Anda di halaman 1dari 2

1.

Konstruksi bagian Plasmid

Plasmid pOptiVecTOPO dan pcDNA3.3TOPO (Invitrogen, USA) digunakan sebagai vektor


ekspresi. Urutan gen sintetik cDNA kodon-dioptimalkan dari rantai berat (HC) dan rantai
ringan (LC) mAb dari Adalimumab (pUC57 HC-Adalimumab dan pUC57 LC-Adalimumab,
masing-masing) untuk sel CHO yang dipesan dari layanan-gen (St. Petersburg , Rusia).
Plasmid dimodifikasi dengan mentransfer fragmen DNA yang mengkode HC dan LC gen dari
vektor donor ke plasmid. Untuk melakukan hal ini, plasmid diperlakukan dengan enzim
restriksi BamHI, XbaI, dan Agei (tas Fermen-, Lithuania). Pemisahan fragmen DNA dilakukan
dengan elektroforesis gel agarosa 1,0% menggunakan Sub-Sel GT System (Bio-Rad, USA).
Untuk elusi fragmen DNA dari gel, kami menggunakan QIAquick berputar kolom kit (Qiagen,
USA). Kemudian, fragmen yang dihasilkan tersebut diikat bersama-sama dengan T4 DNA
ligase (Thermo Fisher Scientific, Lithuania) untuk menciptakan vektor ekspresi berikut:
pcDNA-LC Adali- mumab; pOptiVec-HC Adalimumab; pOptiVec-LC Adalimumab; dan
pcDNA3.3-HC Adalimumab.

Untuk mendapatkan konsentrasi yang diinginkan DNA untuk transfeksi sementara sel CHO,
kami mengubah sel coli XL1 E. kompeten oleh elektroporasi dengan campuran ligasi yang
diperoleh. Isi dari plasmid DNA terisolasi dari klon bakteri yang dihasilkan dikonfirmasi
dengan analisis restriksi.

Untuk transfeksi yang sangat murni ( transfeksi kelas) diisolasi DNA plasmid, kami
menggunakan Plasmid Maxi kit (QIAGEN, USA). Perakitan yang tepat dari vektor ekspresi
diverifikasi oleh analisis restriksi. Urutan nukleotida dari kedua gen diverifikasi oleh
sekuensing.

2. Mengkultur CHO-S dan CHO-DG44

kultur sel dilakukan di 125 mL Erlenmeyer dalam CO2 Multitron Sel pengocok-inkubator
(Infors HT, Swiss) yang beroperasi pada kecepatan 125 rpm dalam Phere atmos- dari 5 % CO2,

pada suhu 37 C dan 95% kelembaban. Reseeding itu per- dibentuk setiap 3-4 hari untuk
kepadatan 0,3-0,5 106 sel / mL. Menggunakan CD DG-44 (teknologi Life, USA) dan
PowerCHO 2CD (Lonza, Swiss) bebas serum media yang dukungan- telah diimplementasikan
dengan 8 mM L-glutamin. Jumlah sel dan analisis kelayakan dilakukan setelah pewarnaan
dengan biru tripan (Panreac, Spanyol) menggunakan counter sel TC10 otomatis (Bio-Rad,
USA).
3. Transfeksi CHO-DG44 dan CHO-S garis sel

Transfeksi dilakukan dengan menggunakan kombinasi vektor ekspresi: pcDNA3.3 LC


Adalimumab + pOptiVec HC Adalimumab dan pOptiVec LC Adalimumab + pcDNA3.3 HC
Adalimumab, menggunakan agen lipofilik FreeStyle MAX (itrogen Inv-, USA).

Sebelum transfeksi, sel-sel kembali berlapis untuk kepadatan 0.5- 0,6 106 sel / mL. Pada hari
transfeksi, densitas sel ditentukan, dan sel-sel pellet dengan sentrifugasi pada 200 g selama 10
menit pada suhu kamar dalam Allegra 25-R centrifuge (Beckman, Jerman). Supernatan telah
dihapus oleh dekantasi, dan sel-sel dihentikan di FreeStyleTM CHO Expression Medium,
mengandung 8 mM Alanyl-glutamin (baik reagen berasal dari Invitrogen, USA) untuk
kepadatan akhir dari 1,2 1,5 106 sel / mL. Transfeksi lanjut dilakukan di piring 6-baik, sesuai
dengan instruksi pabrik (FreeStyle CHO-DG44 Sel, Invitrogen, USA). Efisiensi tion Transfec-
dinilai dengan mikroskop fluoresen sel dengan plasmid pEYFP dan filter warna biru. Efisiensi
transfeksi dievaluasi secara visual menggunakan mikroskop CKX41 (Olympus, Jepang).