peak pertama pada Cires et al. (2011) salah satu faktor
hasil analisis ploidi Spathoglottis plicata digeser mempengaruhi hasil adalah kandungan
tepat ditengah skala 200 pada FL-1 (Gambar 4). metabolit sekunder khususnya pada tanaman.
Hal ini diartikan bahwa peak yang muncul pada Histogram (Gambar 4 dan 5) yang diperoleh
skala 200 merupakan diploid (Spathoglottis menunjukkan bahwa masih terdapatnya
plicata = 2n) dan pada kelipatannya apabila gangguan berupa peak yang tersebar selain
muncul peak yaitu skala 400 merupakan pada range G0G1-G2M. Senyawa yang dapat
tetraploid (4n) dan seterusnya. Pada Gambar 4 digunakan untuk mengurangi kandungan
menunjukkan bahwa terdapat dua peak yang metabolit sekunder khususnya fenolik pada
terbentuk yang artinya terdapat 2 jenis sel tanaman adalah menambahkan -
dengan ploidi yang berbeda. Peak pertama mercaptoethanol atau polyvinyl pirollidon
berarti sel pada fase G0G1 (2C) dengan jumlah (PVP). Kedua senyawa tersebut mempunyai
sel yang terdeteksi 1282 (CV 6.6%) dan peak ikatan hidrogen yang mampu berikatan dengan
kedua yaitu fase G2M (4C) dengan jumlah sel senyawa fenolik. Tanaman dengan metabolit
552 (CV 5.24%). Kondisi ini sesuai dengan yang tinggi harus diperhatikan sebelum
pembacaan histogram yang dilakukan oleh dilakukan preprasi, seperti yang dilakukan oleh
Schepper et al. (2001) pada tanaman Cires et al. (2011) pada tanaman Violoceae,
Rhododendron. namun ternyata histogram yang dihasilkan
Hasil analisis flow cytometry menunjukkan masih kurang baik karena mempunyai nilai CV
bahwa ploidi Spathoglottis Bintang Segunung yang masih tinggi (10%) walaupun telah
dan plantlet yang berkembang dari eksplan dilakukan preparasi menggunakan buffer Otto,
kultur ovarium adalah sama (Gambar 5). Jumlah LB01, dan Tri.MgCl tetap tidak menghasilkan
sel yang terdeteksi pada bagian A (Gambar 5) histogram yang presisi (CV>5%). Penambahan
adalah 1796 (CV 5.19%) dan bagian B (Gambar senyawa -mercaptoethanol, polyvinyl
5) adalah 1155 (CV 4.35%). Berdasarkan pirollidon (PVP), sodium metabisulphite
Gambar 2 telah diketahui bahwa terdapat dua (SMB), dan dithiothreitol (DTT) juga mampu
sel yang diindikasi dapat berkembang menjadi menekan tingkat oksidasi fenol pada suspense
plantlet yaitu dari sel telur atau dari sel somatik, inti sel namun histogram yang dihasilkan juga
namun berdasarkan analisis flow cytometri kurang bagus, selain itu percobaan
maka dapat dipastikan bahwa sel yang perbandingan yang dilakukan adalah
berkembang menjadi plantlet adalah sel membandingkan sampel yang diisolasi pada
somatik. beberapa variasi organ (daun, akar, dan bunga)
ternyata hasilnya tidak signifikan berbeda dan
File: spathoglottis plicata Date: 21-02-2014 Time: 14:10:52 Particles: 2631 Acq.-Time: 1605 s
100
partec CyFlow menghasilkan histogram yang kurang baik
antar ulangan.
80
Hasil yang dilaporkan oleh Kaewpoo
dan Te-chato (2010) juga menunjukkan hasil
60 yang sama bahwa plantlet yang berkembang
dari sel somatik akan menghasilkan histogram
counts

40
G1 yang identik. Namun Yang dan Loh (2004)
G2 menginterpretasikan bahwa histogram pada
20
Gambar 5 merupakan suatu peristiwa
endopoliploid. Namun hasil tersebut kurang
0
0 200 400
FL1 -
600 800 1000 akurat karena jumlah sel yang terbaca sangat
rendah dan tidak konsisten. Hal lain yang tidak
Gambar 4. Tipikal histogram flow dipaparkan oleh Yang dan Loh (2004) adalah
cytometry inti sel anggrek Spathoglottis CV peak tidak ditampilkan sedangkan ini
plicata yang diisolasi dari daun adalah salah satu parameter pembacaan hasil
yang sangat penting serta tidak adanya gating
invitroplant
histogram sehingga kemungkinan peristiwa
pembacaan hasil oleh flow cytometry dapat
Analisis flow cytometry walaupun
terjadi seperti yang paparkan oleh (Wulff,
banyak digunakan untuk mendeteksi ploidi
2006; Cires et al., 2011).

8
File: spathoglottis bintang segunung K Date: 21-02-2014 Time: 14:23:19 Particles: 3489 Acq.-Time: 374 s File: spathoglottis bintang segunung oparium Date: 21-02-2014 Time: 14:40:22 Particles: 2267 Acq.-Time: 854 s
partec CyFlow partec CyFlow

100 100

80 80

G
60 1 60
G
1
counts

counts
40 40

20
G 20 G
2 2
0 0
0 200 400 600 800 0 1000 200 400 600 800 1000
FL1 - FL1 -

A B
Gambar 5. Tipikal histogram flow cytometry inti sel anggrek Spathoglottis Bintang Segunung dan plantlet
dari eksplan kultur ovarium dengan menggunakan daun tanaman

Dalam melakukan analisis flow kondisi baik dengan pemrograman yang


cytometry banyak hal yang perlu sesuai dengan metode yang digunakan.
diperhatikan. Untuk melakukan analisis flow Analisis flow cytometry pada tanaman pada
cytometry maka pastikan bahwa alat flow umumnya menggunakan sampel daun,
cytometry yang akan digunakan dalam namun bukan berarti seluruh bagian daun
kondisi baik dengan pemrograman yang dapat digunakan dengan baik. Pastikan
sesuai dengan metode yang digunakan. bahwa daun yang akan anda gunakan dalam
Analisis flow cytometry pada tanaman pada kondisi sehat (tidak terserang penyakit) dan
umumnya menggunakan sampel daun, merupakan daun segar. Daun yang paling
namun bukan berarti seluruh bagian daun banyak digunakan adalah bagian pucuk atau
dapat digunakan dengan baik. Pastikan yang masih muda, hindari menggunakan
bahwa daun yang akan anda gunakan dalam daun yang telah layu karena akan
kondisi sehat (tidak terserang penyakit) dan memberikan hasil yang kurang baik dengan
merupakan daun segar. Daun yang paling kandungan metabolit sekunder yang tinggi.
banyak digunakan adalah bagian pucuk atau Pada tanaman sel anggrek, mempunyai
yang masih muda, hindari menggunakan aktivitas DNase yang sangat tinggi, oleh
daun yang telah layu karena akan karenya sampel yang digunakan harus segera
memberikan hasil yang kurang baik dengan dipreparasi untuk menghindari gejala
kandungan metabolit sekunder yang tinggi. postmorterm. Walaupun beberapa peneliti
Pada tanaman sel anggrek, mempunyai seperti Suda & Trvnek (2006a; 2006b) dan
aktivitas DNase yang sangat tinggi, oleh Suda et al. (2007) yang melakukan preparasi
karenya sampel yang digunakan harus segera dengan cara mengeringkan daun tanaman
dipreparasi untuk menghindari gejala terlebih dahulu. Namun hal tersebut tidak
postmorterm. Walaupun beberapa peneliti memberikan hasil yang sama apabila
seperti Suda & Trvnek (2006a; 2006b) dan melakukan preparasi antara sampel segar
Suda et al. (2007) yang melakukan preparasi dengan sampel yang telah dikeringkan.
dengan cara mengeringkan daun tanaman Buffer yang digunakan adalah buffer
terlebih dahulu. Namun hal tersebut tidak Otto dengan DNA stain PI. Penggunaan
memberikan hasil yang sama apabila buffer dalam melakukan preparasi sebelum
melakukan preparasi antara sampel segar analisis flow cytometry memberikan hasil
dengan sampel yang telah dikeringkan. yang cukup signifikan pada peak yang
Dalam melakukan analisis flow dihasilkan (Loureiro et al., 2010). Analisis
cytometry banyak hal yang perlu flow cytometry yang baik adalah peak yang
diperhatikan. Untuk melakukan analisis flow mempunyai Coefficient of Variants (CVs)
cytometry maka pastikan bahwa alat flow yang rendah (x<5,5%) serta pengulangan
cytometry yang akan digunakan dalam yang cukup menggunakan beberapa

9
flourosence (Greilhuber et al., 2007). (2011) bahwa tidak ditemukan peristiwa
Konsentrasi pH buffer mungkin sangat endopoliploidisasi pada bagian daun dan ujung tunas.
mempengaruhi hasil, umumnya pH buffer Hal yang sesuai dengan histogram hasil flow
yang digunakan adalah 7-8. Penggunaan cytometry pada tanaman anggrek Spathoglottis
buffer isolasi lain yang lebih baik Bintang Segunung.
menghasilkan peak (CV<5%) adalah LB01
dibandingkan buffer Otto (Schepper et al., 4. KESIMPULAN
2001).
Proses pemotongan sampel menjadi salah satu Berdasarkan penelitian yang telah
faktor dalam pembacaan hasil. Pemotongan sampel dilaksanakan maka dapat disimpulkan bahwa:
yang terlalu banyak dapat menurunkan pH buffer, 1. Konsentrasi optimal senyawa 2,4-Dichloro-
menyebabkan warna suspensi menjadi phenoxyacetic acid (2,4-D) dan cold shock
kehitaman,dan jumlah presipitat yang tinggi 10oC yang mampu menginduksi
terkadang memberikan hasil yang jelek. Untuk perkembangan eksplan kultur ovarium
menghindari hal tersebut sampel tidak dipotong dengan signifikansi 2% adalah 1 ppm 2,4-D
terlalu banyak atau mengurangi jumlah sampel. dan 4 jam perlakuan, serta interaksi keduanya
Waktu pewarnaan DNA juga sangat penting, lama mempunyai signifikansi 1,9%.
inkubasi tiap spesies tanaman dapat berbeda-beda. 2. Konsentrasi optimal senyawa 6-
Umumnya 20-60 menit, tergantung dari laju
Benzylaminopurine (BAP) yang mampu
kemampuan degradasi dari tanaman, pada tanaman
anggrek, laju aktivitas endonuklease cukup tinggi menginduksi embriogenesis eksplan kalus
sehingga waktu perwarnaan yang dibutuhkan hanya anggrek Spathoglottis Bintang Segunung
15-30 menit. dengan signifikansi 0,62% yaitu 2,5 ppm
Kudo dan Kimura (2001) menyatakan bahwa BAP.
variasi level ploidi selular yang disebut endopoliploid 3. Ploidi plantlet yang beregenerasi dari kultur
atau poliploidi somatik adalah suatu peristiwa yang ovarium adalah sama dengan tanaman
dapat terjadi pada banyak eukariot. Sampai tahun sumber eksplan yang berarti sel yang
2001 diketahui bahwa 90% tanaman angiospermae beregenerasi berasal dari sel somatik. Tingkat
mengalami endopoliploid dengan frekuensi tertinggi ploidi anggrek Spathoglottis Bintang
yang merupakan bagian dari endopoliploidisasi Segunung adalah triploid apabila
disebut endoreduplikasi. Endoreduplikasi adalah
dibandingkan dengan tingkat ploidi
peristiwa penggandaan DNA selular tanpa
melibatkan pembelahan sel secara mitosis (Kolano et Spathoglottis plicata sebagai kontrol diploid.
al., 2008). Menurut Valeria dan Martonfi (2011)
persebaran sel yang mengalami endopolipoliploid
adalah spesifik pada tiap organ, terutama terjadi pada 5. REFERENSI
Trifolium pretence yaitu pada bagian karpel, daun
bunga, percabangan bunga dan pada batang, namun Aliyu, O.M. 2012. Development of the flow
tidak ditemukan pada eksplan daun, akar, dan cytometric for ploidy analysis and
stamen. Kudo dan Kimura (2001) melaporkan bahwa determination of relatif nuclear DNA content in
ploidi pada tanaman Raphanus sativus dapat Cashew (Anacardium occidentale Linn.).
mencapai 32C. Endopoliploid tidak ditemukan pada American Journal of Biotechnology and
embrio biji. Peristiwa endopoliploid meningkat cepat Molekular Biology, 2(4):200-215.
dan ekstensif seiring perkembangan pembentukan Bouatrous, Y., E.A.A.A. Elhady, A. Djekoun, and N.
radikula dan hipokotil, namun peristiwa ini tidak Yekhlef. 2010. Production of Haploid Green
ditemukan pada bagian ujung tunas. Pada tanaman Plants by Intergeneric Crossing of Triticum
Chenopodium quinoa berdasarkan penelitian Kalano durum Desf x Zea mays L. American-Eurasian
et al., (2008) menyatakan bahwa pola J. Agric. & Environ. Sci. 7 (5): 512-517.
endoreduplikasi berkorespondensi dengan fase George, E.F., M.A. Hall, and G.J.D. Klerk. 2008.
perkembangan dan jenis organ. Peristiwa polisomatik Plant propagation by tissue culture. 3rd Ed.
sudah mulai terbentuk pada bagian radikula dari Springer, UK. p: 117.
embrio biji yang telah berimbibisi. Seiring Cires, E., C. Cuesta, M.A.F. Casado, H.S. Nava,
perkembangan seedling, maka peristiwa V.M. Vazquez, and J.A.F. Prieto. 2011.
endopoliploidisasi sudah terjadi pada pada banyak Isolation of plant nuclei suitable for flow
organ seperti akar, hipokotil dan kotiledon. Selain itu cytometry from species with extremely
hasil Kalano et al., (2008) sesuai dengan penelitian mucilaginous compouns: an example in the
Kuda dan Kimura (2001) dan Valeria dan Martoni genus Viola L. (Violaceae). Anales del Jardin

10
Botanico de Madrid, 68(2):139-154. unggul (Spathoglottis) hasil poliploidisasi
Doleel, J., J. Greilhuber, and J. Suda. 2007. dengan kolkisin. Laporan Akhir Program
Estimation of nuclear DNA content in plants Kreativitas Mahasiswa 2013. Hal: 7.
using flow cytometry. Nat Protoc, 2:2233 Shalaby, T.A. 2007. Faktors affecting haploid
2244. induction through in vitro gynogenesis in
Greilhuber, J., E.M. Temsch, and J.C.M. summer squash (Cucurbita pepo L.). Scientia
Loureiro. 2007. Nuclear DNA content Horticulturae, 115: 1-6.
measurement. WileyVCH Verlag GmbH Soeradikoesoemo, 2008. Buku Petunjuk Praktikum
& Co. KGaA, Weinheim, 4:67 101. Mikroteknik Tumbuhan. Fakultas Biologi
Irawati. 2002. The Conservation of Orchid Species UGM, Yogyakarta.
in Indonesia. Proceeding of Indonesian Orchid Suda, J. and P. Trvnicek. 2006a. Reliable DNA
Seminar, at Yogyakarta, October 20. 2002, p. ploidy determination in dehydrated tissues of
46- 56. vascular plants by DAPI flow cytometry: new
Kaewpoo, M. and S. Te-chato. 2010. Studi on ploidi prospects for plant research. Cytometry,
level of micropropagated Jatropha curcas L. 69A:27380
via flow cytometry. Journal of Agricutural Suda, J. and P. Trvnicek. 2006b. Estimation of
Technology, 6(2):391-400. relatif nuclear DNA content in dehydrated plant
Kartikaningrum, S. 2012. Pengembangan Teknologi tissues by flow cytometry. Current Protocols in
Haploid pada Anyelir (Dianthus sp.). Desertasi Cytometry. John Wiley & Sons, New York, pp.
IPB. Hal. 15. 7.30.17.30.14
Kartikaningrum, S., T.S. Nur, Q. Hayati, dan Suda, J., P. Kron, B.C. Husband, and P.
Suryanah. 2004. Hibridisasi anggrek Trvncek. 2007. Flow cytometry and
Spathoglottis secara konvensional. Laporan ploidy: applications in plant sistematics,
Akhir Tahun Balai Penelitian Tanaman Hias, ecology and evolutionary biology. Wiley
Segunung, Cianjur. hlm:74-82. VCH Verlag GmbH & Co. KGaA,
Kolano, B., D. Siwinska, and J. Maluszynska. Weinheim, 5:10330.
2008. Endopoliploidy patterns during Svirshevskaya, A.M. and J. Dolezel. 2000.
development of Chenopodium quinoa. Acta Production and Performance of Gynogenetic
Biologica Cracoviensia, 51(2):85-92. Sugarbeet Lines. Journal of Sugar Beet
Kolar, F. and M. Lucanova. 2010. Glycerol-treated Research, 37(4): 117-133.
nuclear suspensions-an efficient preservation Teng, W.L., Nicholson, and M.C. Teng. 1997.
method fol flow cytometric analysis of plant Micropropagation og Spathoglottis plicata.
samples. J. Crhomosome Res 18(3): 1-15.Kudo. Plant Cell Reports, 16:831-835.
N. and Y. Kimura. 2001. Flow cytometry Valeria, K. and P. Martonfi. 2011. Endopoliploidi in
analysis for sistemic endopolyploidy in Trifolium pretense L. Caryologia, 64(4):419-
development of Radish (Raphanus sativus L.). 426.
Plant Biotechnology, 19(1):45-52. Wulff, S. 2006. Flow Cytometry. 2nd Ed. Dako,
Loureiro, J., P. Trvnek, T. Urfus, P. Vt, M. California. USA.
tech, S. Castro, and J. Suda. 2010. The use Yang, M. and C.S. Loh. 2004. Sistemic
of flow cytometry in the biosistematics, endopolyploid in Spathoglottis plicata
(Orchidaceae) development. BMC Cell Biology,
ecology and population biology of
5:33.
homoploid plants. Preslia 82:321.
Schepper, S.D., L. Leus, M. Mertens, E.V.
Bockstaele, and M.D. Loose. 2001. Flow
cytometry analysis of ploidy in Rhododendron
(subgenus Tsutsusi). Hort. Science, 36(1);125-
127.
Semiarti, E., A. Indrianto, dan A.B. Sasongko. 2010.
Identifikasi Genotip Hibrida Hasil Persilangan
Anggrek Lokal Vanda tricolor Lindl. Var suavis
Asal Merapi dan Vanda limbata Blume. dengan
PCR-RFLP pada daerah Intergenik trnL-F
DNA kloroplas. Seminar Nasional Biologin
Fakultas Biologi.Hlm. 754-757.
Setiawan, A., A.N. Shochicha, A.A.C. Pramana, dan
Restiyanti. 2013. Pengembangan marka
molekular untuk karakterisasi anggrek tanah
11
12