Anda di halaman 1dari 31

Teknik L oksidasi -tyrosine di Escherichia coli dan mikroba produksi hydroxytyrosol

Kata kunci:

Tirosin hidroksilase Tetrahydrobiopterin Tetrahydromonapterin Dopa dekarboksilase Hydroxytyrosol

Produksi mikroba

abstrak

Hidroksilasi tirosin merupakan reaksi penting dalam biosintesis banyak produk alami. Penggunaan
bakteri untuk reaksi ini belum sangat sukses karena baik over-oksidasi orto-kuinon ketika
menggunakan tyrosinases dari bakteri atau tanaman, atau kurangnya kofaktor asli,
tetrahydrobiopterin (BH4), yang diperlukan untuk aktivitas hydroxylases tirosin (TH). Di sini, kita
menunjukkan bahwa Escherichia coli kofaktor, tetrahydromonapterin (MH4), dapat digunakan
sebagai kofaktor alternatif untuk TH di hadapan BH4 regenerasi jalur, dan tirosin hidroksilasi
dilakukan tanpa over-oksidasi. Kami menggunakan platform ini untuk biosintesis salah satu
antioksidan yang paling kuat, hydroxytyrosol. Sebuah aromatik aldehid oksidase endogen
diidentifikasi dan tersingkir untuk mencegah pembentukan produk samping, dan ini mengakibatkan
produksi di hampir eksklusif hydroxytyrosol di rekayasa E. coli. Akhirnya, produksi hydroxytyrosol
dari gula sederhana sebagai sumber karbon tunggal adalah ditunjukkan.

1. Perkenalan

Hidroksilasi cincin aromatik merupakan reaksi penting yang digunakan untuk persiapan banyak
senyawa yang berharga termasuk L-DOPA Untuk pengobatan penyakit Parkinson, alkaloid analgesik
seperti matian phine dan kodein, dan indole alkaloid seperti serotonin dan melatonin ( Ali et al,
2007. ; Haq et al., 2003 ; . Maskos et al, 1992 ; Nakagawa et al., 2011 ; . Taman et al, 2011 ).
Dibandingkan dengan organik sintesis, yang sering menggunakan oksidan logam di organik pelarut,
hidroksilasi enzimatik cincin aromatik yang menarik dan metode yang menjanjikan untuk
mensintesis produk yang diinginkan dalam satu langkah dengan regioselectivity tinggi menggunakan
kondisi ringan ( Hollmann et al., 2011 ). Mikroba hidroksilasi aromatik umumnya per-dibentuk oleh
oksigenase dan tyrosinases, dan terjadi pada katabolisme yang senyawa aromatik sebagai sumber
karbon ( Di Gennaro et al., 2011 ). Tirosinase adalah protein tembaga jenis-3 yang ditemukan dalam
jamur, tanaman,dan hewan ( Claus dan Decker 2006 ; Olivares dan Solano, 2009 ; Robb 1984 ;
Solomon et al, 1996. ). Enzim ini mengkatalisis beberapa oksidasi dari L-tyrosine menggunakan
molekul oksigen sebagai oksidan;langkah oksidasi pertama adalah o-hidroksilasi L-tyrosine untuk L-
DOPA dan dikenal menjadi langkah paling lambat, dan oksidasi kedua Langkah adalah produksi orto-
kuinon dari L-DOPA, Yang cepat dan diikuti oleh reaksi non-enzimatik untuk dopachrome, sebuah
berwarna menengah di jalur biosintesis melanin. Sebagai konversi tirosin untuk L-DOPA Lambat,
lebih-oksidasi ortokuinon sulit untuk menghindari ketika mikroba yang diturunkan tirosinase
digunakan ( Haq et al., 2003 ; Land et al., 2003 ). Pada hewan, bagaimanapun, oksidasi L-tyrosine
untuk L-DOPA Adalah dilakukan oleh tirosin hidroksilase (TH) menggunakan tetrahydrobiop-Terin
(BH4) sebagai kofaktor ( Daubner et al, 2011. ; Fitzpatrick 1999 ; Kappock dan Caradonna 1996 ).
Penggunaan kofaktor pterinselama tahap oksidasi adalah fitur unik dari TH dan terkait enzim, seperti
fenilalanin hidroksilase (PAH) dan trypto-Phan hidroksilase (TPH) ( Fitzpatrick 2003 ; . Pribat et al,
2010 ). Persyaratan untuk mengurangi kofaktor ini (BH4) di situs aktif untuk aktivitas enzim
mencegah enzim dari melakukan oksidasi kedua dengan membatasi akses kofaktor segar untuk situs
aktif setelah oksidasi pertama, dan ini meminimalkan over-oksidasi L-tyrosine untuk orto-kuinon (
Maass et al., 2003 ). Namun, penggunaan TH untuk biosintesis mikroba L-DOPA Atau metabolit
terkait belum dilaporkan karena kurangnya koenzim BH4, yang hanya ditemukan pada eukariota (
Torres Pazmino et al., 2010 ).

Di sini, kita direkayasa jalur buatan di Escherichia coli untuk oksidasi L -tyrosine untuk L-DOPA
Menggunakan tirosin tikus hidroksilase ( Iwata et al., 1992 ) Dan kofaktor endogen di E. coli. Kami
juga menggunakan jalur rekayasa ini untuk menghasilkan hidro xytyrosol, anti-oksidan kuat dari
minyak zaitun, di E. coli tidak hanya dari dilengkapi tirosin tetapi juga dari endogenously- diproduksi
tirosin ( Gambar. 1 ).

2. Bahan dan metode

2.1. Strain bakteri dan budaya

Strain yang digunakan dalam penelitian ini diringkas dalam Tabel 1 . E. Coli DH10B (Invitrogen,
Carlsbad, CA) secara rutin digunakan untuk plasmid konstruksi. Untuk mengkonfirmasi
tetramonapterin (MH4) biosintesis, E. coli BW25113 dan yang folM- dan Folx-KO mutan di Koleksi
Keio, JW1598 dan JW2300, yang bekerja ( Baba et al., 2006 ). Adapun produksi hydroxytyrosol, E. coli
JW1380, sebuah feaB- KO mutan yang berasal dari BW25113, dipekerjakan. Ini strain digunakan
setelah menghilangkan kanamisin-resistance gen pada kromosom, seperti yang dijelaskan
sebelumnya ( Datsenko dan Wanner 2000 ). Media yang digunakan adalah media kaldu LB (Lennox,
Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) dan M9 minimal menengah (M9 garam minimal
(Becton, Dickinson dan Perusahaan), 1% (b / v) glukosa, 5 mM MgSO4, 0,1 mM CaCl2) Ditambah
dengan 0,025% (b / v) ekstrak ragi (M9Y media). Jika diperlukan, kanamisin dan karbenisilin
ditambahkan ke media pada 50 mg / Ml dan 100 mg / mL, masing-masing.

2.2. Plasmid konstruksi

Plasmid yang digunakan dalam penelitian ini tercantum dalam Tabel 2 . Untuk memungkinkan
kloning cepat dan perakitan gen, kita mempekerjakan BglBrick strategi kloning menggunakan vektor
BglBrick ( Anderson et al.,2010 ; Lee et al, 2011. ). Gen yang mengkode tirosin hidroksilase (TH) dari
tikus (nomor aksesi NP_033403), pterin-4a- dehidratase carbinolamine (PCD) dari manusia (nomor
aksesi NP_000272), reduktase dihydropteridine (DHPR) dari manusia (Aksesi nomor P09417) dan L-
DOPA Dekarboksilase (DDC) dari babi (nomor aksesi NP_999019), yang dioptimalkan untuk
penggunaan kodon di E. coli dengan menggunakan Gene Designer 2.0 perangkat lunak (DNA2.0 Inc,
Menlo Park, CA), yang dibeli dari GenScript USA Inc (Piscataway, NJ). The tyramine oksidase (TYO)
gen adalah PCR diamplifikasi dari Micrococcus luteus genom (aksesi jumlah AB010716). Gen TH itu
subkloning ke BglBrick kompatibel vektor pBbE1k-RFP (ColE1 asal, promotor trc, Laci, Kanr, Merah
protein fluorescent (RFP) gen) ( Lee et al., 2011 ) untuk membangun pBbE1k-1 seperti yang
dijelaskan dalam Tabel 2 . Dalam rangka untuk membangun operon buatan dari PCD dan DHPR gen
berdasarkan BglBrick strategi, gen ini dimasukkan dalam urutan DHPR-PCD 30 dari promotor trc di
pBbE1k-RFP; konstruk ini ditunjuk pBbE1k-2. Untuk mendapatkan pBbE1k-3, yang mencakup operon
dari Gen TH-DHPR-PCD, gen TH dimasukkan antara promotor dan gen DHPR di pBbE1k-2
menggunakan BglBrick kloning strategi. Gen DDC itu subkloning ke BglBrick kompatibel vektor
pBbE1k-RFP (ColE1 asal, promotor trc, Laci, Kanr, Merah protein fluorescent (RFP) gen) ( Lee et al.,
2011 ) untuk membangun pBbE1k-DDC, seperti yang dijelaskan dalam Tabel 2 . Gen TYO adalah
subkloning ke BglBrick vektor kompatibel pBbS1a-RFP (SC101asal, promotor trc, Laci, Ampr, Merah
gen protein fluorescent) ( Lee et al., 2011 ) Untuk membangun pBbS1a-1, seperti yang ditunjukkan
pada Tabel 2 . Dalam rangka Gambar. 1. Jalur untuk oksidasi tirosin untuk hydroxytyrosol. L oksidasi -
tyrosine dikatalisis oleh tirosin hidroksilase (TH) di hadapan kofaktor pterin. Itu tetrahydrobiopterin
(BH4) sistem kofaktor regenerasi terdiri dari pterin-4 alpha-carbinolamine dehidratase (PCD) dan
reduktase dihydropteridine (DHPR). Tabel 1 Strain bakteri yang digunakan dalam penelitian ini. E.
coli galur Charactristic relevan atau genotipe Sumber atau referensi DH10BF mcrA D(MRR-hsdRMS
mcrBC)

untuk membangun sebuah operon buatan DDC dan TYO berdasarkan Strategi kloning BglBrick, gen
DDC dimasukkan 50 dari TYO gen di pBbS1a-1; konstruk ini ditunjuk pBbS1a-3 ( Tabel 2 ). Untuk
pembangunan plasmid control pBbE1k dan pBbS1a, gen yang mengkode protein fluorescent merah
telah dihapus di pBbE1k-RFP dan vektor pBbS1a-RFP, masing-masing.

2.3. L Produksi DOPA

E. coli menyimpan plasmid pBbE1k diturunkan dikultur di LB media selama 16 jam pada 37 1C.
Aliquot (1 ml atau 0,1 ml) yang diinokulasi ke dalam 250 mL goyang termos yang berisi 50 ml media.
Tersebut dibudidayakan pada 30 1C selama 3 jam dan kemudian isopropil b-D-thiogalactopyranoside
(IPTG) ditambahkan pada konsentrasi 0,5 mM dan sel-sel dikultur untuk penambahan 20 jam pada
30 1C. Supernatan budaya labu goyang dikumpulkan dalam tes tabung untuk mengambil gambar.
2.4. Produksi hydroxytyrosol Goyang percobaan labu dilakukan di 250 mL Erlenmeyer termos berisi
50 ml media M9Y. Aliquot (50 m L) budaya semalam diinokulasi ke dalam 2 mL segar LB menengah
dan berbudaya pada 30 1C selama 4 jam. Kemudian sel-sel yang dipanen dan dicuci sekali dengan
jumlah yang sama M9Y menengah. Semua sel diinokulasi ke dalam 50 mL M9Y menengah. Mereka
dibudidayakan selama 3 jam pada 30 1C dan 160 rpm, dan IPTG ditambahkan pada konsentrasi akhir
0,5 mM. Optical density (OD) pengukuran pada 600 nm juga diambil menggunakan Beckman
spektrofotometer. Sampel (1 mL) dikumpulkan pada titik-titik waktu yang tepat adalah dianalisis
dengan HPLC. Sampel dari supernatan kultur (2 m L) dianalisis menggunakan Agilent Technologies
1200 series HPLC sistem (Agilent Technologies Inc, Santa Clara, CA), dilengkapi dengan kolom
Penemuan HS F5 (15 cm 2,1 mm, 3 mm; Sigma-Aldrich Co LLC, St. Louis, MO). Penyangga A (0,1%
(v / v) larutan asam formiat) dan buffer B (asetonitril dengan 0,1% (v / v) asam format) yang
digunakan sebagai fase gerak, dan senyawa yang dielusi pada 35 1C dan tingkat 0,3 mL min mengalir
A1 , Dengan meningkatnya konsentrasi penyangga B sebagai berikut: 5%, 0-2 menit; 5-30%, 2-22
menit. Dielusi senyawa yang terdeteksi menggunakan spektrofotometer array dioda (Agilent
Technologies) mengukur absorbansi pada 280 nm atau waktu-of-penerbangan spektrometer massa
(Agilent Technologies). Tyro-sinus, L-DOPA, Dopamin, 3,4-dihydroxyphenylacetate (DHPA), dan
hydroxytyrosol (Sigma-Aldrich) digunakan sebagai standar.

2.5. Dalam uji aktivitas in vitro DDC

E. coli BLR (DE3) menyembunyikan pBbE1k atau pBbE1k-DDC yang

dikultur dalam medium LB selama 16 jam pada 37 1C. Aliquot (1 ml)

diinokulasi ke 250 mL goyang termos yang berisi 50 mL LB


menengah. Tersebut dibudidayakan pada 30 1C selama 3 jam dan kemudian IPTG adalah

ditambahkan pada konsentrasi akhir 0,5 mM. Sel-sel yang

berbudaya untuk tambahan 20 jam pada 30 1C. Sel-sel yang dipanen adalah

dicuci dengan 50 mL dingin 20 mM Tris-HCl (pH7.2) dan kemudian

disuspensi kembali dalam 5 mL buffer yang sama. Supernatan setelah

sonikasi dan sentrifugasi pada 20.000 g pada 4 1C selama 30 menit

digunakan untuk in vitro assay enzim.

Campuran reaksi (1 mL) yang terdapat 1 mM dopamin atau

tyramine, 50

M piridoksal-5

-phosphate (PLP), 0,4 mM askorbat,

400

protein g dalam 100 mM Tris HCl (pH 7,2). Reaksi itu

mulai dengan penambahan solusi enzim dan dilakukan pada

suhu kamar. Setelah 1 jam atau titik waktu yang tepat,

campuran reaksi yang ultra-disaring untuk mempersiapkan sampel untuk

Analisis HPLC.

Sampel (2

L) dianalisis menggunakan Agilent-teknologi

gies 1200 sistem seri HPLC (Agilent Technologies Inc),

dilengkapi dengan kolom penemuan HS F5 (15 cm 2,1 mm,

m
m; Sigma-Aldrich Co LLC). Adapun analisis in vitro DDC

aktivitas, penyangga C (50 mM NH

COOH, PH3) digunakan sebagai mobile

fase, dan senyawa yang dielusi pada 35 1C dan laju alir

0,2 mL min

A1

. Senyawa dielusi terdeteksi oleh array dioda

spektrofotometer (Agilent Technologies Inc) mengukur absor-

Bance di 280 nm.

3. Hasil dan diskusi

3.1. Tirosin hidroksilasi

3.1.1. Ekspresi tirosin hidroksilase dan kofaktor

sintesis / regenerasi

Salah satu isu untuk aplikasi tirosin hidroksilase (TH)

bakteri akan ketersediaan koenzim BH4, unik

kofaktor untuk hewan. Untuk menyusun kembali

hidroksilasi -tyrosine di

E. coli menggunakan TH, kami membutuhkan tiga komponen: enzim aktif

(TH), kofaktor (BH4) jalur biosintesis, dan kofaktor (BH4)

sistem regenerasi. Pertama, mouse TH itu kodon dioptimalkan untuk

E. coli, disintesis, dan dikloning ke pBbE1k menggunakan standar BglBrick

kloning untuk mendapatkan pBbE1k-1. Ekspresi TH dikonfirmasi oleh SDS-

HALAMAN (Tambahan Gambar. S1A ), dan aktivitas TH dihukum

dengan perubahan warna dari budaya karena telah melaporkan bahwa

L
-DOPA Mudah teroksidasi dalam budaya aerobik untuk melanin, yang hitam

dalam warna ( Lee dan Xun, 1998 ). Namun, budaya E. coli menyimpan

pBbE1k-1 tidak menunjukkan perubahan warna yang jelas (Tambahan

Gambar. S1B ), meskipun TH dinyatakan dalam bentuk larut

(Tambahan Gambar. S1A ). Hal ini diperkirakan karena enzim

membutuhkan kofaktor BH4 aktif untuk mengoksidasi L-tirosin, tetapi baik

kofaktor atau regenerasi jalur yang hadir dalam E. coli. Kami kemudian

berusaha untuk membangun BH4 biosintesis dan regenerasi path-

cara E. coli ( Gambar. 1 dan 2 A). BH4 biosintesis membutuhkan dua

enzim heterolog selain GTP cyclohy- endogen

drolase (FolE), yang menghasilkan trifosfat 7,8-dihydroneopterin

(H2-NPt-P3) dari GTP: sintase 6-pyruvoyl-tetrahydropterin

(PTSP) mengkatalisis konversi H2-NPt-P3 untuk 6-pyruvoyl-

tetrahydropterin (P-H4-Pt), dan reduktase sepiapterin (SR) melakukan

pengurangan dua langkah dari diketo menengah P-H4-Pt untuk BH4

( Gbr. 2 A) ( Smith 1987 ; Takikawa et al, 1986. ; Thony et al, 2000. ;

Yamamoto et al., 2003 ). Meskipun biosintesis BH4 di E.

coli telah dilaporkan sebelumnya menggunakan jalur heterolog

( Yamamoto et al., 2003 ), Kami tidak bisa mengkloning dan mengekspresikan

Gen SR di E. coli meskipun banyak upaya. Kegagalan ini memotivasi kami untuk

Tabel 2

Plasmid yang digunakan dalam penelitian ini.

Plasmid

nama

Deskripsi

Referensi

pBbE1k
BglBrick vektor kompatibel; ColE1ori, trc

promotor, Km

Lee et al.

(2011)

pBbE1k-1

pBbE1k derivatif dengan gen TH

Penelitian ini

pBbE1k-2

pBbE1k derivatif dengan DHPR dan PCD gen

Penelitian ini

pBbE1k-3

pBbE1k derivatif dengan TH, DHPR, dan PCD

gen

Penelitian ini

pBbE1k-

DDC

pBbE1k derivatif dengan gen DDC

Penelitian ini

pBbS1a

BglBrick vektor kompatibel; pSC101 ori, trc

promotor, Amp

Lee et al.

(2011)

pBbS1a-1

pBbS1a derivatif dengan gen TYO


Satoh et al.

(2012)

pBbS1a-3

pBbS1a derivatif dengan DDC dan TYO gen

Penelitian ini

Y. Satoh et al. / Metabolik Rekayasa 14 (2012) 603-610

605

Halaman 4

pencarian untuk kofaktor alternatif yang dapat digunakan untuk TH menyatakan

heterologously di E. coli.

3.1.2. Verifikasi kofaktor alternatif

E. coli dan bakteri lainnya secara alami menghasilkan tetrahydromonap-

Terin (MH4 atau H4-MPT); misalnya, telah melaporkan bahwa

MH4 adalah kofaktor untuk Pseudomonas hidroksilase fenilalanin

(PAH) ( Ikemoto et al., 2002 ; . Pribat et al, 2010 ). Hal ini juga dilaporkan

yang 6-metil-5, 6, 7, 8-tetrahydropterin (6-MPH4, Gambar. 2 (A)), sebuah

analog sintetik dari spesies tetrahydropterin, mampu digunakan

sebagai kofaktor untuk kegiatan mouse tyrosine hydroxylase

in vitro ( Ichikawa et al., 1991 ). Berdasarkan fungsional dan

kesamaan struktural PAH dan TH ( Maass et al., 2003 ) Dan

potensi spesifisitas kofaktor luas TH, kita hipotesis bahwa

tikus TH mungkin bisa menggunakan MH4 sebagai kofaktor alternatif

BH4 in vivo. Sebagai kofaktor umumnya regenerasi, kami menyiapkan

terkenal BH4 regenerasi jalur hewan dan ditambahkan

ke dalam E. coli galur untuk regenerasi baik MH4 atau lainnya

kofaktor diduga diperlukan untuk kegiatan TH. Kami disintesis gen

encoding pterin-4 alpha-carbinolamine dehidratase (PCD) dan


reduktase dihydropteridine (DHPR) dari manusia ( Thony et al.,

2000 ), dan kemudian dimasukkan ke dalam pBbE1k menggunakan BglBrick

standar kloning untuk membangun pBbE1k-2. Untuk

-DOPA Biosintesis,

gen TH itu subkloning ke operon pengkodean kofaktor yang

regenerasi jalur membentuk pBbE1k-3 (TH, DHPR, dan PCD

dalam urutan ini), dan plasmid ini berubah menjadi E. coli

BLR (DE3). Produksi protein dikonfirmasi dengan analisis SDS-PAGE

(Tambahan Gambar. S1A ).

Untuk menguji hipotesis bahwa MH4 bisa menggantikan BH4 di tirosin

hidroksilasi oleh TH,

Produksi -DOPA oleh E. coli penampungan

pBbE1k, pBbE1k-1, atau pBbE1k-3 ( Tabel 2 ) dianalisis secara in vivo.

Kami menilai

Produksi -DOPA oleh warna medium

seperti yang dijelaskan sebelumnya ( Lee dan Xun 1998 ; Santos dan

Stephanopoulos 2008 ). Ketika E. coli BLR (DE3) menyembunyikan satu

plasmid pBbE1k diturunkan (pBbE1k, pBbE1k-1 atau pBbE1k-3) yang

berbudaya tanpa penambahan BH4 sebagai kofaktor, warna

Perubahan diamati hanya dalam budaya dari strain yang diungkapkan

baik TH dan regenerasi jalur BH4 (Tambahan Gambar.

S1B ). Sebaliknya, budaya strain kontrol, yang tidak

mengekspresikan baik TH atau BH4 regenerasi jalur tidak

perubahan warna (Tambahan S1B Gambar. ). Hasil ini menunjukkan bahwa


rekayasa ketegangan mengekspresikan TH dan regenerasi BH4

gen jalur berhasil diproduksi

-DOPA Tanpa bio yang

sintesis dari kofaktor asli BH4, dan mendukung

hipotesis bahwa ada kofaktor endogen dalam E. coli yang

dapat menggantikan BH4 di tirosin hidroksilasi oleh TH. Namun,

masih tidak yakin bahwa MH4 adalah kofaktor bertanggung jawab TH

Kegiatan di E. coli.

Untuk mengkonfirmasi apakah itu MH4 yang menggantikan BH4 di tirosin

hidroksilasi, kita berubah pBbE1k-3 ke folM (encoding

dihidrofolat reduktase) atau Folx (encoding dihydroneopterin tri

fosfat 2

-epimerase) mutan penghapusan E. coli BW25113,

yang tidak mampu memproduksi MH4 ( Gambar. 2 A) ( Baba et al., 2006 ;

Pribat et al., 2010 ). Budaya mutan menyimpan pBbE1k-3

tidak berubah menjadi hitam di bawah kondisi yang sama yang teroksidasi

-tyrosine untuk

-DOPA ( Gambar. 2 B). Sebaliknya, budaya dari Wild-

Jenis regangan berubah warna di bawah kondisi budidaya yang sama,

menunjukkan bahwa MH4 biosintesis penting untuk kegiatan TH.

Oleh karena itu kita bisa menyimpulkan bahwa MH4 adalah sebuah alternatif untuk BH4

di tirosin hidroksilasi oleh TH di E. coli. Selanjutnya dalam studi vitro

menggunakan MH4 sebagai kofaktor aktivitas TH akan diperkuat


dan menegaskan hipotesis ini. Namun, kofaktor MH4 adalah

tidak tersedia dari sumber komersial, dan kami tidak bisa

melakukan verifikasi lebih lanjut dalam vitro hipotesis kami.

Meskipun kami menunjukkan jalur baru untuk mengoksidasi

-tyrosine untuk

-DOPA Oleh TH di E. coli, kami tidak mengukur aktual

titer

-DOPA Sejak

-DOPA Mudah teroksidasi untuk o-kuinon dan

lebih lanjut untuk melanin. Meskipun reduktor seperti askorbat

asam dikenal untuk mengurangi oksidasi

-DOPA ( Ali et al., 2007 ), mereka

biasanya membuat pemurnian produk fermentasi

kaldu lebih sulit dan membuat proses kurang menarik untuk

aplikasi industri. Sebaliknya, kami memutuskan untuk membuat proses ini

lebih menarik industri dengan memperkenalkan enzim hilir

yang dapat mengubah stabil

-DOPA Untuk produk akhir yang lebih stabil

seperti (etanol 3,4-dihydroxyphenyl) hydroxytyrosol ( Gbr. 1 ).

3.2. Hydroxytyrosol biosintesis

Hydroxytyrosol adalah salah satu antioksidan yang paling kuat, memiliki


kapasitas oksigen absorbansi radikal (ORAC) dari 28.000

mol TE / g,

yaitu sekitar 50% lebih besar dari resveratrol, populer dan

Gambar. 2. pterin kofaktor biosintesis dan oksidasi tirosin di MH4 kekurangan

mutan. (A) Biosintesis pterin kofaktor dari GTP. FolE adalah cyclohy- GTP

drolase. PTSP (pyruvoyl tetraydropterin synthase) dan SR (reduktase sepiapterin)

penting untuk tetrahydrobiopterin (BH4 atau H4-BPT) biosintesis. Folx (dihy-

droneopterin trifosfat 2

-epimerase) dan FolM (dihidrofolat reduktase) yang

penting untuk tetrahydromonapterin (MH4 atau H4-MPT) biosintesis. (B) Tyrosine

oksidasi di wild type E. coli BW25113 (WT) dan mutan di MH4 biosintesis

Folx, JW2300 dan

folM, JW1598). Strain berubah dengan plasmid

menyimpan gen yang mengkode baik TH (tirosin hidroksilase) atau TH dan BH4

sistem regenerasi dan diuji untuk

Produksi -DOPA. Perubahan warna hitam

menunjukkan oksidasi

-tyrosine untuk

-DOPA Dan lebih lanjut untuk melanin. WT bisa


menghasilkan

-DOPA Ketika kedua TH dan sistem regenerasi BH4 diungkapkan,

tapi Folx dan folM mutan tidak mampu menghasilkan

-DOPA Bawah yang sama

Kondisi.

Y. Satoh et al. / Metabolik Rekayasa 14 (2012) 603-610

606

Halaman 5

dikomersialisasikan antioksidan yang ditemukan dalam anggur merah ( Angelino et al.,

2011 ). Selain itu, hydroxytyrosol memiliki potensi sebagai anti-tumor,

anti-aterogenik, anti-inflamasi dan anti-agregasi platelet

agen ( Granados-Principal et al., 2010 ). Saat ini, hydroxytyrosol adalah

sebagian besar diperoleh dari ekstrak zaitun diperkaya setelah bahan kimia atau

hidrolisis enzimatik bentuk ester asam elenolic dari hydroxytyr-

OSOL (oleuropein). Konversi baru-baru mikroba dari tyrosol untuk

hydroxytyrosol telah dilaporkan ( Liebgott et al., 2009 ). Itu

jalur biosintesis dari hydroxytyrosol dari tirosin ditampilkan

di Gambar. 1 .

3.2.1. Konversi bertahap dari

-DOPA Ke hydroxytyrosol

Langkah pertama dalam biosintesis hydroxytyrosol setelah tirosin

oksidasi adalah dekarboksilasi dari

-DOPA Untuk dopamin. Untuk ini


konversi, kami membutuhkan

--DOPA Spesifik dekarboksilase yang

tidak mengkatalisis dekarboksilasi tirosin, karena

produksi tyramine dari tirosin pada akhirnya akan mengarah pada

produksi tyrosol, produk samping dengan jauh lebih lemah antiox-

Potensi idant ( Angelino et al., 2011 ). Setelah penyaringan beberapa

Asam amino aromatik decarboxylases termasuk tirosin decarbox-

ylases (TDC) dan

Decarboxylases -DOPA (DDC), kami bekerja

DDC dari babi (Sus scrofa) ( Blechingberg et al., 2010 ), yang

bertobat

-DOPA Untuk dopamin dengan spesifisitas tinggi sementara tidak

decarboxylating tirosin untuk tyramine in vitro (Tambahan

Gambar. S2 ). Menariknya, ketika menyatakan dari plasmid tinggi copy

di bawah kendali promotor yang kuat, aktivitas DDC rendah

ketika diinduksi dengan IPTG tapi lebih tinggi dengan tidak adanya IPTG

(Tambahan Gambar. S3A ). PAGE SDS menunjukkan bahwa

DDC sebagian besar tidak larut dalam sel yang diinduksi tapi larut dalam

sel uninduced (Tambahan Gambar. S3B ), menunjukkan bahwa

ekspresi dari rendah-copy plasmid akan meningkatkan produksi

DDC aktif.

Untuk mencapai konversi hilir dopamin untuk hidro

xytyrosol, kami membutuhkan oksidase monoamine (MAO) untuk mengkonversi

dopamin untuk 3,4-dihydroxyphenyl asetaldehida (3,4-DHPAA) dan


sebuah dehidrogenase alkohol (ADH) untuk mengubah aldehida untuk

hydroxytyrosol ( Gambar. 1 ). E. coli memiliki endogen MAO dan beberapa

ADHs ( Blattner et al., 1997 ; . Roh et al, 1994 ). Sayangnya, MAO

menunjukkan aktivitas rendah dan hanya menghasilkan sejumlah kecil

hydroxytyrosol bahkan ketika gen pengkodean endogen yang

MAO telah diekspresikan (data tidak ditampilkan). Sebaliknya, kami memilih

tyramine oxidase (TYO) dari Micrococcus luteus, yang telah

digunakan sebelumnya untuk konversi ini ( Roh et al., 2000 ). E. coli

BW25113 berubah dengan pBbS1a-1, yang meliputi TYO dari

M. luteus ( Tabel 1 ) ( Satoh et al., 2012 ), Diproduksi hydroxytyrosol

dari dopamin, yang menegaskan kegiatan TYO dan endo

ADHs genous ( Gambar. 3 A).

Selain memproduksi hydroxytyrosol, bagaimanapun, budaya

juga menghasilkan 3,4-dihydroxyphenyl asam asetat (3,4-DHPA)

( Gambar. 3 A, Tabel 3 ), Menunjukkan bahwa ada endogen lain

enzim dalam E. coli yang mengoksidasi aldehida (3,4-DHPAA) ke

Asam (3,4-DHPA) dan bersaing dengan ADHs untuk substrat yang sama.

Kami mengamati kegiatan serupa di mikroba produksi

tyrosol; phenylacetaldehyde dehidrogenase (FeaB) telah

terlibat dalam E. coli ( Satoh et al., 2012 ). Untuk meningkatkan hasil yang

dan kemurnian hydroxytyrosol, kami menggunakan sistem gugur feaB regangan

E. coli JW1380 ( Baba et al., 2006 ) untuk produksi. E. coli JW1380

diubah dengan pBbS1a-1, sebuah TYO mengekspresikan plasmid ( Tabel 2 ),

berhasil diproduksi hydroxytyrosol sebagai utama dan hampir

produk eksklusif dengan sekitar 70% hasil ketika dibudidayakan di M9Y

menengah dilengkapi dengan dopamin ( Gambar. 3 A, Tabel 3 ). Dengan demikian,

merobohkan feaB tampaknya penting untuk mencapai hasil yang tinggi


dan kemurnian tinggi hydroxytyrosol.

Berikutnya, kami mencoba untuk membangun jalur untuk mengkonversi

-DOPA Untuk

hydroxytyrosol. Untuk konversi ini, kami menambahkan

--DOPA Spesifik

dekarboksilase (DDC) ke strain yang mengkonversi dopamin ke

hydroxytyrosol. Seperti kita mengamati bahwa ekspresi tingkat tinggi dari

encoding gen DDC adalah merugikan aktivitasnya, kami menggunakan rendah

Gambar. 3. produksi Hidroksitirosol dari berbagai substrat. HPLC dengan array dioda

detektor (pada 280 nm) digunakan untuk analisis dan identitas puncak adalah

dikonfirmasi dengan standar produksi (A) Hidroksitirosol dari dopamin. Top:

E. coli JW1380 (

feaB) dengan TYO berlebih. Tengah: E. coli BW25113 (liar

ketik) dengan TYO berlebih. Bawah: E. coli BW25113 tanpa TYO berlebihan

ekspresi. Produksi (B) Hidroksitirosol dari

-DOPA Di E. coli JW1380. Top:

E. coli JW1380 dengan DDC dan TYO berlebih. Bawah: E. coli JW1380 tanpa

DDC dan TYO. Produksi (C) Hidroksitirosol dari glukosa. E. coli JW1380 dengan

TH, sistem regenerasi BH4, DDC dan TYO berlebih. Terbuka lingkaran

mewakili OD

600

, Dan lingkaran tertutup merupakan titer hydroxytyrosol dari budaya

di mana tidak ada tirosin eksogen telah ditambahkan.


Y. Satoh et al. / Metabolik Rekayasa 14 (2012) 603-610

607

Halaman 6

menyalin nomor vektor ke pelabuhan gen ini dan dibangun plasmid

co-mengekspresikan gen yang mengkode DDC dan TYO (pBbS1a-3). Kapan

E. coli JW1380 menyimpan pBbS1a-3 ditumbuhkan dalam medium M9Y

dilengkapi dengan

-DOPA, 0.74 mM hydroxytyrosol yang

terdeteksi ( Gambar. 3 B, Tabel 3 ).

Di bawah kondisi eksperimental,

-DOPA Dikonsumsi dan

baik dopamin dan hydroxytyrosol yang dikumpulkan oleh HPLC

analisis ( Gambar. 3 B). Hasil ini menunjukkan bahwa ekspresi rendah

DDC memiliki aktivitas yang cukup untuk konversi

-DOPA Untuk

dopamin, dan amina oksidasi oleh TYO mungkin tingkat-satu

membatasi langkah. Dalam kasus tyrosol biosintesis seperti yang dilaporkan

sebelumnya ( Satoh et al., 2012 ), Akumulasi tyramine tidak

diamati di bawah kondisi percobaan. Substrat spe

cificity dari TYO, yang lebih suka tyramine untuk dopamin sebagai substrat

( Roh et al., 2000 ), Dapat menjelaskan pengamatan ini dan karena itu

menunjukkan bahwa ekspresi dan / atau kegiatan TYO harus dioptimalkan

untuk produksi hydroxytyrosol efektif.

Selain itu, meskipun fakta bahwa proses ini dari


L

-DOPA Untuk

hydroxytyrosolrequires 3 langkah (dekarboksilasi dari

-DOPA, DEA

mination dopamin, dan pengurangan 3,4-DHPAA), konvergen yang

sion (0,74 mM) sedikit lebih tinggi dari itu (0,69 mM) dari

dopamin oleh E. coli JW1380 mengungkapkan TYO, yang membutuhkan dua

langkah ( Tabel 2 ). Ini dapat dijelaskan oleh efisiensi

serapan substrat; karena struktur kimia

-DOPA Cukup

mirip dengan

-tyrosine, itu bisa diangkut ke E. coli lebih

efisien daripada dopamin.

3.2.2. Produksi hydroxytyrosol dari

-tyrosine dan glukosa menggunakan

E. coli rekayasa

Akhirnya, kami menilai apakah feaB-KO galur mutan

menyembunyikan kedua pBbE1k-3 (TH, PCD, dan DHPR) dan pBbS1a-3

(DDC dan TYO), semua enzim yang diperlukan untuk mengkonversi tirosin

untuk hydroxytyrosol ( Tabel 2 ), bisa menghasilkan hydroxytyrosol. Kapan

dikultur dalam medium M9Y dilengkapi dengan

-tyrosine (1 mM),
budaya E. coli JW1380 menyimpan pBbE1k-3 dan pBbS1a-3

tidak berubah menjadi hitam, sedangkan budaya strain control

penyembunyian pBbE1k-3 dan pBbS1a menjadi berwarna gelap. Ini

menunjukkan bahwa TH dan BH4 regenerasi jalur (pBbE1k-3)

bekerja dengan baik di mutan feaB sistem gugur dan diproduksi

-DOPA,

yang berturut-turut dikonversi ke hydroxytyrosol oleh DDC,

TYO (pBbS1a-3), dan endogen ADHs sebelum oksidasi yang tidak diinginkan

tion untuk melanin terjadi. Dari 1 mM

-tyrosine dilengkapi,

budaya strain rekayasa diproduksi 0,19 mM

hydroxytyrosol tanpa kontaminasi oleh 3,4-DHPA atau tyrosol

( Tabel 3 ). Namun, sejumlah kecil dopamin (0,03 mM)

terdeteksi di bawah kondisi percobaan (Supplemental

Tabel S1 ). Hasil ini juga menunjukkan bahwa aktivitas TYO tidak cepat

cukup dalam rekayasa hydroxytyrosol sel biosintesis sebagai

dijelaskan di atas.

Glukosa dapat dikonversi menjadi

-tyrosine melalui endogen

biosintesis jalur di E. coli ( Gibson dan Pittard 1968 ; Ikeda,

2006 ). Ada juga upaya rekayasa untuk meningkatkan

produksi tirosin dalam E. coli ( Juminaga et al, 2012. ; Lutke-

Eversloh dan Stephanopoulos 2007 ; Patnaik et al, 2008. ). Sejak

E. coli dapat menghasilkan sejumlah kecil tirosin bahkan tanpa


rekayasa lebih lanjut dari tirosin jalur biosintesis, kita diuji

kami hydroxytyrosol memproduksi regangan untuk melihat apakah ia dapat pro-

Duce hydroxytyrosol dari glukosa tanpa tirosin supplemen-

tasi. Seperti ditunjukkan dalam Gambar. 3 C, strain menyimpan baik pBbE1k-3

dan pBbS1a-3 berhasil memproduksi 0,08 mM hydroxytyrosol

lebih dari 3 hari tanpa dilengkapi tirosin. Pada E. coli, tirosin yang

Tingkat dikontrol oleh umpan balik yang kompleks mesin regulasi

( Ikeda 2006 ), Dan sulit untuk memperkirakan tingkat tirosin yang sebenarnya di

kehadiran jalur yang mengkonsumsi tirosin sebagai

substrat. Akibatnya, hal ini juga tidak mudah untuk memperkirakan konversi

efisiensi tirosin untuk Hidroksitirosol dalam ketegangan ini. Lebih lanjut

upaya rekayasa metabolik menggunakan tirosin overproducing E. coli

strain rekayasa untuk produksi hydroxytyrosol dapat meningkatkan

titer hydroxytyrosol dari glukosa ke tingkat yang memungkinkan ini

Platform mikroba alternatif yang baik untuk hidro berbasis zaitun

industri xytyrosol.

4. Penutup

Kami berhasil memperkenalkan jalur buatan untuk

L-tirosin oksidasi dalam E. coli menggunakan tirosin mamalia

hidroksilase (TH) dan endogen E. coli kofaktor. Lebih jauh

lebih, dalam rangka untuk menjelaskan ketersediaan TH di E. coli untuk

biosintesis turunan tirosin hydroxylated, kita memiliki com-

dikombinasi jalur ini dengan biosintesis jalur aril alkohol

dan berhasil memproduksi hydroxytyrosol, sebuah anti kuat

oksidan. Rekayasa E. coli ini mampu menghasilkan hidro

xytyrosol tidak hanya dari suplemen tirosin tetapi juga dari

endogen diproduksi tirosin.


Oksidasi asam amino aromatik seperti L-tirosin adalah

Reaksi penting untuk biosintesis biokimia penting dalam

Tabel 3

Strain untuk produksi hydroxytyrosol.

E. coli galur tuan

sebuah

Gen ditambahkan dalam plasmid (s)

Substrat ditambahkan (1 mM)

Produk (mM) (hydroxytyrosol)

Produk sampingan (mM) (3,4-DHPA)

BW25113

TYO

Dopamin

0.4770.014

0.3170.0059

BW25113

Tak satupun

Dopamin

0.1270.0033

JW1380

TYO

Dopamin

0.6970.0064
0

JW1380

Tak satupun

Dopamin

0.0970.013

JW1380

DDC

, TYO

-DOPA

0.7470.088

JW1380

Tak satupun

-DOPA

JW1380

DDC, TYO

Tirosin

JW1380

DDC, TYO
Tak satupun

JW1380

TH

, Regen

, DDC, TYO

Tirosin

0.1970.0056

JW1380

TH, Regen, DDC, TYO

Tak satupun

0.0870.00060

sebuah

E. coli memiliki endogen MAO (monoamine oxidase) dan ADH (alkohol dehidrogenase).

BW25113 adalah coli galur E. dengan genotipe dari rrnB

lacZ4787 hsdR514

(AraBAD) 567

(RhaBAD) 568 rph-1.


c

JW1380 adalah feaB KO mutan dari BW25113, dari Keio koleksi KO gen tunggal.

Tyramine oksidase dari M. luteus.

Dopa dekarboksilase dari Sus scrofa.

Tirosin hidroksilase dari tikus.

BH4 gen regenerasi jalur terdiri dari pterin-4

sebuah

dehidratase -carbinolamine (PCD) dan reduktase dihydropteridine (DHPR).

Y. Satoh et al. / Metabolik Rekayasa 14 (2012) 603-610

608

Halaman 7

banyak spesies, tetapi tirosin hidroksilase (TH) tidak dapat digunakan untuk

reaksi ini di sejumlah bakteri karena kurangnya BH4, yang

dianggap penting untuk aktivitas enzim ini. Meskipun

telah diketahui bahwa E. coli tidak memproduksi BH4, kami menemukan

bahwa TH fungsional dan dapat mengoksidasi tirosin dalam E. coli menggunakan

kofaktor endogen MH4 dan sistem regenerasi BH4 dari

hewan. Seperti disebutkan sebelumnya, alkaloid benzil isoquinoline,

seperti senyawa analgesik morfin dan kodein, dan

alkaloid indol, seperti serotonin dan melatonin, yang penting

produk alami yang jalur biosintesis termasuk hidroksi

lation asam amino aromatik ( Nakagawa et al., 2011 ; . Taman et al,

2011 ). Amino aromatik Platform oksidasi asam kami melaporkan


di sini akan memungkinkan E. coli, salah satu yang paling banyak digunakan workhorses untuk

produksi biokimia, yang akan digunakan untuk memproduksi senyawa ini

tanpa menguntungkan over-oksidasi masalah. Selain itu, ketika com-

dikombinasi dalam asam amino overproducing ketegangan aromatik, sederhana

gula atau bahkan biomassa dapat digunakan sebagai sumber karbon untuk

produksi, dan ini akan membuat sistem mikroba lebih

ekonomis menarik.

Penulis kontribusi

YS, KT, MM, JDK dan TSL dirancang percobaan. YS

dan TSL melakukan percobaan. YS, JDK, dan TSL menulis

naskah.

Ucapan Terima Kasih

Kami berterima kasih kepada Darmawi Juminaga, Edward Baidoo dan Peter Benke

dari Joint Institute bioenergi untuk diskusi berharga mereka

dan dukungan teknis. Karya ini didukung oleh sintetis yang

Biologi Teknik Research Center (SynBERC) melalui National

Science Foundation hibah BES-0439124 dan oleh Joint bioenergi

Institute melalui kontrak DE-AC02-05CH11231 antara Lawrence

Berkeley National Laboratory dan Departemen Energi AS. YS

didukung oleh COE Program global (Project No. B01:

Katalisis sebagai Dasar untuk Inovasi dalam ilmu material) dari

Kementerian Pendidikan, Kebudayaan, Olahraga, Sains, dan Teknologi

di Jepang.

Lampiran A. Informasi Pendukung

Tambahan data yang terkait dengan artikel ini dapat ditemukan di

versi online di http://dx.doi.org/10.1016/j.ymben.2012.08.002 .

Referensi
Ali, S., Shultz, JL, Ikram, Ul, H., transformasi 2007. Kinerja tinggi mikrobiologi

mation dari

-tyrosine untuk

-DOPA Oleh Yarrowia lipolytica NRRL-143. BMC

Biotechnol. 7, 50.

Anderson, JC, Dueber, JE, Leguia, M., Wu, GC, Goler, JA, Arkin, AP, Keasling, JD,

2010. BglBricks: standar yang fleksibel untuk bagian perakitan biologis. J. Biol. Eng. 4, 1.

Angelino, D., Gennari, L., Blasa, M., Selvaggini, R., Urbani, S., Exposto, S., Servili, M.,

Ninfali, P., 2011. Kimia dan aktivitas antioksidan seluler phytochemical

dimurnikan dari perairan limbah pabrik zaitun. J. Agric. Chem makanan. 59, 2011-2018.

Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko, KA,

Tomita, M., Wanner, BL, Mori, H., 2006. Pembangunan Escherichia coli K-12

di-frame, mutan KO gen tunggal: koleksi Keio. Mol. Syst. Biol. 2,

2006-2008.

Blattner, FR, Plunkett 3, G., Bloch, CA, Perna, NT, Burland, V., Riley, M.,

Collado-Vides, J., Glasner, JD, Rode, CK, Mayhew, GF, Gregor, J., Davis, NW,

Kirkpatrick, HA, Goeden, MA, Rose, DJ, Mau, B., Shao, Y., 1997. lengkap

urutan genom Escherichia coli K-12. Ilmu 277, 1453-1462.

Blechingberg, J., Holm, IE, Johansen, MG, Borglum, AD, Nielsen, AL, 2010.

Aromatik

-amino asam profiling ekspresi dekarboksilase dan isoform deteksi

tion di otak babi berkembang. Otak Res. 1308, 1-13.

Claus, H., Decker, H., 2006. tyrosinases bakteri. Syst. Appl. Microbiol. 29, 3-14.

Datsenko, KA, Wanner, BL, 2000. Satu-langkah inaktivasi gen kromosom pada
Escherichia coli K-12 menggunakan produk PCR. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 97,

6640-6645.

Daubner, SC, Le, T., Wang, S., 2011. Tyrosine hidroksilase dan regulasi

sintesis dopamin. Arch. Biochem. Biophys. 508, 1-12.

Di Gennaro, P., Bargna, A., Sello, G., 2011. Mikroba enzim untuk aromatik

hidroksilasi senyawa. Appl. Microbiol. Biotechnol. 90, 1817-1827.

Fitzpatrick, PF, 1999. hydroxylases asam amino Tetrahydropterin tergantung.

Annu. Rev. Biochem. 68, 355-381.

Fitzpatrick, PF, 2003. Mekanisme aromatik hidroksilasi asam amino.

Biokimia 42, 14.083-14.091.

Gibson, F., Pittard, J., 1968. Persiapan biosintesis dari asam amino aromatik dan

vitamin dan kontrol mereka dalam mikroorganisme. Bacteriol. Wahyu 32, 465-492.

Granados-Principal, S., Quiles, JL, Ramirez-Tortosa, CL, Sanchez-Rovira, P.,

Ramirez-Tortosa, MC, 2010. Hidroksitirosol: dari pemeriksaan laboratorium

untuk uji klinis di masa depan. Nutr. Wahyu 68, 191-206.

Haq, I., Ali, S., Qadeer, MA, Iqbal, J., 2003. Efek Inducive dari cresoquinone di

transformasi mikrobiologi

-tyrosine ke 3,4 fenil dihidroksi

-alanine

oleh Aspergillus oryzae NG-11 (P1). Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 696-699.

Hollmann, F., Arends, IWCE, Buehler, K., Schallmey, A., Buhler, B., 2011. enzyme

oksidasi dimediasi untuk apotek. Hijau Chem. 13, 226-265.

Ichikawa, S., Nasrin, S., Nagatsu, T., 1991. Ekspresi mouse tirosin hidro

xylase di Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 664-671.

Ikeda, M. 2006. Menuju strain bakteri overproducing


L

-tryptophan dan lainnya

aromatik oleh rekayasa metabolik. Appl. Microbiol. Biotechnol. 69, 615-626.

Ikemoto, K., Sugimoto, T., Murata, S., Tazawa, M., Nomura, T., Ichinose, H., Nagatsu,

T., 2002. (6R) -5,6,7,8-tetrahydro-

-monapterin dari Escherichia coli, novel

tetrahydropterin tak terkonjugasi alami. Biol. Chem. 383, 325-330.

Iwata, N., Kobayashi, K., Sasaoka, T., Hidaka, H., Nagatsu, T., 1992. Struktur

tyrosine hydroxylase tikus gen. Biochem. Biophys. Res. Commun. 182,

348-354.

Juminaga, D., Baidoo, EE, Redding-Johanson, AM, Batth, TS, Burd, H., Mukho-

padhyay, A., Petzold, CJ, Keasling, JD 2012. rekayasa Modular dari

produksi -tyrosine di Escherichia coli. Appl. Lingkungan. Microbiol ..

Kappock, TJ, Caradonna, JP, 1996. hydroxylases asam amino pterin tergantung.

Chem. Wahyu 96, 2659-2756.

Tanah, EJ, Ramsden, CA, Riley, PA, 2003. tirosinase autoactivation dan

kimia amina orto-kuinon. Acc. Chem. Res. 36, 300-308.

Lee, JY, Xun, L., 1998. proses biologis Novel untuk

-DOPA Produksi dari

-tyrosine oleh P-hydroxyphenylacetate 3-hidroksilase. Biotech. Lett. 20,

479-482.

Lee, TS, Krupa, RA, Zhang, F., Hajimorad, M., Holtz, WJ, Prasad, N., Lee, SK,

Keasling, JD 2011. vektor BglBrick dan lembar data: biologi sintetik


platform untuk ekspresi gen. J. Biol. Eng. 5, 12.

Liebgot, PP, Amouric, A., Comte, A., Tholozan, JL, Lorquin, J., 2009. Hidroksitirosol

dari tyrosol menggunakan budaya asam-diinduksi hydroxyphenylacetic bakteri dan

bukti peran 4-HPA 3-hidroksilase. Res. Microbiol. 160, 757-766.

Lutke-Eversloh, T., Stephanopoulos, G. 2007.

produksi -tyrosine oleh deregulasi

strain Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 103-110.

Maass, A., Scholz, J., Moser, A., 2003. model kompleks ligan-protein menjelaskan

asal substrat kekhususan dan memberikan wawasan katalitik mechan-

isme fenilalanin hidroksilase dan tirosin hidroksilase. Euro. J. Biochem.

270, 1065-1075.

Maskos, Z., Rush, JD, Koppenol, WH, 1992. hidroksilasi fenilalanin

dan tirosin: perbandingan dengan salisilat dan triptofan. Arch. Biochem.

Biophys. 296, 521-529.

Nakagawa, A., Minami, H., Kim, JS, Koyanagi, T., Katayama, T., Sato, F., Kumagai,

H., 2011. Sebuah platform bakteri untuk produksi fermentasi alkaloid tanaman.

Nat. Commun. 2, 326.

Olivares, C., Solano, F. 2009. wawasan baru ke dalam struktur situs aktif dan

mekanisme katalitik tirosinase dan protein terkait. Pigm. Sel Mela-

noma Res. 22, 750-760.

Park, S., Kang, K., Lee, SW, Ahn, MJ, Bae, JM, Kembali, K., 2011. Produksi

serotonin oleh ekspresi ganda dekarboksilase triptofan dan tryptamine

5-hidroksilase di Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 89, 1387-1394.

Patnaik, R., Zolandz, RR, Hijau, DA, Kraynie, DF 2008.

produksi -tyrosine oleh


rekombinan Escherichia coli: optimasi fermentasi dan pemulihan.

Biotechnol. Bioeng. 99, 741-752.

Pribat, A., Blaby, IK, Lara-Nunez, A., Gregory 3, JF, de Crecy-Lagard, V., Hanson,

AD 2010. Folx dan FolM penting untuk sintesis tetrahydromonapterin di

Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 192, 475-482.

Robb, DA, 1984. tirosinase. CRC Press, Boca Raton, FL.

Roh, JH, Suzuki, H., Azakami, H., Yamashita, M., Murooka, Y., Kumagai, H. 1994.

Pemurnian, karakterisasi, dan kristalisasi monoamine oxidase dari

Escherichia coli K-12. Biosci. Biotechnol. Biochem. 58, 1652-1656.

Roh, JH, Wouters, J., Depiereux, E., Yukawa, H., Inui, M., Minami, H., Suzuki, H.,

Kumagai, H., 2000. Pemurnian, kloning, dan struktur tiga dimensi

prediksi Micrococcus luteus FAD yang mengandung tyramine oksidase. Biochem.

Biophys. Res. Commun. 268, 293-297.

Santos, CN, Stephanopoulos, G., 2008. Melanin berbasis layar high-throughput untuk

produksi -tyrosine di Escherichia coli. Appl. Lingkungan. Microbiol. 74,

1190-1197.

Satoh, Y., Tajima, K., Munekata, M., Keasling, JD, Lee, TS, 2012. Teknik dari

tyrosol-memproduksi jalur, memanfaatkan gula sederhana dan metabolisme pusat

tirosin, di Escherichia coli. J. Agric. Chem makanan. 60, 979-984.

Y. Satoh et al. / Metabolik Rekayasa 14 (2012) 603-610

609

Halaman 8

Smith, GK, 1987. Pada peran reduktase sepiapterin dalam biosintesis

tetrahydrobiopterin. Arch. Biochem. Biophys. 255, 254-266.

Solomon, EI, Sundaram, UM, Machonkin, TE 1996. Multicopper oksidase dan

oksigenase. Chem. Wahyu 96, 2563-2606.


Takikawa, S., Curtius, HC, Redweik, U., Leimbacher, W., Ghisla, S. 1986.

Biosintesis tetrahydrobiopterin. Pemurnian dan karakterisasi

6-pyruvoyl-tetrahydropterin synthase dari hati manusia. Euro. J. Biochem.

161, 295-302.

Thony, B., Auerbach, G., Blau, N., 2000. tetrahydrobiopterin biosintesis, regen-

timbangkan dan fungsi. Biochem. J. 347 (1), 1-16.

Torres Pazmino, DE, Winkler, M., Glieder, A., Fraaije, MW, 2010. Monooxy-

genases sebagai biocatalysts: klasifikasi, aspek mekanistik dan biotechnolo-

aplikasi gical. J. Biotechnol. 146, 9-24.

Yamamoto, K., Kataoka, E., Miyamoto, N., Furukawa, K., Ohsuye, K., Yabuta, M.,

2003. Rekayasa genetika dari Escherichia coli untuk produksi tetrahydrobiop-

Terin. Metab. Eng. 5, 246-254.

Y. Satoh et al. / Metabolik Rekayasa 14 (2012) 603-610

610