Anda di halaman 1dari 11

I.

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Elektroforesis merupakan suatu kegiatan pemisahan komponen atau molekul


bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam suatu matriks yang
dipengaruhi oleh medan listrik. Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik
utama dalam biologi molekular. Komponen atau molekul tersebut dapat berupa
DNA, RNA, maupun Protein dari pengotor lain. Elektroforesis menyediakan
informasi mengenai ukuran, muatan, dan jenis komponen yang dielektroforesis
(Fairbanks, 1999).

Gel yang biasanya digunakan merupakan polimer bertautan silang (crosslinked)


yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan
protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel
yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan
konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan
pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan
ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar
(lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari
ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan (Wolfe, 1995).

DNA dapat ditentukan ukurannya dengan melakukan migrasi didalam gel agarose
atau gel poliakrilamid. Migrasi DNA didalam gel ini biasa disebut dengan
elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang ada di gel harus
diwarnai dengan ethidium bromida kemudian dilihat diatas sinar UV. Untuk dapat
mengetahui proses elektrofotesis DNA, serta mengetahui prinsip kerja dari
elektroforesis terhadap molekul DNA maka dilakukanlah praktikum elektroforesis
DNA ini.
1.2 Tujuan Praktikum

Tujuan dari praktikum ini adalah sebagai berikut :


1. Mengetahui tentang elektroforesis
2. Mengetahui faktor-faktor yang mempengarui migrasi molekul
3. Mengetahui cara pembacaan DNA pada elektroforesis
II. PEMBAHASAN

2.1 Pengertian Elektroforesis

Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul bermuatan melalui


medium larutan atau gel dalam pengaruh medan listrik. Molekul yang bermuatan
jika diletakkan di medan listrik maka molekul tersebut akan bergerak ke medan
elektroda yang berlawanan, molekul asam nukleat bermuatan negatif sehingga
akan bergerak menuju ke kutub positif (anoda). Gel memiliki jaringan pori-pori
yang kompleks, kecepatan gerak molekul asam nukleat ditentukan oleh
kemampuan molekul menembus jaring-jaring gel. Ukuran jarak efektif gel
ditentukan oleh komposisinya. Gel agarosa digunakan untuk memisahkan asam
nukleat yang lebih besar dari beberapa ratus pasangan basa, mengurangi
konsentrasi agarosa untuk pemisahan fragmen besar dan meningkatkannya untuk
fragmen kecil (Dale & Schantz, 2002).

Elektroforesis ion dan molekul pada keadaan netral tidak akan rnenyebabkan
mobilitas apa-apa. Oleh karena itu penggunaan larutan penyangga (buffer)
sangat menentukan mobilitas ion dan molekul selarna proses elektroforesis.
Dengan demikian pemilihan larutan penyangga yang cocok menjadi persyaratan
utama sebelurn mengerjakan elektroforesis. Juga harus diperhatikan pada
pemilihan larutan penyangga ialah jangan sampai larutan penyangga tersebut
dapat mengadakan reaksi dengan komponen-komponen yang akan dipisahkan.
Sebagai contoh larutan penyangga borat kurang balk untuk digunakan
memisahkan komponen-komponen karbohidrat karena borat dapat membentuk
senyawa komplek dengan karbohidrat. Seperti telah disinggung bahwa besarnya
konduktivitas akan mempengaruhi mobilitas ion dan molekul. Di dalam hal
pemilihan larutan penyangga untuk elektroforesis, konsentrasi yang tinggi
konduktivitasnya juga tinggi. Secara umum jika molaritas larutan penyangga
tinggi akan menghasilkan pemisahan yang balk, yaitu pita-pita yang sempit,
tetapi memerlukan waktu lebth lama danpada memakai larutan penyangga
dengan molaritas rendah. Di dalam praktek sering digunakan molaritas larutan
penyangga antara 0,05-0, 10M (Dale & Schantz, 2002).

2.2 Faktor yang Mempengaruhi Migrasi

Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju


pergerakan dari molekul DNA, yaitu:
1. Ukuran Molekul DNA
Ukuran molekul dapat mempengaruhi migrasi DNA, hal ini dikarenakan
molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena
hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul
berukuran besar.
2. Konsentrasi gel
Konsentrasi gel juga dapat mempengaruhi migrasi DNA, semakin tinggi
konsentrasi agarosa, maka semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk
dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi
memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang
lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.
3. Bentuk molekul
Bentuk molekul juga dapat mempengaruhi migrasi DNA, molekul yang
memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan
dengan yang berbentuk bulat.
4. Densitas muatan
Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan
densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan
densitas muatan yang rendah.
5. Pori-pori gel
Semakin besar pori-pori gel yang digunakan maka akan semakin mempercepat
pergerakan molekul DNA. Sedangkan, semakin kecil pori-pori gel yang
digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.
6. Voltase
Semakin rendah tegangan listrik yang diberikan maka akan semakin
memperlambat pergerakan molekul DNA. Sedangkan, semakin tinggi tegangan
listrik yang diberikan maka semakin cepat pergerakan molekul DNA.
7. Larutan buffer elektroforesis
Dengan buffer yang memiliki kadar ion yang tinggi dapat menaikkan
konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA (Wolfe, 1993).

2.3 Alasan Menggunakan Agarose

Istilah agarose harus dibedakan dengan agar. Agar merupakan bentuk olahan dari
rumput laut terutama jenis Gracilaria sp. dan Euchema sp., sedangkan agarose
merupakan bentuk olahan dari agar yang dapat dipakai sebagai gel elektroforesis
DNA. Proses elektroforesis memerlukan beberapa syarat khusus dari agarose yang
digunakan yang kemungkinan tidak didapatkan pada agar biasa contohnya
konsentrasi, zat tambahan, kadar sulfat dan ukuran partikel (Der, 2011).

Ada dua tipe dasar dari bahan-bahan yang banyak digunakan untuk membuat gel
dalam pemeriksaan laboratorium yaitu agarose dan polyacrylamide. Agarose
adalah koloid alami yang diekstrak dari rumput laut. Agarose mudah pecah dan
rusak oleh tangan. Gel agarose memiliki pori berukuran besar dan kegunaan
utamanya untuk memisahkan molekul yang sangat besar dengan berat molekul
lebih dari 200 kilodalton. Gel agarose dapat diproses lebih cepat daripada gel
polyacrylamide, tetapi resolusinya tidak setajam gel polyacrylamide. Oleh sebab
itu band yang dihasilkan gel agarose berkabut dan menyebar agak jauh. Hal ini
merupakan akibat dari ukuran pori dan tidak dapat dikendalikan. Agarose
biasanya digunakan pada konsentrasi antara 1% dan 3%. Gel agarose dibentuk
dengan merendam agarose kering pada larutan buffer lalu mendidihkan hingga
terbentuk cairan jernih. Cairan itu akan menguap dan dingin pada suhu ruangan
sehingga menjadi kaku (Martin, 1996).

Pada percobaan elektroforesis, agar yang diapakai adalah agarosa. Hal ini
disebabkan karena agarosa memiliki banyak kelebihan seperti:
a. Dapat dijadikan sebagai metode standar untuk memisahkan, mengidentifikasi
dan memurnikan fragmen DNA atau RNA.
b. Gel agarosa memiliki resolusi yang lebih rendah daripada gel poliakrilamid,
akan tetapi gel ini dapat memisahkan DNA yang berukuran sampai puluhan
kilo pasang basa.
c. Elektroforesis gel agarosa dapat memisahkan fragmen DNA dan RNA yang
berukuran lebih besar dari 100 bp (base pair) hingga 50 kb dan memisahkan
protein dengan ukuran > 200 kDa dengan gerak medan yang digunakan adalah
secara horizontal.
d. Teknik yang digunakan sederhana.
e. Preparasi gel lebih cepat dilakukan karena pembuatan gel agarosa lebih mudah
dan bersifat non toksik.
f. Laju pemisahan lebih cepat sehingga fragmen DNA pun lebih cepat terbentuk,
dan dapat memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya.
g. Elektroforesis gel agarosa ini dapat dilakukan pada suhu kamar
(Sulaiman, 2007).

2.4 Fungsi Alat dan Bahan Elektrogenesis

Alat yang digunakan pada praktikum elektroforesis yaitu mikropipet, apparatus


elektroforesis, power supply, sumber sinar UV, glove, timbangan digital,
microwave, erlenmeyer, gel doc, parafilm, sisir elektroforesis, dan tangki
elektroforesis. Sedangkan bahan yang digunakan yaitu buffer elektroforesis,
Loading dye, etidium bromida, aquades, TAE, Etylen Diamine Tetra Asetic Acid,
bubuk gel agarose, running buffer, marker DNA.

2.4.1 Alat
1. Mikropipet berfungsi untuk memindahkan sampel dan larutan lainnya dari tube
ke dalam wells pada aparatus elektroforesis.
2. Aparatus elektroforesis terdiri atas comb (sisir) yang membentuk well (sumur)
pada gel agarosa, tray yang merupakan wadah cetakan gel, dan chamber yang
merupakan medium tempat berlangsungnya proses elektroforesis.
3. Power supply (DC) sebagai sumber energi untuk aparatus elektroforesis.
4. Sumber Sinar UV berfungsi untuk membantu mengamati hasil band yang
tampak sehingga terlihat lebih jelas.
5. Glove sebagai pelindung tangan agar bahan-bahan dan alat-alat yang
digunakan tidak mengalami kontaminasi.
6. Timbangan digital untuk mengukur bobot dari bahan yang akan digunakan.
7. Microwave digunakan untuk mengeraskan gel agarose.
8. Erlenmeyer berfungsi sebagai wadah atau penampung bahan seperti buffer.
9. Gel doc digunakan untuk mengamati dan mendokumentasikan hasil
elektroforesis.
10. Parafilm untuk tempat menghomogenkan sampel DNA dan loading dye.
11. Sisir elektroforesis untuk membuat sumuran pada gel agarosa.
12. Tangki elektroforesis untuk running DNA (Susanto, 2012).

2.4.2 Bahan
1. Buffer elektroforesis yang terdiri dari TAE memiliki daya ion dalam larutan
sebagai penghantar listrik.
2. Loading dye berfungsi sebagai pemberat agar tidak keluar dari sumuran.
3. Etidium bromida sebagai pewarna DNA yang akan menyisip di sela-sela basa
nukleotida.
4. Aquades sebagai pelarut.
5. TAE : Trisbase sebagai buffer sesuai dengan pH.
6. EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid) sebagai pe-non aktif DNA.
7. Bubuk gel agarose untuk membuat media.
8. Running buffer untuk mempermudah pengerasan gel saat dilakukan
pemanasan.
9. Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil
ampifikasi. Marker DNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis
berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang
bermigrasi. Marker-marker DNA tersebut merupakan marker yang telah dibuat
oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya jelas. Salah satu contoh marker
DNA adalah lambda HindIII.
10. Loading buffer memiliki fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan
membantu memonitor berapa lama proses elektroforesis telah berlangsung
karena memiliki pewarna bromofenol biru.
11. DNA hasil PCR berfungsi sebagai bahan yang akan dilihat mutu atau
kulitasnya.
12. Gel red sebagai pewarna yang akan menghasilkan warna terang apabila
terpapar sinar UV (Biosciences, 1999).

2.5 Cara Pembacaan DNA pada Elektrogenesis

Eletroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi DNA. Hasil


elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya fragmen DNA hasil amplifikasi
dan menunjukkan ptongan-potongan jumlah pasangan basa (Klug & Cummings,
1994). Dalam elektroforesis digunakan bahan-bahan seperti Etidium Bromide
yang digunakan dalam pembacaan DNA di bawah sinar UV. Hal tersebut karena
Etidium Bromide dapat meningkatkan fluoresensi dari DNA sehingga dapat
terlihat jelas. Selain itu juga pembacaan DNA pada elektroforesis dipengaruhi
oleh ukuran molekul DNA yakni semakin besar molekul DNA maka maka akan
lebih lambat pergerakannya sehingga pada saat pembacaan DNA, DNA yang
memiliki muatan kecil lebih jelas dibandingkan dengan muatan besar.
III. KESIMPULAN

Kesimpulan yang didapatkan adalah sebagai berikut:


1. Elektroforesis merupakan suatu teknik pemisahan molekul bermuatan melalui
medium larutan atau gel dalam pengaruh medan listrik.
2. Faktor-faktor yang mempengaruhi migrasi DNA yaitu ukuran molekul DNA,
konsentrasi gel, bentuk molekul, pori-pori gel, densitas muatan, voltase dan
larutan buffer elektroforesis.
3. Agarosa sebagai gel elektroforesis DNA karena laju pemisahan lebih cepat
sehingga fragmen DNA pun lebih cepat terbentuk.
4. Pembacaan DNA pada elektoforesis dilakukan dengan menggunakan pewarna
Etidhium Bromide di bawah sinar UV dan pembacaan dipengaruhi oleh besar
dan kecilnya molekul DNA.
DAFTAR PUSTAKA

Biosciences. 1999. Protein Electrophoresis. Amersham Biosciences. USA.

Dale, J. W. dan Von Schantz, M. 2002. From Genes to Genomes: Concepts


and Applications of DNA Technology. John Wiley and Sons, Inggris. 31-34.

Der, L. 2011. Automatic DNA Sequencing For Electrophoresis Gel Using Image
Processing Algorithms. J. Biomedical Science and Engineering. 4: 523-528.

Elrod, S. 2007. Genetika Edisi Keempat. Erlangga. Jakarta.

Fairbanks, D. J and Andersen. 1999. Genetics : The continuity of life. Brooks/Cole


Publishing Company, Pacific Grove: xii + 617 hlm.

Klug, W.S & M.R Cummings. 1994. Concepts of Genetics Edisi 4. Prentice Hall.
Englewood Cliffs.

Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: Nucleid Acids. Bios scientific Publisher.


Oxford.

Sulaiman, Adang Hardi G, Noor Anis Kundari. 2007. Pemisahan dan


Karakterisasi Spesi Senyawa Kompleks YTRIUM-90 DAN STRONSIUM-90
dengan elektroforesis kertas. JFN, Vol.1 No.2. Pusat Radioisotop dan
Radiofarmaka BATAN.

Susanto, A.H. 2012. Bahan Ajar Biologi Molekuler. Fakultas Biologi Unsoed.
Purwokerto.

Wolfe,S.L. 1995. Introduction to Cell and Molecular Biology. Wardworth


Publishing Company. Belmont.