MAKALAH

KULTUR JARINGAN DAN BIOSINTESIS

ANALISIS METODE, PRODUKSI/ OPTIMASI TAXOL

OLEH

NAMA : ANDI ANUGRAH AGUNG IBRAHIM

NIM : F1F1 11 091

KELAS : FARMASI B

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HALU OLEO

KENDARI

2015
 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Kanker merupakan suatu penyakit yang disebabkan oleh pertumbuhan sel-sel

jaringan tubuh yang tidak normal. Sel-sel kanker akan berkembang dengan cepat, tidak
terkendali, dan akan terus membelah diri, selanjutnya menyusup ke jaringan sekitarnya
(invasive) dan terus menyebar melalui jaringan ikat, darah, dan menyerang organ-organ
penting serta syaraf tulang belakang. Dalam keadaan normal, sel hanya akan membelah
diri untuk mengganti sel-sel yang telah mati dan rusak. Sebaliknya sel kanker
mengalami pembelahan secara terus menerus meskipun tubuh tidak memerlukannya
sehingga terjadi penumpukan sel baru yang disebut tumor ganas (Yayasan Kanker
Indonesia,2006).
Penyediaan bibit yang berkualitas baik merupakan salah satu faktor yang
menentukan keberhasilan dalam pengembangan pertanian di masa mendatang.
Pengadaan bibit pada suatu tanaman yang akan dieksploitasi secara besar-besaran dalam
waktu yang cepat akan sulit dicapai dengan perbanyakan melalui teknik konvensional.
Salah satu teknologi harapan yang banyak dibicarakan dan telah terbukti memberikan
keberhasilan adalah melalui teknik kultur jaringan. Teknologi tersebut telah banyak
digunakan untuk pengadaan bibit terutama pada berbagai tanaman hortikultura.
Berdasarkan uraian diatas, penyusun akan membahas hasil review dari dua
jurnal berjudul Meingkatkanya Produksi Taxol Yang Stabil Menimbulkan Sinkron/
Hubungan Kultur Sel Pada Taxus Chinensis dan Efek endofit jamur memproduksi
paclitaxel pada pertumbuhan dan pembentukan paclitaxel sel Taxus cuspidata
sehingga dapat memberikan ulasan bagaimana memproduksi dan meningkatkan hasil
dari tanaman penghasil antikanker. Dari kedua jurnal tersebut akan dibahas metode dan
hasilnya secara bertahap sebagai berikut.
 Meingkatkanya Produksi Taxol Yang Stabil Menimbulkan Sinkron/
Hubungan Kultur Sel Pada Txus Chinensis

A. Bahan dan Metode

Kultur suspensi

T. chinensis sel, dimulai dari embrio zigot, diselenggarakan dalam media MS ditambah
dengan 3% sukrosa dan 10 mol 1-1 a-naftalen asam asetat, dan disimpan dalam gelap pada
2591 C. Untuk produksi taxol, sekitar 10 g berat basah sel dipindahkan ke media produksi
100 ml dalam 250 ml labu Erlenmyers. Media produksi dimodifikasi media B5 cair Gamborg
ini menurut Zhang et al. kecuali konsentrasi sukrosa adalah 30 g 1-1. Labu dikocok di 1255
rpm dalam gelap di 2511 C.

Starvasi fosfat ganda

Prosedur yang ditetapkan untuk sinkronisasi sesuai dengan metode yang

sebelumnya telah dijelaskan oleh Amina et al. dengan modifikasi. Sel-sel berusia lima
belas hari itu dipindahkan ke media produksi tanpa 43 dan dibiakkan selama 25 hari,
dan kemudian sel-sel yang tersaring dipindahkan ke media produksi yang baru tanpa
43 dan dibiakkan selama 25 hari lagi. Fosfat diperlukan dalam metabolisme nukleat
untuk tahap siklus sel, dan siklus sel pada sebagian besar sel dianggap ditangkap tepat
setelah fase M dari starvasi fosfat sekunder.

Percobaan elisitasi dalam labu dan bioreaktor

Kultur sinkronis dengan starvasi fosfat ganda atau perlakuan suhu rendah, dan
kultur tak sinkronis dikumpulkan dan diinokulasi menggunakan 100 g berat bersih per
liter medium produksi dalam 250 ml labu dan dalam 15 l bioreaktor aduk dengan
volume sebesar 100 ml dan 10 l, masing-masing. Oleh karena itu, ada tiga jenis awal
fase siklus sel (ICCP): ICCP dalam kultur sinkronis dengan starvasi fosfat ganda fase
G1 utama ditandai sebagai (GP-ICCP). ICCP dalam kultur sinkronis dengan perlakuan
suhu rendah dalam fase M utama ditandai sebagai (MP-ICCP). ICCP dalam kultur tak
sinkronis dalam berbagai fase ditandai sebagai (VP-ICCP). Kondisi kultur labu sama
seperti yang dijelaskan di atas. Bioreaktor aduk dengan botol sampel ambil, dirancang
oleh laboratorium kami, berbentuk kolom dan diameter 25 cm. Pencampuran dilakukan
dengan menggunakan blade impeller spiral pada laju agitasi 60 rpm. Suhu dikontrol
pada 251C untuk semua perlakuan. Setelah 8 hari, kombinasi 60 mol l-1 metil
jasmonat dan 50 mg l-1 elisitor jamur ditambahkan ke dalam kultur. Sampel diambil
untuk pengujian produksi taxol pada interval waktu.

Efek endofit jamur memproduksi paclitaxel pada pertumbuhan dan pembentukan

paclitaxel sel Taxus cuspidata

Metode dan Bahan

Kultur sel tanaman

Sel Taxus cuspidata (line T118) dikultur di dalam gelap dalam shaker berputar pada
100 rpm dan 25 1C di medium B5 Gamborg cair (Gamborg et al. 1968) dilengkapi
dengan naftalen asam asetat (NAA) 2 mg l-1, 6-benzylamino purin (6-BA) 0,15 mg l-1,
kasein asam hidrolisat 1 g 1-1, dan sukrosa 25 g l-1. Dua puluh mililiter kultur suspensi
subkultur berusia 12 hari (~6 g berat basah sel) diinokulasi ke 80 ml media B5 Gamborg
segar di 500-ml labu Erlenmeyer. Kultur suspensi T. cuspidata disubkultur setiap 12
hari selama tiga generasi sebelum percobaan.
Persiapan supernatan kultur endofit jamur (FECS)
Fusarium mairei (strain Y117) diperoleh dari China maire yew dan dipelihara di
laboratorium kami. FECS diperoleh sesuai dengan langkah-langkah percobaan berikut.
Jamur yang berkecambah dalam labu Erlenmeyer 500 ml yang mengandung 100 ml
media B5 Gamborg pada shaker berputar di 170 rpm dan 25 1C selama 6 hari. Kaldu
kultur kemudian disaring dengan empat lapisan kain tipis, disentrifugasi pada 10,000g
selama 20 menit, dan disaring melalui filter 0,45-m. Filtrat (90 ml) diuapkan hingga
volume akhir 30 ml di bawah vakum pada 60C. Kaldu kultur terkonsentrasi triple
disterilisasi dengan filter 0,25-m sebelum digunakan. Konsentrasi gula FECS
ditentukan melalui metode asam fenol-sulfat menggunakan glukosa sebagai standar.
Penetapan unsur aktif dalam FECS
eksopolisakarida (EPS) dalam FECS diperoleh dengan metode presipitasi dengan
etanol. Protein dibuang dari EPS dengan metode Sevag (Staub 1965). Massa molekul
berat rata-rata EPS ditentukan oleh sistem kromatografi eksklusi ukur kinerja tinggi
(HPSEC) (Water 600), menggunakan kolom linear Ultra hydrogelTM (300 mm 7,8
mm i.d. 2) pada suhu kolom 45C, dan dielusi dengan 0,1 mol l-1 NaNO3 pada laju alir
0,9 ml min-1.
Determinasi dan Ekstraksi paclitaxel

Untuk ekstraksi paclitaxel dari sel T. cuspidata, 100 mg sel kering dibuat bubuk
dalam mortar kaca dengan alu, direndam dengan 20 ml metanol selama 12 jam, dan
kemudian dicampur dengan 20 ml air suling. Campuran diekstraksi tiga kali dengan 20
ml triklorometana. Tahap triklorometana dipisahkan dari fase berair dan diuapkan
sampai kering pada 40 C di bawah vakum. Dengan taxan tersisa diselesaikan kembali
dalam 1 ml metanol dan disaring melalui 0,25-m filter membran sebelum kromatografi
cair berkinerja tinggi (HPLC).

Paclitaxel ekstraseluler diekstraksi dari medium kultur menggunakan volume

triklorometana yang sama tiga kali. Kuantifikasi paclitaxel dilakukan melalui sistem
fase-balik HPLC (Aglilent) dengan XDBC18 kolom (4,6 9 250 mm, 5 lm) dan dideteksi
oleh ultraviolet (UV) detektor di 227 nm, dan fase gerak yang terdiri dari metanol: air
(65: 35 v / v). Identifikasi taxoids dicapai dengan perbandingan waktu retensi dan
kromatografi cair / spektrometri massa (LC / MS) pola fragmentasi dengan standar asli
(Sigma).

Analisis statistik

Data eksperimen dilaporkan sebagai rerata tiga percobaan yang berbeda. Hasil
dinyatakan sebagai rerata standar deviasi (SD). Pentingnya perbedaan antara poin
eksperimen ditentukan dengan dua-sample t-tes. P < 0,05 dianggap signifikan secara
statistik.
 PEMBAHASAN
Berdasarkan penjelasan sebelumnya maka sebenarnya elisitasi terjadi alami di
alam. Namun, dengan penambahan elisitor tentunya elisitasi akan semakin tinggi dan
meningkatkan produksi metabolit sekunder dari tanaman tertentu. Pada kultur jaringan
proses elisitasi ini dapat menguntungkan. Contohnya adalah bioproduksi dari taxol,
senyawa diterpenoid yang dihasilkan oleh Taxus. Taxol adalah senyawa yang bernilai
ekonomi sangat tinggi dan sulit didapat karena terbukti memiliki aktivitas antikanker.
Sudah banyak riset yang mempelajari mengenai induksi elisitor untuk produksi dari
taxol dan peningkatan produksinya menggunakan proses elisitasi.
Penggunaan metode elisitasi adalah ketika penggunaan metode kultur jaringan
tidak memberikan hasil metabolit yang tidak optimal dan sudah diketahui enzim
spesifik penghasil metabolit sekuder serta medium paling tepat agar berhasil
meningkatkan produksi metabolit sekunder. Alasannya, dibandingkan dengan berbagai
macam metode untuk meningkatkan produksi metabolit sekunder seperti optimasi
media,cell line selection, cell immobilization,penambahan precursor,transformasi
genetic,kultur rambut akar, elisitasi merupakan metode yang paling berhasil
memproduksi metabolit sekunder dalam kultur sel dari berbagai tanaman.

Hasil berdasarkan junral 1

Produksi taxol dalam labu

Produksi taxol dalam kultur tak sinkronis (VP- ICCP) dan dua kultur sinkronis
(MP-ICCP dan GP-ICCP) pada hari ke-15 lebih tinggi daripada di hari kesepuluh, tapi
produksi taxol di ketiga kultur berbeda (Gambar 1). Pada hari ke-15, produksi taxol
dalam MP-ICCP dan GP-ICCP adalah 4 dan 2 mg l-1, masing-masing, sementara
produksi taxol dalam VP-ICCP adalah 2,5 mg l-1, antara MP- CCP dan GP-ICCP.
 Produksi taxol dalam bioreaktor

Jalannya waktu produksi taxol dalam kultur sel T. chinensis ditunjukkan pada
Gambar 2. Produksi taxol dalam kultur tak sinkronis dan kultur sinkronis meningkat
secara bertahap dalam proses percobaan. Namun, di bawah kondisi elisitasi, ada
perbedaan yang signifikan dalam produksi taxol antara kultur tak sinkronis dan kultur
sinkronis setelah 4 hari. Produksi taxol dalam kultur tak sinkronis elisitasi mencapai
maksimum pada hari ke-10. Produksi taxol di dua kultur sinkronis elisitasi mencapai
maksimum pada hari ke-12, dan produksi taxol di MP-ICCP adalah yang terbesar, pada
24 mg l-1, yang hampir 2 dan 3,5 kali lebih tinggi daripada di VP-ICCP dan GP-ICCP.
Secara umum, produksi taxol dalam bioreaktor lebih rendah daripada di labu, tetapi
perubahan produksi taxol dalam kultur tak sinkronis dan kultur sinkronis dalam
bioreaktor yang mirip dengan dalam kultur tak sinkronis dan kultur sinkronis dalam
labu (Gambar. 1 dan 2).
Hasil berdasarkan junal 2

Pengaruh jumlah FECS pada pertumbuhan dan pembentukan paclitaxel sel T.

cuspidata

Jumlah FECS yang tepat (4, 6, 8, dan 10 ml) telah ditentukan berdasarkan studi
pendahuluan sebelumnya. Konsentrasi FECS adalah 0,85 mg ml-1 gula di set
percobaan. FECS dibuat dari jamur endofit dikultur dalam medium B5 Gamborg ini
selama 6 hari, dan kemudian ditambahkan 100 ml kultur suspensi 12-hari sel T.
cuspidata. Hasilnya ditunjukkan pada Gambar. 1. Dibandingkan dengan kontrol,
perlakuan dengan 4 dan 6 ml FECS tidak memiliki efek yang jelas pada pertumbuhan
sel Taxus (P [0,05), tetapi biomassa kultur diperlakukan dengan 10 ml FECS (9,3 g l-1
dari DCW) adalah 40% lebih rendah dari bahwa kultur kontrol (15,5 g-l 1 dari DCW).
Kultur diperlakukan dengan 10 ml FECS yang tampak kecokelatan setelah 2 hari Selain.
Di bawah mikroskop optik, dinding sel diperlakukan dengan FECS selama 4 hari jelas
menebal, dengan banyak partikel tersebar merata di sitoplasma. Mengenai pembentukan
paclitaxel, hasil tertinggi diperoleh pada kultur diperlakukan dengan 8 ml FECS (6.12
mg l-1), menjadi 3,5 kali lipat lebih tinggi daripada yang dari sel kontrol (1,75 mg l-1).
Dari hasil ini, jumlah optimal EFCS harus 6-8 ml.
 Pengaruh metode persiapan FECS pada efisiensi elisitasi FECS

Dalam penelitian ini, FECS dipersiapkan untuk periode yang berbeda kultur (3, 6, dan 9
hari) dari F. mairei, atau di bawah kondisi aerasi yang berbeda (berkultur dalam labu
500 ml sarat dengan 50, 100, dan menengah B5 200 ml Gamborg dunia ). Seperti
terlihat pada Tabel 1, FECS dibuat dari F. mairei dibudidayakan selama 3, 6, atau 9
hari. Tiga-daycultivation FECS tidak memiliki efek yang jelas pada pertumbuhan dan
paclitaxel produksi sel Taxus. Ada hanya sedikit antara efek 3-hari-budidaya dan 6-hari-
budidaya FECS pada tingkat pertumbuhan sel, meskipun hasil paclitaxel sel Taxus
dirawat oleh FECS 6 hari budidaya adalah 2,6 kali lipat bahwa dengan 3-daycultivation
FECS. Selanjutnya, 9-hari-budidaya FECS adalah yang terbaik di antara mereka diuji
dalam hal akumulasi paclitaxel, namun tingkat pertumbuhannya menurun secara
signifikan dibandingkan dengan sel kontrol.

Tabel 1 Pertumbuhan dan akumulasi paclitaxel T. cuspidata sel diperlakukan dengan

FECS kali budidaya yang berbeda
* P \ 0,05 dibandingkan dengan tanpa pengobatan. Enam mililiter FECS ditambahkan
ke 100 ml kultur sel Taxus di hari 12. Sampel diambil 8 hari setelah perlakuan

Dalam penelitian kami, kami menemukan bahwa aerasi dari kultur endofit jamur
memiliki efek besar pada efisiensi elisitasi FECS. FECS disiapkan melalui kultur F.
mairei dalam labu 500 ml mengandung 50, 100, dan 200 ml media B5 Gamborg,
masing-masing, selama 6 hari. Grafik diberi label sesuai pada Gambar. 2 menunjukkan
bahwa FECS dengan aerasi rendah (volume lebih besar dari media dimuat)
mengakibatkan pertumbuhan sel yang lebih besar, namun FECS dengan aerasi tinggi
(volume kurang dari media dimuat) ditingkatkan pembentukan paclitaxel.

Analisis utama dari bahan-bahan aktif dalam FECS Seperti yang ditunjukkan
pada Gambar. 3, bahan aktif dalam FECS diekstraksi melalui metode presipitasi etanol.
Secara singkat, 100 ml FECS dicampur dengan 300 ml precooled etanol dan menetap
selama 12 jam pada 4C. Setelah mensentrifugasi campuran di 10,0009g selama 10
menit, itu dibagi menjadi dua bagian, supernatan dan endapan. Etanol Endapan yang
diperoleh dilarutkan dalam 100 ml air deionisasi, dan didefinisikan sebagai bagian A.
Bahan kimia di bagian A terutama protein dan exopolysaccharides. EPS diperoleh
dengan menghapus protein gratis dengan metode Sevag (Staub 1965) dari bagian A dan
desalting oleh tas dialisis. Supernatan dari presipitasi etanol diuapkan sampai kering
pada 60C di bawah vakum, dan residu dilarutkan dalam 100 ml air deionisasi, yang
disebut bagian B. Oleh karena itu, konsentrasi mereka nominal yang sama. Bagian A,
EPS, dan bagian B ditambahkan ke kultur 12-hari-tua sel Taxus. Seperti yang
ditunjukkan oleh grafik pada Gambar. 4, Perlakuan dari bagian A dan EPS adalah
serupa dalam hal pertumbuhan sel dan pembentukan paclitaxel, sebagai bagian terdiri
dari protein bebas dan EPS, yang menunjukkan bahwa protein bukan elisitor efektif
dalam FECS. Dibandingkan dengan kontrol (Indeks pertumbuhan 3,26 dan 1,93 mg l-1
paclitaxel), EPS pengobatan penurunan pertumbuhan sel (indeks pertumbuhan 2,1)
sebesar 36% dan menghasilkan 4,31 mg l-1 paclitaxel. Namun, pengobatan FECS hanya
menurun pertumbuhan sel (indeks pertumbuhan 2,95) sebesar 9,5% dan dipamerkan
tertinggi paclitaxel hasil (5,76 mg l-1). Jadi, dibandingkan dengan EPS, FECS
menunjukkan efek positif pada kedua pertumbuhan sel dan akumulasi paclitaxel.
Sebaliknya, bagian B disajikan efek stimulatif pada pertumbuhan sel Taxus (indeks
pertumbuhan 3,95) tetapi tidak ada efek nyata terhadap pembentukan paclitaxel
(paclitaxel, 2,01 mg-l 1). Ketika bagian B dan EPS yang bersama-sama ditambahkan ke
kultur sel Taxus, efek yang sama seperti FECS diamati. Hasil pada Gambar. 5
menunjukkan bahwa hasil paclitaxel dari kultur FECS diperlakukan meningkat dengan
EPS isi FECS, dari mana dapat menyimpulkan bahwa EPS adalah elisitor utama yang
bertanggung jawab untuk akumulasi paclitaxel di FECS.

Gambar. 2 Pengaruh kondisi aerasi untuk kultur endofit jamur endofit pada kultur jamur
supernatan (FECS) efisiensi elisitasi untuk T. cuspidata sel. Angka-angka pada sumbu
X FECS ekspres dibuat dari F. mairei dikultur dalam labu 500 ml mengandung 200,
100, dan 50 ml media. Enam mililiter FECS ditambahkan ke 100 ml kultur sel Taxus di
hari 12. Sampel diambil 8 hari setelah perlakuan
Pemurnian dan karakterisasi EPS

Hasilnya ditunjukkan pada Gambar. 6. Menurut hasil HPSEC (Gambar. 6a),

EPS terdiri dari EPS I dan II EPS, berat molekul * 70 dan 2 kDa, masing-masing. EPS
disahkan melalui Sephadex G 100 kolom (kondisi kromatografi: Kolom 16 9 54 cm,
dielusi dengan 0,1 mol l-1 NaCl 0,3 ml-min 1, 3 ml / tabung) menghasilkan EPS
sederhana murni I dan II EPS (Gambar 6b. ). Persentase EPS saya total EPS adalah 20%
dan EPS II adalah 80%. Analisis GC menunjukkan bahwa EPS II terdiri dari manosa,
glukosa, dan galaktosa pada perbandingan molar 1: 0,35: 0,75 (. Gambar 6c). Hasil dari
Gambar. 7 menunjukkan bahwa hasil dari paclitaxel dalam kultur sel Taxus
diperlakukan dengan 20, 60, dan 120 mg-l 1 EPS I, masing-masing, yang identik dan
mirip dengan kontrol (1,93 mg l-1). Selain itu, hasil paclitaxel disebabkan oleh EPS II
jelas lebih tinggi dibandingkan dengan EPS I. Hasil paclitaxel tertinggi (60 mg l-1
dengan pengobatan EPS II) adalah 2,8 kali lebih tinggi dari kontrol. Hasil ini
menunjukkan bahwa EPS II adalah molekul aktif.

Gambar. 6 Pemurnian dan karakterisasi EPS. Kromatogram EPS oleh berkinerja tinggi
kromatografi ukuran-eksklusi (HPSEC) (a), kurva elusi EPS mentah dari Sephadex G
100 (b), dan analisis komposisi EPS II oleh GC (c)

Perbandingan FECS dan EPS

Dalam rangka untuk menyelidiki interaksi antara EPS dan bahan kimia lainnya
di FECS, perbandingan FECS dan EPS dilakukan dan ditunjukkan pada Gambar. 8.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa efek penghambatan EPS pada pertumbuhan sel
Taxus adalah lebih tinggi dari FECS; di isi 100 mg-l 1, biomasa kultur sel Taxus
dirawat dengan FECS (9,42 g-l 1, DCW) adalah 17% lebih tinggi dari yang
diperlakukan dengan EPS (8.02 g l-1, DCW). Sebaliknya, efek merangsang FECS pada
produksi paclitaxel lebih tinggi dari itu dari EPS saja. Dengan FECS konten yang
mengarah ke hasil paclitaxel tertinggi adalah 80 mg l-1, sedangkan konten EPS
menghasilkan hasil paclitaxel tertinggi adalah 60 mg l-1, dan hasil paclitaxel tertinggi
kultur sel Taxus diperlakukan dengan FECS (8,25 mg l- 1) adalah 58% lebih tinggi dari
yang disebabkan oleh EPS (5,21 mg l-1). Hasil ini menunjukkan bahwa hasil FECS di
sedikit membahayakan sel-sel tanaman dibandingkan dengan EPS selama induksi
paclitaxel.
 KESIMPULAN
Berdasarkan hasil dari jurnal Meingkatkanya Produksi Taxol Yang Stabil
Menimbulkan Sinkron/ Hubungan Kultur Sel Pada Taxus Chinensis dan Efek endofit
jamur memproduksi paclitaxel pada pertumbuhan dan pembentukan paclitaxel sel Taxus
cuspidata diketahui pada junal pertama dengan Optimasi kondisi budaya Produksi
taxol di MP-ICCP adalah yang terbesar, pada 24 mg l-1 dengan waktu lama produksi 15
hari, sedangkan hasil dari junral kedua dengan FECS adalah (8,25 mg l- 1) 58% lebih
tinggi dari dari EPS (5,21 mg l-1) dengan waktu lama produksi 9 hari. Jadi dari
perbandingan jurnal diketahui bahwa jurnal kedua lebih baik dari segi optimalisasi
produksi taxol.
 DAFTAR PUSTAKA

Yong-Cheng Li Wen-Yi Tao. 2009. Effects of paclitaxel-producing fungal

endophytes on growth and paclitaxel formation of Taxus cuspidata cells. China

Jiang Yu *, Wen-Zhi Lan, Wen-Min Qin, Hui-Bi Xu. 2002. High stable
production of taxol in elicited synchronous cultures of Taxus chinensis cells. China