Anda di halaman 1dari 7

ChemInfo

Vol 1, No 1, Hal 386 392 , 2013

ISOLASI DAN PENENTUAN AKTIFITAS SPESIFIK KLOROFILASE


DARI DAUN MAHONI (Swietenia mahagoni)
(Isolation and Determination Specific Activity of Chlorophyllase
from Mahogany Leaf (Swietenia mahagoni))

Nurlita Khasanah., Dra. Wuryanti, M.Si., Dra. Nies Suci M, M.S.


Laboratorium Biokimia, Jurusan Kimia, Universitas Diponegoro, Semarang
Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang 50275, Telepon (024) 7474754
nurlitachem@gmail.com

ABSTRAK
Telah dilakukan isolasi dan penentuan aktifitas spesifik klorofilase dari
daun mahoni (Swietenia mahagoni). Tahapan penelitian meliputi isolasi plastida,
isolasi enzim klorofilase, penentuan aktifitas spesifik klorofilase pada pH= 7,4
dan penentuan aktifitas spesifik klorofilase dengan berbagai variasi pH dan waktu
inkubasi. Hasil penelitian diperoleh bahwa aktifitas spesifik tertinggi klorofilase
dari daun mahoni (Swietenia mahagoni) terdapat pada kejenuhan aseton 80-95%,
yaitu sebesar 13,605 unit/mg protein Adapun pengaruh pH dan waktu inkubasi
terhadap aktifitas spesifik tertinggi pada klorofilase terdapat pada pH 8,6 dan
waktu inkubasi 5 menit, sedangkan aktifitas spesifik klorofilase terendah pada pH
7,0 dan waktu inkubasi 45 menit. Adanya variasi pH dan waktu inkubasi
menunjukkan bahwa pH tidak terlihat mempengaruhi aktifitas spesifik klorofilase
sedangkan semakin lama waktu inkubasi, aktifitas spesifik klorofilase semakin
menurun.

Keywords: isolasi klorofilase, fraksinasi aseton, daun mahoni

ABSTRACK
Enzyme chlorophyllase was isolated and determination specific activity of
chlorophyllase from mahoni leaf (Swietenia mahagoni) Several stage of this work
including plastid isolation, determination of specific activity chlorophyllase at
pH= 7,4 and determination of specific activity of chlorophyllase with pH and
incubation time variation. Result showed the highest specific activity in leaf
mahogany (Swietenia mahogany) present in acetone with saturation of 80-95%,
with value is 13.605 units/mg protein. The influence of pH and incubation time of
the higher specific activity of chlorophyllase at pH 8.6 and incubation time of 5
minutes, whereas the smaller specific activity of chlorophyllase at pH 7.0 and
incubation time of 45 minutes. The presence of variation pH and incubation time
on specific activity of chlorophyllase, showed that variation pH not influence
specific activity of chlorophyllase and the longer of incubation time, specific
activity of chlorophyllase was decreased.

Keywords: isolation chlorophyllase, acetone fractionation, leaf mahogany

386
ChemInfo
Vol 1, No 1, Hal 386 392 , 2013
I. PENDAHULUAN deodocyl sulfate (merck), petroleum eter p.a.,
Enzim merupakan protein yang NaCl, dll.
berfungsi sebagai katalisator reaksi-reaksi
kimia dalam sistem biologis. Enzim memiliki 2.2 METODE KERJA
daya katalitik yang tinggi. Kemampuan enzim 2.2.1 Isolasi klorofil dengan Metode
dalam mengkatalisis suatu reaksi tergambar Kromatografi Kolom
melalui aktifitasnya. Harga aktifitas enzim Isolasi klorofil dari daun mahoni
dipengaruhi beberapa faktor antara lain: pH, menggunakan metode kromatografi kolom
suhu, konsentrasi enzim, konsentrasi substrat (Limantara, dkk., 2009). Daun mahoni yang
dan inhibitor (Lehninger, 1982). telah kering kemudian di blender dan di
Enzim memegang peranan dalam maserasi dengan metanol:aseton (7:3, v/v).
berbagai aspek dalam kehidupan, misalnya Lalu klorofil yang diperoleh digunakan
enzim klorofilase. Enzim klorofilase memiliki sebagai substrat untuk penentuan aktifitas
peranan penting dalam metabolisme daun. spesifik klorofilase.
Secara in vitro enzim ini mengkatalisis 2.2.2 Isolasi Plastida
pemutusan gugus fitol dari klorofil dan juga Daun mahoni yang telah dibersihkan
feofitin (Goodwin, 1976) dan dapat dan dikeringkan diiris kecil-kecil lalu
dimanfaatkan di berbagai bidang, salah diblender kemudian ditimbang sebanyak 75
satunya yaitu di bidang industri minyak. gram lalu dimaserasi dengan 500 mL larutan
Khamessan, dkk., (1995) melaporkan bahwa aseton. Homogenat disaring menggunakan
klorofilase dapat berfungsi sebagai agen corong Buchner. Filtrat hasil maserasi
bleaching pada minyak sayur dengan digabungkan untuk selanjutnya dipekatkan
menghilangkan senyawa klorofil. dengan rotary evaporator lalu dikeringkan dan
Berdasarkan manfaat tersebut, perlu disimpan dalam freezer.
dilakukan penelitian mengenai aktifitas 2.2.3 Isolasi Enzim Klorofilase
spesifik klorofilase yang terdapat pada daun Ekstrak aseton dari daun mahoni yang
mahoni. Tanaman mahoni merupakan tanaman berupa padatan hasil dari pengeringan kemudian
yang memiliki nilai potensial dalam bahan ditimbang sebanyak 2,01 gram. Selanjutnya
pembuatan obat-obatan. Namun daun mahoni isolasi klorofilase dengan menggunakan 40 mL
masih jarang di manfaatkan secara luas. larutan pengekstrak yang terdiri dari tris-
Diharapkan dengan isolasi klorofilase hidroksimetil-aminometan 42 mM, glisin 320
pemanfaatan daun pada mahoni dapat lebih mM, glukosa 670 mM, polivinylpirolidon 2%
luas dan dapat mengetahui informasi mengenai (w/v), sodium deodocyl sulfate 0,5% (w/v)
aktifitas klorofilase yang terdapat di daun dengan kondisi pH larutan campuran tersebut
mahoni tersebut. sebesar 7,4. Kemudian dilakukan pengadukkan
lambat menggunakan pengaduk magnet selama 8
o
II. METODE KERJA jam pada suhu 4 C, lalu disentrifugasi dengan
2.1 Alat dan Bahan kecepatan 10.000 rpm, selama 20 menit.
2.1.1 Alat Selanjutnya filtratnya difraksinasi dengan
Peralatan yang digunakan dalam pelarut aseton.
penelitian ini diantaranya yaitu alat-alat gelas 2.2.4 Fraksinasi Enzim Klorofilase dengan
laboratorium, Spectronic UV mini 1240, pelarut aseton
sentrifus Heraecus model Biofuge 13, Fraksinasi dilakukan untuk
inkubator, detektor UV (Spectroline ENF- memurnikan enzim (enzim kasar) dengan
24/F), dll. prinsip pengendapan. Untuk fraksi 0-20%,
2.1.2 Bahan larutan aseton dingin dengan kejenuhan 0-20%
Bahan yang digunakan dalam ditambahkan sedikit demi sedikit ke dalam
penelitian ini diantaranya yaitu: daun mahoni larutan ekstrak kasar enzim, kemudian
(Swietenia mahagoni), aseton p.a., glisin disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm
(merck), polivinylpirolidon (merck), sodium selama 15 menit. Filtrat hasil fraksi 1
dilanjutkan untuk fraksinasi selanjutnya yaitu
387
ChemInfo
Vol 1, No 1, Hal 386 392 , 2013
fraksi 2, 20-40%, fraksi 3, 40-60%, fraksi 4, larutan di sentrifugasi pada 12.000 rpm selama
60-80%, fraksi 5, 80-95%. 15 menit. Lalu aktifitasnya diuji dengan
pelarut organik dan diukur pada panjang
2.3.5 Penentuan Unit Aktifitas Enzim gelombang 662 nm dan dibandingkan dengan
Klorofilase larutan kontrol.
Satu unit aktifitas enzim klorofilase 2.2.8 Penentuan Aktifitas Spesifik
pada penelitian ini didefinisikan sebagai Klorofilase yang dipengaruhi Variasi
banyaknya enzim yang dapat menghidrolisis 1 Waktu Inkubasi
mg klorofil per menit pada kondisi optimum. Larutan campuran terdiri dari larutan
Untuk menentukan aktifitas enzim dilakukan aseton 35% (v/v), larutan natrium sitrat 12
dengan cara, larutan campuran terdiri dari mM, larutan klorofil dalam aseton, larutan
larutan aseton 35% (v/v), larutan natrium sitrat enzim dan larutan bufer fosfat dengan pH 7,4
12 mM, larutan klorofil dalam aseton, larutan dengan total volume 0,7 mL serta dibuat
enzim dan larutan bufer fosfat pada pH 7,4 larutan pengontrol. Masing-masing larutan
o
dengan total volume 0,7 mL serta dibuat d2nkubasi pada suhu 35 C dengan waktu
larutan pengontrol. Kemudian masing-masing inkubasi yang divariasikan yaitu 5 menit, 10
larutan di sentrifugasi pada 12.000 rpm selama menit, 15 menit, 20 menit, 25 menit, 30 menit,
15 menit. Lalu aktifitasnya diuji dengan 35 menit, 40 menit dan 45 menit. Lalu
pelarut organik dan diukur pada panjang aktifitasnya diuji dengan pelarut organik dan
gelombang 662 nm dan dibandingkan dengan diukur pada panjang gelombang 662 nm dan
larutan kontrol. 35% (v/v), larutan natrium dibandingkan dengan larutan kontrol.
sitrat 12 mM, larutan klorofil dalam aseton,
larutan enzim dan larutan bufer fosfat dengan III. HASIL DAN PEMBAHASAN
pH yang divariasikan pada pH 6,2; 6,3; 6,4; 3.1 Isolasi Klorofil dengan Metode
6,5; 6,6; 7,0; 7,4; 7,8; 8,2; 8,3; 8,4; 8,5; dan Kromatografi Kolom
8,6 dan total volume 0,7 mL, serta dibuat Ekstraksi pigmen klorofil ini dilakukan
larutan pengontrol. Kemudian masing-masing untuk mendapatkan klorofil dari daun mahoni
2.2.6 Penentuan Kadar Protein dengan (Swietenia mahagoni), yang akan digunakan
Metode Lowry sebagai substrat pada penentuan aktifitas
Kadar protein hasil fraksinasi aseton spesifik klorofilase. Hasil kromatografi kolom
ditentukan dengan metode Lowry silika gel didapatkan 23 botol fraksi, dengan
menggunakan larutan Bovine Serum Albumin 11 fraksi yang masing-masing akan di uji
(BSA) sebagai protein standar. dengan KLT. Hasil KLT produk isolasi
2.2.7. Penentuan Aktifitas Spesifik klorofil dengan kromatografi kolom dengan
Klorofilase yang dipengaruhi Variasi eluen heksan:eter:aseton (6:3:2) masing-
pH masing fraksi memberikan noda sebanyak 6
Untuk menentukan aktifitas enzim buah. Profil KLT tersebut mengindikasikan
yang dipengaruhi pH dilakukan dengan cara, ada berbagai macam produk yang dihasilkan
larutan campuran terdiri dari larutan aseton serta menunjukkan bahwa, eluen yang

388
ChemInfo
Vol 1, No 1, Hal 386 392 , 2013

digunakan masih belum cukup untuk larutan enzim berwarna kuning dan endapan
mendapatkan isolat klorofil murni. yang berwarna coklat kehijauan dengan nilai
Hasil analisis klorofil dengan KLT, tertinggi dari aktifitas klorofilase terdapat pada
menunjukkan bahwa klorofil a dan klorofil b fraksi 5, 80-95%.
berhasil di isolasi dari daun mahoni yang Selain menggunakan aseton, fraksinasi
terdapat di fraksi A, ditandai dengan juga dapat menggunakan pelarut organik
terbentuknya noda berwarna hijau muda untuk lainnya dan garam amonium sulfat. Penelitian
klorofil a dan noda berwarna hijau tua untuk sebelumnya (Karboune, dkk., 2005; Arkus,
klorofil b, dengan Rf dari klorofil a sebesar dkk., 2006; Kumar, dkk., 2011) mengisolasi
0,43 serta setelah di analisis dengan lampu dan fraksinasi klorofilase menggunakan
detektor UV, =365 nm terbentuk noda dengan pelarut aseton. Karena pelarut aseton yang
warna merah bata menyala. Klorofil pada bersifat lebih nonpolar dan klorofil akan larut
fraksi A tidak dimurnikan kembali dan dalam aseton dan protein dapat terendapkan
digunakan sebagai substrat pada penentuan tanpa mengendapkan klorofil.
aktifitas spesifik klorofilase. 3.4 Penentuan Kadar Protein dengan
3.2 Isolasi Enzim Klorofilase metode Lowry
Sebelum mengisolasi enzim klorofilase Kadar protein pada tiap-tiap fraksi diukur
pada daun mahoni (Swietenia mahagoni) dengan menggunakan metode Lowry. Melalui
terlebih dahulu dilakukan isolasi jaringan sel metode ini, protein dalam daun mahoni
(plastida) prosedur selanjutnya isolasi enzim (Swietenia mahagoni) akan bereaksi dengan
klorofilase. Hasil yang diperoleh yaitu pereaksi Lowry, menghasilkan senyawa
endapan berwarna hijau kecoklatan. Dalam hal kompleks berwarna biru. Hasil absorbansi
ini, SDS merupakan suatu molekul yang yang diperoleh kemudian diplotkan pada kurva
memiliki rantai lipofilik yang dapat berikatan standar BSA.
dengan protein pada permukaan hidrofiliknya. Kadar protein dari daun mahoni yang
Sehingga ikatan protein yang terikat dengan diperoleh pada fraksi tertinggi nilainya yaitu
kuat melalui gaya hidrofobik dapat terputuskan 65,172 mg/mL. Penelitian sebelumnya dengan
melalui proses pelarutan membran. (Scopes, penggunaan 2,01 gram serbuk yang diekstrak
1982; Johnston, 1987). Sedangkan untuk dan 40 mL larutan pengekstrak yang dikuti
mengurangi pengaruh dari senyawa-senyawa dengan pengendapan aseton mendapatkan
fenol yang dapat menginaktivasi enzim pada 0,387 mg protein pada daun suji, Sibarani,
saat mengukur aktifitas enzim digunakan dkk., (1995).
polivinylpirolidone (PVP). Berdasarkan 3.5 Penentuan Aktifitas Spesifik Enzim
penelitian (Lopez, dkk., 1992) diinformasikan klorofilase
bahwa polivinylpirolidone (PVP) yang Enzim Klorofilase ditemukan pertama
digunakan pada saat isolasi enzim klorofilase kali oleh Wilstater dan Stoll pada tahun 1910.
dapat meningkatkan aktifitas enzim klorofilase Nilai aktifitas enzim klorofilase ditentukan
dari Citrus limon. dari banyaknya substrat klorofil yang
3.3 Fraksinasi enzim klorofilase dengan berkurang, karena hasil reaksi enzimatis

389
ChemInfo
Vol 1, No 1, Hal 386 392 , 2013
pelarut aseton
Filtrat hasil penyaringan yang berisi
campuran protein enzim dan protein non 3.7 Pengaruh Waktu Inkubasi terhadap
enzim ini disebut ekstrak kasar enzim, Aktifitas Spesifik Klorofilase
sehingga masih membutuhkan pemurnian Waktu inkubasi merupakan waktu
lebih lanjut, menggunakan fraksinasi dengan kontak antara enzim dan substrat untuk
pelarut aseton. Hasil yang diperoleh yaitu menghasilkan produk. Hasil menunjukkan
klorofil yang diukur dengan metode bahwa enzim klorofilase hasil isolasi dari daun
spektrofotometri pada = 662 nm (Terpstra, mahoni (Swietenia mahagoni) memiliki pola
dkk., 1981., Khamessan, dkk., 1994). grafik yang tidak semestinya dari kerja suatu
Hasil yang diperoleh tidak adanya enzim. Seperti yang terlihat pada gambar 3.3
penampakkan warna hijau pada larutan semakin lama waktu inkubasi aktifitas enzim
tersebut. Hasil yang seharusnya adalah klorofilase semakin menurun.
terbentuknya larutan berwarna hijau yang
14.000
(Swietenia mahagoni) yang dipengaruhi

spesifik(U/mgprotein)
12.000
variasi pH, dilakukan terhadap enzim fraksi 10.000
terbaik hasil fraksinasi dengan aseton. Hasil 8.000

aktivitas
yang diperoleh, pada pH= 6,4 aktifitas enzim 6.000
spesifik klorofilase di daun mahoni mengalami 4.000
penurunan dengan unit aktifitas sebesar 4,487 2.000
unit/mL, pada pH= 7,4 hingga pH= 8,6 0.000
aktifitas enzim klorofilase dapat mengalami 0 20 40 60
peningkatan. Gambar grafik dari pengaruh pH t inkubasi (menit)
terhadap aktifitas enzim klorofilase pada daun
mahoni dapat dilihat pada gambar 3.2 berikut Gambar 3.3 Grafik pengaruh waktu
ini: inkubasi terhadap aktifitas spesifik
klorofilase pada daun mahoni (Swietenia
6.000 mahagoni)
aktivitas spesifik

5.000
(U/mg protein)

Penurunan aktifitas dapat disebabkan


4.000
karena enzim klorofilase yang diperoleh masih
3.000
belum murni dan adanya pengaruh inhibitor
2.000
pada saat pembentukkan reaksi kompleks
1.000
enzim substrat. Selain itu juga dapat
0.000 disebabkan karena waktu kontak dengan
6 7 8 9
aseton dan fitol yang dapat menurunkan laju
variasi pH reaksi. Karena aseton dan fitol dapat bertindak
sebagai inhibitor reaksi, sehingga akan terjadi
Gambar 3.2 Grafik pengaruh pH terhadap penyimpangan terhadap aktifitas yang
aktifitas spesifik klorofilase pada daun diperoleh dan memungkinkan terjadinya reaksi
mahoni (Swietenia mahagoni) balik penguraian kompleks enzim substrat
Dari gambar gambar 3.2 menunjukkan menjadi enzim bebas dan substrat kembali
tidak adanya puncak optimum yang diperoleh sehingga produk yang dihasilkan semakin
dari hasil kerja enzim tersebut dan pH tidak sedikit (Garcia, dkk., 1980).
terlihat mempengaruhi aktifitas spesifik enzim
klorofilase dikarenakan kondisi kemurnian IV. KESIMPULAN
enzim dan substrat yang masih belum murni. Dari hasil penelitian ini dapat
Selain itu, aktifitas enzim yang mulai menurun disimpulkan bahwa :
dapat disebabkan kontak enzim dengan sisa 1. Enzim klorofilase dapat diisolasi dari daun
aseton hasil fraksinasi. Karena aseton dapat mahoni (Swietenia mahagoni) yang
berfungsi sebagai inhibitor. (Garcia, 1980). difraksinasi menggunakan pelarut aseton.
390
ChemInfo
Vol 1, No 1, Hal 386 392 , 2013
Hasil fraksinasi dengan pelarut aseton
menunjukkan aktifitas spesifik tertinggi
pada daun mahoni (Swietenia mahagoni)
terdapat pada Fraksi ke 5, (80-95)%,
nilainya yaitu 13,605 unit/mg protein.

2. Pengaruh pH dan waktu inkubasi terhadap


aktifitas spesifik tertinggi pada klorofilase
terdapat pada pH 8,6 dan waktu inkubasi 5
menit, sedangkan aktifitas spesifik
klorofilase terendah pada pH 7,0 dan
waktu inkubasi 45 menit, dengan pola
grafik yang tidak sewajarnya (tidak
diperoleh kondisi optimum dari kerja
enzim klorofilase tersebut). Semakin lama
waktu inkubasi, aktifitas spesifik
klorofilase semakin menurun dan variasi
pH tidak mempengaruhi aktifitas spesifik
klorofilase pada daun mahoni (Swietenia
mahagoni).

V. DAFTAR PUSTAKA
1. Arkus, A.J., Kiani, dan Jez, M, Joseph.,
2006, Development of High- Troughput
purification method and a continous assay
system for Chlorophyllase. USA, Donald
Danforth Plant Sciences, Elsivier:
Analytical Biochemistry, 353, 93-98
2. Garcia, A.L., Galindo, L., dan Navaro, S.,
1980, Chlorophyllase in Citrus Leaves,
Kinetics Aspects of Reaction, Biol.Plant,
22,(4), 255-262
3. Goodwin, T.W., 1976, Chemistry and
Biochemistry of Plant Pigments, edisi
kedua, Vol.,2 Acid Pess, New York
4. Johnston, A., 1987, Immunochemistry in
Practice, edisi kedua. Blackwill Sci, Publ.
Grit, Britain
5. Karboune, Salwa, Neufeld, Ronald dan
Kermasha, S., 2005, Immobilization and
biocatalysis of chlorophyllase in selected
organic solvent systems, Elsevier, Journal
of Biotechnology, 120, 273-283
6. Khamessan, A., Kermasha, S., dan
Mollimard, L., 1995, Optimization of
Chlorophllase-Catalyzed Hydrolytic
Activity in a Micellar Ternary System,
Biotechnol, Appl. Biochem, 22, 327-343
7. Kumar, N., Gupta, S., Gupta, S.M., 2011,
Role of chlorophyllase in chlorophyll
homeostasis and post-harvest breakdown
391