Anda di halaman 1dari 9

TUGAS PERIODONTAL

Pengendalian Pembentukan Biofilm Oral oleh


Decapeptide antimikroba

Disusun oleh

Nama : Allisyia Permata Sari

NIM : 04101004068

Universitas Sriwijaya

Fakultas Kedokteran Prog.Studi Kedokteran Gigi

2011/2012
Pengendalian Pembentukan Biofilm Oral oleh Decapeptide antimikroba

Abstrak

Oral biofilm dicampur-spesies mikroba masyarakat, dan hasil tak terkendali mereka
dapat mengekspresikan sebagai penyakit mulut. Antimikroba peptida merupakan kelas
alternatif antimikroba yang menunjukkan selektivitas untuk prokariota. Kami ingin menguji
efek dari sintetik decapeptide antimikroba, KSL, pada pengembangan biofilm lisan dibentuk
oleh terisolasi bakteri saliva manusia. Kami menggunakan diferensial gangguan kontras
mikroskop, ditambah dengan dual-sistem aliran sel, untuk menentukan efek KSL pada
pengembangan biofilm lisan. kami menggunakan pengurangan jumlah yang layak dan
confocal mikroskop untuk menilai aktivitas bakterisidal KSL pada biofilm lisan dewasa. KSL
efektif diblokir perkembangan biofilm. Sebuah dampak yang signifikan pada kelangsungan
hidup biofilm matang diamati ketika KSL digunakan dalam kehadiran surfaceactive agen,
atau setelah biofilm secara mekanis terganggu. Studi ini menunjukkan bahwa mungkin KSL
berguna tambahan untuk kebersihan oral konvensional untuk mencegah plak-dimediasi
penyakit gigi.

KATA KUNCI: biofilm mulut, bakteri saliva, antimikroba peptida, dual-aliran sel,
surfaceactive agen.

PENDAHULUAN
Biofilm mulut manusia yang kompleks tiga-dimensi struktur yang terdiri komunitas mikroba
beragam dan multispecies terbentuk pada colonizable permukaan (Kolenbrander dan London,
1993; Marsh dan Bradshaw, 1995; Foster et al, 2004;. Kolenbrander dan Palmer, 2004).
Selain dari sifat fisik dan kimia substrat yang permukaan, yang memiliki dampak yang
signifikan pada akumulasi bakteri (Quirynen et al., 2000), pembentukan biofilm lisan
melibatkan serangkaian acara. Hal ini mencakup awal pembentukan sebuah film air liur yang
diturunkan AC (yang diakuisisi ludah pellicle) pada permukaan colonizable, lampiran
penjajah utama untuk tuan yang diturunkan molekul reseptor hadir dalam pellicle diperoleh,
selanjutnya interaksi penjajah sekunder dengan awal terpasang penjajah, diikuti oleh
proliferasi bakteri menempel (Penjajahan), dan pengembangan komunitas mikroba yang
matang (Kolenbrander dan London, 1993; Marsh dan Bradshaw, 1995; Quirynen et
al, 2000).. Pertumbuhan mikroba yang tidak terkontrol penduduk tertentu dalam masyarakat
dapat berkontribusi terhadap perkembangan penyakit mulut (Loesche, 1999). Peptida
antimikroba menunjukkan berbagai aktivitas antibakteri dan dapat memainkan peran dalam
perlindungan terhadap infeksi (Raj dan Dentino, 2002; Zasloff, 2002; Koczulla dan Bals,
2003; Finlay dan Hancock, 2004). Untuk Misalnya, epitel yang berasal peptida antimikroba
seperti manusia-defensin?-3 bisa melindungi host dari infeksi yang disebabkan oleh patogen
periodontal (Bissell et al., 2004). Kami sebelumnya menunjukkan (Concannon et al., 2003)
bahwa decapeptide-heliks? antimikroba, KSL, memiliki berbagai aktivitas mikrobisida, dan
efektif membunuh strain patogen dipilih lisan, Mutans streptococci termasuk. Namun,
kemampuan untuk mengendalikan biofilm lisan pembentukan biofilm dan merusak lisan utuh
belum ditentukan. Dalam studi ini, kami mengadopsi penggunaan air liur-dilapisi
hidroksiapatit (HA) dan germanium (Ge) (Herles et al., 1994) disk sebagai permukaan
tumbuh untuk oral biofilm yang dibentuk oleh bakteri saliva. Kami menggunakan sistem sel
dual-aliran, terdiri dari 2 kamar aliran individu, untuk menguji efek dari kami
antimikroba decapeptide, dibandingkan dengan kontrol, dalam mempengaruhi biofilm
pembentukan, dan terhadap biofilm dikembangkan.

BAHAN & METODE

Sintesis dari Decapaptide antimikroba, KSL KSL (KKVVFKVKFK-NH2) disintesis oleh


standar-padat fase prosedur, dengan 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) kimia, pada peptida
otomatis synthesizer (Model 90, Advanced ChemTech, Louisville, KY, USA), dan
kemurnian yang ditentukan sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya (Concannon et al.,
2003).

Buffer dan Media

Buffer saliva buatan disiapkan seperti telah dijelaskan sebelumnya (Shellis, 1978).

Sebuah media berbasis air liur (Williams, 1999) digunakan untuk in vitro plak uji sistem.
Koleksi Air liur dan Isolasi Bakteri saliva Prosedur untuk mengumpulkan manusia air liur
dan bakteri saliva mengisolasi telah dijelaskan sebelumnya (Concannon et al., 2003).
Penelitian ini disetujui oleh Kelembagaan Review Board dari Walter ReedTentara Lembaga
Penelitian, dan informed consent diperoleh dari semua relawan. Dual-aliran your Sistem
Dual-aliran sel sistem yang digunakan dalam studi dimodifikasi dari chemostat aliran sel dari
Herles et al. (1994) dan dibangun sesuai dengan kami desain dan spesifikasi dengan
BioSurface Technologies (Bozeman, MT, USA) (Gambar 1). Aliran sel terdiri dari 2
kompartemen, masing-masing mengandung aliran polikarbonat ruang dengan 3 ceruk untuk
menahan Ge disk (10 mm dan 1,8 mm ketebalan) di mana biofilm dibentuk. Ge disk yang
disediakan permukaan reflektif yang memungkinkan kita untuk memvisualisasikan biofilm
ternoda menggunakan diferensial gangguan kontras (DIC) mikroskop. Untuk membentuk
biofilm, kita AC Ge disk (Mindrum, Rancho Cucamonga, CA, AS) di sel dual-aliran selama 1
jam dengan steril 50% air liur seluruh manusia. Terpencil bakteri saliva, disesuaikan dengan
sekitar 1,0 x 107 sel / mL pada Air liur 50% (total 1,5 mL), yang disuntikkan ke dalam ruang
aliran. Setelah 2 jam kepatuhan awal bakteri ke permukaan disk, aliran media kultur (20%
Todd- Hewitt kaldu) dimulai pada tingkat 0,2 mL / menit (Foster et al., 2004). Para laju aliran
digunakan menghasilkan laju geser sekitar 9,65 s-1 pada substrat permukaan, kompatibel
dengan aliran fluida dilaporkan dalam rongga mulut (Bakker et al., 2003). Untuk
mengevaluasi efek dari KSL dalam mengendalikan pengembangan dan pematangan biofilm
lisan, kami terus perfusi permukaan sel ditaati (setelah kolonisasi awal) dengan
KSL-bebas atau KSL-berisi media (KSL pada 10 atau 50 g / mL?). Atau, biofilm pada
berbagai tahap pematangan (yaitu, 4 atau 6 jam setelah inokulasi) adalah pulsa-diperlakukan,
dengan cara yang injeksi pompa, sebesar 0,2 mL / menit dengan 50? g / mL KSL pada 20%
Todd-Hewitt kaldu atau dengan media kontrol selama 30 menit pada twohour
interval. Langsung perbandingan efek antimikroba pada pertumbuhan biofilm antara sel
dirawat dan diobati adalah dibuat secara real time dengan mikroskop LPS.
Bakterisida Kegiatan KSL terhadap Biofilm Lisan Dalam hubungannya dengan sistem sel
dual-aliran, kami menggunakan modifikasi dari suatu model plak in vitro pembentukan
biofilm (Guggenheim et al., 2001) untuk menentukan efek antimikroba diuji dan lainnya
agen pada biofilm lisan dikembangkan (lihat LAMPIRAN untuk rincian). HA disk (Clarkson,
Selatan Williamsport, PA, USA) digunakan sebagai substrat untuk bakteri saliva untuk
membentuk biofilm. Untuk menentukan aktivitas penghambatan KSL pada lisan
dikembangkan biofilm, kami ditransfer disk yang mengandung 45-jam berusia biofilm untuk
sumur berair KSL mengandung (200 g / mL; 1 mL / baik). Berikut 30 menit paparan pada 37
C, disk dibilas 3 kali dengan 1 mL garam dan ditransfer ke steril 15 mL tabung
polypropylene berisi 1 mL PBS. Biofilm pada permukaan sel patuh (setelah
pengobatan) yang ditemukan oleh sonikasi selama 2 menit pada 5 Watts dengan
Microson pengganggu sel ultrasonik dilengkapi dengan tanduk cangkir (Misonix Inc,
Farmingdale, NY, USA). Pengaturan, termasuk waktu yang Interval yang digunakan dalam
sonication, adalah pra-ditentukan secara empiris untuk menghasilkan pemulihan maksimal
patuh biofilm sel. Kami menilai pengaruh KSL pada terganggu biofilm dengan memulihkan
biofilm sel dari disk HA (45-hourold biofilm) melalui sonikasi sebagai dijelaskan di atas.
Biofilm terpisah sel (dalam dH2O steril) dicampur dengan volume yang sama KSL berair
untuk mendapatkan konsentrasi peptida akhir dari 200? g / mL, dan reaksicampuran
diinkubasi pada 37 C selama 30 menit. Kami mengakhiri interaksi KSL dan ditangguhkan
biofilm sel dengan mencucinya dalam PBS. Untuk menentukan efek dari aktif-permukaan
agen (benzalkonium klorida, Sigma, St Louis, MO, USA) dalam mempromosikan
pembunuhan utuh biofilm dengan KSL, kami diperlakukan 66-hourold lisan biofilm dengan
KSL (200 ? G / mL), benzalkonium klorida (0,001%), atau kombinasi dari dua
agen, diikuti oleh jumlah yang layak penentuan dan laser confocal mikroskop pemindaian
diperlakukan sampel. Para benzalkonium klorida dosis yang telah ditentukan secara empiris
untuk pemilihan konsentrasi agen menunjukkan bakterisida minim aktivitas. Kami
menetapkan jumlah yang layak biofilm sel berasal dari disk diperlakukan atau terganggu
biofilm dengan pelapisan spiral serial sampel diencerkan ke darah agar-agar piring. Distilasi
air atau 0,12% klorheksidin berair digluconate (Sigma) digunakan sebagai negatif atau
kontrol positif, masing-masing. The 45 - jam berusia biofilm yang terkena klorheksidin
selama 1 menit, dan air selama 30 menit pada 37 C. HASIL Interaksi KSL dengan Biofilm
Oral Terbentuk dalam aliran your Dual- Untuk menentukan apakah KSL telah antibiofilm
kegiatan, kami memeriksa efek dari berbagai konsentrasi KSL pada pengembangan biofilm
lisan. Menggunakan mikroskop DIC, kami mengamati kepatuhan saliva bakteri ke
permukaan air liur Ge-AC dalam aliran ruang 2 jam setelah inokulasi aliran sel (Gbr. 2Aa,
2Ad, 2Ba, 2Bc). Setelah lampiran bakteri ke permukaan, ruang alir perfusi terus menerus
dengan budaya menengah dengan atau tanpa KSL. Dalam ruang aliran perfusi dengan KSL
menengah kurang, microcolonies dibentuk 5 jam setelah inokulasi (Gambar 2Ab) dan terus
berkembang menjadi film seperti struktur setelah 8 jam (Gambar 2Ac). Sebaliknya, KSL di
50 g /? ML terganggu perkembangan biofilm. Bakteri tetap terpasang, tetapi gagal untuk
membentuk microcolonies dan film-seperti struktur (Gbr. 2Ad-2Af). Selanjutnya, pada 10
KSL? G / mL sebagian efektif dalam menghambat pembentukan biofilm. Microcolonies
terbentuk 8 jam setelah inokulasi (Gambar 2Bc-2Bd), sedangkan bakteri tidak diobati ludah
menempel membentuk suatu filmlike struktur (Gbr. 2Ba, 2Bb). Sementara perfusi terus KSL
medium yang mengandung untuk ruang aliran saliva mencegah bakteri menempel dari
membedakan ke dalam biofilm pada permukaan Ge AC, kami juga tertarik dalam
menentukan apakah KSL bisa mengganggu proses pembangunan dengan perlakuan biofilm
berdenyut sel pada titik waktu yang berbeda setelah inokulasi. Seperti ditunjukkan dalam
Gambar. 3A (ac) pengobatan, berdenyut (30 menit pada 0,2 mL / menit untuk setiap
dua jam interval) dari sel-sel biofilm 4 jam setelah inokulasi dengan KSL-bebas menengah
tidak mencegah bakteri menempel ludah berkembang menjadi biofilm. Sebaliknya, berdenyut
pengobatan sel biofilm 4 jam setelah inokulasi dengan KSL mengandung
menengah (50 g / mL?) menghambat pembentukan biofilm (Gbr. 3Ad- 3Af). Namun,
dibandingkan dengan kontrol (Gbr. 3Ba-3Bc),berdenyut pengobatan biofilm 6 jam setelah
inokulasi dengan KSLcontaining media gagal untuk menghambat atau mengubah
perkembangan struktur biofilm (Gbr. 3Bd-3Bf). Interaksi dari KSL dengan Utuh dan
terganggu Biofilm Mulut Aliran-sel kita percobaan menunjukkan bahwa biofilm lisan matang
kurang rentan terhadap KSL. Sebaliknya, paparan patuh bakteri saliva atau sel biofilm untuk
KSL pada tahap awal pengembangan menghambat pengembangan lebih lanjut mereka
menjadi dewasa tumbuh biofilm. Dalam konteks ini, kami tertarik menentukan,
menggunakan uji in vitro plak di, apakah struktur terorganisir dari biofilm lisan
dikembangkan berkontribusi perlawanan dari biofilm lisan matang untuk KSL. Ada
pengurangan jumlah kecil yang layak (p <0,05) bila 45 utuh - jam berusia biofilm yang
terbentuk pada air liur mulut-AC disk HA yang terkena KSL (Gambar 4A). Penurunan lebih
besar dari yang layak jumlah diamati dengan biofilm utuh diobati dengan 0,12%
klorheksidin. Ketika biofilm secara mekanis terganggu oleh sonication sebelum pengobatan
KSL, ada jauh lebih besar (1,8 log) pengurangan viabilitas KSL-diperlakukan sel
dibandingkan dengan sel diperlakukan dH2O-kontrol. Ada juga penurunan yang signifikan
dari kelangsungan hidup di terganggu biofilm dibandingkan dengan biofilm utuh
diperlakukan dengan sama konsentrasi KSL. Interaksi dari KSL dengan Biofilm oral Utuh
dalam Kehadiran Agen Permukaan-aktif Karena struktur terorganisir dari biofilm mungkin
mempengaruhi biofilm kerentanan terhadap antimikroba, kami tertarik menentukan,
menggunakan uji in vitro dalam plak, efek dari aktif-permukaan agen, benzalkonium klorida,
dalam mempromosikan membunuh sel biofilm oleh KSL. Dibandingkan dengan air
pengobatan, KSL, di hadapan benzalkonium klorida (0,001%), secara signifikan mengurangi
kelangsungan hidup (lebih dari satu log pengurangan) dari 66-jam berusia biofilm oral
kepada batas yang mirip dengan yang disebabkan oleh klorheksidin (Gambar 4B). KSL (200
g / mL?) Atau benzalkonium klorida (0,001%) saja memiliki efek kurang pada viabilitas dari
biofilm. Hasil ini dikonfirmasi oleh pewarnaan hidup / mati dari sampel diperlakukan seperti
diungkapkan oleh confocal mikroskop (Gambar 4C). PEMBAHASAN Penggunaan sel dual-
aliran yang mengandung colonizable dilepas permukaan, bersama-sama dengan bakteri saliva
terisolasi, menyediakan metode alternatif untuk pemeriksaan efek antimikroba pada biofilm
lisan formasi. Penggunaan ludah manusia bakteri sebagai benih plak sangat relevan, karena
ini berasal dari bakteri biofilm terbentuk pada jaringan keras dan lunak di rongga mulut
(Helmerhorst et al., 1999). Sistem ini memungkinkan untuk nondestructive tersebut,
perbandingan langsungbiofilm pembangunan antara diperlakukan dan kelompok kontrol
negatif. Dalam sistem tes, KSL nyata dicegah biofilm pembangunan sebagai
dibandingkan dengan kontrol. Kami beralasan bahwa penghambatan diamati mungkin karena
antimikroba kegiatan KSL. Kami telah menunjukkan bahwa KSL exerts aktivitas antimikroba
dengan Target destabilisasi membran bakteri (Concannon et al., 2003). Sebaliknya,
mengekspos lisan biofilm didirikan (45 -jam berusia biofilm) untuk KSL tidak
mengganggu struktur atau sebab apapun yang besar pengurangan viabilitas sel biofilm. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa, sekali dikembangkan, biofilm lebih tahan untuk KSL.
Menariknya, sifat serupa yang diamati denganlaktoferin, komponen antimikroba asli yang
berlimpah hadir dalam sekresi permukaan. Perfusi berkelanjutan laktoferin pada sub-hambat
konsentrasi dicegah biofilm pengembangan oleh Pseudomonas aeruginosa. Namun,
laktoferin, seperti KSL, gagal untuk mengubah struktur matang biofilm (Singh et al., 2002).
Beberapa faktor mempengaruhi kerentanan biofilm untuk antimikroba (Gilbert et al, 1997;..
Campanac et al, 2002; Stewart et al., 2004). Kami hipotesis bahwa mengurangi kerentanan
biofilm lisan dikembangkan untuk KSL bisa disebabkan terbelakang difusi atau pengecualian
dari antimikroba kami, yang dipaksakan oleh tiga-dimensi struktur biofilm dan / atau adanya
exopolymeric zat. Untuk menguji ini, kami terganggu oral biofilm ditanam di air liur-dilapisi
permukaan HA dibentuk oleh bakteri saliva, dan menentukan kerentanan ini terganggu sel
biofilm untuk KSL dibandingkan dengan biofilm utuh. Kami beralasan bahwa gangguan
struktur biofilm akan meningkatkan aksesibilitas dari sel-sel biofilm yang ditargetkan untuk
kami antimikroba agen. Memang, prosedur gangguan sangat meningkatkan kerentanan sel
biofilm dari terganggu karena dibandingkan dengan biofilm lisan utuh, menunjukkan bahwa
struktur terorganisir dari biofilm mungkin memainkan peran dalam mempengaruhi
kerentanan biofilm utuh terhadap antimikroba. Namun, kita tidak yakin apakah kerentanan
berkurang diamati dengan biofilm yang utuh juga disebabkan oleh exopolymers yang
mungkin berhubungan dengan sel biofilm. Selanjutnya, subbactericidal konsentrasi
benzalkonium klorida, yang dikenal kationik aktif-permukaan agen (Baker et al., 1978),
secara signifikan dipromosikan kerentanan biofilm untuk KSL. Meskipun kita tidak
jelas tentang mekanisme yang mendasari, salah satu kemungkinan penjelasan adalah bahwa
kehadiran sub-hambat konsentrasi benzalkonium klorida dapat memfasilitasi aksesibilitas
sel biofilm berada dalam biofilm lisan utuh untuk KSL oleh mempengaruhi struktur biofilm.
Atau, agen kationik benzalkonium klorida dapat memberikan efek sinergis pada
bakterisida kegiatan KSL dalam membunuh bakteri saliva. Kesimpulannya, temuan bahwa
KSL mencegah pengembangan biofilm lisan meningkatkan kemungkinan bahwa KSL
bisa menjadi tambahan yang berharga untuk pasta gigi untuk mencegah plak gigi dimediasi
penyakit. Hal ini terutama relevan sejak KSL efektif dalam membunuh sel biofilm lisan
terganggu. Gangguan ini bisa dihasilkan oleh mekanik menyikat dan / atau flossing selama
prosedur kebersihan mulut.