UNIVERSIDAD AUTNOMA JUAN MISAEL SARACHO

FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGA

DEPARTAMENTO DE QUMICA
CARRERA DE INGENIERA QUMICA
CTEDRA DE ANLISIS INSTRUMENTALQMC 031
PRACTICA # 3

SEPARACIONES III CROMATOGRAFA E INTERCAMBIO INICO

1.- FUNDAMENTO.-

La cromatografa es una tcnica analtica que permite la separacin de los componentes de una
mezcla de acuerdo a la diferencia en su distribucin entre dos fases inmiscibles: la fase estacionaria
(generalmente slida) y la fase mvil (lquida o gaseosa). La distribucin de los componentes entre
las fases se realiza de acuerdo al grado de afinidad qumica entre las molculas.
La afinidad qumica puede explicarse a travs de la premisa de que lo semejante disuelve lo
semejante. Se dice que dos molculas son afines si son capaces de establecer fuerzas
intermoleculares (electrostticas, dipolo-dipolo inducido, dipolo inducido-dipolo inducido,
qumicas, etc.). La similitud se extiende en algunos casos a molculas de tamao y forma
semejante.

Como en la cromatografa es condicin esencial que la fase estacionaria sea totalmente inmiscible
con la fase mvil, los analitos interactan con dos molculas totalmente distintas entre si. Se habla
de cromatografa en fase normal, si la fase estacionaria es polar y la fase mvil es apolar.

La cromatografa es una tcnica que permite separar mezclas de compuestos Estrechamente

relacionados. En las separaciones cromatogrficas, la mezcla se disuelve en una fase mvil (FM,
gas o slido) y se hace pasar a travs de una fase estacionaria inmiscible (FE, slido o lquido
sobre un soporte slido).
Las fases se eligen de forma que los componentes de la mezcla se distribuyan de modo distinto
entre ambas. Esto es posible debido a la influencia de dos efectos contrarios:

Retencin: por interaccin de los componentes de la mezcla con la fase estacionaria FE.
Elucin o Desplazamiento: por interaccin de los componentes con la fase mvil FM.

En general, la mezcla se deposita sobre la fase estacionaria y el paso de la fase mvil a travs del
sistema da lugar a un desplazamiento distinto de sus componentes. La separacin depende del
balance de las interacciones entre los componentes de la mezcla y las dos fases.

Hay muchos tipos de cromatografa dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria, de la fase

mvil, del tipo de interacciones que se establecen, etc. (ver Tabla 1). Vamos a centrarnos en la
cromatografa de adsorcin slido-liquido en la que se utiliza una fase estacionaria slida o
adsorbente (FE) de carcter polar (p. ej. slica-gel, almina) y una fase mvil lquida o eluyente
(FM). Las interacciones suelen ser tipo dipolo-dipolo o puentes de hidrgeno.
Los eluyentes ms utilizados suelen ser disolventes orgnicos o mezclas de disolventes. La
interaccin eluyente-molcula depende fundamentalmente de la polaridad del eluyente que viene
determinada por el grupo funcional que posee. Los eluyentes aparecen ordenados en la llamada
serie eluotrpica y algunos de los ms usados son (de menos a ms polar):

ter de petrleo < ciclohexano < tetracloruro de carbono < benceno < cloroformo < cloruro
de metileno < ter etlico < acetato de etilo < acetona < piridina < etanol <metanol < agua <
cido actico

En general en la separacin la retencin y la selectividad del proceso dependen de:

a) La naturaleza del adsorbente, en nuestro caso slica-gel, un slido polar.

b) La naturaleza del eluyente, un disolvente o mezcla de disolventes. Se puede modular la
separacin cambiando el eluyente.
c) La polaridad del compuesto: viene determinada por el nmero, naturaleza y disposicin
relativa de sus grupos funcionales:
Los compuestos poco polares se desplazan con facilidad incluso con eluyentes
(FM) poco polares, ya que interaccionan dbilmente con el adsorbente (FE).
Los compuestos ms polares necesitan eluyentes (FM) ms polares ya que
interaccionan fuertemente con el adsorbente (FE) y se desplazan con dificultad. En
algunos casos la interaccin es tal que se desplazan en forma de punta de flecha,
como por ejemplo los cidos carboxlicos.
A).- Cromatografa en Columna.-

La cromatografa en columna utiliza una columna de vidrio vertical que se llena con un
soporte slido adsorbente (fase estacionaria: los ms utilizados son gel de slice (SiO2) y
almina (Al2O3)). La muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de este
soporte. El resto de la columna se llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase
mvil) que, por efecto de la gravedad, hace mover la muestra a travs de la columna. Se
establece un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente
eluyente que fluye por la columna. Debido a que cada uno de los componentes de una
mezcla establecer interacciones diferentes con la fase estacionaria y la mvil, sern
transportados a diferentes velocidades y se conseguir su separacin. As, de manera similar
a otros tipos de cromatografa, las diferencias en las velocidades de desplazamiento a travs
del medio slido se corresponden con diferencias en los tiempos de elucin por la parte
inferior de la columna para cada uno de los componentes de la muestra original, que se
recogern en fracciones diferentes.

La polaridad del eluyente afecta las velocidades relativas con las que los diferentes
componentes de la mezcla se mueven en la columna. Los disolventes polares compiten ms
eficientemente con las molculas polares de una mezcla por los lugares polares del
adsorbente. Por lo tanto, un disolvente polar desplazar las molculas, incluyendo las ms
polares, rpidamente a travs de la columna. Si el disolvente es muy polar la elucin ser
muy rpida y generalmente habr poca separacin de los componentes de la mezcla. Si por
el contrario el disolvente es muy apolar, no eluirn los compuestos de la columna. Por lo
tanto, la eleccin del eluyente es crucial para el xito de la cromatografa en columna. A
menudo se utiliza un gradiente creciente de polaridad para la elucin.

El proceso de cromatografa en columna consta de tres pasos:

a) Preparacin de la columna: Empaquetamiento de la fase estacionaria en la columna. Se

prepara una suspensin del adsorbente (fase estacionaria) en el eluyente (fase mvil) y se
vierte en el interior de la columna.

b) Siembra de la muestra: La muestra se deposita (siembra) en la superficie superior del

adsorbente contenido en la columna con la ayuda de una pipeta. Si la muestra es lquida se
puede sembrar directamente, si es slida se siembra una solucin concentrada de la misma
en un disolvente adecuado (de baja polaridad).

c) Desarrollo/Elucin de la columna: Una vez sembrada la muestra se permite el paso de la

fase mvil a travs de la fase estacionaria y se van recogiendo fracciones consecutivas del
eluyente, que sern examinadas posteriormente para determinar su composicin.

En 1978 se introdujo una versin modificada denominada cromatografa en columna

rpida. La diferencia con la cromatografa en columna tradicional es que en la tcnica
rpida el disolvente se hace atravesar la fase estacionaria aplicando una presin positiva.
Esto hace que las separaciones mejoren en resolucin y se pueda disminuir el tiempo de
elucin, por lo cual constituye un mtodo de eleccin.
 Elucin por gravedad con P Bomba Peristtica

Anlisis de los eluatos de la columna

Si los compuestos separados en una cromatografa en columna son coloreados, el progreso

de la separacin se puede monitorizar visualmente.

Las sustancias que tienen mayor afinidad por el adsorbente

aparecern en la parte superior de la columna, mientras que
aquellas que son retenidas dbilmente por la fase estacionaria,
aparecern como bandas ms anchas y en la parte inferior de la
columna.

No obstante, a menudo los compuestos que deben ser aislados suelen

ser incoloros. En este caso, se recogen secuencialmente pequeas
fracciones de eluatos en tubos rotulados y la composicin de cada
fraccin se analiza por cromatografa en capa fina. Una vez identificadas
las diferentes fracciones que contienen el mismo producto, se renen, se
elimina el disolvente y se analiza la identidad de los componentes por
mtodos espectroscpicos.

B).- Cromatografa de Capa Fina.-

Una CCF implica:

I) Preparacin de la placa depositando la cantidad adecuada de cada muestra. Si la cantidad es
excesiva el soporte se satura y la elucin da manchas alargadas; si es escasa, no se ver bien la
composicin de la muestra.
II) Elucin: Es necesario elegir el eluyente que distribuya los compuestos en el centro de la placa,
ni pegados al frente (eluyente demasiado polar), ni en la parte baja (eluyente poco polar).
Los compuestos polares se eluyen bien con eluyentes polares, y los poco polares, con eluyentes
poco polares.

III) Visualizacin de los compuestos: si son coloreados, basta la luz visible y sin son activos a
la luz ultravioleta, se utiliza una lmpara UV (si las placas contienen un indicador fluorescente).
En los otros casos se necesita un reactivo (revelador) que reaccionar con los productos sobre la
placa dando manchas coloreadas.
Algunos ejemplos son:

Aplicaciones de la CCF: La CCF es muy til para:

a) Comprobar la pureza de un compuesto, ya que es una tcnica muy sensible.
b) Determinar los componentes de una mezcla (si la polaridad de los componentes es muy distinta,
se debern hacer CCF con eluyentes de distinta polaridad).
c) Identificar un compuesto cuando se dispone del patrn correspondiente.
Si se sospecha que una muestra desconocida X es un compuesto conocido A y se dispone de un
patrn del mismo, se colocan en la placa muestras de X, A y una mezcla de los dos X+A. Se eluye,
y si se observa una sola mancha en los tres casos, los compuestos deben ser idnticos. Esto permite
diferenciarlos incluso si su polaridad es muy parecida. Para asegurarlo se pueden hacer CCF con
distintos eluyentes y confirmar que el resultado es siempre el mismo.

d) Seguir la evolucin de una reaccin: haciendo CCF de la mezcla de reaccin M a intervalos de

tiempo. P.ej., supongamos que estamos llevando a cabo la transformacin A B. Con patrones de
A y de B (si se dispone) se puede observar la velocidad a la que se consume A y se forma B.
Limitaciones: No es fcil separar compuestos de polaridad muy similar.
El estudio y caracterizacin de las distintas biomolculas (azcares, lpidos, protenas, cidos
nucleicos, etc.) requiere en numerosos casos su aislamiento y purificacin a partir de mezclas
complejas como son los preparados de cualquier material biolgico. Una de las tcnicas
bioqumicas ms clsicas y utilizadas para dicho fin es la cromatografa. La cromatografa
incluye una amplia gama de tcnicas, que se pueden clasificar atendiendo al fundamento fsico-
qumico en el que se basa la separacin (cromatografa de adsorcin, de reparto, de cambio
inico, de filtracin molecular, hidrofbica y de afinidad), o al material sobre el que se lleva a
cabo (cromatografa en papel, capa fina, en columna y de gases).
Todas las tcnicas intentan explotar las diferencias fsicas, qumicas y biolgicas de las distintas
biomolculas para llevar a cabo su separacin y aislamiento.
Entre dichas propiedades podramos citar:

i) Diferencias en solubilidad en diferentes solventes, tanto orgnicos como acuosos.

ii) Diferencias en tamao y forma.
iii) Diferencias en carga.
iv) Diferencias en afinidad por otras biomolculas.

Todas estas propiedades y, por tanto, la separacin de diferentes compuestos estn influenciadas
por las condiciones del medio de separacin, pH, temperatura, fuerza inica e hidrofobicidad.

Hay una amplia gama de mtodos colorimtricos que permiten la determinacin cuali- y
cuantitativa de aminocidos. El ms general y utilizado es el de la reaccin con la ninhidrina.
La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminocidos que tengan el grupo
amino libre, dando lugar a la formacin de amoniaco y anhdrido carbnico, con reduccin del
reactivo (ninhidrina) a hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y
otra molcula de ninhidrina para dar un compuesto de adicin doble que presenta una
coloracin azul-prpura, con la excepcin de la prolina que da una coloracin amarillenta.

C).- Intercambio Inico.-

El intercambio inico es un intercambio reversible y estequiomtrico de iones entre una fase slida
inica y una fase lquida externa, sin un cambio sustancial de la estructura del slido. La fase slida
consiste usualmente en una matriz polimrica (por lo general una resina) o una red cristalina,
insoluble pero permeable, sobre la cual se ubican grupos cargados y fijos y contraiones mviles de
de carga opuesta que pueden ser intercambiados por otros iones de la fase lquida externa.

Este mtodo es aplicable generalmente a compuestos inicos, o compuestos ionizables (cidos y

bases) y compuestos que pueden interactuar con grupos inicos (ligandos mono- y polidentados).

Clasificacin de las resinas: Los intercambiadores de iones se dividen en dos grandes grupos:
catinicos (o cidos) y aninicos (o bsicos), de acuerdo a las cargas negativas o positivas,
respectivamente, de sus funciones inicas fijas y, consiguientemente, a su afinidad por las cargas
positivas o negativas de los contraiones. Cada grupo puede subdividirse, a su vez, en dos subgrupos:
catinicas fuertes (RSO3H) y dbiles (RCOOH, ROH), y aninicas fuertes (RNR 3) y dbiles
(RNR2H, RNR2H2).

Los mtodos de intercambio inico se basan en la distribucin de especies inicas entre una
solucin externa y una fase slida (resina). Los equilibrios se establecen de acuerdo a las
siguientes reacciones:

Grado de entrecruzamiento: El entrecruzamiento de una resina depende de la proporcin

de DVB en la copolimerizacin. Se especifica el grado de entrecruzamiento de una resina
indicando el porcentaje de ese compuesto que contiene, mediante el signo x (lase por)
seguida por el nmero que expresa ese porcentaje, a continuacin del nombre comercial de
la resina. Generalmente el porcentaje de DVB se encuentra entre un 4 y un 16, siendo las
resinas x8 las ms ampliamente usadas.
Selectividad: Todos los intercambiadores exhiben cierto grado de preferencia para una
especie inica en relacin a otras. En una operacin que involucra el intercambio entre los
iones de una resina catinica (en su forma protnica) y una solucin de un electrolito que
contiene iones M+n, tiene lugar la siguiente reaccin:

Donde R- simboliza sitios de intercambio negativos fijos en la matriz de la resina. El

equilibrio se establece cuando no hay cambios ulteriores posibles en la relacin M+n/H+ en
la resina.

En el equilibrio, la concentracin de los iones est dada por la constante de equilibrio o

coeficiente de selectividad (EH M/n) como sigue:
donde r indica la fase de la resina (slida) y las concentraciones estn expresadas en peso
ion-gramo por gramo de resina.

El coeficiente de selectividad no es una constante, depende de la proporcin de los dos

iones que se intercambian, de la concentracin inica total de la solucin y, para una resina
dada, del grado de entrecruzamiento (al disminuir significativamente el tamao del poro,
comienza a actuar como un tamiz y slo intercambian las funciones perifricas). En la
siguiente tabla se dan a modo de ejemplo algunos valores de coeficiente de selectividad: se
refieren a equivalentes de ion absorbido a partir de 1 ml de solucin por 1 g de resina en la
forma H+ (catinica) o Cl -(aninica).

Capacidad de intercambio inico de una resina: La capacidad de una resina es la medida del
contenido de sitios activos, o de la facilidad para tomar contraiones, en unidad de volumen (n de
meq/ml de resina hmeda), o en unidad de peso (n de meq/g de resina seca). La capacidad terica
es el nmero de grupos funcionales por unidad de peso seco. No obstante, depende del estado inico
de la resina.

La capacidad en volumen tambin depende del estado inico, sobre todo en las catinicas dbiles,
en las que resulta obvia la diferencia en ionizacin (y volumen) segn se trate, por ejemplo, de la
forma RCOOH o RCOONa (en esta ltima ambos, volumen e ionizacin, son mucho mayores que
en la RCOOH). En general, vara con el nmero de molculas de agua que contenga el ion en su
carga de hidratacin, consecuentemente, una resina se expande o contrae cuando se produce un
cambio de iones. En general, la capacidad en volumen se refiere al volumen aparente que ocupa el
lecho de la resina en la forma H+ (o Cl-), es decir, al volumen propio de la resina hmeda (hinchada)
ms el volumen que ocupa el lquido entre las partculas. Las capacidades en peso y en volumen
para una resina estn relacionadas por:

en donde: Vb: volumen del lecho. V0: volumen muerto o intersticial (entre los grnulos de
la resina) ocupado por la fase lquida. : fraccin de volumen muerto (V 0/Vb). QV:
capacidad en volumen (meq/ml de lecho). Qw: capacidad en peso (meq(g de resina seca). :
densidad de la resina hmeda (g de resina hmeda/ml de resina hmeda). wr: peso de la
resina seca. S: fraccin en peso de agua en la resina hmeda. *: densidad aparente de la
resina en el lecho (g de resina seca/ml de lecho).

El coeficiente de particin est dado por: Este coeficiente es anlogo al coeficiente de

Nernst en extraccin lquido-lquido. Para condiciones dadas, puede calcularse a partir del
coeficiente de selectividad, si se conocen la capacidad de la resina y la concentracin del
otro ion participante. Suponiendo que la resina est cargada inicialmente con iones
hidrgeno:
Este coeficiente es anlogo al coeficiente de Nernst en extraccin lquido-lquido. Para
condiciones dadas, puede calcularse a partir del coeficiente de selectividad, si se conocen la
capacidad de la resina y la concentracin del otro ion participante. Suponiendo que la resina
est cargada inicialmente con iones hidrgeno:

Para intercambios entre iones de distinta carga, el coeficiente de distribucin depende en

buen grado de la concentracin inica de la solucin externa. Por ejemplo, en el caso de
una resina que ha sido utilizada para ablandamiento de aguas, cargada por tanto con iones
calcio y magnesio, puede ser regenerada por iones sodio contactndola con soluciones
concentradas de cloruro de sodio.

Separaciones en contacto discreto (batch): En operaciones en batch, la tcnica consiste

en colocar simplemente la resina dentro de la solucin de contacto permitiendo que se
establezca el equilibrio mediante agitacin y tiempo de espera apropiados. Luego se
elimina la fase solucin por centrifugacin.

El coeficiente de particin por s solo no da informacin acerca de la proporcin de un ion

absorbido o no por el intercambiador. Para una informacin ms especfica se necesitan
conocer las cantidades de resina (en g) y de solucin (en ml) para obtener la cantidad total
de ion en la resina y en la fase solucin y poder calcular as el coeficiente de distribucin D:

El grado de intercambio que tiene lugar en una separacin batch est limitado por la
selectividad de la resina en el equilibrio. La absorcin completa de un ion por parte de la
resina puede producirse cuando Kw > (V / w).103. Bajo condiciones prcticas, un ion puede
ser absorbido si Kw > 10000 y quedar en solucin cuando Kw < 0,01.

Cromatografa de intercambio inico: La cromatografa de intercambio inico consiste

en separar especies inicas de igual signo, en una columna cargada con una resina
intercambiadora con funciones fijas de signo contrario, aprovechando los diferentes
coeficientes de selectividad. Para ello se carga una columna con una suspensin acuosa de
la resina, la que debe mantenerse permanentemente cubierta de fase lquida (se carga en
suspensin totalmente hidratada para evitar explosin de la columna por hinchamiento de la
resina y se mantiene cubierta de lquido para evitar formacin de vas de aire).
Generalmente se procede por la tcnica denominada elucin, en la que la introduccin de la
muestra (solucin que contiene los iones a separar) se realiza colocando una fina banda de
la misma en la parte superior de la columna. Luego, los iones son arrastrados en sentido
descendente mediante el pasaje de un eluyente adecuado, en una serie de procesos de
intercambio. Si los coeficientes de los iones de la muestra difieren suficientemente, cada
ion viajar por la columna con diferente velocidad y emerger como una banda distinta.
En operaciones en columna se introduce un nuevo parmetro: coeficiente de particin en
volumen, que se define como sigue:
La relacin entre ambos coeficientes de particin (en peso y en volumen) est dada por:

El coeficiente de distribucin puede calcularse a partir del coeficiente de particin en

volumen mediante:

2.- OBJETIVOS.-

Realizar una separacin de una mezcla de colorantes aplicando cromatografa de

columna.
Determinar los parmetros de la columna cromatogrfica y trazar un cromatograma
aproximado utilizando curvas calibratorias estndar
Separar los pigmentos presentes en un triturado de hojas de acelga con cromatografa
de columna.
Realizar la separacin aplicando CCF de una mezcla de azcares con sustancias
orgnicas neutras no polares y revelarlas con una mezcla de cido sulfrico y etanol.
Desarrollar la separacin cromatogrfica con CCF de una mezcla de aminocidos y
revelar la placa con rociado con solucin de ninhidrina.
Clculo del valor de Rf para cada uno de los compuestos. Justificacin de las
diferencias en Rf de los distintos aminocidos.
Identificacin de la naturaleza de compuestos desconocidos, comparando con el avance
de muestras patrn.
Determinar las capacidades de intercambio de resinas catinicas y aninicas.
Separacin de mezclas de cationes y de aniones coloreados en base a las diferencias de
los coeficientes de selectividad.
Ensayo de elucin con gradiente de concentracin.

3.- MATERIALES.-

Bote de vidrio (Cmara Cromatogrfica) (2)

Probeta 10 mL
Papel aluminio
Cuentagotas plstico + Puntas para CCF (2)
Cuentagotas de vidrio
Pinzas metlicas de diseccin
Placas de slice
Secador (1 por mesa)
Atomizador casero.

4.- REACTIVOS.-

Disolventes

Hexanos - Acetato de etilo [1:2]

Etanol amonaco (1:3): [7:3]
Compuestos patrn

Glucosa
Fructosa
Maltosa
Galactosa
Sacarosa
Solucin problema de azcares

Glutamato.
Glicina.
Lisina.
Prolina.
Leucina.
Solucin problema de aminocidos.

Otros:
Etanol.
Hidrxido amnico.
Ninhidrina.

5.- PARTE EXPERIMENTAL.-

5.1.- Cromatografa de Columna.

a).- Separacin de una mezcla de colorantes.

I. Preparacin de la Columna:

Preparar una suspensin con 15 g slica gel en etanol al 96%

(aprox. 20 ml).
Comprobar que la llave de la columna est cerrada aadir la
suspensin de almina activada en etanol al 96%.
Golpear suavemente, con un tubo de goma o con el dedo, las
paredes externas de la columna para favorecer la eliminacin de
las burbujas de aire que se puedan haber formado.
Abrir la llave de la columna y dejar fluir lentamente el etanol hasta
que la altura de ste quede 2 mm por encima de la almina.
Durante esta elucin inicial la almina sedimenta y, al finalizar la
elucin, debe presentar un aspecto uniforme y una superficie lisa y
perpendicular al eje longitudinal de la columna.
El etanol que se obtiene de la columna durante esta parte del
proceso se puede reutilizar.
NOTA: a lo largo del proceso cromatogrfico la columna nunca debe
secarse, es decir, la fase estacionaria debe encontrarse en todo
momento cubierta por la fase mvil, ya que de lo contrario la fase
estacionaria se contraera y agrietara.

II. Siembra de la muestra:

Una vez compactada la columna se proceder a sembrar,

depositar, 1 ml de la muestra sobre la superficie de la slica gel
con la ayuda de una pipeta.
Finalizada la adicin de la muestra se abre la llave de la columna y
se eluye hasta que la muestra sea adsorbida y el nivel del lquido
 quede aproximadamente 1 mm por encima de la superficie del
adsorbente.
Si la pared interna de la columna se ha manchado con la muestra
al depositarla, se lava dejando gotear por ella un poco del
eluyente (con la ayuda de la pipeta) y se eluye de nuevo hasta que
el nivel del lquido vuelva a quedar 1 mm por encima de la
superficie del adsorbente.
Finalmente se aade 1 ml de etanol y se eluye de nuevo hasta que
el nivel del lquido vuelva a quedar 1 mm por encima de la
superficie del adsorbente.

III. Elucin de la Columna:

Adicionar, con la ayuda de una pipeta Pasteur y lentamente, 10 ml

de etanol en la parte superior libre de la columna y abrir la llave
para permitir el flujo del etanol a travs de la almina.
A medida que evoluciona el cromatograma se observa que el azul
de metileno eluye a lo largo de la columna, formando una banda
de color azul bien diferenciada que se desplaza hacia la parte
inferior de la misma, mientras que el naranja de metilo queda
retenido en la parte superior. Si es necesario se aadir ms
etanol a la columna durante el proceso de elucin.
Cuando el azul de metileno est prximo a la salida de la columna
se proceder a recoger fracciones en matraces Erlenmeyer
numerados de forma consecutiva, hasta que todo el producto se
haya recogido y el etanol no presente coloracin azul.
Dejar fluir el etanol a travs de la columna hasta que la altura de
ste quede 2 cm por encima de la slica y llenar la parte superior
libre de la columna de agua destilada (cambio de eluyente), con
la ayuda de una pipeta Pasteur y lentamente. Abrir la llave de la
columna y dejar fluir el agua a travs de la almina. A medida que
evoluciona el cromatograma se observa que el naranja de metilo
eluye a lo largo de la columna, formando una banda de color
naranja bien diferenciada que se desplaza hacia la parte inferior
de la misma. Cuando el naranja de metilo est prximo a la salida
de la columna se proceder a la recoleccin de fracciones
siguiendo un procedimiento anlogo al anterior para el azul de
metileno, hasta que el agua no presente coloracin.

b).- Separacin de pigmentos vegetales.

I. Preparacin de la Columna:

Similar a la del inciso (a), pero utilizando etanol al 90%.

II. Siembra de la muestra:

Una vez compactada la columna se proceder a sembrar,

depositar, 2 ml de un extracto de acelga o espinaca (extrado con
etanol, i-propanol o hexano).
Finalizada la adicin de la muestra se abre la llave de la columna y
se eluye con etanol 90% hasta que la muestra sea adsorbida y el
nivel del lquido quede aproximadamente 1 mm por encima de la
superficie del adsorbente.
 Si la pared interna de la columna se ha manchado con la muestra
al depositarla, se lava dejando gotear por ella un poco del
eluyente (con la ayuda de la pipeta) y se eluye de nuevo hasta que
el nivel del lquido vuelva a quedar 1 mm por encima de la
superficie del adsorbente.
Finalmente se aade 1 ml de etanol y se eluye de nuevo hasta que
el nivel del lquido vuelva a quedar 1 mm por encima de la
superficie del adsorbente.

III. Elucin de la Columna:

Adicionar, con la ayuda de una pipeta lentamente, 5 ml de etanol

90% en la parte superior libre de la columna y abrir la llave para
permitir el flujo del etanol a travs de la slica gel.
Continuar aadiendo porciones de 2-3 mL del eluyente y anotar
todos los cambios en la apariencia de la columna.
Conforme las bandas empiezan a bajar y a separarse en la
columna, recolectar las fracciones de los pigmentos separados en
tubos de ensaye numerados.
Cambiar de tubo cuando est lleno hasta dos terceras partes o
antes, si se nota un cambio de coloracin en el eluyente.
Mientras el movimiento de los pigmentos ocurra a una velocidad
apreciable, continuar aadiendo porciones del mismo solvente, no
importa cul sea el volumen utilizado ni cuantos tubos se llenen
con el mismo eluyente.
Si ya no hay movimiento de los pigmentos, empezar a usar como
eluyente el solvente puro o la mezcla de la siguiente polaridad
decreciente y continuar con el mismo solvente hasta que
nuevamente ya no haya cambios.
Continuar eluyendo los pigmentos con solventes de polaridad
decreciente. El orden de solventes que debe seguirse, para esta
prctica es el siguiente:

Etanol ---- isopropanol --- metil, etil ter --- ciclohexanona

--- hexano

Anotar los resultados en una tabla: los colores de las fracciones

recolectadas, el solvente con el que se eluy cada una de ellas y el
volumen aproximado de cada fraccin.
Al terminar la cromatografa, observar los tubos y en base a los
colores determinar cules de ellos corresponden al mismo
pigmento. Anotar en la tabla asignndole el mismo nmero de
compuesto a las fracciones iguales.
5.2.- Cromatografa de Capa Fina.

I. Preparacin:

Antes de comenzar compruebe que todo el material y la zona de trabajo estn perfectamente
limpios y secos.
Tome con las pinzas una placa para cromatografa ya cortada y depostela en una zona
limpia y seca de la mesa.
Con un lpiz dibuje una lnea horizontal a aprox. 1 cm del borde inferior de la placa. Sobre
esta lnea marque suavemente tantas X como muestras a analizar con especial cuidado en
no acercarse a los bordes.
Bajo cada X anote con lpiz el cdigo que indique a que muestra corresponde.
IMPORTANTE: las placas no deben tocarse con los dedos en la zona plana.
Introduzca en la/s cubeta/s de cromatografa el eluyente (hasta una altura de
aproximadamente 0,5 cm).
o Para la separacin cromatogrfica de aminocidos usar propanol amonaco (7:3)
o Para la sepracin cromatogrfica de azcares usar una de las siguientes mezclas:
n-butanol HAc agua (4;1:5)
i-propanol HAc agua (3;1:1)
Tape la cubeta con tapa de vidrio, papel de aluminio o un vidrio de reloj para evitar la
evaporacin. El nivel de lquido debe quedar por debajo de la lnea de la placa para que no
pueda tocar la/s muestra/s.
Disuelva una pequea cantidad de la/s muestra/s a analizar en un disolvente voltil
intentando que la disolucin no est ni muy diluida ni muy concentrada.

II) Preparacin de patrones, muestras y soluciones reveladoras:

a).- Aminocidos

- Disoluciones patrn de aminocidos: 1mg/ml en etanol al 96 %, 0,5 M

en HCl.
Patrn 1: fenilalanina. Patrn 2: -alanina. Patrn 3: cido asprtico.
Patrn 4: lisina Patrn 5: prolina. Patrn 6: serina Patrn 7: cistena
Patrn 8: triptofano
- Disolucin de revelado: Ninhidrina al 0,3 % (p/v) en n-butanol/cido
actico al 3
% (v/v)
- Fase mvil: N-propanol:NH3 30 % (7:3, v/v)
- Disolucin problema (puede contener uno o varios aminocidos)
b).- Azcares

a) Disolver 0.1 ml de anilina ( 0,93 gramos) , y 1.7 gramos de cido ftlico en 100 ml de
butano!. Calentar a 100C por 10 minutos y dejar enfriar.
b) Mezclar 80 ml de solucin I, y 20 ml de Solucin II
SOLUCION I: NaI04 al 2% : Disolver 2 g de peryodato de sodio en 100 ml de agua
SOLUCION II: KMn04 al 1% en Na2CO3 al 2%: Disolver 1 g de permanganato de
potasio en 100 ml de carbonato de sodio al 2% el cual previamente se prepar
disolviendo 2 gramos de Na2CO3, en 100 ml de agua.

III) Sembrado de las muestras:

Sumerja una punta de un capilar para CCF en la disolucin patrn o muestra y una pequea
cantidad de lquido ascender por capilaridad. Apoye suavemente la punta en la X
correspondiente sobre la placa y deje que la disolucin descienda hasta formar un pequeo
crculo. La mancha debe ser lo ms pequea posible para una separacin ptima (aprox. 2
mm) y nunca debe solaparse con las contiguas.
Deje secar al aire y compruebe si hay suficiente muestra mirando la placa a la luz UV. Se
deben ver crculos morados oscuros en los puntos donde se ha depositado la muestra. Si no
hay suficiente cantidad puede aadir de nuevo, pero dejando secar antes de eluir.
Para comparar con patrones se hace directamente la mezcla de la muestra y el patrn
(Mixto) sobre la placa. El lquido que contiene la punta suele ser suficiente para depositar
un poco en la X de la muestra y poner un poco tambin en la X del toque mixto.

IV) Elucin:

Con ayuda de las pinzas introduzca cuidadosamente la placa en la cubeta (deje que la parte
superior se apoye ligeramente en la pared). Tape la cubeta y deje que ascienda el eluyente
por capilaridad. Asegrese de que el frente del disolvente sube igual en toda la placa, si
sube torcido saque rpidamente la placa y consulte al profesor/a.
Cuando el frente del eluyente llegue a aprox. 0,5 cm del borde superior, saque la placa,
marque con lpiz la lnea del frente (altura a la que ha llegado el eluyente) y deje evaporar
el disolvente al aire en la vitrina.

V) Visualizacin de los compuestos:

a).- Separacin de mezclas de azcares

Al concluir la separacin cromatogrfica, dejar secar la placa sobre el mesn a temperatura

ambiente.
Rociar cuidadosamente con la disolucin de revelado
Dejar secar nuevamente en estufa a 80 durante 15 min.
Visualizadas las manchas, trazar un borde alrededor de cada una con un lpiz.
Identificar los azcares de cada patrn y de la muestra y calcular sus valores de Rf.

b).- Separacin de una mezcla de aminocidos.

Terminada la cromatografa se saca la placa, se marca la distancia recorrida por el

eluyente, se seca dentro de la campana de gases con la ayuda de un secador de aire y se
roca con un pulverizador que contiene la solucin reveladora de Ninhidrina 0,2% p/v
(en la campana de gases). La placa se secar hacindole llegar aire caliente con el
secador.

5.3.- Intercambio Inico.

I. Determinacin de la capacidad de intercambio de la resina:

a).- Resina Catinica:

Colocar un tubo de vidrio en posicin vertical y cerrar, con pinza de Mohr, el tubo
de goma colocado en su extremo inferior.
Agregar agua destilada hasta de su altura total. Colocar en una probeta la resina
suspendida en agua destilada. La misma debe estar pretratada (en contacto batch) y
en forma protnica.
Dejar sedimentar y medir el volumen de la resina. Volverla al vaso de precipitado y
transvasarla a la columna, dejando drenar agua destilada a un vaso, hasta que el
nivel en la columna quede unos 5 cm por encima de la resina. (nunca dejar que el
nivel del liquido quede por debajo de la resina).
Sustituir el vaso de precipitado por un Erlenmeyer de 500 ml y comenzar el
agregado del NaCl 5 %, en la columna, en porciones de 10-20, regulando el caudal
del efluente a unas 20 gotas por minuto, recogindolo en el Erlenmeyer.
Agregar nuevas porciones de NaCl cuando el lquido desciende a menos de 5 cm
por encima del nivel de la resina. Comprobar el pH del efluente con papel indicador
universal.
Cuando el pH del efluente sea neutro al papel, suspender el agregado de la solucin
de NaCl. Retirar el Erlenmeyer y sustituirlo por un vaso de precipitado, entonces
hacer pasar agua destilada a travs de la columna para lavar la resina.
Titular el lquido del Erlenmeyer con solucin valorada de NaOH 0,1N.
Trasvasar la resina a la probeta y medir su nuevo volumen una vez sedimentada.
Luego volver al vaso de precipitado y regenererla con HCl 4 M.

b).- Resina Aninica:

Proceder dem que en (a), solo que empleando NaOH 4M para la preparacin y
regeneracin de la resina y solucin valorada de HCl 0,1N para la titulacin
respectiva.

II. Preparacin de las Columnas de Intercambio:

a).- Columnas delgadas para separacin de sales coloreadas.

Tomar dos buretas de 10 ml y colocar en su interior u trozo de algodn (no apretado),

recorrindolo al fondo de la bureta con una varilla de vidrio.
Humedecer con agua destilada y llenar la primera con una suspensin de resina de
intercambio catinica y la segunda con resina de intercambio aninica; ambas hasta un
volumen de lecho empacado de 10 ml.
Colocar un tapn de algodn ms delgado en la parte superior y saturar lentamente ambas a
sus formas sdica y de cloruro con una solucin de NaCl de mediana concentracin.
(velocidad de flujo de 1 ml/min), durante unos 15 minutos.
Lavar las dos columnas con abundante agua destilada.
Colocar en la parte superior de la resina catinica 1 ml de una muestra de una mezcla de
cationes de coloraciones intensas y en la resina aninica 1 ml de una mezcla de aniones
coloreados provistos por el docente.
Dejar penetrar la muestra en la parte superior de la columna, agregando a continuacin
primero unos mililitros de agua destilada y posteriormente una solucin de concentracin
creciente de cloruro de potasio en la columna de intercambio aninica y de sulfato de sodio
en la columna aninica.

b).- Columnas gruesas para seguimiento de la velocidad de saturacin y separacin de sales

complejas.

Tomar dos ampollas de separacin graduadas de 50 ml y colocar en su interior u trozo de

lana de vidrio, recorrindola al fondo de la ampolla con una varilla de vidrio.
 Humedecer con agua destilada y llenar la primera con una suspensin de resina de
intercambio catinica y la segunda con resina de intercambio aninica; ambas hasta un
volumen de lecho empacado de 40 - 45 ml.
Colocar un tapn de algodn ms delgado en la parte superior y saturar lentamente ambas a
sus formas protonada e hidroxlica respectivamente aadiendo para tal efecto soluciones de
HCl 4N en la primera y de NaOH 4N en la segunda. (velocidad de flujo de 5 ml/min),
durante unos 20 minutos.
Interrumpir el flujo justo cuando el borde superior del lquido est al mismo nivel de la
parte superior de la columna.
Tapar las ampollas en espera de la siembra de las muestras que se quieren separar.

III. Elucin de las Columnas de Intercambio:

a).- Separacin de sales coloreadas.

Proceder a la elucin de las columnas delgadas catinica y aninica) con una velocidad de
flujo lenta (10 a 15 gotas por minuto) haciendo un seguimiento de la separacin de las
bandas coloreadas en cada columna.
Recolectar en frascos de vidrio pequeos con tapa esmerilada volmenes iguales de eluato
de cada resina y cuidando de separar las porciones que hayan arrastrado los cationes y
aniones que van emergiendo de la columna.
Preparar en tubos de khan patrones estndar de dilucin de cada una de las sales coloreadas
para determinar por comparacin colorimtrica concentraciones aproximadas de los eluatos
recogidos.
Una vez que hayan emergido todas las bandas de color, lavar la resina con abundante agua
destilada y repetir la experiencia si no se hubiera realizado una separacin adecuada.

b).- Velocidad de saturacin de una columna de intercambio catinico.

Lavar la columna catinica con abundante agua destilada.

Iniciar la saturacin de la misma con solucin de hidrxido de sodio 0,5M a una velocidad
de 1 a 2 ml/minuto, recogiendo el eluato en frascos de vidrio con tapa esmerilada en
porciones de aproximadamente 10 ml c/u.
Agregar a cada porcin que se vaya extrayendo 2 a 3 gotas de fenolftalena.
Separar aquellas porciones en las que se observa coloracin rosada
Titular 5 ml de cada una de las porciones seleccionadas con solucin valorada de cido
clorhdrico.
Trazar la curva de saturacin de la columna en una grfica de gasto de titulante vs. Volumen
eluido.

c).- Separacin de sales complejas en una columna de intercambio aninico.

Disolver 2 g de sulfato de cobre pentahidratado, 2 g de cloruro de cobalto y 2 g de cloruro

frrico en 30 ml de cido clorhdrico 1:1
Drenar el lquido hasta que el nivel del mismo est justo sobre el nivel de la resina
Pipetear 0,50 ml de muestra y sembrarla muy cuidadosamente sobre la resina,
evitando que se produzca agitacin en la superficie de la misma.
Una vez que la muestra ingres a la columna y cuando el nivel de fase lquida es el
mismo de la resina, se comienza a agregar HCl 4 M, inicialmente en pequeo
volumen, hasta alcanzar una altura apenas sobre el nivel de la resina, de modo que
nuevos agregados no alteren su superficie.
Luego se pueden agregar volmenes mayores regulando a su vez, el caudal en 15 a
20 gotas/min.
Recoger el eluato inicial en un vaso de precipitacin o matraz Erlenmayer de 200
ml.
Cuando la banda azul de cobalto se aproxima al extremo inferior de la columna se
quita el vaso de precipitado y se reemplaza por tubos de ensayo sucesivos de 10 ml,
recogiendo el eludo hasta que haya desaparecido la banda azul.
 Cambiar la concentracin de eluyente y usar HCl 1 M, para sacar el cobre (banda
amarilla) de la columna, recolectando el eluato nuevamente en un matraz EM.
Cuando esta banda llegue al extremo inferior de la columna se recoge nuevamente
en tubos sucesivos de 10 ml.
Se cambia nuevamente la concentracin del eluyente a HCl 0,5M para separar la
ltima banda de hierro. Proceder en la recoleccin al igual que en los dos casos
anteriores.
Colocar los tubos reolectados en tres series en una gradilla.
Agregar a los tubos conteniendo cobalto y hierro 5 ml de solucin de tiocianato de
potasio.
A los tubos conteniendo cobre, adicionar solucin de amonaco 6 M y completar a
aproximadamente 15 ml en los tubos respectivos.
Determinar las concentraciones aproximadas de cada tubo comparando su
coloracin con soluciones patrn que hubieran recibido el mismo tratamiento.
Trazar un grfico aproximado de la elucin de dicha columna.

6.- CUESTIONARIO.-

1. Para llevar a cabo una cromatografa de capa fina (CCF) es necesario un adsorbente y un
eluyente:
a) Que funcin tiene el eluyente?, cmo acta?
b) Qu funcin tiene al adsorbente?, cmo acta?
2. Cmo podemos observar cul es el resultado de una CCF?
3. a) Qu puede ocurrir si se pone demasiada muestra en la CCF?
b) Y si se pone demasiado poca?
4. Ordene los siguientes eluyentes segn su polaridad:
a) agua, cloruro de metileno, hexanos
b) etanol, acetato de etilo, cloruro de metileno
5. Ordene los siguientes compuestos segn su polaridad
a) acetato de etilo, ciclohexanona, cido benzoico.
b) ter etlico, benzoato de metilo, anilina (fenilamina).

b).- Cromatografa de columna.

1. El contenido de agua en los tejidos de plantas es muy elevado. Tomando esto en cuenta,
explique porqu la extraccin de pigmentos se lleva a cabo en metanol y luego se pasan
al hexano. Sera conveniente extraer directamente con hexano?

2. Cul sera el efecto en los resultados de la cromatografa en columna si ocurriera alguno

de los siguientes errores:
a) Al aadir la muestra a la columna se usa una cantidad excesiva de solvente.
b) No se mantiene el nivel del solvente arriba del adsorbente y la columna se agrieta.
c) No se elimina completamente el metanol del extracto de pigmentos antes de hacer la
cromatografa.

c).- Intercambio inico.

1.- Explicar el orden de elucin de los cationes, aniones y de las muestras de metales.
2.- A qu se debe el intercambio de color cuando se aumenta la concentracin de cido para eluir los
componentes?
3.- En cromatografa de intercambio aninico normal, se v aumentando la concentracin de cido
para eluir los componentes. Por qu razn en este caso se realiza lo contrario?