Universidad de San Carlos de Guatemala

Facultad de Ciencias Qumicas y

Farmacia

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

(CCF)

Anlisis Instrumental II
Diciembre, 2013

1
 Cromatografa en Capa Fina
En CCF (TLC) la separacin se lleva a cabo
sobre una capa fina de fase estacionaria
slida adherida a un soporte slido (placa
de vidrio, Al o plstico), al paso de una
fase mvil lquida, llamada tambin
disolvente, que se mueve a lo largo de la
placa.

2
3
 Ejemplo de aplicacin.

Separacin del sesquiterpenoide

Hernandulcina de la planta
P. dulcis.

4
 Mecanismos de separacin
Adsorcin

Reparto

Intercambio inico

Exclusin por tamao

5
 Adsorbentes y otros separadores
cromatogrficos
Los mismos o similares a los usados en
CC (Slica gel, Almina, diatomeas, etc).
Menor tamao de partcula que en CC.
Algunos adsorbentes cuentan con
indicador fluorescente (Silicato de zinc
emite luz de 254 a 360 nm)
Adsorbente ms utilizado en CCF, Slica
gel
6
El proceso de adsorcin

7
Separacin de dos componentes en un
experimento de CCF

8
 Seleccin de las condiciones
cromatogrficas
Solventes seleccionados en orden de polaridad creciente.

Solvente Constante dielctrica

hexanos 1.89
ciclohexano 2.02
tolueno 2.38
Eter dietlico 4.34
Acetato de etilo 6.02
Cloruro de metileno 8.93
acetona 20.7
metanol 32.7
agua 80.1 9
Diagrama que relaciona la polaridad de la muestra
con la del solvente y la actividad del adsorbente
para una buena separacin por CCF.

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Familias de compuestos orgnicos en orden creciente
de polaridad:
Hidrocarburos alifticos,
halogenuros de alquilo,
hidrocarburos insaturados,
hidrocarburos aromticos,
halogenuros de arilo,
teres,
steres,
cetonas,
aldehidos,
amidas,
aminas,
alcoholes,
fenoles,
cidos carboxlicos,
aminocidos.

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Enlaces de hidrgeno intra e
intermoleculares

12
 Separacin de mezclas hipotticas.
Compuesto 1 es ms polar que el compuesto 2.

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 Ejercicio:
Los siguientes fenoles fueron analizados por CCF en Slica Gel G usando
una mezcla de tolueno, metanol y cido actico (10:2:1) como fase mvil.
los valores de Rf medidos fueron: 0.20, 0.41, 0.63, 0.84. Indique el valor
de Rf que corresponde a cada estructura.

resorcinol salicilaldehido Galato de etilo

cido glico

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Separacin de mezclas hipotticas.

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 Adsorbentes y otros separadores
cromatogrficos
xido de Aluminio (Almina)

Adsorbente alcalino, preparado tambin como

almina neutra y cida.
Utilidad: Separacin de compuestos neutros y
alcalinos, hidrocarburos policclicos, alcaloides,
aminas, vitaminas liposolubles y algunas cetonas.
La almina puede catalizar la descomposicin de
muchos compuestos organicos, en particular
cetonas insaturadas

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 Adsorbentes y otros separadores
cromatogrficos
Clasificacin de la Almina de acuerdo al contenido de agua
Cantidad de agua a adicionar al Cantidad de Agua determinada
Tipo I por el mtodo de Karl-Fischer (%)

Tipo II 4-4.5%

Tipo III 7-7.5%

Tipo IV 11-11.5%

Tipo V 16-16.5%

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 Adsorbentes y otros separadores
cromatogrficos
Slica Gel:
Para separar: aldehdos, cetonas,
alcaloides, azcares, fenoles, esteroides,
terpenoides, cidos grasos y aminocidos.
Cuando la slica gel no se activa por calor,
contiene agua suficiente para que las
separaciones ocurran por un mecanismo de
reparto.
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 Adsorbentes y otros separadores
cromatogrficos
Celulosa y resinas cambiadoras de
iones:
Se emplean en la cromatografa de capa
fina por intercambio inico y las resinas se
usan tambin para separacin de
compuestos orgnicos por mecanismo de
reparto.

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 Adsorbentes y otros separadores
cromatogrficos
Polvo de poliamidas: Formacin de enlaces
de hidrgeno entre cadenas de polmero y
solutos.
Preparadas a partir de nylon 66, nylon 11 y
nylon 6
Tipos de compuestos separados:
flavonoides, fenoles, nitroanilinas,
benzofenonas, derivados de aminocidos,
etc.
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 Adsorbentes y otros separadores
cromatogrficos
Aglutinantes: Su objeto es retener la capa
del adsorbente sobre la placa; el ms
comn es el yeso (sulfato de calcio
monohidratado), que se aade a los
adsorbentes en un 10 a 15%. Otro es el
almidn que se aade en cantidades de 1
a 3%.

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 Preparacin de Placas
Aplicador Kensaco

Espesores mltiples y compuertas intercambiables: capas de 250, 275, 500,

1500 y 2000 mm de espesor.
Compuerta para capas de espesores de 50 a 3000 mm en etapas de 50 mm.
Valores de Rf constantes dentro de un intervalo de espesor razonablemente
amplio (10 a 20 mm)
Compuertas con gradiente de espesor.
Aplicadores con separadores de adsorbente, para dos a cinco secciones
paralelas de diferentes capas de adsorbentes sobre la misma placa.

Aplicador Camag:

Estacionario, la placa se desplaza por debajo del aplicador. Se producen

placas de 300 a 500 mm de espesor y durante el secado se encoge la capa a
200-250 mm.

Preparacin de portaobjetos por sumergimiento en suspensin de

adsorbente.

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23
 Preparacin de Placas
Secado:
Slica gel o almina, son secadas durante 15
minutos manteniendo el soporte en posicin
vertical. Despus se seca en posicin vertical en
un horno durante 1 a 2 h a 10-120C.
Actividad determinada efectuando la
cromatografa de una mezcla patrn de colorantes
(azobenceno, p-metoxiazobenceno, p-
aminoazobenceno, sudn III y sudn IV) o
mediante sustancias del tipo de las que se desean
separar.

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 Preparacin y aplicacin de muestras

Procedimientos similares a CP y CC.

Muestras: disoluciones 0.1 - 1% aplicadas con

micropipetas o microjeringas de 10 a 100 ml o con
tubos capilares con orificio de 0.5 - 0.1 mm d.

Manchas: 1-3 mm d; separacin: 1-2 cm

Separaciones analticas: aplicaciones de 5 a 100

mg.

25
Aplicacin de la muestra

26
Anlisis del cromatograma

27
 Anlisis del cromatograma
Rf depende principalmente de:

El espesor del adsorbente

La naturaleza de la fase estacionaria y su
grado de activacin.
La fase mvil
La cantidad de material aplicado

28
 Anlisis del cromatograma
El Rf es difcil de reproducir.

a) Uso de estndar para identificacin preliminar

(realizar anlisis posteriores, para confirmacin).
b) Co-cromatografa.

Importante: En CCF el nmero de manchas indica

el nmero mnimo de compuestos presentes en
una muestra.

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 Seleccin de sistemas de disolventes
Tipos de disolventes utilizados en CCF dependen
del adsorbente, su actividad y los solutos:

a) Disolventes puros de las series eluotrpicas

b) Mezclas de disolventes
c) Disolventes totalmente acuosos, totalmente
orgnicos, acuoso-orgnicos e inicos.

Pequeas variaciones en la composicin de las

mezclas de disolventes pueden variar Rf.

30
 Seleccin de sistemas de disolventes

Mezclas equielutrpicas: Mezclas diversas de

disolventes que pueden originar iguales
desplazamientos de una misma mancha.

Para productos naturales o productos

farmacuticos es conveniente correr
cromatografas usando mezclas de los mismos
disolventes en diferentes proporciones.

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 Mtodos de desarrollo en CCF
Para publicar valores de Rf se recomienda:

1) Usar adsorbentes comerciales estndar

2) Preparar y activar las capas siempre de la misma
manera
3) Aplicar cantidades pequeas y conocidas de los
compuestos que se van a separar
4) Preequilibrar las cromatoplacas en una cmara
cuidadosamente saturada
5) Desarrollo de cromatogramas a distancia constante.
6) Promedio de tres o ms determinaciones.

32
 Localizacin de zonas, identificacin y
documentacin
Localizacin:
Agentes cromgenos (tcnicas de visualizacin destructivas y no
destructivas).
Localizacin con luz UV a 254 nm (uso de silicato de Zn)
Manchas radiactivas: contador de radiaciones o autorradiografa.

Identificacin:
Comparacin con compuestos de referencia
Tcnicas espectrofotomtricas

Documentacin:
Delineacin en papel cebolla
Fotografas
Fotocopias

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Cromatoplacas CCF con indicadores
fluorescentes visualizadas por luz UV

34
 Reactivos cromgenos utilizados en las CCF

CCF, recomendable, rociado de la cromatoplaca

con el reactivo. Hacerlo en campana de
extraccin y a una distancia de 20 a 30 cm.
Los cromatogramas deben examinarse con luz
UV, (254 nm y 360 nm) antes y despus de la
aplicacin de los agentes cromgenos.
Agentes cromgenos permiten localizar en el
cromatograma en papel de 1 a 10 mg de
compuesto y en cromatogramas en capa fina,
de 0.1 a 1 mg.

35
 Isotermas de adsorcin en CCF

La calidad de una separacin cromatogrfica

depende de la concentracin de la muestra,
entre otros factores.
Existe un nmero limitado de sitios de enlace en
la superficie del adsorbente, por lo que hay
tambin un lmite para la cantidad de material
que puede ser adsorbido por unidad de rea.
La grfica de la relacin entre las
concentraciones den la Fase estacionaria ([A]s)
y en la fase mvil ([A]m) para un compuesto
hipottico, es llamada isoterma de adsorcin.
36
Isotermas de adsorcin en CCF

37
Efecto de la concentracin sobre la forma del pico

38
Efecto de la concentracin sobre la forma del pico

39
 Ventajas y desventajas de CCF
Ventajas:

Facilidad de realizar en cualquier laboratorio.

Velocidad
Necesita solo pequeas cantidades de muestra (mg)
Utilidad: Seguimiento de reacciones, determinacin de nmero de
compuestos en una mezcla, identificacin de compuestos, para
seguimiento de cromatografas en columna y para verificar la
pureza de las muestras.

Limitaciones:

No se pueden analizar compuestos voltiles.

Cuantificacin ms difcil que en CG y HPLC.

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 Disolventes usados en la CCF de algunos grupos de compuestos
orgnicos (Relacin v/v)
Tipo de compuesto Sistema cromatogrfico

Esteroides y Esteroles: Benceno o benceno-acetato de etilo (9:1 8:2), (Slica gel G)

Cloroformo-etanol (96:4), (almina)
Acetato de etilo-ciclohexano (mezclas diversas), (cido silcico
aglutinado con almidn)
Benceno-cloroformo (9:1), (Slica gel G)
Terpenoides Hexano o hexano-acetato de etilo (85:15), (cido silcico aglutinado
con almidn)
Benceno o mezclas de benceno-ter de petrleo o etanol (almina)
ter isoproplico o ter isoproplico-etanol (5:2 o 19:1) (Slica gel G)
Aceites esenciales Benceno-cloroformo (1:1), (Slica Gel G)
ter de petrleo (Slica gel G)

cidos grasos ter de petrleo-ter isoproplico-cido actico (70:30:1) (Slica Gel C)

Cloroformo-ter de petrleo (Almina)

Alcaloides Cloroformo o etanol o hexano-cloroformo (3:7) ms 0.05%

dietilamina (Almina)
Benceno-etanol (9:1), (Slica Gel)
Cloroformo-acetona-dietilamina (5:4:1), (Slica Gel G) 41
 Separacin I: Slica gel GF
Fase mvil: Benceno
Revelador: fosfomolibdato, 10 min, 100C
Anisaldehido-cido sulfrico, 10 min 100C

42
Separacin 2: Fase estacionaria: Slica Gel G
Fase mvil: cloroformo-benceno (75+25)
Revelador: fosfomolibdato, 10 min, 100C

43
 Separacin 3: Fase estacionaria: Slica Gel G
Fase mvil: benceno-Acetato de etilo (70+30)
Revelador: anisaldehido-Acido sulfrico, 10 min, 100C

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Bioautografa

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 Anlisis Cuantitativo
1) In situ
Fluorescencia
Radiocromatogramas

2) Espectrofotomtricas
Raspado y disolucin
Elucin de las manchas

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Densitmetro

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 Cromatografa en Capa Fina
Preparativa
Para separar mezclas de masa < 0.5 g
Capas gruesas de adsorbente (0.2-2 mm)
Aplicacin de la muestra de hasta 5 mL
Localizacin de bandas por formacin de
tiras gua
Raspado de bandas para recuperacin de
compuestos separados

48
CCF preparativa

49
CCF de dos dimensiones

50