PEMBAHASAN LAPORAN BIOTEKNOLOGI

ISOLASI PROTEIN
Pada praktikum yang kami lakukan, protein yang kami isolasi merupakan protein
yang berasal dari organ hati dan jaringan otot ikan. Dalam proses isolasi protein, dikenal
adanya dua prinsip utama yaitu homogenesasi dan fraksinasi. Homogenesasi adalah proses
pengeluaran protein dari organ serta pencampuran reagen dengan organ target, sedangkan
fraksinasi adalah pemisahan protein dari organel lain berdasarkan berat molekulnya yang
dilakukan dengan menggunakan sentrifugasi (Fatchiyah dkk., 2012).
Proses homogenisasi diawali dengan menimbang organ hati dan jaringan otot ikan
seberat 0,5 gram dan meletakkannya di cawan petri. Langkah selanjutnya adalah mencuci
organ hati dan otot tersebut dengan menggunakan PBS (Phosphat Buffer Saline) sebanyak
tiga kali. Fungsi PBS (Phosphat Buffer Saline) ialah untuk pengenceran, mencuci suspensi
sel, pembilasan, serta bahan aditif untuk media kultur sel. PBS ini juga digunakan untuk
membantu penghalusan sampel, sebagai ringer, buffer, dan mencegah selsel pecah akibat
tekanan osmosis (Martin, 1996).
Organ hati dan otot yang telah dicuci dengan PBS diletakkan pada mortal dingin dan
dihaluskan. Fungsi penggunaan mortal dingin dalam menghaluskan organ adalah untuk
membantu protein di dalam organ agar tidak terdenaturasi. Hal yang perlu diperhatikan pada
proses penghalusan pada sampel organ adalah tidak boleh dilakukan terlalu lama agar protein
yang berada di dalam organ tersebut tidak rusak. Setelah penghalusan selesai, ditambahkan
PBS Tween-PMSF (Phenyl Methyl Sulfonyl Flouride) sebanyak 200 l. PMSF terbuat dari
Tris Base, EDTA, NaCl, PMSF dan NP40. PMSF bekerja sebagai inhibitor protease, dalam
hal ini PMSF menghambat kerja enzim protease agar tidak melisiskan protein (Yulianti,
2006). Setelah penambahan PBS Tween-PMSF, sampel dimasukkan ke dalam microtube
dengan menggunakan mikropipet dan dilanjutkan dengan sonifikasi selama 10 menit
menggunakan sonikator. Sonifikasi merupakan proses pemecahan membran dengan bantuan
gelombang ultrasonik.
Prosedur selanjutnya adalah melakukan fraksinasi dengan menggunakan sentrifuge.
Dalam praktikum ini, proses sentrifuge dilakukan dengan kecepatan 6000 rpm selama 15
menit pada suhu 4C. Fatchiyah, dkk. (2012) juga menjelaskan bahwa untuk
mempertahankan struktur dan fungsi protein, fraksinasi dilakukan pada suhu rendah (0-4C).
Pada proses sentrifuge ini, hanya diambil supernatannya saja karena berat molekul debris sel
lebih berat dari pada protein sehingga debris sel akan mengendap di permukaan bawah dan
protein akan berada di bagian atas. Supernatan yang sudah diambil kemudian dimasukkan ke
empat microtube baru masing-masing sebanyak 500 l, selanjutnya masing-masing
ditambahkan 500 l Ethanol PA dengan perbandingan 1:1. Penambahan ethanol PA
berfungsi untuk tahapan presipitasi (Fatchiyah, dkk, 2012). Setelah ditambahkan ethanol PA,
sampel organ hati dan otot dikocok sampai tercampur kemudian dihomogenkan dengan
menggunakan vortex, setelah itu didiamkan di freezer selama 24 jam agar ethanol bisa
terpresipitasi dengan sempurna.
Setelah diinkubasi di freezer selama 24 jam, dilakukan sentrifuge kedua dengan
kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4C selama 15 menit. Setelah selesai, etanol dibuang lalu
sampel dibiarkan dalam keadaan terbuka pada suhu ruang. Langkah selanjutnya adalah
meletakkan sampel pada wadah dengan posisi microtube terbuka. Wadah kemudian ditutup
dengan aluminium foil dan dimasukkan ke dalam kulkas dengan suhu 4C selama 24 jam.
Setelah 24 jam, sampel dikeluarkan dari kulkas dan ditambahkan dengan Tris-HCl pH 6,8
sebanyak 100 l. Tris HCl berfungsi untuk menjaga pH protein. Setelah ditambahkan Tris-
HCl, sampel dikocok sampai tercampur dan disimpan dalam freezer. Sampai pada tahapan
ini, sampel yang diperoleh berupa supernatan dalam tabung yang disebut dengan crude
protein yang siap untuk diuji secara kuantitatif dan kualitatif. .

UJI KUANTITATIF PROTEIN

Crude protein yang telah diperoleh diuji secara kuantitatif dengan menggunakan
Nanodrop spektrofotometer. Nanodrop spektrofotometer merupakan alat untuk mengukur
kuantitas hasil isolasi DNA, RNA, dan protein serta kontaminasi sampel. Spektrofotometer
terdiri dari spektrofotometer di bagian atas dan spektrofotometer di bagian bawah. Prinsip
kerjanya adalah spektrofotometer akan menembak sinar yang selanjutnya akan diserap oleh
bahan dan diukur oleh fotometer. Oleh karena itu ditambahkan Tris HCl sebagai
pelarut/buffer pada saat proses perhitungan dengan menggunakan Nanodrop
spektrofotometer.
Perhitungan kuantitas protein dilakukan dengan panjang gelombang 280 nm karena
diindikasikan bahwa protein mengandung triptofan, redisu tirosin atau ikatan cys-cys
disulfide yang menyerap cahaya dengan panjang gelombang 280 nm. Hasil pengukuran
secara kuantitatif ini menunjukkan bahwa konsentrasi protein yang tertinggi dimiliki oleh
sampel I yaitu 145,772 mg/ml dan konsentrasi protein yang terendah dimiliki oleh sampel II
yaitu 49,057 mg/ml.
UJI KUALITATIF PROTEIN
SDS-PAGE merupakan teknik purifikasi skala kecil yang menghasilkan pemisahan
suatu protein berdasarkan berat molekulnya dalam band (pita) spesifik yang tampak pada gel
polyacrylamide. Gel acrylamide dalam SDS-PAGE diletakkan diantara dua plat kaca. Ada
dua macam gel yang digunakan, yaitu main atau separating gel dan stcking gel. Separating
gel merupakan gel yang komposisinya paling banyak dan terletak dibagian bawah alat.
Separating gel berfungsi untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekulnya. Stacking
gel terletak pada bagian atas, digunakan untuk mencetak sumuran (sekat pemisah untuk
penempatan sempel). Komponen penting yang membentuk gel poliakrilamida adalah:
1. Akrilamida, sebagai senyawa utama yang menyusun gel dan merupakan senyawa
karsinogenik.
2. Bis akrilamida, berfungsi sebagai cross-linking agent yang membentuk kisi-kisi bersama
polimer akrilamida. Kisi-kisi tersebut berfungsi sebagai saringan molekul protein.
Perbandingan antara akrilamida dengan bis akrilamida dapat diatur sesuai dengan berat
molekul protein yang dipisahkan. Semakin rendah berat molekul protein yang
dipisahkan, maka semakin tinggi konsentrasi akrilamida yang digunakan agar kisi-kisi
yang terbentuk semakin rapat.
3. Amonium persulfat (APS), berfungsi sebagai inisiator yang mengaktifkan akrilamida
agar bereaksi dengan molekul akrilamida yang lainnya membentuk rantai polimer yang
panjang.
4. TEMED, berfungsi sebagai katalisator reaksi polimerisasi akrilamid menjadi gel
poliakrilamid sehingga dapat digunakan dalam pemisahan protein.
SDS merupakan sejenis detergen yang berfungsi mendenaturasikan protein,
memberikan muatan negatif pada protein, dan molekul hidrofobik (tidak suka air) (Seidman
dan Moore, 2000). Metode SDS PAGE dimanfaatkan untuk mendenaturasi protein menjadi
bentuk yang lebih sederhana, mengubah molekul menjadi bermuatan negatif. Metode SDS-
PAGE menggunakan gel poliakrilamid. Gel poliakrilamid terbentuk dari hasil
polimerasimonomer akrilamid dan bis akrilamid. Polimerisasi tersebut diinisiasi oleh
amoniun persulsat (APS) yang dapat membentuk radikal bebas (Martin, 1996).
Sistem buffer terdiri dari continous system dan discontinuous system. Continous
system menggunakan satu jenis gel yaitu menggunakan resolving gel, sementara discontinous
system menggunakan dua jenis gel berupa resolving gel dan stacking gel. Stacking gel
berfungsi untuk menahan sementara agar sampel bermigrasi pada waktu yang bersama.
Resolving gel berfungsi untuk memisahkan molekulmolekul yang ada berdasarkan berat
molekulnya. Pewarnaan atau staining pada gel juga merupakan bagian dari teknik SDS-
PAGE. Pada praktikum kali ini, pewarnaan dilakukan dengan menggunakan. Commasie blue
staining adalah pewarna tekstil trifenilmetana, dan lebih sering digunakan di dalam teknik
SDS PAGE. Commasie blue staining memiliki beberapa kelebihan yaitu harga yang relatif
murah, mengikat protein secara spesifik, dan bekerja cepat (Boyer, 1993).
Sebelum dilakukan elektroforesis, sampel ditambah dengan reducing sample buffer
disingkat RSB. Campuran sampel dan RSB didihkan kemudian dibiarkan dingin dan
ditambah gliserol 20% serta bromophenol blue 0,005%. Penambahan gliserol dimaksudkan
untuk menambah berat jenis sampel sehingga sampel tidak mengapung tetapi terdeposit atau
turun mengendap pada dasar sumur sampel, sedangkan bromophenol blue digunakan sebagai
tracking dye untuk menandai batas terjauh dari pergerakan sampel protein pada saat
elektroforesis (Fatchiyah dkk., 2012).
Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negatif
menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel poliakrilamid tergantung pada
berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka semakin jauh pula protein
bergerak dengan kata lain mobilitisnya tinggi. Sebaliknya, protein dengan berat molekul lebih
besar akan bergerak pada jarak yang lebih pendek dengan kata lain mobilitisnya rendah.
Dengan demikian, pada jalur pergerakan protein akan didapatkan jajaran protein (disebut
sebagai band atau pita protein) yang sudah terseparasi berdasarkan berat molekulnya
(Fatchiyah dkk., 2012).
Dalam kondisi tidak diwarnai, protein tersebut tidak terlihat karena memang protein
dalam sampel tidak berwarna. Setelah diwarna dengan staining solution yang mengandung
Coomassie brilliant blue R-250, protein yang tidak berwarna tersebut menjadi berwarna biru
karena mengikat Coomassie blue. Dalam kondisi ini kita bisa mengetahui keberadaan dan
mengukur mobilitas protein untuk kemudian ditentukan berat molekulnya (Fatchiyah dkk.,
2012).
Pada praktikum yang kami lakukan terjadi beberapa masalah. Masalah pertama yang
terjadi adalah sumuran yang dihasilkan kurang baik. Hal ini diakibatkan oleh katalis yang
digunakan kurang baik (APS dan TEMED), hal ini bisa saja terjadi karena volume kedua
larutan tersebut kurang tepat ketika ditambahkan. Atau hal ini terjadi akibat larutan terpapar
oksigen terlalu lama atau bisa juga karena penggunaan sisir yang tidak tepat. Permasalahan
kedua, pita-pita protein tidak tampak pada hasil. Hal ini disebabkan oleh sampel yang kurang
karena sumuran yang dibuat sebelumnya kurang baik. Pita-pita protein juga tampak tidak
jelas. Hal ini disebabkan oleh polimerisasi gel yang kurang maksimal dan belum lengkap atau
suhu gel yang terlalu tinggi (belum dingin).
Dalam praktikum ini, migrasi protein dengan elektroforesis dilakukan dengan arus
listrik sebesar 60 MA 130 volt selama 90 menit. Berdasarkan analisis data yang diperoleh,
penghitungan berat molekul protein secara kualitatif ini menunjukkan bahwa berat molekul
protein dari jaringan otot ikan lebih besar daripada berat molekul protein dari organ hati ikan.

KESIMPULAN
1. Melalui uji kuantitatif dengan menggunakan Nanodrop Spektrofotometer, diperoleh hasil
bahwa konsentrasi protein yang tertinggi dimiliki oleh sampel I yaitu 145,772 mg/ml dan
konsentrasi protein yang terendah dimiliki oleh sampel II yaitu 49,057 mg/ml.
2. Melalui uji kualitatif dengan menggunakan elektroforesis, diperoleh hasil bahwa berat
molekul protein otot lebih besar daripada berat molekul protein organ hati ikan.

DAFTAR PUSTAKA

Boyer, R.F. 1993. Modern Experimental Biochemistry. Second Edition. California: The
Benjamin Cummings Company Inc.

Fatchiyah; Widyarti, Sri; Arumningtyas, Estri Laras dan Permana, Sofi. 2012. Buku
Praktikum Teknik Analisis Biologi Molekuler. Malang: Universitas Brawijaya.

Martin, R. 1996. Gel Electroforesis: Nucleid Acids. Oxford: Bros Scientific Publishers Ltd.

Seidman, L.A. and Moore, C.J. 2000. Basic Laboratory for Biotechnology: Textbook and
Laboratory Reference. New Jersey: Prentice Hall, Inc.

Yulianti, Evy. 2006. Pengembangan Teknik Isolasi DNA Tumbuhan Menggunakan Detergen
Komersial. Yogyakarta: Jurusan Pendidikan Biologi FMIPA UNY.