DAFTAR ISI

DAFTAR ISI ........................................................................................................... 1

BAB I. ..................................................................................................................... 2
PENDAHULUAN .................................................................................................. 2
1.1 Latar Belakang .............................................................................................. 2
1.2. Tujuan ........................................................................................................... 3
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA........................................................................... 4
BAB III. .................................................................................................................. 6
METODE ................................................................................................................ 6
3.1 Alat dan Bahan .............................................................................................. 6
BAB IV. .................................................................................................................. 9
PEMBAHASAN DAN HASIL ............................................................................... 9
BAB V................................................................................................................... 13
PENUTUP ............................................................................................................. 13
5.1 Kesimpulan .................................................................................................. 13
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 14
 BAB I.

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Rekayasa genetika merupakan salah satu ilmu terapan dalam merekayasa
materi genetik untuk kepentingan manusia. Obyek rekayasa genetika mencakup
hampir semua golongan organisme, mulai dari bakteri, fungi, hewan tingkat
rendah, hewan tingkat tinggi, hingga tumbuh-tumbuhan. Rekayasa genetika sudah
digunakan dalam berbagai bidang kehidupan yaitu bidang kedokteran dan farmasi,
ilmu pangan, kedokteran hewan, pertanianlaporan bioteknologi (termasuk
peternakan dan perikanan), serta teknik lingkungan juga telah melibatkan ilmu ini
untuk mengembangkan bidang masing-masing. Rekayasa genetika sendiri
merupakan teknikn untuk memodifikasi DNA (sebagai substansi kimiawi dalam
kromosom yang bertanggung jawab atas pewarisan sifat) untuk menghasilkan
produk-produk baru yang memiliki kombinas sifat yang diinginkan (Chang 2009).

Plasmida adalah unsur genetik di luar kromosom (ekstrakromosoma) yang

mengadakan replikasi secara autonom di dalam sel bakteri. DNA-nya berbentuk
lingkaran dan beruntai ganda. Dan plasmida itu mendukung gen yang diperlukan
baik untuk replikasi plasmida maupun untuk fungsi lain. Umumnya wahana
plasmida mempunya densitas apungan berlainan daripada DNA inang dan dengan
mudah dapat dimurnikan. Beberapa plasmida memiliki beberapa kemampuan
untuk berintegrasi ke dalam kromosom inang, dan plasmida ini disebut episom
(Widyastuti, 2006).
Keberadaan plasmid merupakan hal terpenting dalam teknik DNA
rekombinan. Keberhasilan suatu teknik DNA rekombinan tergantung dari hasil
mengisolasi dan memurnikan DNA plasmid dari bakteri atau yeast. Pemurnian
DNA plasmid dilakukan untuk menghilangkan berbagai pengotor-pengotor yang
berasal dari bagian sel yaitu dinding sel dan beberapa protein (Sambrook &
Russell 2006).

Plasmid adalah DNA untai ganda yang berbentuk sirkuler yang berada
diluar DNA kromosomal bakteria. DNA ekstrakromosomal yang etrjadi secara
alamiah pada bakteria, yeast, dan beberapa sel eukaryotik yang berada secara
simbiotik maupun parasitik pada sel inang. Ukuran plasmid DNA lebih dari 100
kb. Sebagaimana sel inang yang menggandakan DNA kromosomal, sebelum
membelah plasmid juga melakukannya (Lodish, dkk, 2004).

Dalam dunia rekombinasi, plasmid yang sering digunakan adalah plasmid

dari bakteri E. coli, hal dikarenakan plasmid pada bakteri ini adalah plasmid yang
mempunyai ukuran yang cukup panjang, sehingga ketika direduksi, maka plasmid
ini akan menghasilkan ukuran sekitar 3 bp panjangnya (Lodish, 2000). Isolasi
plasmid bisa menggunakan metode minipreparation, dimana metode ini
digunakan untuk menekstrak DNA plasmid dari suspensi sel bakteri dan
didasarkan pada prosedur alkalin lysis yang telah dikembangkan oleh Birnboim
and Doly (dalam penelitianya tentang asam nukleat 7:1513, 1979) (Rachdie.
2008).

Dua tipe utama prosedur yang digunakan untuk memurnikan DNA adalah
sentrifugasi dan ekstraksi secara kimiawi. Prinsip-prinsip dari sentrifugasi adalah
dengan memisahkan molekul berdasarkan ukuran dan berat molekul. Sampel yang
disentrifugasi dengan kecepatan tinggi dan gaya sentrifugal menyebabkan
komponen yang lebih besar dan lebih berat akan terendap di dasar tabung yang
biasa disebut dengan pelet, sedangkan molekul yang ukuran dan beratnya lebih
kecil akan berada pada lapisan yang atas yang biasa disebut dengan supernatan.
Sebagai contoh, pemecahan sel bakteria dengan menggunakan lysozim dan
detergen akan menghasilkan larutan yang mengandung fragmen-fragmen dinding
sel yang lebih kecil dan fragmen DNA yang merupakan molekul raksasa. Apabila
larutan tersebut disentrifugasi maka DNA dan beberapa komponen besar lainnya
akan mengendap di dasar tabung sentrifus. sedangakan fragmen dinding sel
bersama dengan berbagai komponen larut lainnya bercampur pada supernatan
(Calladine,. 2004)

1.2. Tujuan
1.2.1 Mahasiswa mampu menganalisis DNA plasmid menggunakan elektroforesis
agarosa

1.2.2 Mahasiswa mampu menentukan ukuran DNA plasmid hasil retriksi

 BAB II.
TINJAUAN PUSTAKA

Elektroforesis merupakan proses migrasi molekul bermuatan dalam medium

yang dialiri arus listrik (Holme dan Hazel, 1998). prinsip dasar elektroforesis
adalah molekul dan partikel bermuatan akan bergerak ke arah elektrode yang
memiliki muatan berlawanan di bawah pengaruh medan listrik. Laju migrasi
molekul bermuatan tersebut menuju elektrode yang bermuatan negatif disebut
elektromobilitas.

Elektromobilitas suatu molekul dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu

semakin besar muatan molekul maka semakin besar pula elektromobilitasnya,
nilai elektromobilitas berbanding terbalik dengan besar ukuran molekul sehingga
molekul dengan ukuran lebih besar memiliki elektromobilitas yang lebih kecil bila
dibandingkan dengan molekul yang berukuran lebih kecil (Switzer, 1999). Selain
besar muatan dan ukuran molekul tersebut, topologi atau bentuk molekul turut
berpengaruh pula terhadap elektromobilitas suatu molekul.

Analisis keberadaan DNA plasmid dapat diketahui menggunakan metode

elektroforesis. Elektroforesis DNA umumnya menggunakan metode elektroforesis
gel agarosa (Karp, 2008). Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat
makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga
listrik. Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau
kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya (Magdeldin,
2012).

Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju

kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif
(kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug and Cummings,
1994). Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran,
konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala
besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat
digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap
individu (Fairbanks & Andersen, 1999).
 Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:

1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda

oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang
berukuran besar.
3. Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem
elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar.

Agarosa merupakan polisakarida turunan yang didapat dari alga merah

(Miesfeld, 1999). Biasanya, gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen
DNA yang lebih besar (lebih dari 200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk
fragmen kecil (kurang dari 200 bp). Mobilitas/pergerakan DNA relatif tergantung
pada faktor-faktor tertentu, terutama pada konsentrasi agarosa dalam gel, kekuatan
arus yang digunakan, kekuatan ionik dari larutan buffer, dan konformasi fragmen
DNA itu sendiri.

Molekul DNA bermigrasi melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam

padatan gel agarosa. Secara umum, molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat
dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena memiliki gesekan yang lebih
rendah saat bergerak menuju elektroda positif. Konsentrasi yang rendah pada gel
agarosa memberikan resolusi yang lebih baik untuk fragmen besar, dengan
memberikan pemisahan yang lebih besar antara band yang secara ukuran tidak
terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel yang lebih tinggi, di sisi lain, dapat
mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang yang sementara itu dapat
memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada fragmen DNA kecil (Lee &
Bahaman, 2010).

Namun, fragmen yang lebih besar dapat bermigrasi secara lebih cepat
daripada fragmen yang lebih kecil, karena tegangan pada gel yang ditingkatkan.
Selain itu, DNA memiliki muatan yang konsisten untuk rasio massa, sehingga
ukuran molekul DNA merupakan faktor utama yang mempengaruhi migrasi
melalui matriks gel.
 BAB III.

METODE

3.1 Alat dan Bahan

Alat

1. Neraca analitik
2. Erlenmeyer
3. Microwave
4. Mikropipet dan mikrotip
5. Tabung mikrosentrifus
6. Cetakan gel
7. Mesin elektroforesis
8. UV transilluminator

Bahan

1. Loading dye
2. Ekstrak DNA
3. DNA ladder 1 kb sebagai marker
4. Agarose
5. TBE 1 x (tris boric EDTA)
6. EtBr (ethidium bromida)
Prosedur Kerja : Elektroforesisi

agarosa ditimbang 0,4 g dan dilarutkan dalam 40 ml buffet TBE 1x

dengan cara pemanasan sampai semua agarosa larut sehingga
diperoleh gel agarosa 1 %, kemudian tambahkan 1 l EtBr. larutan
didiamkan hingga suhu 60oC.

cetakan / tray agarosa disiapkan dengan menutup sisi lubang

cetakan dengan selotip dan menempatkan sisir elektroforesis untuk
membentuk sumur.

larutan agarosa dituang ke dalam cetakan dan dibiarkan hingga

memadat.

setelah gel memadat, penutup cetakan dan sisir dilepaskan,

kemudian cetakan ditempatkan dalam tangki elektroforesis
yang berisi buffer TBE 1x.

sampel 5 l hasil isolasi (DNA genom / DNA plasmid)

yang telah dicampur dengan 2 l loading buffer (6x)
dimasukkan ke dalam salah satu sumur dan 6 l marka
DNA 1 kb ke dalam sumur lainnya.

elektroforesis dijalankan pada 80 V, 400 mA selama 60

menit.

gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV.

Penentuan Ukuran DNA

dibuat garis regresi antara log BM DNA (x) dengan jarak

migrasi (y)

jarak migrasi DNA yang akan ditentukan diukur dan

diinterpolasikan ke dalam garis regresi yang telah
dibuat sehingga dapat diketahui bila log BM dari
DNA tersebut
 BAB IV.

PEMBAHASAN DAN HASIL

Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:

1. Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarose.
2. Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarose.
3. Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarose.
4. Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses
elektroforesis(Birren and Lai, 1993).
Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada
makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif (Yuwono, 2005). Prinsip
kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui
suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke
kutub yang berlawanan muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak
dari kutub negatif ke kutub positif (Elektroforesis) melalui membran matriks gel
agarose tersebut (Yuwono, 2005).

Gel agarose merupakan fase diam dalam pemisahan fragmen DNA, konsentrasi
agarose yang digunakan dalam pemisahan fragmen DNA sangat mempengaruhi
mobilitas fragmen DNA, semakin besar konsentrasi agarose yang digunakan maka
semakin kecil pori-pori gel, dan semakin kecil konsentrasi agarose maka semakin
besar pori-pori gel. Perangkat dalam elektroforesis gel agarosa diantaranya terdiri dari
power supply sebagai sumber arus listrik; cetakan gel; sisir yang digunakan untuk
membuat sumuran tempat peletakan DNA yang akan dielektroforesis. Pembuatan
sumuran ini dilakukan dengan meletakkan sisir pada gel sebelum gel memadat; tangki
elektroforesis; dan elektrode(Martin, 1996).

Pemisahan fragmen DNA berdasarkan elektromobilitas berguna sebagai metode

analitik maupun preparatif, molekul DNA yang bermuatan negatif karena adanya
gugus fosfat akan bergerak menuju anode (elektrode bermuatan positif) saat
dipisahkan dengan elektroforesis (Miesfeld, 1999). Fragmen DNA yang memiliki
ukuran molekul yang sama akan memiliki elektromobilitas yang sama dan menempuh
jarak migrasi yang sama pula (Gilbert, 2000).

Proses running elektroforesis DNA sampel bersamaan dengan DNA yang telah
diketahui ukurannya (standard) dapat berguna dalam analisis besar ukuran DNA
dalam sampel (Switzer, 1999). DNA yang akan dielektroforesis pada umumnya
dicampur dengan loading dye yang berfungsi untuk memonitor mobilitas
elektroforesis, loading dye bermigrasi bersama molekul DNA selama proses running
elektroforesis. bromphenol blue dan xylenecyanol merupakan jenis loading dye yang
umum digunakan dalam elektroforesis DNA, bromphenol blue dapat bermigrasi
bersama dengan molekul DNA berukuran 0,5 kb sedangkan xylenecyanol dapat
bermigrasi bersama molekul DNA berukuran 5 kb (Ausubel et al., 2003).

Hasil elektroforesis dapat divisualisasi dengan menggunakan pewarna

fluoresensi ethidium bromide (EtBr) (Gilbert, 2000). Larutan ini berfungsi untuk
meningkatkan daya fluoresensi DNA saat disinari sinar UV dalam Gel Doc. Secara
teknis, setelah proses running, gel direndam dalam larutan buffer TBE atau TAE yang
mengandung ethidium bromide, selanjutnya ethidium bromide akan berdifusi ke
dalam gel dan berasosiasi dengan DNA (Switzer, 1999).

Ethidium bromide mampu berinterkalasi diantara pasang basa nukleotida pada

struktur double heliks (Gambar 3) dan saat gel hasil elektroforesis disinari dengan
ultraviolet maka fragmen-fragmen DNA yang telah terpisah tampak sebagai band-
band berwarna oranye (Campbell dan Shawn, 2009).
 Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju
pergerakan dari molekul DNA, yaitu:

1. Ukuran Molekul DNA

Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena
hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran
besar.
2. Konsentrasi gel
Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga
sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi
memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih
rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.
3. Bentuk molekul
Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak
dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.
4. Densitas muatan
Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan
densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan
densitas muatan yang rendah.
5. Pori-pori gel
Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan
molekul DNA.
6. Voltase
Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan
molekul DNA.
7. Larutan buffer elektroforesis
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga
mempercepat migrasi DNA(Wolfe, 1993).
 Pada hasil praktikum ini terlihat bahwa pita fragmen DNA dan marker DNA
yang tersinari UV bermigrasi pada gel agarose. Pita fragmen DNA dapat terlihat
maka dapat dihitung panjang fragmen dari suatu produk DNA. Pita fragmen DNA
dapat diukur dengan menggunakan suatu kurva regresi linier.

Hasil Elektroforesis disinari UV

Berikut Hasil dari praktikum kali ini:

Pb Log Jarak migrasi Jarak migrasi
Marka (cm) Sampel
Pita 1 :100 0.2 10 0.1237
Pita 2 : 500 2.09 1.4 0.55
Pita 3 : 1000 3 1.6 3.3
Pita 4 : 1650 3.22 1.8 3.3
Pita 5 : 2000 3.3 2 3.3
Pita 6 : 1200 4.08 3.5 3.3
Pers Regresi Y= 1.7133x 1.6873
Ukuran Sampel Pita 1: 35.5 Pb Pita 2: 1.8105 Pb
Keterangan :
Eluen 6 cm
Marker 1:5.7 cm
Maeker 2: 1.3 cm
Sampel 1: 1.3 cm
Sampel 2: 3.3 cm
 BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Prinsip kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan
melalui suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu
kutub ke kutub yang berlawanan muatannya (positif), maka molekul tersebut akan
bergerak dari kutub negatif ke kutub positif (Elektroforesis) melalui membran matriks
gel agarose tersebut
Pita fragmen DNA dapat diukur dengan menggunakan suatu kurva regresi
linier. Dimana persamaan regresi pada praktikum ini Y= 1.7133x 1.6873 dan
menghasilkan pita 1:35.5 Pb dan pita 2: 1.8105 Pb
 DAFTAR PUSTAKA

Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI. Nomor

1.Balitbang Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI, Jakarta

Sudarmadji, S., 1996. Teknik Analisa Biokimiawi. Edisi

Pertama.Liberty.Yogyakarta.

Sumitro, S. B, Fatchiyah, Rahayu, Widyarti, dan Arumningtyas. 1996. Kursus

Teknik-Teknik Dasar Analisis Protein dan DNA. Jurusan Biologi FMIPA
Universitas Brawijaya. Malang

Lee, S.V., Bahaman, A.R. 2010. Modified gel preparation for distinct DNA fragment
analysis in agarose gel electrophoresis.Tropical Biomedicine 27(2): 351-354
(2010).

Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed field ge electrophoresis: a practical guide. Academic
Press, Inc., San Diego.

Fairbanks, D.J., W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life. Brooks/Cole
Publishing Company, New York

Wolfe, S. L. 1995. Introduction to cell and molecular biology. Wardworth Publishing

Company, Belmont.