Resumen: Las plantas poseen protenas importantes para la realizacin de la fotosntesis, como
tambin para la sntesis de azcares. Estas protenas se encuentran distribuidas en diversos
compartimentos subcelulares tales como cloroplastos y mitocondrias y la localizacin de estas
protenas se ha podido vislumbrar a travs de experimentos de fraccionamiento de estos
compartimentos subcelulares y su consecuente anlisis de las protenas presentes en dichos
compartimentos. En este prctico se realiz fraccionamiento subcelular de cloroplastos para la
determinacin de la localizacin de las protenas clorofila I y clorofila II (encargadas de cosechar la luz
incidente) y de las subunidades y de Coupling Factor 1 (CF 1) que forman parte del complejo
encargado de la sntesis de ATP. Por otro lado, mediante la transformacin transitoria de plantas de
tabaco con Agrobacterium tumefaciens fue posible insertar material gentico al ncleo celular de
clulas vegetales que contena las protenas a estudiar fusionadas a protenas fluorescentes tales como
GFP, YFP y RFP que pudieron ser vistas bajo microscopio de fluorescencia identificando la localizacin
subcelular de estas protenas. Por tanto, el uso de estas dos metodologas ya sea de forma separadas
o complementndose sirven para la determinacin correcta de la localizacin subcelular de protenas
de inters.
Por ltimo, los objetivos de este prctico fueron: Una vez obtenida la nueva concentracin se
obtener una suspensin cruda de cloroplastos procedi a determinar la distribucin de la
para realizar el fraccionamiento subcelular Protena Clorofila I (PCI), Protena Clorofila II
permitindonos localizar la ubicacin de las (PCII) y de las subunidades y de Coupling
protenas de inters; lograr transformacin Factor 1 (CF1). Para eso se debi seguir el
transitoria de hojas de tabaco mediante protocolo, detallado en Materiales y mtodos,
agrobacterium tumefaciens para determinar con lo cual se obtuvieron 4 muestras (NS, NP,
mediante microscopa de fluorescencia la TS y TP) las cuales fueron cargadas en un gel
localizacin de las protenas de fusin en condiciones denaturantes obtenindose lo
insertadas. mostrado en Figura 1. En la Figura 1A (gel sin
teir) las bandas de color verde indican la
Resultados
presencia pigmentos de distintos pesos
Fraccionamiento subcelular de cloroplastos moleculares, aunque al no haber bandas en el
carril 1 (leader) se dificulta conocer sus pesos
Tras la preparacin de la suspensin cruda de moleculares. Al teir el gel (Figura 1B) es
cloroplastos, se procedi a la estimacin de posible apreciar el Leader y por tanto conocer el
Figura 1. Gel de poliacrilamida en condiciones denaturantes sin teir (A) y con tincin de Coomassie (B). 1:Leader; 2-5:
Muestras NS, NP, TS, TP del Grupo de trabajo; 7-10: Muestras Grupo de Exequiel; 11: Control de Grupo de Mara
Jess G.; 12: Control de Grupo de Camila A.; 13: Control de Grupo de Valeria D.; 14: Control de Grupo de Pablo; 15:
Control de Grupo de trabajo.
Figura 2: Imgenes de microscopia de fluorescencia de muestras epidermal peel de hojas de tabaco infiltradas con
suspensin de agrobacterium con vector binario de protenas de fusin fluorescentes. A-D: Muestra Control (suspensin
de agrobacterium sin transformar); E-H: Muestra A; I-L: Muestra B; M-O: Muestra C; P-S: Muestra D. Imgenes A, E, I,
M y P corresponden a imagen de microscopia de campo; imgenes B, F, J, N y Q corresponden a imagen de microscopa
de fluorescencia superponiendo los filtros verde y azul; imgenes C, G, K, y R corresponden a imagen de microscopa
de fluorescencia usando filtro verde; imgenes D, H, L, O y S corresponden a imagen de microscopa de fluorescencia
usando filtro azul.