HPLC / KCKT

1. Prinsip
Pemisahan komponen-komponen dalam campuran berdasarkan perbedaan interaksi
antara analit (solut-solut) atau fasa gerak dengan fasa diam dalam kolom. Dimana fasa
gerak dialirkan melalui kolom dengan bantuan pompa tekanan tinggi yaitu sebesar
400 atm hingga setiap komponen terpisah dalam kolom dan melewati detektor.
Sampel yang diinjeksikan kedalam aliran fasa gerak kemudian larut dalam solvent.
Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan lebih cepat keluar
dari kolom, dan sebaliknya. Setiap komponen yang keluar akan dideteksi oleh
detektor dan direkam dalam bentuk kromatogram.
Kromatogram HPLC terdapat puncak-puncak atau peak, dimana jumlah peak
menyatakan jumlah komponen; luas area peak menyatakan konsentrasi komponen
dalam Ukuran kolom sama dengan fase normal namun silika yang digunakan
dimodifikasi menjadi bersifat non-polar karena terikat dengan hidrokarbon rantai
panjang, yaitu 8-18 atom karbon. Pelarut yang digunakan adalah pelarut polar.
Komponen non-polar akan berinteraksi dengan gugus hidrokarbon akibat dari gaya
dispersi van der waals. Oleh karena itu, komponen polar akan lebih cepat keluar
melewati kolom.

2. Fase gerak dan fase diam dalam HPLC

Fase gerak berupa pelarut berwujud cair (liquid). Beberapa syarat fasa gerak yang
digunakan dalam HPLC adalah :
1) Fasa gerak harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk sampel yang
dianalisis.
2) Fasa gerak harus murni sekali untuk menghindari adanya mpurities yang
akan mengganggu interpretasi pada kromatogram dan dapat mengotori
kolom.
 3) Fasa gerak harus jernih sekali untuk menghindari terjadinya penyumbatan
pada kolom. Pelarut harud disaring dan didegas. Saringan yang digunakan
berupa nilon dengan diameter 0,45 mikrometer.
4) Fasa gerak harus mudah diperoleh, tidak mudah terbakar, dan tidak
beracun.
5) Fasa gerak idak viskous, dimana kekentalannya tidak boleh melebihi 0,5
cP (centi poise).
6) Fasa gerak haruslah sesuai dengan detektornya. Untuk detektor RI
(refractive index) pelarut harus memiliki indeks bias yang berbeda dengan
solut; untuk detektor UV, pelarut tidak boleh menyerap cahaya pada
penjang gelombang cahaya yang dipakai.

Jenis fasa gerak yang digunakan, bila dikelompokkan berdasarkan kepolaran fasa
diam dan fasa geraknya maka dibedakan menjadi dua, yaitu :

1) Fasa normal (normal phase)

fasa jenis ini bukan merupakan jenis fasa pada HPLC yang biasa
digunakan. Kolom terisi dengan partikel silika atau alumina, dan pelarut
yang digunakan adalah bersifat non-polar, misal heksana atau i-propileter.
Diameter internal kolom sebesar 4,6 mm (atau bisa juga lebih kecil), dan
panjang sekitar 150 hingga 250 mm. Komponen yang lebih polar akan
tertahan lebih lama.
2) Fasa terbalik (reverse phase)
Ukuran kolom sama dengan fase normal namun silika yang digunakan
dimodifikasi menjadi bersifat non-polar karena terikat dengan hidrokarbon
rantai panjang, yaitu 8-18 atom karbon. Pelarut yang digunakan adalah
pelarut polar, misal air; metanol; asetonitril. Komponen non-polar akan
berinteraksi dengan gugus hidrokarbon akibat dari gaya dispersi van der
waals. Oleh karena itu, komponen polar akan lebih cepat keluar melewati
kolom.
3. Pompa
Laju alir sekitar 0,01 hingga 5 mL/menit. Kestabilan laju aliran tidak lebih dari 1%.
Untuk stabilitas laju alir tidak boleh kurang dari 0,2%. Hal ini dikarenakan, supaya
tercapainya degassing sistem ang terintegrasi, seperti pembersihan gas helium, atau
membrane filtering.
Fungsi dari pompa sendiri adalah untuk memberikan gaya pada cairan atau fasa
gerak untuk melewati kromatograf pada laju alir tertentu yang dinyatakan dalam
mL/menit. Laju alir nornal pada HPLC adalah 1-2 mL/menit, pompa tipe tertentu
dapat mencapai tekanan hingga 600psi.
Selama proses kromatografi, pompa memberikan laju fasa gerak yang konstan
komposisinya (isocratic) atau dengan komposisi fase gerak yang meningkat (gradien).
4. Sampel injector
a. Injeksi syringe
 Syringe berisi sampel diinjeksikan melalui septum (seal karet). Injeksi
dilakukan dengan konstan dan bebas gelembung udara.
b. Injeksi stop-flow
Saat dilakukan injeksi, pelarut diberhentikan sementara. Sampel disuntikkan
langsung pada ujung kolom.
c. Kran sampel
Disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Sejumlah volume sampel
(salam solvent) disuntikkan ke dalam loop dalam posisi load, sampel masih
berasa dalam loop. Kemudian kran diutar (ke bawah) untuk mengubah ke
posisi injeksi dan fasa gerak membawa sampel kedalam kolom.
5. Kolom
Tipe kolom dalam HPLC, dibedakan menjadi 4 jenis yaitu :
a. Kolom analitik : diameter internal sebesar 1,0-4,6 mm; panjang kolom 15-250
mm.
b. Kolom preparatif : diameter internal sebesar lebih dari 4,6 mm; panjang kolom
50-250 mm.
c. Kolom kapiler : diameter internal sebesar 0,1-1,0 mm; panjang kolom
bermacam-macam.
d. Kolom nano : diameter internal sebesar kurang dari 0,1 mm atau terkadang
ditetapkan sebesar kurang dari 100 mikrometer.
Material yang digunakan sebagai tube biasanya berupa stainless steel, kemudian ada
juga yang menggunakan kaca (biasanya untuk biomolekul), dan polimer PEEK yang
biokompatibel serta inert secara kimiawi pada kebanyakan pelarut.

6. Detektor
Jenis-jenis detektor yang digunakan dalam HPLC ada 3, yaitu :
a. Detektor fluorescence
Detektor fluorescence memberikan sensitifitas yang lebih tinggi
dibandingkan detekor UV serta selektif sehingga dapat mengkuantisasi dan
mengidentifikasi komponen dan impurities dalam kompleks matriks yang
konsentrasinya sangat kecil (trace level analysis). Namun, detektor ini hanya
digunakan untuk material yang fluorescence.
b. Detektor (UV) absorpsi
Sinar ultraviolet diarahkan melewati sel dan sensor mengukur banyaknya
sinar yang terlewatkan melalui sel. Apabila komponen terelusi dari kolom
dimana komponen tersebut menyerap sinar, hal itu akan mengubah banyaknya
sinar yang sampai ke sensor. Hasil perubahan sinar elektrik ini diperjelas oleh
amplifier dan diteruskan ke rekorder atau sistem data.

c. Detektor indeks refraksi

Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC, karena detektor ini
non-destruktif. Respon dari detektor ini adalah adanya perubahan indeks
refraksi dari fasa gerak. Sangat sensitif terhadap suhu +/- 0,001C. namun
detektor ini sekarang mulai jarang digunakan karena absorbansi detektornya
rendah sekali.
Detektor ini bekerja berdasarkan kemampuan komponen atau pelarut
untuk membelokkan cahaya sehingga itulah yang dideteksi. RI mengukur
kemampuan molekul untuk membelokkan cahaya dalam aliran fasa gerak
dalam aliran sel relatif pada fasa gerak yang diam dalam aliran sel referensi.
Banyaknya pembelokan setara dengan konsentrasi. Detektor ini kurang
sensitif.
 JURNAL
Pengaruh Konsentrasi Sulfur Dioksida Terhadap Asam-Asam Organik dan b-Karoten dalam
Aprikot Kering Selama Masa Penyimpanan

1. Pendahuluan
Turki merupakan mayor produsen buah aprikot baik dalam bentuk kering maupun
buah segar dimana jumlahnya mencapai 800000 sampai 100000 ton per tahun. Dalam
pengolahannya, terutama pada aprikot kering diaplikasikan surlfur dioksida untuk
melindungi karakter warna kuning keemasan dari aprikot kering yang dimana
merupakan komponen bioaktif yaitu asam-asam organik dan karoenoid. Asam-asam
organik dalam aprikot diantaranya asam malat, asam oksalat, asam sitrat, dan asam
suksinat. Asam-asam organik ini diproduksi di dalam mitokondria dan disimpan di
vakuola. Waktu penyimpanan aprikot dapat mempengaruhi jumlah asam-asam
organik dalam buah aprikot. Pemberian sulfur dioksida mempengaruhi laju respirasi
pada buah aprikot pada masa penyimpanan sehingga mempengaruhi metabolisme dari
asam-asam organik tersebut. Sulfur dioksida diketahui meiliki aktifitas antioksidan
yang tinggi dan dapat melindungi karotenoid dari oksidasi.
2. Metode
a. Pensulfuran
Aprikot segar dimasukan kedalam chamber kemudian dialiri gas sulfur
dioksida dalam waktu yang bervariasi sehingga didapatkan konsentrasi sulfur
 dioksida pada buah yang beragam. Kemudian buah dikeringkan dibawah sinar
matahari selama 7 hari dan disimpan selama 379 hari.
b. Analisis
1) Preparasi sampel untuk analisis
Setiap sampel aprikot diambil dari inkubator kemudian dihaluskan dan
dihomogenkan. Untuk analisa asam-asam organik dan b-karoten,
dilakukan ekstraksi terlebih dahulu.
2) Instrumentasi dan kromatografi
Pemisahan dan kuantifikasi asam-asam organik dilakukan dengan
bantuan instrumen HPLC dengan pompa biner, detektor photo diode
array (PDA), sampler automatis.
Pada analisa beta karoten dilakukan dengan kurva kalibrasi dimana
range kurva kalibrasi antara 0-40 mg/L yang terdiri dari 8 poin data
yaitu pada 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, dan 40 mg/L.
3. Hasil dan pembahasan
a. Efek konsentrasi sulfur dioksida pada asam-asam organik selama masa
penyimpan

Dari data yang diperoleh, dapat diketahui bahwa pada buah dengan kandungan
sulfur dioksida yang rendah konsentrasinya asam organik yang dominan
adalah asam suksinat kemudian diikuti dengan asam malat, asam sitrat dan
asam oksalat. Asam suksinat dominan pada konsentrasi SO2 rendah karena
terjadinya oksidasi asam levulinat menjadi asam suksinat, dengan menurunnya
konsentrasi sulfur dioksida maka reaksi ini meningkat. Pada buah dengan
kandungan sulfur dioksida yang lebih besar lagi konsentrasinya asam organik
yang dominan adalah asam malat, kemudian diikuti dengan asam suksinat,
asam sitrat, dan asam oksalat. Kemudian buah dengan kandungan sulfur
 dioksida yang paling tinggi konsentrasinya asam organik yang dominan adalah
asam malat.

Diatas merupakan data peengaruh masa penyimpanan terhadap masing-masing

asam organik. Dari data diatas dapat diketahui bahwa dengan bertambahnya
waktu penyimpanan maka konsentrasi asam-asam organik total dalam buah
aprikot meningkat sehingga diketahui bahwa sulfur dioksida dapat melindungi
kandungan asam-asam organik dalam buah aprikot dari kerusakan selama
masa penyimpanan.
b. Perubahan kandungan b-karoten selama masa penyimpanan

- karoten teridentifikasi sebagai senyawa karotenoid paling banyak yang ada

pada buah aprikot yaitu sebanyak 68-75% dari total karotenoid sehingga pada
penelitian ini hanya -karoten yang diteliti. Dari data yang diperoleh diatas
dapat disimpulkan bahwa semakin banyak konsentrasi sulfur dioksida maka
semakin banyak pula -karoten yang dipertahankan dari kerusakan.