Anda di halaman 1dari 24

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Healthcare associated infections (HAI) adalah infeksi yang didapatkan

seorang pasien ketika berada di rumah sakit, dimana infeksi tersebut tidak ada

atau tidak dalam masa inkubasi saat pasien mulai dirawat. Prevalensi healthcare

associated infections berkisar antara 3,5% sampai 12% di negara maju, dan 5,7%

sampai 19,1% di negara berkembang. Prevalensi HAI di Indonesia sendiri

diperkirakan mencapai 7,1%. (WHO.2011)

Kejadian healthcare associated infections pada jenis atau tipe rumah sakit

tertentu di Indonesia sangat beragam. Penelitian yang dilakukan oleh Depkes RI

pada tahun 2004 menunjukkan data proporsi kejadian healthcare associated

infections dirumah sakit pemerintah dengan jumlah pasien 1.527 orang dari

jumlah pasien berisiko 160.417 (55.1%), sedangkan untuk rumah sakit swasta

jumlah pasien 991 dari jumlah pasien yang berisiko 130.047 (35,7%) dan untuk

rumah sakit ABRI dengan jumlah pasien 254 dari jumlah pasien berisiko 1.672

(9,1%) (Jumriah.2013)

Staphylococcus aureus merupakan salah satu bakteri yang paling sering

menyebabkan healthcare associated infections. Penelitian Central Public Health

Laboratory (dalam Harris.2002) menujukkan bahwa lebih dari 4% pasien yang

yang mengalami operasi pada 96 rumah sakit di Inggris selama 1997-1999

mengalami healthcare associated infections, dimana 81% dari infeksi tersebut

disebabkan S. aureus. Studi Rubin (1999) menunjukkan bahwa infeksi S. aureus

dapat meningkatkan lama rawat, kematian, dan biaya hingga kurang lebih dua kali
2

lipat. S. aureus dapat menyebabkan infeksi yang relatif ringan sampai infeksi

yang dapat mengancam nyawa seperti pneumonia, bakteremia, dan endokarditis.

Salah satu faktor virulensi yang penting dalam healthcare associated infections

oleh S. aureus adalah kemampuannya membentuk biofilm pada permukaan

perangkat medis.

Biofilm didefinisikan sebagai kumpulan bakteri yang melekat pada

permukaan padat atau satu sama lainnya yang terbungkus dalam matriks

ekstraseluler polisakarida. Biofilm memiliki peranan penting dalam healthcare

associated infections, terutama yang berhubungan dengan penggunaan perangkat

medis seperti kateter intravaskular, kateter urin dan implan ortopedik.

Disinfeksi dan sterilisasi perangkat medis merupakan salah satu cara untuk

menanggulangi pembentukan biofilm pada perangkat medis. Akan tetapi, biofilm

yang terbentuk pada permukaan perangkat medis tersebut seringkali memiliki

tingkat resistensi yang tinggi terhadap antimikroba, sehingga dapat terjadi

penurunan efektifitas disinfeksi.

Mengingat besarnya peranan biofilm dalam kejadian healthcare

associated infections, maka diperlukan metode disinfeksi yang tepat untuk dapat

mengatasi pembentukan biofilm pada perangkat medis sehingga dapat

mengurangi angka kejadian healthcare associated infections di rumah sakit.

1.2 Rumusan Masalah

Dengan memperhatikan latar belakang masalah di atas dapat dibuat

rumusan masalah sebagai berikut: Bagaimanakah efek perbedaan lama inkubasi

terhadap aktifitas antibiofilm sodium hipoklorit 1% dan hidrogen peroksida 3%

pada Staphylococcus aureus?


3

1.3 Tujuan Penelitian

1.3.1 Tujuan Umum

Untuk mengetahui efek perbedaan lama inkubasi terhadap aktifitas

antibiofilm disinfektan pada Staphylococcus aureus.

1.3.2 Tujuan Khusus

(1) Untuk mengetahui efek perbedaan lama inkubasi terhadap aktifitas

antibiofilm sodium hipoklorit 1% pada Staphylococcus aureus.

(2) Untuk mengetahui efek perbedaan lama inkubasi terhadap aktifitas

antibiofilm hidrogen peroksida 3% pada Staphylococcus aureus.

1.4 Manfaat Penelitian

1.4.1 Manfaat Ilmiah

Manfaat Kegunaan ilmiah yang diharapkan dalam penelitian ini yakni

dapat memberikan suatu sumbangsih ilmu pengetahuan dalam hal efek perbedaan

lama inkubasi terhadap aktifitas antibiofilm disinfektan pada Staphylococcus

aureus.

1.4.2 Manfaat Klinis

Manfaat klinis yang diharapkan dari penelitian ini adalah sebagai referensi

pencegahan kejadian healthcare associated infections yang berhubungan dengan

pembentukan biofim di rumah sakit.


4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Gambaran Umum Biofilm

Biofilm didefinisikan sebagai kumpulan bakteri yang melekat pada

permukaan padat atau satu sama lainnya yang terbungkus dalam matriks

ekstraseluler polisakarida. Biofilm dapat terbentuk pada hampir semua jenis

permukaan kateter, perangkat medis dan implan. (Pace.2006)

Pada kebanyakan biofilm, mikroorganisme hanya berkontribusi 10%

terhadap berat kering biofilm, dimana 90% sisanya merupakan matriks

ekstraseluler. Matriks ini mencegah pergerakan bakteri dalam biofilm dan

membuat bakteri berada pada jarak yang dekat satu sama lain. Hal ini

memungkinkan adanya interaksi yang intens antar bakteri, termasuk komunikasi

antar sel dan pembentukan microconsortia yang sinergis. (Flemming dan

Wingender.2010)

Gambar 2.1 Model biofilm pada permukaan biomaterial (a)

dan komponen utama matriks biofilm (b) (Flemming dan Wingender.2010)


5

Bakteri dalam biofilm memiliki tingkat resistensi terhadap antibiotik yang

lebih tinggi dibandingkan bakteri planktonik. Hal ini dapat disebabkan penetrasi

antibiotik yang lambat pada eksopolimer biofilm, laju pertumbuhan bakteri yang

lambat, peningkatan laju transfer genetik, dan ekspresi gen resisten dalam biofilm.

(Pace.2006) Beberapa studi menemukan bahwa tingkat maturitas biofilm juga

berpengaruh terhadap resistensi bakteri dalam biofilm terhadap antibiotik. Studi

Wollcott (2010) menunjukkan bahwa biofilm P. aeruginosa yang ditumbuhkan

selama 6 dan 12 jam masih suseptibel terhadap gentamicin, sementara bakteri

yang ditumbuhkan selama 24 dan 48 jam menunjukkan tingkat toleransi yang

tinggi terhadap gentamicin.

2.2 Metode deteksi biofilm

2.2.1 Tube Method (TM)

Tube method merupakan salah satu metode deteksi biofilm secara

kualitatif. Mikrorganisme yang diuji diinokulasikan ke dalam Tryptic Soy Broth

(TSB) dengan glukosa 1% pada tabung reaksi. Tabung diinkubasi pada suhu 37 0 C

selama 24 jam. Setelah diinkubasi, tabung dikosongkan dan dibilas dengan PBS

(Phospate Buffered Saline) dan kemudian dikeringkan. Pewarnaan kemudian

dilakukan pada bagian dalam tabung dengan crystal violet (0,1%), dan stain

berlebih dibilas dengan deionized water. Tabung kemudiang dikeringkan dalam

posisi terbalik. Pembentukan biofilm dinyatakan positif jika tampak lapisan pada

dinding bagian dalam dan dasar tabung. (Hassan.2011)

Tube Method memiliki korelasi yang tinggi dengan TCP pada organisme

pembentuk biofilm yang kuat, sementara organisme pembentuk biofilm lemah dan

organisme non-biofilm sulit dibedakan. (Mathur.2006) Studi Mathur (2006)


6

menunjukkan bahwa sensitifitas dan spesifisitas Tube Method masing masing

mencapai 77,9% dan 96,0%, sementara studi Hassan (2006) menunjukkan angka

73% dan 92,5%.

2.2.2 Tissue Culture Plate (TCP) Method

Tissue Culture Plate Method merupakan metode deteksi kuantitatif biofilm

yang dianggap sebagai gold standard deteksi biofilm. (Hassan.2011)

Mikroorganisme yang akan diuji diinokulasikan dalam 10 ml TSB dengan 1%

glukosa dan kemudian diinkubasi pada 370 selama 24 jam. Dilusi kemudian

dilakukan pada hasil kultur dengan perbandingan 1:1000 pada medium baru. 0,2

ml hasil dilusi kemudian diisikan pada well plate mikrotiter. Plate mikrotiter

kemudian diinkubasi selama 24 jam pada 370. Setelah inkubasi, isi well

dikeluarkan dan kemudian dicuci dengan 0,2 ml PBS (Phospate Buffered Saline)

sebanyak empat kali. Biofilm kemudian dicat dengan kristal violet dan cat

berlebih dihilangkan dengan deionized water. Pengukuran Optical density (OD)

kemudian dilakukan dengan ELISA reader pada 570 nm. (Hassan.2011)

2.3 Gambaran Umum Staphylococcus aureus

Staphylococci adalah bakteri gram positif berbentuk kokus dengan ukuran

0.5 1.5 m yang biasanya tersusun dalam untaian irregular seperti anggur.

Bakteri ini bersifat anaerob fakultatif, yang mampu tumbuh dengan respirasi

aerobic maupun dengan fermentasi. Sampai saat ini, terdapat 32 spesies dan

delapan subspesies dalam genus Staphylococcus, akan tetapi hanya dua strain

yang sering dipelajari, yaitu S. aureus dan S. epidermidis. (Harris.2002) Strain

Staphylococci patogenik umumnya dibedakan berdasarkan kemampuannya

memproduksi koagulase. Hal ini membedakan spesies Staphylococci koagulase


7

positif yang bersifat patogenik (e.g Staphylococcus aureus) dengan spesies

koagulase negative lain (e.g Staphylococcus epidermidis). (Brooks.2007)

Staphylococcus aureus merupakan pathogen penting yang makin sering

dipelajari seiring meningkatnya tingkat resistensi terhadap antibiotik. S. aureus

memiliki tingkat virulensi yang lebih tinggi daripada Staphylococci koagulase-

negatif, walaupun terdapat kesamaan filogenetik pada keduanya. (Harris.2002)

S. aureus memiliki dinding sel yang kuat, dengan tebal 20-40 nm.

Peptidoglikan dan asam teikoat merupakan dua komponen utama yang masing

masing menyusun 50% dan 40% massa dinding sel S. aureus, dan sisanya

tersusun dari surface protein, eksoprotein, dan autolysin. Beberapa komponen ini

terlibat dalam adhesi S. aureus pada permukaan benda padat dan menentukan

virulensinya. Lebih dari 90% strain klinis S. aureus memiliki kapsul polisakarida

yang mampu menurunkan fagositosis secara in vitro dan meningkatkan virulensi

S. aureus dalam model bacteremia pada tikus. Faktor lain yang berpengaruh pada

virulesi S. aureus adalah kemampuannya memproduksi eksotoksin seperti

enterotoxin A E, toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1), dan exfoliative toxins A

dan B. (Harris.2002)

S. aureus memiliki tingkat resistensi yang tinggi terhadap antibiotik yang

sering digunakan seperti erythromycin, ampicillin, dan tetracycline. Pada banyak

kasus, resistensi terhadap antibiotik dikode dalam gen yang disebarkan melalui

plasmid dan memicu persebaran resistensi antibiotik yang cepat. Strain MRSA

(Methicillin Resistant S. aureus) muncul dalam waktu yang relative singkat

setelah methicillin diperkenalkan, dan saat ini MRSA telah tersebar di seluruh

dunia sebagai pathogen nosokomial, Strain S. aureus dengan resistensi sedang


8

terhadap vancomycin juga mulai muncul dalam jumlah yang relative sedikit.

(Harris.2002)

2.4 Pembentukan Biofilm Pada S. aureus

Pembentukan biofilm S. aureus terbagi menjadi setidaknya tiga tahapan:

(i) Adhesi pada permukaan jaringan atau biomaterial, (ii) Proliferasi sel pada

permukaan dan produksi matriks eksopolisakarida, dan (iii) Penyusunan bakteri

dalam bentuk tiga dimensi seperti jamur dengan kanal sebagai saluran nutrisi dan

ekskresi tersebar di dalamnya. (Pace.2006)

Gambar 2.2 Gambaran SLCM (Scanning laser confocal microscopy)

Biofilm S. aureus (Pace.2006)

Pembentukan biofilm diawali dengan kolonisasi pada permukaan

biomaterial. S. aureus memiliki kemampuan adhesi pada permukaan biomaterial

melalui adhesi langsung pada polimer biomaterial maupun melalui protein tubuh

manusia yang melapisi permukaan biomaterial. Asam teikoat merupakan polimer


9

anion yang tersebar secara merata di seluruh dinding sel S. aureus dan berperan

dalam memberikan arus negatif pada permukaan bakteri. Beberapa studi

menunjukkan eliminasi ester D-alanine pada asam teikoat menyebabkan

penurunan yang signifikan pada adhesi awal dan kemampuan S. aureus

membentuk biofilm. Konstituen dinding sel lain yang berperan dalam adhesi S.

aureus adalah autolysin. Protein ini merupakan hidrolase peptidoglikan yang

berperan memotong molekul peptida atau glikan pada dinding sel, dan berperan

dalam lisis dan pembelahan sel. Studi pada S. epidermidis dan S. aureus

menunjukkan bahwa autolysin meningkatkan kemampuan adhesi bakteri pada

polystyrene. Surface protein lain yang berperan dalam adhesi S. aureus tergolong

dalam famili microbial surface components recognizing adhesive matrix

molecules (MSCRAMM). Protein MSCRAMM kebanyakan terikat pada dinding

sel S. aureus dan memiliki kemampuan adhesi pada komponen matriks

ekstraselular (ECM) inang. (Pace.2006)

Polysaccharide intercellular adhesin (PIA) atau polymeric N-acetyl

glucosamine (PNAG) merupakan matriks eksopolisakarida yang diproduksi S.

aureus dan S. epidermidis yang berperan dalam akumulasi dan agregasi sel

menjadi kluster berlapis. Komposisi kimiawi PIA/PNAG tidak dapat ditentukan

dengan pasti karena kesulitan dalam membedakannya dengan kontaminan pada

media dan komponen dinding sel Staphylococcus. Molekul lain yang berperan

dalam tahap ini adalah alpha-toxin yang dikode gen hla S. aureus. Pada studi in

vitro, mutasi pada gel hla menyebabkan kegagalan dalam membentuk kluster

berlapis yang diperlukan dalam tahap kedua pembentukan biofilm. Biofilm

associated protein (BAP) merupakan surface protein yang berperan dalam tahap
10

pertama dan kedua pembentukan biofilm S. aureus. Strain mutan dengan insersi

tranposon pada gen bap tidak dapat membentuk biofilm pada polysterene, dengan

adhesi awal dan agregasi interselular yang menurun secara signifikan. (Pace.2006)

S. aureus memiliki tiga jenis regulator gen global; (i) Two-component

systems (TCSs), (ii) Faktor transkripsi dengan jaringan interregulasi yang

memfasilitasi transkripsi gen (e.g SarA), dan (iii) Faktor transkripsi yang

merespon stress lingkungan (e.g sigma factor B). Lokus agr merupakan salah satu

regulator gen global pada S. aureus, dimana lokus ini memproduksi komponen

TCS dan autoinducting peptide AIP. AgrD dan AgrB berperan memproduksi dan

mensekresi AIP ke ekstraseluler. AgrC yang berfungsi sebagai reseptor dari sistem

agr kemudian mengikat AIP dari ekstraseluler dan memberi respon melalui AgrA.

Keseluruhan sistem ini merupakan autoinducting circuit atau quorum sensing

yang berfungsi mengukur densitas populasi S. aureus dalam biofilm. (Pace.2006)

2.5 Disinfektan

Disinfektan didefinisikan sebagai agen kimia kuat yang dapat membunuh

atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme. (Katzung.2006) Penggunaan

disinfektan sangat penting untuk memastikan perangkat medis dan bedah tidak

mentransmisikan patogen pada pasien. Kebanyakan disinfektan dapat digunakan

sendiri atau dikombinasikan dengan disinfektan lain. Beberapa jenis disinfektan

yang sering dipakai adalah alkohol, chlorin, formaldehyde, iodophors, dan phenol.

(CDC.2008)

Pembentukan biofilm pada perangkat medis dapat mempengaruhi

efektifitas disinfektan. Mikroorganisme dapat terlindungi dari disinfektan dengan

berbagai cara, termasuk karakter fisik biofilm, variasi genotip bakteri, produksi
11

neutralyzing enzyme, dan gradien fisiologis (e.g pH) dalam biofilm. Bakteri dalam

biofilm memiliki tingkat resistensi sampai 1000 kali lipat dibandingkan bakteri

yang sama dalam suspensi. (CDC.2008)

2.5.1 Klorin

Hipoklorit merupakan jenis disinfektan klorin yang paling sering

digunakan, dengan dua jenis bentuk sediaan; cair (e.g sodium hipoklorit) dan

padat (e.g kalsium hipoklorit). Klorin memiliki efek antimikrobia dengan

spektrum luas, tidak meninggalkan residu toksik, murah, memiliki insiden

toksisitas yang rendah, dan mampu menghilangkan mikroorganisme dalam

biofilm pada permukaan. Klorin bersifat bakterisida, fungisida, sporicidal,

tuberculocidal, tuberculocidal dan virucidal.

Mekanisme efek antimikrobial klorin belum dapat dijelaskan sepenuhnya.

Inaktivasi oleh klorin dapat terjadi melalui beberapa mekanisme, seperti oksidasi

enzim sulfydryl dan asam amino, hilangnya komponen intraseluler, uptake nutrien

yang menurun, inhibisi sintesis protein, penurunan uptake oksigen, penurunan

produksi ATP, kerusakan DNA, dan penurunan sintesis DNA. Pada konsentrasi

100 ppm klorin dapat membunuh 106107 S. aureus, Salmonella choleraesuis, dan

P. aeruginosa dalam <10 menit. (CDC.2008)

Beberapa studi menunjukkan bahwa klorin merupakan salah satu

disinfektan yang efektif untuk eliminasi biofilm. Studi LeChevelier dkk (1998)

menemukan bahwa larutan 0,08 mg asam hipoklorit dalam 1 liter air dapat

menurunkan viable bacterial count biofilm P. aeruginosa hingga 99% dalam 1

menit. Akan tetapi, efek biosida klorin terhadap viabilitas bakteri saja tidak cukup

karena matrix biofilm masih dapat terkolonisasi kembali. Studi Tote (2010)
12

menunjukkan bahwa larutan 1% klorin dapat mengurangi viable mass biofilm S.

aureus hingga 99% dalam 1 menit, sementara reduksi 55% pada matriks bioflim

baru dapat tercapai dalam 60 menit.

Klorin digunakan di rumah sakit sebagai high-level disinfectant pada

beberapa jenis perangkat medis dan low-level disinfectant pada permukaan

nonkritikal. Klorin umum digunakan sebagai disinfektan untuk perangkat

semikritikal, yaitu perangkat yang mengalami kontak dengan mukosa atau kulit

yang tidak intak. (Rutala dan Weber.1997) Beberapa perangkat yang tergolong

perangkat semikritikal adalah endoskop, perangkat terapi pernafasan dan anastesi,

manometri esofagus, dan sebagainya. (CDC.2008)

2.5.2 Hidrogen peroksida

Hidrogen peroksidan merupakan disinfektan golongan peroksigen yang

memiliki tingkat bakterisida yang tinggi dan bekerja dalam spektrum luas.

Hidrogen peroksida memliki efek bakterisida, sporicidal, virucidal, dan

fungicidal. Keuntungan penggunaan hidrogen peroksida sebagai disinfektan

adalah produk dekomposisinya tidak toksik dan tidak berbahaya bagi lingkungan.

Hidrogen peroksida bekerja dengan menghasilkan radikal bebas yang

dapat menyerang membran lipid, DNA, dan komponen esensial sel lainnya. Studi

Tote (2010) menunjukkan bahwa larutan hidrogen peroksida 3% dapat

mengurangi viable mass biofilm S. aureus hingga 80% dan reduksi matriks

biofilm hingga 84% dalam 60 menit.


13

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini menggunakan desain eksperimental (True Experimental

Control Group Design) untuk mengetahui efek perbedaan lama inkubasi terhadap

aktifitas antibiofilm sodium hipoklorit 1% dan hidrogen peroksida 3% pada

Staphylococcus aureus secara in vitro.

Gambar 3.1 Rancangan Kelompok Kontrol dan Intervensi

Keterangan :

K1 = Kelompok kontrol negatif, inkubasi 24 jam

K2 = Kelompok kontrol negatif, inkubasi 48 jam


14

K3 = Kelompok kontrol negatif, inkubasi 72 jam

K4 = Kelompok kontrol positif, inkubasi 24 jam

K5 = Kelompok kontrol positif, inkubasi 48 jam

K6 = Kelompok kontrol positif, inkubasi 72 jam

I1 = Kelompok intervensi 1, Sodium hipoklorit 1%, inkubasi 24 jam

I2 = Kelompok intervensi 2, Sodium hipoklorit 1%, inkubasi 48 jam

I3 = Kelompok intervensi 3, Sodium hipoklorit 1%, inkubasi 72 jam

I4 = Kelompok intervensi 4, Hidrogen peroksida 3%, inkubasi 24 jam

I5 = Kelompok intervensi 5, Hidrogen peroksida 3%, inkubasi 48 jam

I6 = Kelompok intervensi 6, Hidrogen peroksida 3%, inkubasi 72 jam

3.2 Sampel dan Besar Sampel

Sesuai dengan rancangan penelitian, maka sampel dialokasikan ke dalam

12 kelompok, yaitu 6 kelompok intervensi (I1, I2, I3, I4, I5 dan I6) dan 6

kelompok kontrol (K1, K2, K3, K4, K5 dan K6). Untuk mengetahui jumlah

sampel dalam tiap kelompok, dipergunakan rumus Federer sebagai berikut:

Rumus Federer: (p-1)(n-1) 15; dengan n = jumlah sampel minimal, p =

jumlah kelompok intervensi

(p-1)(n-1) 15

5(n-1) 15

n3

Sampel yang digunakan adalah isolat S. aureus yang didapat dari

Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana. Rumus

sampel yang digunakan adalah rumus Federer: (p-1)(n-1) 15 dengan nilai p

(perlakuan) adalah 6, dan didapat n (jumlah sampel minimal) pada tiap kelompok
15

adalah 3. Penelitian ini menggunakan enam sampel pada masing-masing

kelompok, dengan total sampel sebanyak 72.

3.3 Kriteria Inklusi dan Eksklusi

3.3.1 Kriteria Inklusi

Sampel terbukti positif mampu membentuk biofilm pada tes Tube Method

(TM)

3.3.2 Kriteria Eksklusi

Sampel yang terkontaminasi.

3.4 Variabel Penelitian

3.4.1 Variabel Bebas (Independent Variable)

(1) Lama inkubasi (24h, 48h, dan 72h)

(2) Disinfektan (Sodium hipoklorit 1% dan Hidrogen peroksida 3%)

3.4.2 Variabel Tergantung (Dependent Variable)

Pembentukan biofilm, yang dinyatakan dengan pengukuran Optical

density (OD) pada tes Tissue Culture Plate (TCP).

3.4.3 Variabel Kontrol

(1) Durasi kontak

3.5 Definisi Operasional Variabel

(1) Lama inkubasi adalah lama inkubasi biofilm S. aureus pada suhu 370C

(24h, 48h, dan 72h)


(2) Optical density (OD) merupakan indikator pertumbuhan biofilm yang

diukur dengan ELISA reader dengan panjang gelombang 620 nm.


(3) Durasi kontak adalah lama kontak antara disinfektan dan biofilm, yang

dalam penelitian ini ditentukan selama 5 menit.

3.6 Prosedur Penelitian


16

3.6.1 Uji Deteksi Pembentukan Biofilm

Kemampuan bakteri membentuk biofilm diuji dengan menggunakan

metode Tube Method (TM) yang dideskripsikan Hassan dkk (2011). Sampel

Staphylococcus aureus yang akan diuji diinokulasikan ke dalam 10 ml TSB

(Tryptic Soy Broth) dengan glukosa 1% pada tabung reaksi. Tabung diinkubasi

pada suhu 370 C selama 24 jam. Setelah diinkubasi, tabung dikosongkan dan

dibilas dengan PBS (Phospate Buffered Saline) dan kemudian dikeringkan.

Pewarnaan kemudian dilakukan pada bagian dalam tabung dengan kristal violet

(0,1%), dan cat berlebih dibilas dengan deionized water. Tabung kemudian

dikeringkan dalam posisi terbalik. Pembentukan biofilm dinyatakan positif jika

tampak lapisan pada dinding bagian dalam dan dasar tabung.

3.6.2 Uji aktifitas antibiofilm sodium hipoklorit 1% dan hidrogen

peroksida 3% terhadap S. aureus

Pengujian aktifitas antibiofilm sodium hipoklorit 1% terhadap

Staphylococcus aureus dilakukan dengan metode Tissue Culture Plate (TCP).

Kultur Staphylococcus aureus dilakukan pada TSB dengan 1% glukosa selama

semalam, kemudian 0,2 ml suspensi tersebut dimasukkan ke dalam microtiter

plate. Microtiter plate diinkubasi selama 24 jam, 48 jam, atau 72 jam pada suhu

370C. Setelah waktu inkubasi masing masing selesai, isi well diaspirasi dan

dicuci dengan 0,2 ml PBS (phosphate buffered saline) sebanyak 2 kali. Kemudian

0,2 ml sodium hipoklorit 1% atau hidrogen peroksida 3% ditambahkan pada well

dengan durasi kontak 5 menit. Isi dari microtiter plate kemudian diaspirasi

kembali dan dicuci dengan 0,2 ml PBS sebanyak satu kali. Biofilm yang

menempel pada well kemudian dicat dengan kristal violet, serta dilakukan
17

pembilasan dengan menggunakan aquades dan dikeringkan. Untuk menganalisis

pembentukan biofilm secara kuantitatif, 0,2 ml dari isopropanol ditambahkan di

setiap well, kemudian dilakukan pengukuran Optical density (OD) menggunakan

ELISA Reader (Biomeriux Reader 270) dengan panjang gelombang 620 nm.

3.7 Analisis data

Analisis data pada penelitian dilakukan dengan terlebih dahulu melakukan

uji normalitas dan homogenitas data dengan tes Kolmogorov-Smirnov dan tes

Levene. Jika data terdistribusi normal dan homogen, analisis data dilanjutkan

dengan uji statistik Independent Sample T-Test dan One-Way ANOVA.


18

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas

Kedokteran Universitas Udayana dari tanggal 26 Oktober 2014 sampai 21

November 2014. Sampel yang digunakan adalah adalah isolat klinis

Staphylococcus aureus yang telah terbukti mampu membentuk biofilm pada tube

test. Sampel ini diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran

Universitas Udayana.

Sampel dikelompokkan ke dalam dua belas kelompok yang terbagi

menjadi kelompok kontrol (K) dan intervensi (I). Kelompok kontrol dibagi

menjadi kontrol negatif (K1 K3) dan kontrol positif (K4 K6), dimana

kelompok intervensi dibagi menjadi kelompok intervensi dengan Sodium

hipoklorit (I1 I3) dan kelompok intervensi dengan Hidrogen peroksida (I4 I6).

Tampak terjadi kontaminasi pada kelompok kontrol negatif dengan lama

inkubasi 72 jam (K3). Hal ini telah dapat diamati sejak 24 jam pasca inokulasi ke

dalam well, dimana terdapat bercak-bercak putih di dasar well tersebut. Penyebab

kontaminasi ini belum dapat dipastikan; Namun mengingat penggunaan

microplate seal pada penelitian ini dapat meminimalkan risiko kontaminasi

silang, penelitian tetap dilanjutkan (Berg, 2001).

Aktivitas antibiofilm dalam penelitian ini dilihat dengan menilai residu

biofilm pada permukaan well pasca intervensi (Tabel 5.1). Terdapat perbedaan

rerata OD (Optical density) yang signifikan (Independent Sample T-Test,

P=0.002) antara kelompok dengan intervensi sodium hipoklorit (0.189 0.080)


19

dengan kelompok intervensi hidrogen peroksida (0.316 0.137); Dimana sodium

hipoklorit cenderung menghasilkan lebih sedikit residu daripada hidrogen

peroksida (Gambar 4.1).

Tabel 4.1 Rerata dan Standar Deviasi Pengukuran OD

Lama Inkubasi
Kelompok
24 Jam 48 Jam 72 Jam
Kontrol Negatif (K1 K3) 0.156 0.039 0.125 0.012 0.540 0.256
Kontrol Positif (K4 - K6) 0.299 0.209 0.125 0.056 0.394 0.165
Sodium hipoklorit 1% (I1 I3) 0.175 0.031 0.176 0.103 0.220 0.098
Hidrogen peroksida 3% (I4 0.249 0.111 0.246 0.065 0.453 0.118
I6)

Gambar 4.1 Rerata OD (Optical density) Sodium hipoklorit dan Hidrogen

peroksida
20

Sodium hipoklorit dan Hidrogen peroksida merupakan jenis disinfektan

yang memiliki kemampuan oksidatif terhadap senyawa organik, sehingga mampu

membersihkan matriks biofim. Sodium hipoklorit baik digunakan karena memiliki

aktifitas dengan spektrum luas, mampu merusak matriks biofilm, murah, dan

mudah digunakan.(Lens. 2003) Akan tetapi sodium hipoklorit memiliki penetrasi

yang rendah ke dalam matriks biofilm; sehingga lebih efektif digunakan untuk

biofilm berumur pendek (Zineb dkk. 2014). Hidrogen peroksida memiliki

kemampuan melemahkan dan melepaskan biofilm, relatif non-toksik, dan dapat

dengan mudah digunakan in situ; namun harus digunakan dalam konsentrasi

tinggi. (Lens.2003)

Hasil dalam penelitian ini bertolak belakang dengan studi Tote dkk (2011)

yang menyatakan bahwa dengan waktu kontak 5 menit, sodium hipoklorit hanya

mampu mereduksi matriks biofilm sampai 21% sedangkan hidrogen peroksida

mampu mereduksi sampai 85%. Hal ini kemungkinan disebabkan perbedaan

konsentrasi hidrogen peroksida yang digunakan; dimana studi Tote dkk

menggunakan hidrogen peroksida dengan konsetrasi 5% sedangkan pada

penelitian ini konsentrasi yang digunakan sebesar 3%. Hal lain yang perlu

dipertimbangkan adalah kemampuan S. aureus membentuk katalase yang mampu

memecah hidrogen peroksida menjadi oksigen dan air. Studi Stewart dkk (2000)

menunjukkan bahwa P. Aeruginosa wild-type memiliki tingkat resistensi yang

lebih tinggi terhadap hidrogen peroksida dibanding strain dengan defisiensi

katalase.

Pengaruh lama inkubasi bakteri terhadap aktifitas antibiofilm dinilai

dengan melakukan uji One Way ANOVA pada kedua intervensi terhadap lama
21

inkubasi. Terdapat perbedaan yang signifikan antar kelompok sampel dengan lama

inkubasi 24 jam, 48 jam, dan 72 jam pada kontrol negatif (P=0.000), kontrol

positif (P=0.029) dan Hidrogen peroksida (P=0.004); tidak ditemukan perbedaan

yang signifikan pada Sodium hipoklorit (P=0.495). (Gambar 4.2) Perbedaan yang

signifikan pada kelompok kontrol negatif kemungkinan disebabkan adanya

kontaminasi pada sampel kontrol negatif dengan lama inkubasi 72 jam. Setelah

sampel yang terkontaminasi ini dieksklusi dari analisis, tidak ditemukan

perbedaan yang signifikan pada kelompok tersebut (P=0.92).

Gambar 4.2 Rerata OD menurut intervensi dan lama inkubasi.


22

Perbedaan residu yang tersisa dari intervensi dengan hidrogen peroksida

menunjukkan bahwa aktifitas antibiofilm hidrogen peroksida dipengaruhi lama

inkubasi bakteri. Aktifitas antibiofilm hidrogen peroksida cenderung menurun

seiring meningkatnya lama inkubasi. Perbedaan aktifitas antibiofilm ini dapat

disebabkan perbedaan growth phase bakteri pada masing-masing lama inkubasi.

Studi Luppens dkk (2000) pada S. aureus dalam larutan menunjukkan bahwa S.

aureus mengalami lag phase selama 1 jam setelah inokulasi, exponential phase

selama 2-5 jam, stationary phase dari 10-24 jam, dan decline phase setelah 24

jam. S. aureus dalam decline phase (>24 jam) memiliki tingkat resistensi yang

lebih tinggi terhadap hidrogen peroksida. Hal ini dapat disebabkan jumlah

katalase yang lebih banyak, aktifitas katalase yang lebih tinggi pada decline

phase, atau katalase yang masih aktif pada sel mati. Mekanisme resistensi yang

sama juga dapat terjadi pada penelitian ini karena growth phase yang sama juga

terjadi pada biofilm.

Intervensi dengan sodium hipoklorit tidak menimbulkan perbedaan residu

yang signifikan pada masing-masing lama inkubasi. Hal ini menunjukkan bahwa

aktifitas antibiofilm sodium hipoklorit tidak dipengaruhi lama inkubasi bakteri.

Hasil ini berbeda dengan beberapa studi yang menunjukkan perbedaan resistensi

biofilm pada lama inkubasi yang berbeda.

Studi Ozok dkk (2007) pada biofilm Fusobacterium nucleatum dan

Peptostreptococcus micros menunjukkan tingkat resistensi yang lebih tinggi

terhadap sodium hipoklorit pada 96 jam dibanding 24 jam. Studi Liu dkk (2010)

juga menunjukkan bahwa S. aureus pada starvation phase memiliki resistensi


23

yang lebih tinggi terhadap sodium hipoklorit dibanding pada stationary phase dan

exponential phase, dan resistensi meningkat seiring maturasi biofilm.

Salah satu faktor yang dapat menjelaskan perbedaan hasil pada penelitian

ini dengan penelitian sebelumnya adalah kemampuan strain S. aureus yang

digunakan dalam membentuk biofilm; dimana sodium hipoklorit cenderung

memiliki penetrasi yang lebih rendah pada biofilm yang tebal dibanding biofilm

tipis. Oleh karena itu, diperlukan penelitian lanjutan dengan strain S. aureus yang

berbeda dalam hal kemampuan pembentukan biofilm dan lama inkubasi yang

lebih lama.
24

BAB V

SIMPULAN DAN SARAN

5.1 Simpulan

Terdapat pengaruh lama inkubasi terhadap aktifitas antibiofilm hidrogen

peroksida; dimana aktifitas antibiofilm ini cenderung menurun seiring

meningkatnya lama inkubasi. Tidak terdapat pengaruh lama inkubasi terhadap

aktifitas antibiofilm sodium hipoklorit.

5.2 Saran

5.2.1 Bagi Penyedia Layanan Kesehatan

Disinfeksi merupakan salah satu upaya mengontrol biofilm pada

lingkungan rumah sakit, dimana dalam penelitian ini ditemukan bahwa lama

inkubasi mempengaruhi aktifitas antibiofilm disinfektan, terutama hidrogen

peroksida. Oleh karena itu, lama inkubasi patut dipertimbangkan dalam pemilihan

disinfektan yang digunakan.

5.2.2 Bagi Peneliti Selanjutnya

Dalam penelitian ini, terjadi kontaminasi pada beberapa sampel kontrol

negatif. Pada penelitian selanjutnya, diperlukan teknik yang lebih steril dan

mencegah kontaminasi.

Penelitian ini dapat dikembangkan dengan menggunakan variasi strain

bakteri yang digunakan, sehingga pengaruh lama inkubasi dapat diamati pada

beberapa strain sekaligus. Selain itu, jangkauan lama inkubasi yang lebih lama

(>72 jam) juga dapat digunakan untuk mengkonfirmasi temuan ini.