1

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Dasar Teori

Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak

mengadopsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat
warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadopsi dan
membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingnya
ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel
seperti spora dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat
(Dwidjoseputro, 1998). Pewarnaan bakteri dapat dibedakan atas pewarnaan negatif
dan pewarnaan positif yang terdiri atas pewarnaan sederhana, pewarnaan
differensial, dan pewarnaan khusus. Namun pada praktikum ini menggunakan
pewarnaan gram. Pewarnaan gram termasuk pewarnaan differensial karena dapat
digunakan untuk membedakan bakteri gram negatif dan bakteri gram positif.
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mengikat kuat pewarna dasar (kristal
violet) dan tidak dapat luntur oleh bahan peluntur (alkohol) dan setelah pewarnaan
gram akan menunjukkan warna ungu. Sebaliknya bakteri gram negatif akan
kehilangan warna dasar utama setelah tahap dekolorisasi dan setelah pemberian
warna penutup safranin akan memberikan warna merah muda.
Karakterisasi dan klasifikasi sebagian besar mikroba seperti bakteri dapat
diketahui berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat
tumbuh pada beberapa tipe media, memproduksi tipe metabolit tertentu yang di
deteksi dengan interaksi mikroba dengan reagen tes yang menghasilkan warna
reagen. Reaksi-reaksi dalam sel akan teridentifikasi dengan melakukan pengujian-
pengujian tertentu. Sel akan memberikan respon sesuai dengan kemampuan yang
dimilikinya, misalnya menghasilkan enzim katalase, enzim gelatinase atau
kemamupuan untuuk menghidrolisis lemak. Secara morfologis, biakan maupun sel
bakteri yang berbeda dapat tampak serupa. Oleh karena itu, ciri fisiologi ataupun
biokimia merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi spesimen
bakteri yang tidak dikenal karena secara morfologis biakan ataupun sel bakteri yang

1
 2

berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil pegamatan fisiologis yang memadai
mengenai kandungan (Cowan, 2004).

1.2 Rumusan Masalah

Adapun rumusan masalah yang terdapat dalam praktikum ini adalah :

Bagaimana cara melakukan pewarnaan gram pada bakteri?

Bagaimana cara melakukan identifikasi bakteri melalui uji biokimia?

Jenis bakteri apakah yang terkarakterisasi dalam uji biokimia yang dilakukan
dalam praktikum ini ?

1.3 Tujuan Percobaan

Praktikum ini bertujuan agar mahasiswa mampu mengetahui, teknik melakukan

pewarnaan gram, identifikasi, dan karakterisasi bakteri melalui uji biokimia.

1.4 Manfaat Percobaan

Manfaat yang dapat diambil dalam praktikum ini adalah mahasiswa biologi
mampu melakukan teknik pewarnaan gram kemudian dilanjutkan dengan
identifikasi dan karakterisasi bakteri melalui uji biokimia. Selain itu uji biokimia
ini dapat digunakan untuk mencari bakteri yang mampu menguraikan misalnya
limbah urea, nitrat, asam-asam kuat dan basa kuat hal tersebut dapat dimanfaatkan
dalam bidang industri sebagai pengolahan limbah yang dihasilkan oleh pabrik.
 3

BAB 2

MATERI DAN METODE

2.1 Alat dan Bahan

Alat dan Bahan Pewarnaan Gram Alat dan Bahan Uji Biokimia Bakteri
Isolat bakteri Koloni Bakteri
Gelas obyek Media Pertumbuhan (TSIA,
Bunsen SIM, MRVP, Simon Sitrat)
Ose Osse
Sendeok Bengkok Needle
Mikroskop Tabung Reaksi
Aquades Bunsen
Iodine Inkubator
Pewarna Gram (kristal violet)
Alkohol
Safranin
Minyak emersi

2.2 Prosedur Kerja

A. Pewarnaan Gram

- Melakukan penanaman sampel pada permukaan media padat.

- Memijarkan ose dan tunggu sampai dingin, kemudian ambil satu ose
suspense sampel yang telah terlebih dahulu sudah dipersiapkan.
- Menggoreskan ose ini pada permukaan Nutrien Agar, dimulai dari bagian
pinggir cawan petri, secara tidak terputus ose digerakan kekiri dan
kekanan.
- Memijarkan ose lagi, tunggu sampai dingin, ambil posisi cawan petri
diputar sedikit kearah kiri (berawanan jarum jam). Goreskan ose ini
dengan awal goresan menyentuh bagian akhir dari goresan pertama. Jadi
arah goresan kedua menyilang gorengan pertma. Lakukan demikian

3
 4

seterusnya untuk goresan ketiga dan keempat. Perhatikan bahwa ose

dipijarkan setiap akan digunakan untuk menggores. Untuk mengurangi
terjadinya kontaminasi, selama melakukan goresan cawan petri berada
dekat api dan tutup cawan dibuka secukupnya saja.
- Menginkubasikan pada 37C selama 18-24 jam.
- Mengambil salah satu sampel pada koloni untuk pembuatan preparat dan
pewarnaan bakteri.
- Menyiapkan gelas objek yang sudah dibersihkan diberi tanda lingkaran
(diameter kurang lebih 1cm). Gunakan daerah ini untuk mewarnai bakteri.
Membalik gelas obyek sehingga tanda lingkaran berada di baliknya.
- Menggunakan ose teril letakkan satu tetes aquadest pada permukaan gelas
objek didalam lingkaran
- Menggunakan ose steril untuk mengambil sedikit koloni bakteri dari
permukaan media padat dan campur dengan aquadest. Membuat lapisan
yang tipis mengeringkan gelas obyek ini pada temperature ruang atau
dengan cara meletakkan penuh diatas api busen.
- Meneteskan 2-3 tetas zat warna pertama, Kristal violet pada permukaan
gelas obyek yang berisi bakteri yang sudah difiksasi. Membiarkan selama
1 menit.
- Mencuci dengan air mengalir (air keran) dan dikeringkan.
- Menetesi dengan beberapa tetes larutan ioin (agar permukaan bakteri
diwarnai tertutup dengan larutan pewarna), dibiarkan selama 1 menit.
- Mencuci sisa iodin dengan air mengalir dan dikeringkan.
- Gelas objek dimiringkan sedikit, kemudian menyiram permukaan gelas
obyek yang berisi bakteri dengan larutan alcohol sampai larutan bekas
cucian alcohol tidak berwarna (30 detik)
- Cuci dengan air mengalir dan dikeringkan.
- Meneteskan beberapa tetes pewarna penutup, safranin dan biarkan selama
2 menit.
- Mencuci secara cepat dengan air mengalir dan dikeringkan (dengan
menggunakan kertas saring). Preparat dapat ditutupi dengan gelas
penutup.
 5

- Amati preparat dengan mikroskop perbesaran kuat 100x dengan minyak

emersi. Dicatat warna yang terlihat, warna merah menunjukkan bakteri
Gram negative, sedangkan warna biru bakteri Gram positif.

B. Uji Biokimia
- Sterilkan needle dengan bunsen
- Mengambil koloni bakteri menggunakan needle yang sudah steril.
- Menginokulasi secara tusuk tegak (stab) biakan bakteri pada medium
pertumbuhan sesuai pilihan.
- Menginkubasikan pada suhu 37 C selama 24-48 jam.
- Setelah inkubasi menambahkan tetes reagen yang sesuai dengan medium
pertumbuhan ke dalam tabung reaksi.
- Mengamati hasil yang didapat serta apa saja yang menjadi ciri khas dari
hasil medium tersebut.
 6

BAB 3
HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Pewarnaan Gram

Gambar 1. Hasil Pewarnaan Gram Bakteri Gram Positif

Berdasarkan pewarnaan gram pada praktikum kali ini, didapatkan hasil

bahwa bakteri yang digunakan berjenis gram positif. Preparat menunjukan warna
ungu atau violet yang merupakan salah satu ciri khas dari bakteri gram positif.
Pewarnaan gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang dapat membedakan
dua tipe dinding sel bakteri berdasarkan dari reaksi dinding sel terhadap zat warna
safranin atau kristal violet. Dari sistem pewarnaan ini bakteri dapat dibedakan
menjadi dua jenis, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.
Bakteri gram positif adalah bakteri yang memiliki dinding sel yang
mengandung sitoplasmik membran, terdapat banyak lapisan polimerik dari
peptidoglikan yang berhubungan dengan asam amino, dan terdiri atas beberapa
lapisan terluar yang disebut kapsul (Yazdankhah, 2001). Bakteri gram positif
memiliki struktur peptidoglikan yang tebal. Lapisan peptidoglikan ini digunakan
dalam identifikasi bakteri dengan sistem pewarnaan gram differensial (Lowy,
2009).
Bakteri gram positif berwarna ungu karena struktur lapisan dinding selnya
akan mempertahankan zat warna kristal violet sehingga saat diamati dengan

6
 7

mikroskop akan tampak warna ungu. Gram positif mempunyai susunan dinding sel
yang kompak dengan lapisan peptidoglikan yang tebal. Hal itu menyebabkan
permeabilitas dinding sel kurang, sehingga zat warna kristal violet tidak dapat
keluar saat dicuci oleh alkohol. Selain itu, bakteri gram positif yang tidak memiliki
kadar lipid yang tinggi pada dinding selnya akan mengalami denaturasi protein pada
dinding selnya akibat pencucian dengan alkohol. Protein dinding sel menjadi keras
dan beku, pori-pori mengecil sehingga zat warna kristal violet yang berwarna ungu
dipertahankan dan bakteri akan tetap berwarna ungu.
Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik bila digunakan biakan segar
yang berumur 24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan terjadi
penyimpangan hasil pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel yang mengalami
kerusakan pada dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat
warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol). Hal inilah
yang menyebabkan bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak dapat
mempertahankan zat warna kristal violet sehingga akan terlihat sebagai bakteri
gram negatif (Lay, 1994).

Gambar 2. Struktur Dinding Sel Bakteri (Silhavy, 2010).

 8

3.2 Uji Biokimia

Uji Biokimia Hasil Gambar
Triple Sugar Iron Bidang slant:
Agar (TSIA) Kuning
Bidang Butt:
Kuning
Produksi gas:
Positif (+)
Produksi H2S:
Negatif (-)

Simon Citrate Agar Perubahan Warna

(SCA) Hijau menjadi
Biru: Negatif (-)

Uji Gula-Gula Fermentasi Gula-

(Glukosa, Sukrosa, gula: Positif (+)
Maltosa, Manitol, Produksi Gas dan
dan Laktosa) Asam: Positif (+)

Tabel 1. Hasil Uji Biokimia Bakteri

 9

3.2.1 Uji Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

TSIA adalah media differensial yang digunakan untuk menentukan adanya
fermentasi karbohidrat dan produksi H2S. Gas yang berasal dari fermentasi
karbohidrat juga dapat diamati. Bakteri dapat memetabolisme karbohidrat secara
aerob (dengan oksigen) dan anaerob (fermentasi/tanpa oksigen). TSIA
membedakan bakteri berdasarkan kemampuannya dalam fermentasi glukosa,
laktosa, dan sukrosa serta berdasarkan produksi H2S (Lehman, 2005).
Pada media TSIA terdapat 3 macam karbohidrat, yaitu glukosa, laktosa, dan
sukrosa. TSIA mirip seperti Kliglers Iron Agar, tetapi pada Kliglers Iron Agar
hanya terdapat 2 karbohidrat, yaitu glukosa dan laktosa. Selain terdapat karbohidrat,
media ini juga mengandung ekstrak daging, ekstrak yeast, dan pepton yang
merupakan sumber dari nitrogen, vitamin, dan mineral. Pada tabung, terlihat bagian
slant dari media yang bersifat aerob dan bagian butt yang bersifat anaerob. Ketika
karbohidrat difermentasi, penurunan pH (keadaan asam) menyebabkan media
berubah warna dari merah-orange menjadi kuning (Lehman, 2005).
Jika slant tabung berwarna kuning maka menunjukan bahwa bakteri tersebut
memfermentasi sukrosa dan laktosa. Jika bagian butt tabung berwarna kuning
menunjukan bahwa bakteri tersebut memfermentasi glukosa. Warna kuning pada
bagian slant atau butt tabung menunjukan bahwa bakteri bersifat asam, tetapi jika
slant atau butt tabung berwarna merah berarti tersebut bersifat alkali. Warna merah
tersebut disebabkan karena adanya pepton yang bersifat alakali. Sodium
trhiosulfate pada media akan dipecah oleh bakteri menjadi hidrogen sulfida (H2S).
Terbentuknya H2S ini ditandai dengan munculnya warna hitam. Fermentasi
karbohidrat pada TSIA juga menyebabkan terjadinya pembentukan gas CO2 yang
dapat dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar pada bagian butt tabung.
Pada praktikum yang telah dilakukan, bagian slant dan butt pada tabung
berwarna kuning (A/A atau acid over acid). Sehingga dapat diambil kesimpulan
bahwa bakteri dapat memfermentasi glukosa, sukrosa, dan laktosa. Pada tabung
tidak timbul warna hitam yang menunjukan bahwa tidak terbentuknya H2S. Pecah
dan terangkatnya agar pada bagian butt tabung menunjukan bahwa terdapat
pembentukan gas CO2.
 10

3.2.2 Uji Simon Citrate Agar (SCA)

Simon Citrat Agar (SCA) adalah media padat yang terdiri atas
monoamonium fosfat, Na citrate, NaCl, air, agar, dan indicator Bromtymol blue.
Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui apakah bakteri menggunakan sitrat
sebagai sumber karbonnya. Apabila bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber
karbon maka media akan berubah menjadi basa dan berubah warna menjadi biru.
Apabila tidak terjadi perubahan warna media dari hijau menjadi biru maka hasil
didapatkan adalah negatif. Bakteri tersebut tidak mempunyai enzim citrat permease
yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam sel. Sehingga bakteri tidak
menggunakan sitrat sebagai salah satu/satu-satunya sumber karbon. Apabila terjadi
perubahan warna media dari hijau menjadi biru maka hasil yang didapatkan adalah
positif. Bakteri menggunakan sitrat sebagai salah satu/satu-satunya sumber karbon
(Ratna, 2012).
Pada praktikum yang telah dilakukan, terlihat bahwa media tidak
mengalami perubahan warna menjadi biru. Maka dapat diambil kesimpulan bahwa
bakteri tersebut tidak menggunakan sitrat sebagai sumber karbonnya.

3.2.3 Uji Gula-Gula

Uji ini digunakan untuk mengetahui apakah bakteri dapat memfermentasi
glukosa, laktosa, sukrosa, maltosa dan manitol dan kemudian membentuk asam.
Pemanfaatan gula sebagai sumber karbon menyebabkan akan terbentuknya asam
yang menurunkan pH media sehingga media yang mengandung indikator fenol red
tersebut akan berubah dari merah menjadi kuning. Hasil negatif (-) didapatkan jika
tidak terjadi perubahan warna media dari merah menjadi kuning, artinya bakteri
tidak memfermentasi gula. Hasil positif (+) didapatkan jika terjadi perubahan warna
media dari merah menjadi kuning. Fermentasi gula juga dapat menyebabkan
terbentuknya gas yang akan terlihat pada media. Gas yang diperhitungan minimal
10% dari tinggi tabung durham (Adam, 2001)
Pada praktikum yang telah dilakukan terlihat bahwa terjadi perubahan
warna media menjadi kuning yang menunjukan hasil positif fermentasi gula dan
membentuk asam. Selain itu, pada media juga ditemukan gas yang menunjukan
bahwa fermentasi gula tersebut disertai dengan terbentuknya gas.
 11

BAB 4
PENUTUP
4.1 Kesimpulan
Pewarnaan gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang dapat
digunakan untuk membedakan dua tipe dinding sel bakteri. Setelah dilakukan
prosedur pewarnaan gram, hasil menunjukan bahwa warna ungu pada media
menandakan bakteri yang diuji bersifat gram positif. Karena memiliki lapisan
dinding sel dengan peptidoglikan yang tebal, bakteri gram positif tidak mengalami
peluruhan dan perubahan warna saat dicuci dengan alkohol. Zat warna kristal violet
tetap melekat pada dinding sel bakteri gram positif.
Karakterisasi dan klasifikasi bakteri dapat dilakukan dengan cara reaksi
enzimatik atau uji biokimia. Pada praktikum kali ini dilakukan tiga uji biokimia,
yaitu uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar), uji SCA (Simon Citrate Agar), dan uji
gula-gula. Pada uji TSIA bagian slant dan butt pada tabung berwarna kuning dengan
media yang terlihat pecah dan terangkat. Hal itu menunjukan bahwa bakteri tersebut
dapat memfermentasi glukosa, sukrosa, dan laktosa serta dapat menghasilkan gas
CO2. Pada uji SCA terlihat bahwa tabung reaksi tidak mengalami perubahan warna
media. Hal itu menunjukan bahwa bakteri yang diuji tidak membutuhkan sitrat
sebagai sumber karbonnya. Pada uji yang terakhir, yaitu uji gula-gula terlihat bahwa
terjadi perubahan warna media menjadi kuning serta terlihat gas pada media. Hal
ini menunjukan bahwa bakteri tersebut positif memfermentasi gula, membentuk
asam, terbentuk gas pada proses fermentasinya.

4.2 Saran
Sebaiknya untuk para praktikan lebih berhati-hati dalam penggoresan jarum
ose ke medium. Karena jika medium rusak, pada saat melakukan pengamatan akan
sulit untuk melihat pertumbuhan koloni bakteri tersebut. Selain itu, perlu dilakukan
praktikum lebih lanjut agar mahasiswa dapat mengaplikasikan teori yang
didapatkan dengan lebih baik sehingga tidak lagi terjadi kegagalan dalam
percobaan yang dilakukan.

11
 12

DAFTAR PUSTAKA
Adam, M. R. 2001. Microbiology of Fermented Food. Elsivier Applied Science
Publisher. New York.
Cowan, S.T. 2004. Manual for the Identification of Medical Fungi. Cambridge
University Press. London.
Dwidjoseputro. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Malang.
Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Erlangga: Jakarta.
Lehman, Donald. 2005. Triple Sugar Iron Agar Protocols. American Society For
Microbiology: 1-6.
Lowy, Frank. 2009. Bacterial Classification, Structure and Function. Columbia
University Press. New York.
Ratna, Siri. 2012. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek: Teknik dan Prosedur Dasar
Laboratorium. PT Gramedia: Jakarta.
Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. 2010. The Bacterial Cell Envelope. Cold
Spring Harbor Perspectives in Biology Vol 2: 1-13.
Yazdankhah, S. P., Sorum, H. Larsen, H. J. S., Gogstad, G. 2001. Rapid Method
for Detection of Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria in Milk from
Cows with Moderate or Severe Clinical Mastitis. Journal of Clinical
Microbiology Vol. 39 (9): 3228-3229.