MAKALAH VALIDASI DAN PENGEMBANGAN METODE ANALISIS

Development and Validation of a Stability Indicating Method for

Quantification of the Sesquiterpene Lactone Eremantholide C from
Lychnophora trichocarpha (Brazilian arnica)

Disusun Oleh:

Dona Indriastuti (10060314132)

Isman Maulia Reza A. (10060314140)

Reza Nurwahyuni (10060314143)

Humairani Rahman (10060314146)

Lia Ajizah (10060314149)

Wulan Apriani (10060314150)

Helmi Chaerul F (10060314152)

Sufini Miranti (10060314153)

Atika Zulfa Karimah (10060314162)

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS ISLAM BANDUNG

2017 M / 1439 H
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar belakang

HPLC adalah teknik pemisahan fisik yang dilakukan dalam fase cair dimana
sampel dipisahkan menjadi komponen penyusunnya (atau analit) dengan
mendistribusikan antara fase gerak (cairan yang mengalir) dan fase diam (sorben
yang dikemas dalam kolom). Detektor memonitor konsentrasi masing-masing
komponen yang terpisah dalam kolom dan menghasilkan kromatogram. HPLC
adalah teknik analisis yang paling banyak digunakan untuk analisis kuantitatif obat-
obatan, biomolekul, polimer, dan senyawa organik lainnya. Di bawah fasa bergerak
bertekanan tinggi dipompa ke kolom yang mengandung fase diam. Teknik ini
dikembangkan berdasarkan ukuran partikel kecil dari fase diam di kolom yang
membutuhkan tekanan tinggi untuk aliran mudah fase bergerak tanpa hambatan.
Asal spesies Lychnophora ("arnica Brasil", Aster-aceae), semak asli
"cerrado" dari Brasil, biasanya digunakan dalam pengobatan tradisional, di
maserasi dengan alkohol, sifat anti-inflamasi, analgesik dan anti-rematiknya.
Penelitian sebelumnya telah menunjukkan anti-inflamasi, anti-hiperurikemia,
artritis anti-gout, antitumor dan aktivitas try-panocidal untuk Sprecnophora
trichocarpha (Spreng.) Spreng. ex Sch.Bip. ekstrak etanol. Sesquiterpene lactone
eremantholide C adalah salah satu zat kimia aktif yang ada pada spesies ini yang
bertanggung jawab atas ekspresi aktivitas ini.

Eremantholide C menunjukkan pengurangan yang signifikan terhadap

edema yang diinduksi pada karagenan tikus. Mekanisme yaitu berkurangnnya dema
yang diinduksi karagenan penghambatan produksi TNF- dan stimulasi produksi IL-
10. Aktivitas anti hyperuricemia untuk pengobatan gout artritis, ditunjukkan dengan
hiperurisemia yang disebabkan oleh kalium oksonat pada tikus.
Studi stabilitas menunjukkan kemampuan zat aktif atau obat untuk tetap
berada dalam spesifikasi yang ditetapkan dengan menjaga sifat fisikokimia, potensi,
kemurnian dan kualitasnya selama periode yang telah ditentukan yang berlawanan
dengan kondisi lingkungan.
Saat ini, penggunaan ekstrak sebagai obat alami telah umum dan populer.
Namun, selama pembuatan dan proses ekstraksi bahan alam, pada banyak kasus,
senyawa aktif yang bertanggung jawab atas ekspresi aktivitas farmakologis terpapar
oksidasi, hidrolisis, serangan mikroba atau degradasi lingkungan lainnya, yang
merupakan masalah stabilitas untuk produk (Henriques et al., 2017).
Dengan demikian, tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan
dan memvalidasi eremntholide C dengan metode HPLC. Dan selain itu, untuk
mengevaluasi stabilitas ekstrak etanol Lychnophora trichocarpha dan pemurnian
eremantholide C, menganalisis kesesuaian penggunaan ekstrak sebagai fitoterapi
dan eremantholide C sebagai obat potensial.
 BAB II

PEMBAHASAN

2.1 HPLC (High Preformance Liquid Chromatography)

HPLC adalah teknik pemisahan fisik yang dilakukan dalam fase cair dimana
sampel dipisahkan menjadi komponen penyusunnya (atau analit) dengan
mendistribusikan antara fase gerak (cairan yang mengalir) dan fase diam (sorben
yang dikemas dalam kolom). Detektor memonitor konsentrasi masing-masing
komponen yang terpisah dalam kolom dan menghasilkan kromatogram. HPLC
adalah teknik analisis yang paling banyak digunakan untuk analisis kuantitatif obat-
obatan, biomolekul, polimer, dan senyawa organik lainnya. Di bawah fasa bergerak
bertekanan tinggi dipompa ke kolom yang mengandung fase diam berpori. Teknik
ini dikembangkan berdasarkan ukuran partikel kecil dari fase diam kolom yang
membutuhkan tekanan tinggi untuk aliran fase gerak tanpa hambatan (Putra, 2004
: 1).
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia.
KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan
fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika
dibandingkan dengan metode lainnya (Skoog, 2004: 973-977). Kelebihan metode
ini mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran, mudah, kecepatan
analisis dan kepekaan yang tinggi, dapat dihindari terjadinya dekomposisi /
kerusakan bahan yang dianalisis, Resolusi yang baik, dapat digunakan bermacam-
macam detektor, kolom dapat digunakan kembali, mudah melakukan "sample
recovery" (Putra, 2004 : 1-2).
 Komponen-komponen penting dari KCKT dapat dilihat pada Gambar
KCKT berikut ini

Pompa (Pump) Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak
melalui kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan
(constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan
konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe.
Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur
(pulsating),oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik
untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor
sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak
terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi
reservoirnya terbatas (Putra, 2004 : 5).
Kolom (Column), Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau
gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan
yang sesuai. (David Harvey, 2000: 578-585).
Detektor (Detector) . Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya
komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya
(analisis kuantitatif).Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan
(noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk
semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi
temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh. (Putra, 2004 : 6).
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi
cair klasik, antara lain:
- Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari1 jam. Banyak analisis
yang dapat diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak
rumit (uncomplicated), waktu analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai.
- Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa
dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir
sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai
hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara
selektif dengan fasa diam dan fasa gerak pada KCKT memberikan
parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.
- Sensitivitas detektor: Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan
dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9
gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan
Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram(10-12 gram).
Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi,
Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT.
- Kolom yang dapat digunakan kembali: Berbeda dengan kolom
kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable)
. Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sma sebelum
darijenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven
yang digunakan Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik :zat zat
yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah ,
biasanya diderivatisasi untuk menganalisi spsesies ionik. KCKT dengan
tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat zat
tersebut.
- Mudah rekoveri sampel: Umumnya setektor yang digunakan dalam
KCKT tidak menyebabkan destruktif(kerusakan) pada komponen
sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat
 dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detector.Solvennya dapat
dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi
penukarion memerlukan prosedur khusus.
(Putra, 2004: 8)

2.2 Lychnophora trichocarpha

Kingdom: Plantae

Orde : Asterales

Family : Asteraceae

Tribe : Vernonieae

Genus : Lychnophora Mart

Spesies : Lychnophora trichocarpha

Ekstrak etanol Lychnophora trichocarpha mengandung Eremantholide C.

Eremantholide C adalah sesquiterpene lactone dan salah satu unsur kimia aktif yang
bertanggung jawab atas aktivitas yang diberikan oleh L.trichocarpha.
Eremantholide C menunjukkan pengurangan yang signifikan terhadap edema yang
disebabkan karagenan pada pangkal kaki tikus. Mekanisme efek pada pengurangan
edema yang disebabkan karaginan dapat dikaitkan dengan penghambatan produksi
TNF- dan stimulasi produksi IL-10 (Ferrari et al., 2013).

(Struktur Eremantholide C)
2.3 Eksperimental Bahan
2.3.1 Penyiapan bahan
L. trichocarpha dikumpulkan pada bulan Juli, 2007, di Ouro Preto, Minas
Gerais, Brasil. Spesies tanaman dikumpulkan dengan izin Instituto Brasileiro do
Meio Ambient Recambos Naturais Renovveis (IBAMA - nomor lisensi 009 /
2006). L. trichocarpha (245 g) dikeringkan dengan udara pada suhu 37 C, digiling
dan diekstraksi dengan etanol 95%, dengan perforasi. Pelarut dihilangkan di bawah
tekanan dan suhu di bawah 40 C untuk mendapatkan ekstrak etanol kasar (31,2
g).

2.3.2 Isolasi Eremantholide C

Eremantholide C diperoleh dengan fraksi kromatografi sesuai dengan
metodologi yang dijelaskan oleh Sade-Guimares et al. (2014). Eremantholide C
diidentifikasi dengan analisis spektrometer inframerah, resonansi magnetik nuklir,
titik lebur dan rotasi optik. Lalu dilakukan uji kemurnian dengan HPLC yang
hasilnya menunjukan kemurnian Eremantholide C adalah 97,4% seperti yang
ditentukan oleh analisis HPLC.
Eremantholide C (1): 6,9-epoxi-2H-1,4-dioxaciclodeca [c, d] pentaleno-2,7
(4aH) -dioxano, 2a, 3,5,6,11a, 11b-hexaidro-3 - hidroxi-2a, 6,10-trimetil-3- (1 '-
metiletenil) -2aR *, 3S *, 4aR *, 6S *, 10Z, 11aS *, 11bS *. Padat tak berwarna,
titik lebur: 213.6C sampai 215.0C, [] D 25 = -10.0 (c 0,01 g / ml, metanol). IR
(KBr) vmaks (cm-1): 3450 (OH), 2900 (CH), 1770 (CO de -lactone), 1700 (CO
dengan keton terkonjugasi), 1660 (CC), 1590 (CC oleh sistem C COR furanone ),
1450, 1370, 1350, 1320, 1270, 1220, 1200, 1150, 1100, 1060, 1040, 1000, 960, 920,
810, 730 (CC). 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): 5,63 (s, H-2); 6.04-6.03 (m, H-5);
5.02-4,98 (m, H-6); 2,82 (dd, J = 4,3; 7.1 Hz, H-7); 4,09 (ddd, J = 2.5; 4.2; 12 Hz,
H-8); 2,48 (dd, J = 2,5; 13,5 Hz, H-9a); 2.00 (dd, J = 12,0; 13,5 Hz, H-9b); 1,18 (s,
H-13); 1,45 (s, H-14); 2,05 (t, J = 1,9 Hz, H-15); 5.31 (sl, H-2 'a); 5.07 (t, J = 1,6
Hz); 1,91 (s, H-3 '); 3,79 (s, OH). 13 C NMR (CDCl3, 75 MHz): 205.89 (C-1);
104,54 (C-2); 187.27 (C-3); 130.00 (C-4); 134.77 (C-5); 81.46 (C-6); 62,53 (C-7);
78.37 (C-8); 43.46 (C-9); 90,24 (C-10); 59.88 (C-11); 175,72 (C-12); 21,94 (C-13);
20.48 (C-14); 20.30 (C-15); 106,09 (C-16); 142,22 (C-1 '); 115.80 (C-2 '); 19.00
(C-3 ').

2.4 Eksperimental Pengembangan

2.4.1 Pengembangan Metode
Digunakan dua kolom octadecylsilane dengan ukuran partikel yang
berbeda, kolom yang digunakan yaitu Waters Spherisorb (150 mm 4,6 mm, 5
m) (kolom 1) dan Waters Atlantis T3 (150 mm 4,6 mm, 3 m) (kolom 2), kedua
komponen C18Phenomenex digunakan.
Campuran fase gerak yang pertama yang mengandung metanol pro HPLC
grade / ultra-pure water yang diperoleh dengan sistem Direct Q dari Millipore dan
yang kedua acetonitrile pro HPLC grade / ultra-pure water yang diperoleh dengan
sistem Direct Q dari Millipore, menggunakan sistem elusi isokratik. Untuk
menentukan kondisi laju alir yang baik digunakan beberapa variasi yaitu 0,5, 0,8,
1,0 dan 1,2 ml /menit, dan suhu kolom yang dievaluasi berada pada 30 dan 350 C.
Detektor yang digunakan yaitu Photo Dioda Array (PDA). Ditentukan
terlebih dahulu panjang gelombang maksimum 200 dan 400 nm untuk panjang
gelombang Eremantholide C. hasilnya Eremantholide C menyerap maksimal pada
265nm. Karena itu, analit dievaluasi pada panjang gelombang 265nm menggunakan
detektor PDA.

2.4.2 Metode Validasi

Metode validasi dilakukan menurut rekomendasi ICH (ICH, 1995). Standar
analisis kumarin digunakan dengan kandungan 99%. Standar internal berada
dalam konsentrasi konstan 100 g / ml, disiapkan dengan menggunakan larutan stok
yang mengandung 1000 g / ml metanol dan kemudian diencerkan dalam larutan
kerja dalam metanol.

2.4.3 Penyiapan Larutan Standar

Sampel ekstrak disiapkan dengan cara dilarutkan dalam metanol dengan
HPLC untuk mendapatkan konsentrasi akhir 2000 g / ml. Larutan standar Ereman-
tholide C dan coumarin (IS) yang telah dilarutkan dalam metanol diuji dengan
menggunakan HPLC konsentrasi akhir 200 dan 1000 g / ml

2.4.4 Linearitas
Linearitas dievaluasi oleh tiga kurva analitik dengan menggunakan delapan
konsentrasi berbeda untuk eremantholide C: 2, 4, 5, 20, 60, 100, 140 dan 180 g /
ml.

2.4.5 Presisi dan akurasi

Akurasi dan presisi ditentukan dengan menganalisis tiga kali larutan standar
Eremantholide C 5,60 g/mL dan 140 g/mL. Hasilnya dinyatakan dalam bentuk
persentase Relative Standard Deviation (% RSD). Keakuratannya dievaluasi
dengan menggunakan konsentrasi yang sama seperti di atas, namun hasilnya
dinyatakan dalam persentase relatif terhadap Nilai Teoritis (% TV)

2.4.6 Analisis Recovery

Analisis recovery dianalisis dengan penambahan larutan standar
Eremantholide C 2 g/mL, 5 g/mL, 10 g/mL dan 15 g/mL dalam larutan ekstrak 1000
g/mL. Hasil konsentrasi Eremantholide C yang diperoleh dihitung setelah
dilakukan ekstraksi. Lalu ekstrak tanpa penambahan standar dibandingkan dengan
ekstrak setelah penambahan standar

2.4.7 Spesifisitas
Spesifisitas dievaluasi dengan metode penambahan standar. Ekstrak 1000
g/mL tanpa penambahan standar dan setelah menambahkan larutan standar
Eremantholide C 2 g/mL, 5 g/mL, 10 g/mL dan 15 g/mL dan IS pada 100 g/mL
dianalisis. Selain itu, dilakukan konfirmasi metode spesifisitas dengan menganalisis
kemurnian puncak.

2.4.8 Batas Deteksi dan Kuantifikasi

Batas deteksi (LOD) dan kuantifikasi (LOQ) dihitung dari kemiringan kurva
linieritas dan Standar Deviasi (SD) antara intersepsi sumbu Y dari tiga kurva
linieritas.
2.4.9 Pengujian Stabilitas

Ekstrak etanol Lychnophora trichocarpha dan stabilitas Eremantholide C

dievaluasi selama waktu penyimpanan, dengan fotostabilitas pada tingkat yang

berbeda. Parameter yang digunakan untuk mengevaluasi sampel pada akhir uji

stabilitas adalah kandungan Eremantholide C.

2.4.10 Pengujian Stabilitas Jangka Panjang, Dipercepat dan Suhu rendah

Ekstrak etanol Lychnophora trichocarpha dan Eremantholide C disimpan

pada vial yang berbeda dan dilakukan uji stabilitas jangka panjang, dipercepat

(40C) dan suhu rendah (8C). Pengujian ini dilakukan selama enam bulan, ekstrak

sampel dan zat terisolasi dikumpulkan pada akhir bulan: 1, 2, 3, 4,5 dan 6. Suhu

yang akan digunakan pada masing-masing uji stabilitas dan waktu untuk melakukan

analisis sampel didasarkan pada rekomendasi panduan Anvisa untuk uji kestabilan

obat-obatan (Anvisa, 2005). Selama perlakuan uji stabilitas, kondisi dan jumlah

sampel dihitung untuk melakukan setiap penelitian. Alikuot ditarik pada setiap

selang waktu dan ditempatkan dalam botol kaca secara terpisah lalu dianalisis.

Karena karakteristik zat alami variatif, aliquot mungkin sudah ada satu sama lain.

Dalam percobaan variasi kurang dari 3%. Terjadinya pembusukan pada nilai yang

sama atau lebih rendah dari variasi tidak dapat secara langsung dikaitkan dengan

ketidakstabilan ekstrak. Ekstrak sidik jari dan jumlah dari kandungan

Eremantholide dievaluasi jika terjadi penurunan zat aktif secara biologis serta jika

terjadi munculnya puncak sekunder, yang menunjukkan adanya produk degradasi.

2.4.11 Kondisi yang Digunakan dalam Uji Degradasi Eremantholide C

Degradasi Kondisi percobaan

Asam 1 mL larutan Eremantholide C 1000 g/mL + 1 mL larutan HCl

1 M. Larutan yang dihasilkan disimpan pada suhu kamar dan

terlindungi dari cahaya selama 3 hari. Ditambahkan 1 mL

larutan NaOH 1 M dan dan ditambahkan metanol sampai

volumenya 5 ml untuk menghasilkan konsentrasi akhir

Eremantholide C pada 200 g/mL.

Alkaline 1 mL larutan Eremantholide C 1000 g/mL + 1 mL larutan

NaOH 1 M. Larutan yang dihasilkan disimpan pada suhu

kamar dan terlindungi dari cahaya selama 3 hari.Setelah

ditambahkan 1 mL larutan HCl 1 M ditambahkan metaol

sampai volumenya 5 mL untuk menghasilkan konsentrasi

akhir Eremantholide C pada 200 g/mL.

Netral 1 mL larutan Eremantholide C 1000 g/mL + 1 mL air ultra

murni tambahkan metanol sampai volumenya 5 ml untuk

menghasilkan konsentrasi akhir Eremantholide C pada 200

g/mL. Larutan yang dihasilkan disimpan pada suhu kamar dan

terlindungi dari cahaya selama 3 hari.

oksidatif 1 mL larutan Eremantholide C 1000 g/ml + 1 mL H2O2 10%.

Ditambah methanol sampai volumenya 5 mL. arutan yang

dihasilkan disimpan pada suhu kamar dan terlindungi dari

cahaya selama 3 hari.

Perbandingan dilakukan dengan menghitung Eremantholide C dalam sampel dan

ekstrak puri-fied.

2.4.12 Pengujian fotostabilitas

Ekstrak etanol Lychnophora trichocarpha dan sampel Eremantholide C

disimpan dalam botol tertutup yang berbeda dibagi menjadi dua kelompok: botol

tak berwarna, yang terkena radiasi cahaya, dan botol kuning yang terlindungi dari

radiasi cahaya. Kemudian, sampel ditempatkan di ruang gelap dengan lampu

fluoresen selama sepuluh hari.

Pada akhir periode paparan, ekstrak sidik jari disisipi kandungan zat warna

Eremantholide C yang diuji kemudian dianalisis. Kandungan sampel dibandingkan

dengan kondisi dari sampel yang tidak terkena radiasi cahaya.

2.4.13 Pengujian Degradasi Ketahanan Eremantholide C

Larutan Eremantholide C 1000 g/mL didegradasi dengan asam, basa, netral

dan oksidatif sesuai dengan prosedur. Setelah terpapar, sampel dievaluasi

dabdibandingkan dengan Eremantholide C 200 g/mL yang digunakan sebagai

kontrol. Selanjutnya, vial tertutup yang mengandung Eremantholide C disimpan

pada 90 C selama tiga hari. Setelah itu zat biologis aktif dilarutkan dalam metanol

menghasilkan larutan 200 g/mL, yang diambil untuk kuantifikasi. Hasil yang

diperoleh dibandingkan dengan satu larutan kontrol Eremantholide C.

2.5 Hasil dan Pembahasan

2.5.1 Pengembangan Metode

Kondisi terbaik untuk metode analisis ini menggunakan kolom kedua yaitu

Waters Atlantis T3 (150 mm 4,6 mm, 3 m), fasa geraknya Asetonitril dan air

pada elusi gradien, laju alir fase gerak 0,8 mL/menit dan suhu kolom 30 C. Gradien

fase yang paling sesuai dimulai dengan Asetonitril 10% selama 5 menit, Asetonitril

30% selama 10 menit, Asetonitril 50% selama 15 menit, Asetonitril 60% selama 20

menit, Asetonitril 65% selama 23 menit, Asetonitril 90% selama 30 menit, dan

Asetinitril 10% selama 35 menit. Waktu retensi yang diperoleh dengan metode ini

adalah 12,3 menit untuk kumarin, dan 17,1 menit untuk Eremantholide C, dan

matrik kromatogram yang diperoleh ditunjukkan pada gambar 1.

Kolom 2 menunjukan hasil yang baik, pemisahan resolusi pada puncak.

Kedua kolom memiliki fase gerak yang sama yaitu oktadesil silane tetapi pada fase

diam yang menggunakan ukuran partikel kecil menunjukkan hasil pemisahan yang

lebih baik pada analit. Kolom HPLC Atlantis T3 diikat dengan pengendalian

reaksi trifungsional C18 silane yang disiapkan dengan kondisi yang sesuai

menggunakan partikel silica yang dibuat dengan teknologi novel end capping.

Kolom Atlantis T3 merupakan sorben baru, dengan bobot ligan (1,6 mol / m2).

Telah memberikan kinerja, fleksibilitas, dan retensi yang baik untuk senyawa polar,

juga mampu mempertahankan retensi untuk campuran kompleks seperti ekstrak L.

trichocarphaethanolic. Penelitian terbaru menghasilkan peningkatan retensi,

selektivitas, bentuk puncak, dan stabilitas melalui sintesis substrat, menyerupai

morfologi partikel, dan modifikasi permukaan (Gilar et al., 2005; Mac Donalds et

al., 2007)

Hal ini juga memungkinkan untuk memperoleh profil kromatografi yang

sesuai, dengan resolusi yang lebih baik (resolusi kumarin eremantholide C adalah

resolusi puncak implisit C 18 dan eremantholide C adalah 2,6) dan waktu

pemisahan analisis yang singkat yaitu 35 menit. Analit ini cukup memadai untuk

kuantifikasi dari isolat Eremantholide C dan ekstrak tanaman, dimana memberikan

resolusi yang memadai antara sinyal analit dan sinyal yang berdekatan .

Berdasarkan acuan dari Santos et al. (2003) Sosos et al. (2003) diperoleh

suatu metode dengan waktu analisis 40 menit, namun menggunakan campuran

standar furanoheliangolides yang dikelompokkan dari matriks vegetal. Menurut

persamaan resapan master, parameter Rs = Resolution; n = jumlah ofdishes

(efisiensi); = faktor pemisahan (k2 / k1); k = faktor retensi dihitung dengan tujuan

untuk menunjukan perubahan pada k yang menyebabkan perubahan pada n

sehingga meningkatkan Rs analit (Cassand Cassiano, 2015). Jumlah teoritis yang

diperoleh dalam kondisi yang baik, dihitung dari analisis eremantholide C, yaitu

396.906 N / meter.
 Gambar 1 Ekstrak etanol Lychnophora trichocarpha 500 g / ml (A); ekstrak etanol
Lychnophora trichocarpha 500 g / ml + koumarin 100 g / ml (B); dan eremantholide C 180
g / ml + coumarin 100 g / ml (C).

Fase gerak metanol menunjukkan resolusi dan pemisahan yang lebih baik
antara kedua puncak eremantholide C, kumarin dan zat yang mengganggu. Tailing
Factor dihitung dengan membagi lebar puncak pada 5% tinggi dengan dua kali nilai
bagian anterior puncak, relatif dengan lebar 5% dari tinggi untuk sinyal relatif
terhadap eremantholide C sama dengan 1. Hasil ini menunjukkan bahwa kondisi
percobaan yang dibolehkan untuk meminimalkan pengotor kromatografi sinyal
(Snyder et al., 1997). Dengan demikian, elusi gradien didefinisikan, dengan aliran
rendah (0,8 ml / menit) dan suhu 300C. Aliran fase gerak diubah dengan melihat
atau memantau tekanan sistem.
Keberadaan cincin lakton -- 6- tidak jenuh penanda dalam struktur kimia
kumarin dan 5 sesquiterpene lactones gugus kromofor, memungkinkan penyerapan
maksimum pada panjang gelombang yang sama. Detektor PDA digunakan karena
kemampuannya untuk mengevaluasi perbedaan panjang gelombang secara
berkesinambungan. Hal ini penting dalam uji stabilitas untuk memantau puncak
yang bisa dihubungkan dengan hasil penguraian.
Detektor PDA memverifikasi kemurnian kromatografi puncak dan
pengembangan metode yang mampu mendeteksi eremantholide C tanpa gangguan
dari zat lain. Dengan demikian, detektor ini menyediakan lebih banyak parameter
untuk memantau stabilitas ekstrak.

2.5.2 Metode Validasi

Hasil metode validasi terhadap jumlah eremantholide C linier berkisar 2-

180 g / ml, dengan batas masing-masing dari deteksi dan kuantifikasi sebesar 0,76

dan 2,54 g / ml. Metode ini tepat karena menunjukkan nilai % RSD kurang dari 5%,

dan akurat dengan% nilai TV antara 98,0 dan 102,0%.

Perolehan kembali dari eremantholide C memnuhi syarat dibuktikan

dengan nilai konstanta yang diperoleh dengan jumlah yang ditambahkan, pada

rentang antara 95,0 dan 105,0%. Hasilnya ditunjukkan pada Tabel 2.5.2.

Spesifisitas metode dikonfirmasi dengan metode penambahan standar, dan

penyimpangan yang diperoleh kurang dari 5% eremantholide C . Pada Gambar

2.5.2 menunjukkan puncak kemurnian yang diperoleh eremantholide C pada 180 g

/ ml. Sudut kemurnian (0.126) dalam warna hijau lebih rendah dari ambang batas

kemurnian (0,789), berwarna biru, yang menunjukkan ketepatan dari metode ini.

Tabel 1 Hasil validasi terhadap metode kuantifikasi eremantholide C dengan

adanya IS,menunjukkan koefisien korelasi (R) yang diperoleh terhadap linieritas,
penyimpangan dan Standar Deviasi Relatif (% RSD) presisi, akurasi, pemulihan
dan spesifisitas.

Gambar 2 puncak kemiringan eremantholide C di 180 g / ml

2.5.3 Pengujian Stabilitas
Ekstrak etanol Lychnophora trichocarpha dan eremantholide C yang

terpapar selama enam bulan pada suhu kamar, 400C dan 80C. Pada Gambar 3,

kromatogram berhimpit terhadap kromatogram ekstrak yang dilakukan pada awal

uji stabilitas dan setelah enam bulan memungkinkan pembusukan dengan waktu

retensi kira-kira 17 menit dan meningkat relatif terhadap sinyal kromatografi

lainnya yang bisa dihasilkan dalam waktu kira-kira 6,5 dan 20,5 menit. Sinyal

kromatografi yang lain muncul, bagaimanapun, dengan intensitas yang kurang dan

pada waktu yang sesuai dengan waktu retensi yang berbeda dari yang diamati untuk

eremantholide C.

Gambar 3, kromatogram berhimpit ekstrak etanol dari Lychnophora trichocarpha

diperoleh dari sampel dalam uji stabilitas jangka panjang dengan waktu penyimpanan 6
jam (berwarna biru) dalam kaitannya dengan waktu nol (dalam warna hitam) pada
konsentrasi 500 g / ml.

Penurunan maksimum kandungan eremantholide C pada ekstrak adalah

10% dan hasil yang diperoleh dijelaskan pada Tabel 2. Meskipun pada Gambar 4
pergerakan grafik untuk percepatan stabilitas dilakukan dengan sampel ekstrak
menunjukkan peluruhan sinyal kromatografi relatif terhadap analit, ini tidak
melebihi 10% dari konsentrasi awal. Puncak degradasi produk yang mengganggu
kadar eremantholid C atau residu yang terdapat pada intensitas tinggi tidak dapat
diamati. Untuk eremantholide C, zat yang dimurnikan, penguraian maksimum
adalah 5%. Hasilnya tercantum dalam Tabel 3. Masa pakai obat adalah saat
konsentrasi zat aktif bioaktif secara logis menghasilkan penguraian maksimum
sampai 5% bila studi stabilitas digunakan. Namun, dalam kasus tanaman dan
turunannya, di mana konstituen dengan aktivitas terapeutik masih belum diketahui,
variasi kandungan selama masa menyimpan yang tidak boleh melebihi 10% dari
nilai awal (Bilia et al., 2001).

Untuk uji yang dilakukan, ekstrak L. trichocarpha dan eremantholide C

tetap stabil selama enam bulan saat disimpan di ruangan pada botol gelas kedap air,
oleh karena itu dapat digunakan dengan aman dan efektif dalam jangka waktu
tersebut. Uji stabilitas yang dipercepat membantu memperkirakan masa simpan,
sejak degradasi zat terjadi dengan kecepatan yang lebih tinggi pada suhu yang
mendukung reaksi kimia. Di bawah 40C, konsentrasi eremantholide C dalam
etanolicextract turun 12,94%, sedangkan pada bentuk terisolasi, ia menurun 9,51%.
Oleh karena itu, stabilitas diamati pada 4,5 bulan untuk ekstrak dan 3 bulan untuk
eremantholide C dalam bentuk terisolasi. Penurunan konsentrasi C eremantholide
lebih tinggi pada ekstrak dibandingkan dengan bentuknya yang terisolasi. pada suhu
tinggi, reaksi kimia antara berbagai zat yang membentuk ekstrak mendukung
karena adanya hilangnya ikatan dan pembentukan intermolekuler baru (Ev, 2001)
Uji stabilitas pada suhu rendah, mengurangi pengraian zat aktif secara
biologis. Hal ini ditentukan dengan ekstrak etanol dan eremantholide C pada suhu
8 C, menghasilkan penurunan 7,55% dan 2,52% konsentrasi eremantholide C
dalam ekstrak dan bentuk yang terisolasi. Oleh karena itu, dalam kondisi ini, waktu
stabilitas atau waktu penggunaan aman dan efektif. dari ekstrak atau isolat bisa
menjadi lebih baik. Menurut uji fotostabilitas, kandungan rata-rata eremantholide
C dalam ekstrak pada sampel yang dilindungi dari cahaya adalah 28,91 g / mg,
sedangkan kandungan rata-rata sampel yang tidak terpapar cahaya adalah 27,88 g /
mg. Dengan demikian, ekstrak tersebut menghasilkan penurunan 3,55% ketika
terpapar cahaya pada konsentrat eremantholide C. Untuk isolat eremantholide C
yang terisolasi, kandungan rata-rata sampel yang terlindungi dari cahaya adalah
72,59 g / mg, sedangkan kandungan rata-rata sampel yang terpapar Cahaya 69,30 g
/ mg, menghasilkan penurunan 4,53% dalam konsentrasi zat kimia eremantholide
C. Fotolisis merupakan penyebab utama terjadinya degradasi zat bioaktif.
Gambar 4. Sidik jari ekstrak etanol oral Lychnophora trichocarpha diperoleh dari
sampel uji stabilitas dipercepat 500 g / ml dengan menggunakan kondisi metode
yang divalidasi.

2.5.4 Pengujian Degradasi Ketahanan Eremantholide C

Penurunan konsentrasi Eremantholide C dihitung dari perbandingan antara
sampel yang digunakan pada kondisi degradasi dan kontrol. eremantholide C
mengalami degradasi di bawah kondisi asam dan basa terdegradasi secara
sempurna, sementara pada kondisi oksidatif terjadi penurunan dibawah 0,35%.
Eremantholide C di bawah kondisi asam dan basa seluruhnya mengalami
penurunan, sementara kondisi oksidatif mengalami penurunan sekitar 0,35%,
konsentrasi eremantholide C berdasarkan uji degradasi ketahanan adalah 81,43 g /
ml dan 81,72 g / ml untuk kontrol.

Tabel 2
Jumlah eremantholide C dalam ekstrak etanol Lychnophora trichocarpha
dalam jangka panjang, dipercepat dan stabilitas suhu rendah setelah penyimpanan
dalam waktu yang berbeda dan penyimpangan yang berkaitan dengan konsentrasi
sampel yang baru disiapkan.
Tabel 3
Jumlah dari isolat eremantholide C dalam stabilitas suhu rendah, jangka
panjang, dan dipercepat setelah penyimpan dalam waktu yang berbeda dan
penyimpangan yang berkaitan dengan konsentrasi sampel yang baru disiapkan.

Uji degradasi ketahanan isolat bertujuan untuk menentukan kondisi yang

memiliki dampak signifikan terhadap stabilitas, yang memberikan pengembangan
formulasi untuk melindungi dari kondisi degradasi.
Hasilnya menunjukkan ketidakstabilan dari eremantholide C hanya pada
media asam dan basa setelah netralisasi sampel, menunjukkan bahwa reaksi
degradasi yang terjadi tidak dapat diubah. Degradasi eremantholide C dalam
medium alkali terjadi karena pda kondisi ini disebabkan karena pembukaan cincin
lakton.
Dengan mengetahui sifat produk berdasarkan perbedaan kondisi, seseorang
dapat memilih komponen yang paling sesuai untuk mempersiapkan formulasi yang
dapat memperlambat proses degradasi. Ketidakstabilan Eremantholide C dalam
media asam dan basa menunjukkan bahwa formulasi yang akan dibuat dari ekstrak
atau isolat harus memiliki pH yang mendekati netral. Bida disimpulkan bahwa tidak
ada batasan mengenai proses penanganan yang mengakibatkan pengumpulan udara
dalam produk atau diperlukannya penggunaan panas.
Informasi ini dapat menunujkan bahwa produk yang dapat
mempertahankan komponen aktif biologis dari kualitas, keamanan dan efektif dapat
dikembangkan.
 KESIMPULAN

Hasil validasi menunjukan bahwa metode ini linear pada konsentrasi

berkisar 2-180 gram/mL tepat, akurat dan spesifik. pengujian Stabilitas menunjukan
bahwa . trichopha ekstrak etanol dan Eremantoid C tetap stabil selama 6 bulan bila
disimpan pada suhu kamar dan dalam botol kaca.
Uji stabilitas menunjukan bahwa Eremantoid C akan terdegradasi dalam
keadaan asam dan basa dan akan stabil selama 3 hari pada kondisi netral oksidatif
dan suhu yang tinggi.
Hasil dapat dijadikan acuan untuk produk baru yangsecara memadai
menjaga fitur asli zat aktif biologis dengan kualitas, keamanan dan efisiensi.
 DAFTAR PUSTAKA

David, Haervey. (2000). Modern Analytical Chemistry. New York: McGraw-Hill.

Henriques O. Barbara et al. 2017. Development and Validation of a Stability

Indicating Method for Quantification ff the Sesquiterpene Lactone
Eremantholide C from Lychnophora Trichocarpha (Brazilian arnica).
Brazilian Journal of Pharmacognosy : Elsevier

Putra Effendi. 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dalam Bidang Farmasi.
Universitas Sumatra Utara : Fakultas MIPA jurusan Farmasi.

Skoog, dkk. (2004). Fundamentals of Analytical Chemistry. USA: Thomson

Brooks/Cole.