Anda di halaman 1dari 14

Situs-Directed Mutagenesis dari rekombinan Tikus DNA Polymerase p: Keterlibatan

dari Arginine-183 dalam Primer Recognition +


Takayasu Date, $ Setsuko Yamamoto, J Kiyomi Tanihara, t Yoshio Nishimoto, s Nan Liu, s dan Akio
Matsukage * + l
Departemen Biokimia, Kanazawa Medical University, Uchinada. Ishikawa 920-02, Jepang, dan
Laboratorium Sel Biologi, Prefektur Cancer Center Research Institute, Chikusa- ku, Nagoya 464, Jepang
Menerima 12 Oktober 1989; Revisi Naskah diterima tanggal 18 Januari I990
ABSTRAK: Dengan situs-diarahkan mutagenesis menggunakan oligonukleotida sintetik, residu asam amino 18'Phe-
A rg - A ~ - g '~ ~
DNA polimerase rekombinan @ digantikan oleh asam amino lain untuk memperjelas perannya
residu ini dalam reaksi DNA sintesis. Penggantian Phe-18 1 oleh alanin mengurangi enzim
aktivitas hanya 30%. Penggantian Arg-182 oleh alanin dan glutamin mengakibatkan pengurangan aktivitas

sekitar 67% dan 95%, masing-masing. The Arg-182 - Gln pengganti meningkatkan kekuatan mengikat
untai tunggal DNA tetapi tidak secara signifikan mengubah K, 's untuk primer dan dTTP, menunjukkan bahwa
Arg-182 terlibat dalam modulasi mengikat template daripada primer atau deoxyribonucleoside
trifosfat Penggantian Arg-183 oleh Gln mengakibatkan berkurangnya aktivitas sekitar 9596, dan ini
Perubahan, meski menyebabkan sedikit perubahan kekuatan mengikat DNA beruntai tunggal, menghasilkan 3-4
kali lipat meningkat dalam K, 's untuk primer dan deoxyribonucleoside trifosfat. Perubahan yang lebih dramatis
adalah diamati ketika Arg-183 digantikan oleh Ala, yang mengakibatkan penurunan 99,98% dari aktivitas enzim.
Meskipun K, untuk deoxyribonucleoside trifosfat enzim mutan ini hampir tidak berubah, bahwa
untuk primer meningkat 159 kali lipat. Oleh karena itu, disimpulkan bahwa Arg-183 menempati bagian penting dari
situs pengakuan primer DNA polimerase

Sebuah DNA sel Nimal polymerase 0 telah dianggap terlibat dalam perbaikan DNA (Fry & Loeb, 1986) dan
mungkin di rekombinasi (Hirose et al., 1989). Bentuk aktif dari enzim tikus terdiri dari polipeptida tunggal dari
335 asam amino residu (Matsukage et al., 1987) dan lebih kecil dari yang lain prokariotik dikenal atau
eukariotik DNA polimerase. Enzy- tikus rekombinan aktif dan DNA mologically polym-
menghapus p ini telah diproduksi di Escherichia coli dan dimurnikan ke homogenitas dalam jumlah banyak
(Date et al., 1988; Abotts et al., 1988). Selanjutnya, strukturnya, enzimatik
sifat, dan antigenisitas DNA tikus rekombinan
polimerase 0 adalah tidak bisa dibedakan dari yang dimurnikan
dari sel tikus (Date et al., 1988). Struktur sederhana dan
Pemurnian mudah enzim rekombinan telah berhasil
menguntungkan untuk mempelajari situs aktif DNA polimerase.
Sebuah pencarian komputer mengungkapkan bahwa ada sim-
ilarities antara tikus DNA polimerase p dan terminal manusia
deoxynucleotidyl transferase (terminal transferase) di
urutan asam amino serta di lokasi putative
struktur sekunder dan tersier (Matsukage et al., 1987).
Sebuah daerah antara posisi asam amino 179 dan 184 DNA
polimerase 0, yang berisi dua residu arginin, adalah yang paling
dilestarikan antara enzim ini, menunjukkan bahwa daerah ini
penting untuk kegiatan DNA polimerisasi. Dalam makalah ini,
kami melaporkan bahwa penggantian residu arginin pada posisi
182 atau 183 dari tikus rekombinan DNA polimerase P oleh alanin
atau glutamin menurun drastis aktivitas enzim.
Analisis enzimologis DNA polimerase mutan yang dimurnikan
@ Menunjukkan bahwa Arg-183 terlibat dalam pengakuan atas
primer

BAHAN DAN METODE


Site-Directed Mutagenesis. Ekspresi plasmid JMpo5,
yang berisi seluruh urutan pengkodean DNA tikus
polimerase p di M 13 phageplasmid chimeric pUC vektor 1 18
(Date et al., 1988), digunakan untuk pekerjaan ini. Isolasi dosa-
gle untai DNA melingkar dari E. coli diubah oleh
plasmid dan mutagenesis yang diarahkan oligonukleotida
dilakukan seperti yang telah dijelaskan sebelumnya (Date et al., 1988).
Oligonukleotida yang digunakan untuk mutagenesis secara kimiawi
disintesis (Gambar 1). Dengan penggunaan oligonukleotida ini,
fenilalanin pada 18 1, arginin pada 182, arginin pada 183, atau keduanya
dua arginines tersebut diubah menjadi alanin atau glut-
amina (s). Dengan metode yang sama, enzim mutan itu
Kembali ke tipe liar untuk mengecualikan kemungkinan itu
Situs selain situs mutasi yang diinginkan tidak sengaja
berubah dan bahwa perubahan ini mungkin berakibat pada pengurangan
dari aktivitas enzim mutan.
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) -Polyacrylamide Gel
Elektroforesis Crude Ekstrak Recombinant E. coli ini.
Plasmid rekombinan diperkenalkan ke E. coli JM109,
dan transforman ditumbuhkan dalam 20 ml medium 2X YT
mengandung 50 pg / mL ampicilin. Bila absorbansi pada 600
nm dari kultur mencapai 0,2, isopropil o-thiogalaktosida
(IPTG) ditambahkan ke konsentrasi akhir 1 mM, dan sel
ditanam untuk tambahan 4 jam. Sel dikumpulkan oleh
sentrifugasi pada 4000g selama 3 menit, dan endapan itu
resuspended dalam 0,5 mL larutan lysing yang mengandung 10 mM
Tris-HC1, pH 7,8, 10% sukrosa, dan 0,1 mg putih telur
lysozyme Setelah inkubasi selama 30 menit pada 0 OC, ekstrak kasar
diperoleh dengan sonikasi selama 5 menit pada 0 “C dalam Branson
Sonifire. Aliquot diambil, diencerkan dengan buffer sampel untuk
Elektroforesis gel SDS-poliakrilamida (SDS-PAGE), dan
kemudian mengalami elektroforesis. Dalam rangka untuk menentukan
Jumlah relatif dari 40-kDa DNA polymerase / 3 polipeptida,
gel itu diwarnai dengan Coomassie Brilliant Blue R-250 dan
dipindai oleh pemindai gel Shimadzu

Deteksi DNA Polymerase / 3 Aktivitas di mentah yang


Ekstrak dengan Metode Gel Acticity. DNA polimerase ac-
Efek dari ekstrak kasar dideteksi oleh gel aktivitas
metode yang dijelaskan oleh Spanos et al. (1981) dengan modi-
fikasi (Yamaguchi et al., 1983). Setelah elektroforesis di
gel yang mengandung DNA timus betis yang teraktivasi, reaksinya
dilakukan selama 30 menit di Tris-HCI, pH 7,8, 6 mM MgCI2, 10
mM 2-mercaptoethanol, 100 pM masing-masing dATP, dGTP, dan
dTTP, dan 10 pCi dari [CY .- '~ P] ~ CTP (400 Ci / mmol). DNA
Kegiatan polimerase p dapat dideteksi di wilayah sekitar
40 kDa di autoradiograms. Aktivitas enzim adalah quan-
tified dengan menghitung daerah 40-kDa dengan p AMBIS
pemindai
Pemurnian rekombinan Tikus DNA Polymerase p. Itu
rekombinan ditanam pada media 2X YT, dan bila
absorbansi pada 600 nm dari budaya mencapai 0,5, IPTG adalah
ditambahkan ke konsentrasi akhir 0,5 mM untuk menginduksi sintesis
DNA polimerase p. Sel bakteri dipanen pada 6 h
setelah IPTG induksi dan disimpan pada -80 "C sampai digunakan.
Jenis liar dan mutan dari DNA polimerase p adalah
dimurnikan dari rekombinan E. coli seperti yang dijelaskan sebelumnya
(Tanggal et al, 1988). Singkatnya, beku rekombinan E. coli (sekitar
2 g) dihentikan di 6 mL 50 mM Tris-HCI, pH 7,8,
mengandung 25 5% (w / v) sukrosa dan diinkubasi dengan 2,5 mg / mL
telur lisozim putih selama 1 jam pada 0 "C. EDTA ditambahkan ke
konsentrasi akhir 50 mM, dan campuran diinkubasi
selama 5 menit. Sel dilisis dengan mencampur suspensi sel dengan
6 mL melisiskan buffer yang mengandung 0,5% Nonidet P-40, 0,8 M
KCI, 2 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) dan 50
mM Tris-HCI, pH 7,8. Lysate disonikasi untuk menggunting
DNA dan kemudian diperjelas dengan sentrifugasi pada 12000g selama 30
min untuk mendapatkan ekstrak kasarnya. Ekstrak kasar diencerkan
dengan penambahan tiga volume PC penyangga (50 mM
Tris-HCI, pH 7,8, 0,1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, dan
10% gliserol), dan konsentrasi KCI disesuaikan menjadi 0,4
M. Sebagian besar asam nukleat dikeluarkan dari minyak mentah
ekstrak dengan melewatkannya melalui kolom DEAE-selulosa yang
telah diseimbangkan dalam buffer PC yang mengandung 0.4 M KCI.
Eluen yang mengandung sebagian besar DNA polimerase
Aktivitas diencerkan dengan volume buffer PC yang sama
mengurangi konsentrasi KCI dan diterapkan untuk phosphocellulose sebuah
Kolom diseimbangkan dengan 0,2 M KCl mengandung penyangga PC.
Kromatografi dikembangkan dengan KCI linear concen-
gradien trasi dari 0,2 sampai 0,8 M pada buffer PC. DNA po-
lymerase p dipantau oleh aktivitas enzim dan / atau
SDS-PAGE. DNA polimerase 0 kegiatan dan / atau yang 40-kDa
polipeptida dari rekombinan tipe liar dan mutan
dielusi pada konsentrasi KCI antara 0,45 dan 0,55 M.
Fraksi kolam yang mengandung protein enzim diencerkan
3 kali lipat dengan buffer PC dan kemudian dioleskan pada anak sapi yang didenaturasi
selulosa DNA selulosa kolom diseimbangkan dengan 0,15 M
Penyangga KCI-PC. Kromatografi dikembangkan dengan linier
gradien konsentrasi KCI dari 0,15 sampai 1,0 M pada PC
penyangga. Aktivitas dan polipeptida DNA polimerase
dipantau seperti yang dijelaskan untuk phosphocellulose chro-
matografi. Kemurnian persiapan biasanya 80%
atau lebih tinggi sehubungan dengan polipeptida 40-kDa, yang
reaktif terhadap antibodi polimerase p anti-DNA. Enzy-
Karakterisasi mologis dilakukan dengan enzim
Persiapan pada langkah ini.
Assay untuk DNA Polymerase p Activity. DNA polimerase
/ 3 aktivitas ditentukan dengan poli (rA) -oligo (dT) sebagai
template primer di bawah kondisi reaksi yang telah digunakan
untuk polimerase DNA cewek, 8 (Yamaguchi et al., 1980). Satu
unit DNA polimerase didefinisikan sebagai jumlah katalis

penggabungan 1 nmol dari dTMP ke poli (dT) di 60 menit.


Untuk penentuan parameter enzimatik,
konsentrasi substrat, dTTP, atau primer, oligo-
(dT)] 2-] 8, bervariasi. Dalam uji enzim dengan rendah
aktivitas, aktivitas spesifik [3H] dTTP meningkat 10
kali atau lebih tinggi.
Penentuan Konsentrasi Protein. Protein concen-
trasi ditentukan oleh kit protein Bio-Rad dan dengan
albumin serum sapi sebagai standar sesuai dengan suplier
prosedur.
Netralisasi dan Imunobinding DNA Polymerase
P oleh Anti-Tikus DNA Polymerase 0 Serum diperoleh dari
kelinci yang telah diimunisasi dengan DNA tikus yang dimurnikan
polimerase 0 diproduksi di rekombinan JMpP5 (Tanggal et al.,
1988). Antibodi yang dimurnikan pada protein A-Sepharose
kolom seperti yang telah dijelaskan sebelumnya (Ei et al., 1978). Sesuai
Jumlah sediaan enzim yang menunjukkan hampir sama
kegiatan dicampur dalam volume akhir 10 pL dengan serial
antibodi diencerkan dalam 0,2 M KCl-PC buffer yang mengandung 1 mg / mL
albumin serum sapi, dan kemudian campuran diinkubasi
selama 3 jam pada 4 "C. Setelah inkubasi, 15 pL reaksi
campuran untuk aktivitas DNA polimerase ditambahkan ke masing-masing re-
tindakan dalam percobaan netralisasi. Dalam immunobinding yang
Pengujian, reaksi yang mengandung enzim dan antibodi setelah
inkubasi pertama dicampur dengan 10 pL dari 10% (b / v) forma-
lin-tetap Staphylococcus aureus (S. aureus) Cowan Saya mempertahankan satu
pensiun. Campuran diinkubasi selama 1 jam pada 4 "C, dan
kompleks imun diendapkan dengan sentrifugasi selama 10 menit
di 8000g. Sepuluh mikroliter supernatan dicampur dengan
15 pL dari campuran reaksi untuk kegiatan polimerase DNA
pengujian kadar logam.
Analisis Immunoblotting. Anti-cewek DNA polimerase p
antibodi kelinci, yang disiapkan melawan yang sangat murni
Persiapan enzim, telah dijelaskan sebelumnya (Yama-
guchi et al., 1982). Analisis SDS-PAGE dan imunobloting
dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Date et al., 1988) kecuali
bahwa antibodi terhadap DNA polimerase ayam dan tikus
p ini yang digunakan bukan dari yang melawan cewek DNA polimerase
p saja.

HASIL
Situs-Directed Mutagenesis dari Tikus DNA Polymerase 6. Dengan
metode mutagenesis yang diarahkan ke situs menggunakan oligonukleotida
(Date et al., 1988), masing-masing residu asam amino berurutan
'*' Phe-Arg-ArglE3 dari DNA polimerase tikus rekombinan
/ 3 digantikan oleh alanin, dan mutan yang ditunjuk

sebagai FA181 (PheI8' - Ala), RA182 (ArgIE2 - Ala), dan

RA183 (Arg183 - Ala), masing-masing (Gambar 1). Arginin


residu pada posisi 182, yang pada posisi 183, atau pada keduanya
Posisi juga digantikan oleh glutamin, dan mutan ini

yang ditunjuk sebagai RQ182 (ArgIE2 - Gln), RQ183 (ArgIS3

- Gln), dan RQ182 / 183 (ArglE2-ArglE3 - Gln-Gln), kembali

secara spektral.
Penggantian dengan residu alanin dapat mempengaruhi reaksi
sifat enzim secara dramatis, terutama Arga- 182 dan
Arga- 183, jika residu arginin ini memiliki peran penting dalam
reaksi katalitik Selanjutnya, penggantian Arg by Gln
tampaknya menjadi salah satu cara terbaik untuk memeriksa efek dari
muatan positif dari Arg pada aktivitas enzim, karena Gln memiliki
kelompok netral dan masih hidrofilik pada ujung
residu alkil dan bukan kelompok dasar di Arg.
Sel E. coli JM109 menyimpan setiap plasmid rekombinan
tumbuh, dan sintesis enzim diinduksi oleh
1 .O mM IPTG. Dalam semua rekombinan, 40-kDa polipeptida yang
Hadir dalam jumlah banyak, dan produksi jelas de-
tergantung pada penambahan IPTG (Gambar 2). Dengan demikian,

GAMBAR 1: Oligodeoxynucleotides digunakan untuk mutagenesis situs-diarahkan


tikus DNA polimerase B. (Top) Partial urutan asam amino dari DNA
polimerase B di mana penggantian asam amino diperkenalkan
dan urutan nukleotida pengkodeannya. Oligonukleotida secara kimiawi
disintesis sehingga mengandung urutan pelengkap pengkodean
urutan kecuali substitusi nukleotida seperti yang ditunjukkan oleh un-
derlines. Dengan penggunaan oligonukleotida ini sebagai primer pada M 13 yang diturunkan
DNA beruntai tunggal yang berisi keseluruhan bingkai pengkodean untuk
-tipe liar DNA tikus polimerase 6, pengganti asam amino ditampilkan
pada angka ini tercapai. Selanjutnya dengan oligonukleotida
Di bagian bawah enzim mutan, seperti RA183, dapat dikembalikan
ke dalam enzim tipe liar.
Penggantian asam amino pada posisi ini tidak berpengaruh
sintesis dan stabilitas DNA polimerase p poli-
peptida dalam E. coli.
Deteksi Kegiatan Bermutasi DNA Polymerase p. Itu
ekstrak kasar E. coli dengan tipe liar dan enzim mutan
diperiksa dalam gel aktivitas untuk mendeteksi DNA polimerase
aktivitas. Seperti ditunjukkan pada Gambar 3A, aktivitas enzim pada
Wilayah 40 kDa berbeda di antara rekombinan, sedangkan
kegiatan ukuran yang lebih besar, yang menunjukkan DNA E. coli
polimerase I, hampir identik pada semua ekstrak. Meskipun
Ekstrak FA181 dan RA182 memiliki aktivitas yang serupa dengan itu
yang liar, penggantian Arg-183 oleh alanin (RA183

secara ekstensif mengurangi aktivitas enzim. Enzim mutan


RQ182 dan RQ183 juga memiliki aktivitas yang jauh lebih rendah daripada
tipe liar. Enzim RQ182 / 183, di mana dua arginin
residu digantikan oleh glutamin, tidak memiliki de-
Aktivitas enzim yang baik dengan metode ini (data tidak ditunjukkan).
Karena aktivitas enzim beberapa enzim mutan (RQ182,
RQ183, RQ183, dan RQ182 / 183) jauh lebih rendah dari itu
dari tipe liar satu kromatografi seperti yang ditunjukkan nanti (lihat
Angka 4 dan 9, kegiatan rendah ini enzim mutan
Pada gel aktivitas tidak disebabkan oleh rendahnya efisiensi
dalam renaturasi pada gel tetapi disebabkan oleh asam amino
substitusi.
Untuk mengesampingkan kemungkinan pengurangan tersebut
Aktivitas enzim oleh mutasi disebabkan dari kebetulan
perubahan di situs selain situs yang diarahkan, kami telah mencoba
untuk mengembalikan enzim mutan ke dalam yang liar menggunakan oligo-
nukleotida dengan urutan tipe liar. Contoh ditunjukkan
pada Gambar 3C. Pembalikan Ala-183 di RA183 ke aslinya
Arg (AR183) menghasilkan aktivitas enzim tinggi yang serupa dengan itu
yang liar
Karena penggabungan [cx ~ ~ ~ PI ~ CMP pada suhu 40 kDa
Daerah dalam gel aktivitas sebanding dengan jumlah
ekstrak kasar rekombinan tipe liar (Gambar 3B),
Aktivitas spesifik relatif setiap enzim mutan bisa terjadi
dihitung secara kasar dengan mengukur radioaktivitas dan
jumlah polipeptida 40-kDa pada setiap persiapan di
gel pewarna pewarna (Gambar 2). Aktivitas spesifik yang diperoleh
relatif terhadap enzim tipe liar adalah sebagai berikut: FA181,
70%; RA182,33%; RQ182,13%, RA183,0,1%; RQ183,5%;
RQ182 / 183, CO.l%. Dalam metode gel aktivitas, con-
sentimen dCTP berlabel 32P dalam campuran reaksi
sangat rendah Namun, karena K ,,, nilai-nilai mutan ini
enzim untuk deoksiribonukleosida trifosfat dan primer adalah

Halaman 1
Biokimia 1990, 29, 5027-5034
5027
Situs-Directed Mutagenesis dari rekombinan Tikus DNA Polymerase p: Keterlibatan
dari Arginine-183 dalam Primer Recognition +
Takayasu Date, $ Setsuko Yamamoto, J Kiyomi Tanihara, t Yoshio Nishimoto, s Nan Liu, s dan Akio
Matsukage * + l
Departemen Biokimia, Kanazawa Medical University, Uchinada. Ishikawa 920-02, Jepang, dan
Laboratorium Sel
Biologi, Prefektur Cancer Center Research Institute, Chikusa- ku, Nagoya 464, Jepang
Menerima 12 Oktober 1989; Revisi Naskah diterima tanggal 18 Januari I990
ABSTRAK: Dengan situs-diarahkan mutagenesis menggunakan oligonukleotida sintetik, residu asam amino 18'Phe-
A rg - A ~ - g '~ ~
DNA polimerase rekombinan @ digantikan oleh asam amino lain untuk memperjelas perannya
residu ini dalam reaksi DNA sintesis. Penggantian Phe-18 1 oleh alanin mengurangi enzim
aktivitas hanya 30%. Penggantian Arg-182 oleh alanin dan glutamin mengakibatkan pengurangan aktivitas

sekitar 67% dan 95%, masing-masing. The Arg-182 - Gln pengganti meningkatkan kekuatan mengikat
untai tunggal DNA tetapi tidak secara signifikan mengubah K, 's untuk primer dan dTTP, menunjukkan bahwa
Arg-182 terlibat dalam modulasi mengikat template daripada primer atau deoxyribonucleoside
trifosfat Penggantian Arg-183 oleh Gln mengakibatkan berkurangnya aktivitas sekitar 9596, dan ini
Perubahan, meski menyebabkan sedikit perubahan kekuatan mengikat DNA beruntai tunggal, menghasilkan 3-4
kali lipat
meningkat dalam K, 's untuk primer dan deoxyribonucleoside trifosfat. Perubahan yang lebih dramatis adalah
diamati ketika Arg-183 digantikan oleh Ala, yang mengakibatkan penurunan 99,98% dari aktivitas enzim.
Meskipun K, untuk deoxyribonucleoside trifosfat enzim mutan ini hampir tidak berubah, bahwa
untuk primer meningkat 159 kali lipat. Oleh karena itu, disimpulkan bahwa Arg-183 menempati bagian penting dari
situs pengakuan primer DNA polimerase p.
Sebuah DNA sel Nimal polymerase 0 telah dianggap
terlibat dalam perbaikan DNA (Fry & Loeb, 1986) dan mungkin di
rekombinasi (Hirose et al., 1989). Bentuk aktif dari
enzim tikus terdiri dari polipeptida tunggal dari 335 asam amino
residu (Matsukage et al., 1987) dan lebih kecil dari yang lain
prokariotik dikenal atau eukariotik DNA polimerase. Enzy-
tikus rekombinan aktif dan DNA mologically polym-
menghapus p ini telah diproduksi di Escherichia coli dan dimurnikan
ke homogenitas dalam jumlah banyak (Date et al., 1988; Abotts
et al., 1988). Selanjutnya, strukturnya, enzimatik
sifat, dan antigenisitas DNA tikus rekombinan
polimerase 0 adalah tidak bisa dibedakan dari yang dimurnikan
dari sel tikus (Date et al., 1988). Struktur sederhana dan
Pemurnian mudah enzim rekombinan telah berhasil
menguntungkan untuk mempelajari situs aktif DNA polimerase.
Sebuah pencarian komputer mengungkapkan bahwa ada sim-
ilarities antara tikus DNA polimerase p dan terminal manusia
deoxynucleotidyl transferase (terminal transferase) di
urutan asam amino serta di lokasi putative
struktur sekunder dan tersier (Matsukage et al., 1987).
Sebuah daerah antara posisi asam amino 179 dan 184 DNA
polimerase 0, yang berisi dua residu arginin, adalah yang paling
dilestarikan antara enzim ini, menunjukkan bahwa daerah ini
penting untuk kegiatan DNA polimerisasi. Dalam makalah ini,
kami melaporkan bahwa penggantian residu arginin pada posisi
182 atau 183 dari tikus rekombinan DNA polimerase P oleh alanin
atau glutamin menurun drastis aktivitas enzim.
Analisis enzimologis DNA polimerase mutan yang dimurnikan
@ Menunjukkan bahwa Arg-183 terlibat dalam pengakuan atas
primer.
'Karya ini didukung sebagian oleh Grant-in-Aid dari Japa-
* Sesuai penulis.
* Kanazawa Medis Unviersitas.
5 Aichi Cancer Center Research Institute.
Kementerian Pendidikan, Ilmu Pengetahuan dan Kebudayaan.
BAHAN DAN METODE
Site-Directed Mutagenesis. Ekspresi plasmid JMpo5,
yang berisi seluruh urutan pengkodean DNA tikus
polimerase p di M 13 phageplasmid chimeric pUC vektor 1 18
(Date et al., 1988), digunakan untuk pekerjaan ini. Isolasi dosa-
gle untai DNA melingkar dari E. coli diubah oleh
plasmid dan mutagenesis yang diarahkan oligonukleotida
dilakukan seperti yang telah dijelaskan sebelumnya (Date et al., 1988).
Oligonukleotida yang digunakan untuk mutagenesis secara kimiawi
disintesis (Gambar 1). Dengan penggunaan oligonukleotida ini,
fenilalanin pada 18 1, arginin pada 182, arginin pada 183, atau keduanya
dua arginines tersebut diubah menjadi alanin atau glut-
amina (s). Dengan metode yang sama, enzim mutan itu
Kembali ke tipe liar untuk mengecualikan kemungkinan itu
Situs selain situs mutasi yang diinginkan tidak sengaja
berubah dan bahwa perubahan ini mungkin berakibat pada pengurangan
dari aktivitas enzim mutan.
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) -Polyacrylamide Gel
Elektroforesis Crude Ekstrak Recombinant E. coli ini.
Plasmid rekombinan diperkenalkan ke E. coli JM109,
dan transforman ditumbuhkan dalam 20 ml medium 2X YT
mengandung 50 pg / mL ampicilin. Bila absorbansi pada 600
nm dari kultur mencapai 0,2, isopropil o-thiogalaktosida
(IPTG) ditambahkan ke konsentrasi akhir 1 mM, dan sel
ditanam untuk tambahan 4 jam. Sel dikumpulkan oleh
sentrifugasi pada 4000g selama 3 menit, dan endapan itu
resuspended dalam 0,5 mL larutan lysing yang mengandung 10 mM
Tris-HC1, pH 7,8, 10% sukrosa, dan 0,1 mg putih telur
lysozyme Setelah inkubasi selama 30 menit pada 0 OC, ekstrak kasar
diperoleh dengan sonikasi selama 5 menit pada 0 “C dalam Branson
Sonifire. Aliquot diambil, diencerkan dengan buffer sampel untuk
Elektroforesis gel SDS-poliakrilamida (SDS-PAGE), dan
kemudian mengalami elektroforesis. Dalam rangka untuk menentukan
Jumlah relatif dari 40-kDa DNA polymerase / 3 polipeptida,
gel itu diwarnai dengan Coomassie Brilliant Blue R-250 dan
dipindai oleh pemindai gel Shimadzu.
0006-2960 / 90 / 0429-5027 $ 02,50 / 0 0 1990 American Chemical Society

Halaman 2
5028 Biokimia, Vol. 29, No. 21, 1990
Tanggal et al.
Deteksi DNA Polymerase / 3 Aktivitas di mentah yang
Ekstrak dengan Metode Gel Acticity. DNA polimerase ac-
Efek dari ekstrak kasar dideteksi oleh gel aktivitas
metode yang dijelaskan oleh Spanos et al. (1981) dengan modi-
fikasi (Yamaguchi et al., 1983). Setelah elektroforesis di
gel yang mengandung DNA timus betis yang teraktivasi, reaksinya
dilakukan selama 30 menit di Tris-HCI, pH 7,8, 6 mM MgCI2, 10
mM 2-mercaptoethanol, 100 pM masing-masing dATP, dGTP, dan
dTTP, dan 10 pCi dari [CY .- '~ P] ~ CTP (400 Ci / mmol). DNA
Kegiatan polimerase p dapat dideteksi di wilayah sekitar
40 kDa di autoradiograms. Aktivitas enzim adalah quan-
tified dengan menghitung daerah 40-kDa dengan p AMBIS
pemindai
Pemurnian rekombinan Tikus DNA Polymerase p. Itu
rekombinan ditanam pada media 2X YT, dan bila
absorbansi pada 600 nm dari budaya mencapai 0,5, IPTG adalah
ditambahkan ke konsentrasi akhir 0,5 mM untuk menginduksi sintesis
DNA polimerase p. Sel bakteri dipanen pada 6 h
setelah IPTG induksi dan disimpan pada -80 "C sampai digunakan.
Jenis liar dan mutan dari DNA polimerase p adalah
dimurnikan dari rekombinan E. coli seperti yang dijelaskan sebelumnya
(Tanggal et al, 1988). Singkatnya, beku rekombinan E. coli (sekitar
2 g) dihentikan di 6 mL 50 mM Tris-HCI, pH 7,8,
mengandung 25 5% (w / v) sukrosa dan diinkubasi dengan 2,5 mg / mL
telur lisozim putih selama 1 jam pada 0 "C. EDTA ditambahkan ke
konsentrasi akhir 50 mM, dan campuran diinkubasi
selama 5 menit. Sel dilisis dengan mencampur suspensi sel dengan
6 mL melisiskan buffer yang mengandung 0,5% Nonidet P-40, 0,8 M
KCI, 2 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) dan 50
mM Tris-HCI, pH 7,8. Lysate disonikasi untuk menggunting
DNA dan kemudian diperjelas dengan sentrifugasi pada 12000g selama 30
min untuk mendapatkan ekstrak kasarnya. Ekstrak kasar diencerkan
dengan penambahan tiga volume PC penyangga (50 mM
Tris-HCI, pH 7,8, 0,1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, dan
10% gliserol), dan konsentrasi KCI disesuaikan menjadi 0,4
M. Sebagian besar asam nukleat dikeluarkan dari minyak mentah
ekstrak dengan melewatkannya melalui kolom DEAE-selulosa yang
telah diseimbangkan dalam buffer PC yang mengandung 0.4 M KCI.
Eluen yang mengandung sebagian besar DNA polimerase
Aktivitas diencerkan dengan volume buffer PC yang sama
mengurangi konsentrasi KCI dan diterapkan untuk phosphocellulose sebuah
Kolom diseimbangkan dengan 0,2 M KCl mengandung penyangga PC.
Kromatografi dikembangkan dengan KCI linear concen-
gradien trasi dari 0,2 sampai 0,8 M pada buffer PC. DNA po-
lymerase p dipantau oleh aktivitas enzim dan / atau
SDS-PAGE. DNA polimerase 0 kegiatan dan / atau yang 40-kDa
polipeptida dari rekombinan tipe liar dan mutan
dielusi pada konsentrasi KCI antara 0,45 dan 0,55 M.
Fraksi kolam yang mengandung protein enzim diencerkan
3 kali lipat dengan buffer PC dan kemudian dioleskan pada anak sapi yang didenaturasi
selulosa DNA selulosa kolom diseimbangkan dengan 0,15 M
Penyangga KCI-PC. Kromatografi dikembangkan dengan linier
gradien konsentrasi KCI dari 0,15 sampai 1,0 M pada PC
penyangga. Aktivitas dan polipeptida DNA polimerase
dipantau seperti yang dijelaskan untuk phosphocellulose chro-
matografi. Kemurnian persiapan biasanya 80%
atau lebih tinggi sehubungan dengan polipeptida 40-kDa, yang
reaktif terhadap antibodi polimerase p anti-DNA. Enzy-
Karakterisasi mologis dilakukan dengan enzim
Persiapan pada langkah ini.
Assay untuk DNA Polymerase p Activity. DNA polimerase
/ 3 aktivitas ditentukan dengan poli (rA) -oligo (dT) sebagai
template primer di bawah kondisi reaksi yang telah digunakan
untuk polimerase DNA cewek, 8 (Yamaguchi et al., 1980). Satu
unit DNA polimerase didefinisikan sebagai jumlah katalis
penggabungan 1 nmol dari dTMP ke poli (dT) di 60 menit.
Untuk penentuan parameter enzimatik,
konsentrasi substrat, dTTP, atau primer, oligo-
(dT)] 2-] 8, bervariasi. Dalam uji enzim dengan rendah
aktivitas, aktivitas spesifik [3H] dTTP meningkat 10
kali atau lebih tinggi.
Penentuan Konsentrasi Protein. Protein concen-
trasi ditentukan oleh kit protein Bio-Rad dan dengan
albumin serum sapi sebagai standar sesuai dengan suplier
prosedur.
Netralisasi dan Imunobinding DNA Polymerase
P oleh Anti-Tikus DNA Polymerase 0 Serum diperoleh dari
kelinci yang telah diimunisasi dengan DNA tikus yang dimurnikan
polimerase 0 diproduksi di rekombinan JMpP5 (Tanggal et al.,
1988). Antibodi yang dimurnikan pada protein A-Sepharose
kolom seperti yang telah dijelaskan sebelumnya (Ei et al., 1978). Sesuai
Jumlah sediaan enzim yang menunjukkan hampir sama
kegiatan dicampur dalam volume akhir 10 pL dengan serial
antibodi diencerkan dalam 0,2 M KCl-PC buffer yang mengandung 1 mg / mL
albumin serum sapi, dan kemudian campuran diinkubasi
selama 3 jam pada 4 "C. Setelah inkubasi, 15 pL reaksi
campuran untuk aktivitas DNA polimerase ditambahkan ke masing-masing re-
tindakan dalam percobaan netralisasi. Dalam immunobinding yang
Pengujian, reaksi yang mengandung enzim dan antibodi setelah
inkubasi pertama dicampur dengan 10 pL dari 10% (b / v) forma-
lin-tetap Staphylococcus aureus (S. aureus) Cowan Saya mempertahankan satu
pensiun. Campuran diinkubasi selama 1 jam pada 4 "C, dan
kompleks imun diendapkan dengan sentrifugasi selama 10 menit
di 8000g. Sepuluh mikroliter supernatan dicampur dengan
15 pL dari campuran reaksi untuk kegiatan polimerase DNA
pengujian kadar logam.
Analisis Immunoblotting. Anti-cewek DNA polimerase p
antibodi kelinci, yang disiapkan melawan yang sangat murni
Persiapan enzim, telah dijelaskan sebelumnya (Yama-
guchi et al., 1982). Analisis SDS-PAGE dan imunobloting
dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Date et al., 1988) kecuali
bahwa antibodi terhadap DNA polimerase ayam dan tikus
p ini yang digunakan bukan dari yang melawan cewek DNA polimerase
p saja.
HASIL
Situs-Directed Mutagenesis dari Tikus DNA Polymerase 6. Dengan
metode mutagenesis yang diarahkan ke situs menggunakan oligonukleotida
(Date et al., 1988), masing-masing residu asam amino berurutan
'*' Phe-Arg-ArglE3 dari DNA polimerase tikus rekombinan
/ 3 digantikan oleh alanin, dan mutan yang ditunjuk

sebagai FA181 (PheI8' - Ala), RA182 (ArgIE2 - Ala), dan

RA183 (Arg183 - Ala), masing-masing (Gambar 1). Arginin


residu pada posisi 182, yang pada posisi 183, atau pada keduanya
Posisi juga digantikan oleh glutamin, dan mutan ini

yang ditunjuk sebagai RQ182 (ArgIE2 - Gln), RQ183 (ArgIS3

- Gln), dan RQ182 / 183 (ArglE2-ArglE3 - Gln-Gln), kembali

secara spektral.
Penggantian dengan residu alanin dapat mempengaruhi reaksi
sifat enzim secara dramatis, terutama Arga- 182 dan
Arga- 183, jika residu arginin ini memiliki peran penting dalam
reaksi katalitik Selanjutnya, penggantian Arg by Gln
tampaknya menjadi salah satu cara terbaik untuk memeriksa efek dari
muatan positif dari Arg pada aktivitas enzim, karena Gln memiliki
kelompok netral dan masih hidrofilik pada ujung
residu alkil dan bukan kelompok dasar di Arg.
Sel E. coli JM109 menyimpan setiap plasmid rekombinan
tumbuh, dan sintesis enzim diinduksi oleh
1 .O mM IPTG. Dalam semua rekombinan, 40-kDa polipeptida yang
Hadir dalam jumlah banyak, dan produksi jelas de-
tergantung pada penambahan IPTG (Gambar 2). Dengan demikian,

Halaman 3
Primer Pengakuan Site DNA Polymerase / 3
Biokimia, Vol. 29, No. 21, 1990 5029
181 182 183
N-Cys Gly Ser Phe Arg Arg Gly Ala Glu-C
5'TGC GGC AGT TTC CGA AGA CIGC GCA GAG T 3 '
Penggantian Mutan
01 igomer untuk mutagenesis
FA181
Phe + Ala
3'ACG CCG TCA cc; C, GCT TCT CCG 5'
RAl82
Arg + A1 a
RQ182
Arg + Gln
3'6 TCA AAG GE TCT CCG CCI 5 '
RA183
Arg-Ala
3'TCA AACI GCT ET CC6 CGT CT 5 '
RQ183
Arg + Gln
3'CA AAG GCT UT CCG CGT 5 '
RQ182 / 183 Arg-Arg + Gln-Gln
AR183
A1 a + Arg
3'CCG TCA AACI CGA TCT CCG CGT CT 5'
3'CG TCA AAG GEGT CCG CGT CTC A 5 '
3'TCA AAG GCT TCT CCG CGT CT 5 '
GAMBAR 1: Oligodeoxynucleotides digunakan untuk mutagenesis situs-diarahkan
tikus DNA polimerase B. (Top) Partial urutan asam amino dari DNA
polimerase B di mana penggantian asam amino diperkenalkan
dan urutan nukleotida pengkodeannya. Oligonukleotida secara kimiawi
disintesis sehingga mengandung urutan pelengkap pengkodean
urutan kecuali substitusi nukleotida seperti yang ditunjukkan oleh un-
derlines. Dengan penggunaan oligonukleotida ini sebagai primer pada M 13 yang diturunkan
DNA beruntai tunggal yang berisi keseluruhan bingkai pengkodean untuk
-tipe liar DNA tikus polimerase 6, pengganti asam amino ditampilkan
pada angka ini tercapai. Selanjutnya dengan oligonukleotida
Di bagian bawah enzim mutan, seperti RA183, dapat dikembalikan
ke dalam enzim tipe liar.
Penggantian asam amino pada posisi ini tidak berpengaruh
sintesis dan stabilitas DNA polimerase p poli-
peptida dalam E. coli.
Deteksi Kegiatan Bermutasi DNA Polymerase p. Itu
ekstrak kasar E. coli dengan tipe liar dan enzim mutan
diperiksa dalam gel aktivitas untuk mendeteksi DNA polimerase
aktivitas. Seperti ditunjukkan pada Gambar 3A, aktivitas enzim pada
Wilayah 40 kDa berbeda di antara rekombinan, sedangkan
kegiatan ukuran yang lebih besar, yang menunjukkan DNA E. coli
polimerase I, hampir identik pada semua ekstrak. Meskipun
Ekstrak FA181 dan RA182 memiliki aktivitas yang serupa dengan itu
yang liar, penggantian Arg-183 oleh alanin (RA183)
IPTG ttt
1
saya
-
secara ekstensif mengurangi aktivitas enzim. Enzim mutan
RQ182 dan RQ183 juga memiliki aktivitas yang jauh lebih rendah daripada
tipe liar. Enzim RQ182 / 183, di mana dua arginin
residu digantikan oleh glutamin, tidak memiliki de-
Aktivitas enzim yang baik dengan metode ini (data tidak ditunjukkan).
Karena aktivitas enzim beberapa enzim mutan (RQ182,
RQ183, RQ183, dan RQ182 / 183) jauh lebih rendah dari itu
dari tipe liar satu kromatografi seperti yang ditunjukkan nanti (lihat
Angka 4 dan 9, kegiatan rendah ini enzim mutan
Pada gel aktivitas tidak disebabkan oleh rendahnya efisiensi
dalam renaturasi pada gel tetapi disebabkan oleh asam amino
substitusi.
Untuk mengesampingkan kemungkinan pengurangan tersebut
Aktivitas enzim oleh mutasi disebabkan dari kebetulan
perubahan di situs selain situs yang diarahkan, kami telah mencoba
untuk mengembalikan enzim mutan ke dalam yang liar menggunakan oligo-
nukleotida dengan urutan tipe liar. Contoh ditunjukkan
pada Gambar 3C. Pembalikan Ala-183 di RA183 ke aslinya
Arg (AR183) menghasilkan aktivitas enzim tinggi yang serupa dengan itu
yang liar
Karena penggabungan [cx ~ ~ ~ PI ~ CMP pada suhu 40 kDa
Daerah dalam gel aktivitas sebanding dengan jumlah
ekstrak kasar rekombinan tipe liar (Gambar 3B),
Aktivitas spesifik relatif setiap enzim mutan bisa terjadi
dihitung secara kasar dengan mengukur radioaktivitas dan
jumlah polipeptida 40-kDa pada setiap persiapan di
gel pewarna pewarna (Gambar 2). Aktivitas spesifik yang diperoleh
relatif terhadap enzim tipe liar adalah sebagai berikut: FA181,
70%; RA182,33%; RQ182,13%, RA183,0,1%; RQ183,5%;
RQ182 / 183, CO.l%. Dalam metode gel aktivitas, con-
sentimen dCTP berlabel 32P dalam campuran reaksi
sangat rendah Namun, karena K ,,, nilai-nilai mutan ini
enzim untuk deoksiribonukleosida trifosfat dan primer adalah
2-t
s
-
t
-
t
-
4OKDa +
GAMBAR 2: SDS-poliakrilamid gel analisis elektroforesis ekstrak E. coli JM109 yang diubah oleh plasmid yang mengandung cDNA
untuk jenis liar dan mutan DNA polimerase 8. Sel dikultur, dan produksi enzim diinduksi oleh IPTG. Ekstrak
dibuat
seperti dijelaskan di bawah Bahan dan Metode. Setelah elektroforesis, gel diberi pewarnaan oleh Coomassie
Brilliant Blue. Dengan beberapa mutan
(RQ182, RQ183, dan RQ182 / 183), sampel dengan dan tanpa induksi IPTG dibandingkan, menunjukkan
bahwa sintesis polipeptida 40-kDa
DNA polimerase 6 tergantung pada induksi

GAMBAR 3: Deteksi kegiatan DNA polimerase dalam ekstrak sel


rekombinan liar, mutan, dan revertan dengan metode gel aktivitas.
Ekstrak yang sama digunakan dalam Gambar 2 digunakan. (A) volume yang sama
(5 pL) dari ekstrak elektroforesis dipisahkan dalam diaktifkan
Gel yang mengandung DNA, dan setelah renaturasi enzim dengan cara menghilangkannya
SDS dari gel, reaksi sintesis DNA in situ dilakukan
dalam campuran reaksi yang mengandung [32P] dCTP. (B) serial diencerkan
-tipe liar ekstrak dan tepat diencerkan atau mutan nondiluted
Ekstrak dianalisis untuk membandingkan aktivitas relatifnya. Dengan tidak-
merealisasi nilai yang diperoleh dengan jumlah polipeptida 40-kDa
ditunjukkan pada Gambar 2, kegiatan khusus jelas enzim mutan
relatif terhadap enzim tipe liar dapat diperkirakan. (C) 5-,
OS-, dan 0,05-pL ekstrak dari reversi dari RA183 (AR183) dan
original tipe liar rekombinan E. coli yang diterapkan untuk suatu kegiatan
gel.
lebih tinggi dari pada reaksi ini seperti yang disebutkan di bawah ini
kegiatan tertentu tidak terbatas. Nilai absolut spesifik
kegiatan di Vmax mereka akan dijelaskan kemudian.
Karakterisasi Enzimatik DNA Mutan Polym-
menghapus p dengan Kegiatan Mengurangi. Mutan DNA polimerase
p dengan kegiatan berkurang secara signifikan (RQ-182, RA-183,
RQ- 183, dan RQ-182/183) dimurnikan, dan enzy-
Sifat-sifat mologis dibandingkan dengan spesies liar
enzim.
Hasil kromatografi kolom fosforelulosa
ditunjukkan pada Gambar 4. Polimer DNA mutan adalah
semua dielusi dengan 0,45-0,55 M KCl sama dengan tipe liar.
Meskipun menggunakan jumlah sel rekombinasi serupa
bahan awal, jumlah aktivitas enzim mutan
jauh lebih sedikit dibandingkan dengan enzim tipe liar. Meskipun
aktivitas enzim dari RQ182 mutan / 183 tidak terdeteksi,
polipeptida 40-kDa, yang dideteksi oleh SDS-poly-
elektroforesis gel akrilamida, dielusi pada posisi
sesuai dengan kegiatan DNA polimerase @ yang lain
sampel (Gambar 4G).
Fraksi yang mengandung DNA polimerase @ kegiatan dan / atau
Polipeptida 40-kDa dikromatografi dalam denaturasi
DNA-selulosa kolom (Gambar 5). Setelah langkah ini, dimurnikan

Persiapan enzim diperoleh [Gambar 5F, G dan juga


Tanggal et al. (1988) l. Semua mutan DNA polimerase Ps sebagai
dan juga aktivitas pengikatan DNA yang liar. Meskipun
Aktivitas DNA polimerase pada sampel tipe liar itu
dielusi pada 0,35 M KCl, beberapa DNA polimer mutan
p ini dielusi dari kolom dengan konsentrasi KCl lebih tinggi:
RQ182,0.50 M; RQ183,0.40 M. Namun, RA183 dan
RQ182 / 183 enzim atau polipeptida dielusi dari ini
kolom dengan 0,3 dan 0,35 M KCl, masing-masing, hampir
konsentrasi yang sama seperti untuk elusi enzim tipe liar.
Hasil ini menunjukkan bahwa residu arginin pada posisi
182 dan 183 tidak penting untuk pengikatan DNA DNA
polimerase @, tapi daerah ini, terutama Arg-182, adalah mungkin
penting untuk modulasi kekuatan ikatan DNA.
Aktivitas DNA polimerase dari RQ182 dan RQ183
rekombinan dan juga tipe wild type dinetralisir
dan secara imunologis diendapkan oleh antibodi kelinci pra-
dikupas terhadap tipe liar DNA tikus polimerase p diproduksi di
E. coli (Gambar 6). Karena jumlah enzim mutan
Protein yang digunakan dalam percobaan ini lebih dari 10 kali lipat
dari yang liar untuk mendapatkan jumlah kegiatan yang sama seperti untuk
enzim tipe liar, diperlukan konsentrasi antibodi
netralisasi dan pengendapan enzim mutan
lebih tinggi dari yang dibutuhkan untuk tipe liar. Mengingat
Perbedaan ini, enzim mutan ini mungkin memiliki antigenitas
mirip dengan yang liar. Karena aktivitasnya juga
rendah, kami tidak melakukan netralisasi atau imunopresipi-
Percobaan tation menggunakan enzim RQ182 / 183 dan RQ183.
Namun, dengan analisis imunoblot, mereka adalah iblis-
memiliki antigenisitas terhadap anti-tikus dan anti-ayam
DNA polimerase @ antibodi mirip dengan enzim lainnya
(Gambar 7).
Untuk mendapatkan aktivitas enzim spesifik yang tepat, pastinya
konsentrasi protein dan aktivitas DNA polimerase
ditentukan dalam percobaan seperti yang ditunjukkan pada Gambar 8. Fur-
thermore, diperoleh nilai aktivitas enzim spesifik
dikalibrasi oleh rasio kecepatan maksimal ke ve-
lokasi pada konsentrasi substrat (50 pM) yang digunakan dalam hal ini
percobaan (lihat Gambar 9). Hal ini penting untuk tepat
perbandingan, karena K, nilai-nilai enzim mutan yang
berbeda. Hasilnya dirangkum dalam Tabel I. tertentu
aktivitas enzim tipe liar setinggi 2,3 X lo6
unit / mg protein, sedangkan RQ182, RQ183, dan
RA183 adalah 8,9 X lo4, 1,4 X lo5, dan 3,7 X unit LO2 / mg
protein, masing-masing. Bahkan jika kita bekerja dalam jumlah besar
dari persiapan enzim RQ182 / 183 dan [3H] dTTP dengan
Radioaktivitas spesifik yang tinggi, kami memperoleh sedikit aktivitas. Demikian,
Aktivitas spesifiknya diperkirakan kurang dari 10 unit / mg
protein. Bukti ini menunjukkan bahwa setidaknya satu dari ar-
residu ginine pada posisi 182 dan 183 sangat penting untuk DNA
polimerase aktivitas @. Harus ditunjukkan bahwa ab-
sensi aktivitas DNA polimerase yang signifikan dalam
RQ182 / 183 persiapan dikesampingkan kontaminasi de

jumlah tectable E. polimerase DNA coli di enzim


persiapan pada langkah terakhir.
Untuk wawasan lebih lanjut tentang efek mutasi, enzy-
parameter monomer RQ182, RQ183, dan RA183
enzim dibandingkan dengan enzim tipe liar
(Gambar 9 dan 10). Meskipun K, nilai-nilai untuk dTTP dan
primer enzim RQ182 hampir identik dengan
orang-orang dari enzim tipe liar, nilai-nilai RQ183 sekitar
3-4 kali lipat lebih tinggi dari tipe liar. Lebih dramatis
kenaikan K ,,, nilai diamati ketika Arg- 183 itu kembali
ditempatkan oleh alanin (RA183); Km untuk dTTP dan primer [oli-
pergi (dT)] adalah 270 pM dan 333 pg / mL, masing-masing, yang
6.9- dan 159 kali lipat, masing-masing dari tipe liar en-
zyme Kami takut dengan kemungkinan kebutuhan itu
dari konsentrasi primer yang tinggi oleh RA183 mungkin tergantung pada
terminal transferase seperti, aktivitas yang dihasilkan oleh mutagenesis.
Tampaknya mungkin karena DNA polimerase p memiliki luas
homologi dengan transferase terminal (Matsukage et al., 1987).
Namun, ini tidak terjadi, karena aktivitas
Enzim RA183, seperti tipe liar, benar-benar de-
tergantung pada primer dan template (data tidak ditunjukkan).
Hasilnya dengan RQ183 dan RA183 menunjukkan bahwa Arg-183
terlibat dalam pengakuan primer dan / atau dTTP. Untuk
Aktivitas polimerisasi DNA dengan DNA polimerase, for-
mation dari kompleks terner dengan substrat ini di aktif
Situs enzim dibutuhkan. Pengurangan afinita

ke primer dapat mempengaruhi persyaratan untuk deoksi tinggi-


konsentrasi nukleosida trifosfat dan sebaliknya. Dalam urutan
untuk mengklarifikasi apakah primer atau deoksinukleosida trifosfat
Aktivitas mengikat adalah penyebab utama dari nilai-nilai Km yang tinggi dalam
dua substrat, ketergantungan konsentrasi dTTP adalah
ditentukan dalam reaksi dengan konsentrasi primer yang tinggi
(120 pg / mL) bukan konsentrasi biasa (20 pg / mL).
Seperti ditunjukkan dalam Gambar 11, yang Km dari RA183 untuk dTTP adalah
identik dengan enzim tipe liar dengan kondisi ini.
Oleh karena itu, fungsi primer dipengaruhi oleh substitusi
Arga- 183 dengan Ala isqprimer mengikat daripada mengikat dTTP.
DISKUSI
DNA polimerase diperkirakan memiliki banyak subfungsi
untuk melakukan reaksi DNA polimerisasi: (1) mengikat
template DNA dan pengakuan dasar pada template,
(2) pengakuan 3'-OH primer, (3) pengakuan
dan pengikatan deoxynucleoside triphosphate dengan basis
melengkapi dasar template, dan (4) fosfat
pembentukan ikatan phodiester antara primer 3'-OH dan
5'-a-fosfat deoksiribonukleosida trifosfat. Itu
Penelitian ini dilakukan untuk mengklarifikasi struktur DNA
polimerase @ bertanggung jawab untuk subfunctions ini. CDNA
untuk DNA tikus polimerase @ dikloning, dan enzim aktif
berhasil dinyatakan dalam E. coli (Date et al., 1988).
Selanjutnya, vektor digunakan untuk berlebih adalah pUC118

GAMBAR 6: Netralisasi (A) dan immunobinding (B) dari liar dan


jenis mutan (RQ182 dan RQ183) dari DNA polimerase / 3 dengan anti-tikus
DNA polimerase B antibodi. Aktivitasnya hampir sama (sekitar 4 unit)
DNA polimerase @ 's dicampur dengan antibodi serial diencerkan
atau imunoglobulin dari serum preimun (CS). Setelah inkubasi,
setengah dari masing-masing campuran dicampur dengan campuran reaksi untuk DNA
aktivitas polimerase (A), dan bagian sisanya dicampur dengan
suspensi formalin-fixed S. aureus Cowan-1 untuk menghapus
kompleks imun. Alikufat supernatan kemudian dicampur dengan
campuran reaksi untuk aktivitas DNA polimerase (B). Dalam (A), 100%
nilai untuk wild, RQ182, dan RQ183 adalah 1,26, 1,53, dan 1,94 unit,
masing-masing, sedangkan di (B) adalah 0,26, 0,59, dan 0,19 satuan, re-
Secara visual, karena inaktivasi aktivitas enzim secara umum selama
inkubasi dan perawatan

GAMBAR 5: DNA-selulosa kromatografi kolom liar dan


jenis mutan DNA tikus polimerase 8. fraksi Pooled mengandung
DNA polimerase / 3 kegiatan dan / atau yang polipeptida 40-kDa setelah
kromatografi kolom fosfoselulosa diaplikasikan pada denaturasi
kolom selulosa DNA timbalik, dan kromatografi adalah de-
dililitkan oleh gradien linier KCI. Aktivitas DNA polimerase dan
polipeptida dianalisis seperti yang dijelaskan pada Gambar 4.
yang dapat dengan mudah diubah menjadi bentuk untai tunggal
karena memiliki replikasi asal DNA fage M13 (Tanggal
et al., 1988). Hal ini membuat mudah untuk mutagenize enzim
dengan penggunaan oligonukleotida.
Kami mencoba substitusi dengan glutamin atau alanin dari
residu fenilalanin pada posisi 181 dan arginin
residu pada posisi 182 dan 183 dari tikus DNA polimerase 0,
yang sangat dilestarikan antara enzim dan manusia ini
transferase terminal (Matsukage et al., 1987). walaupun
Penggantian Arg-182 oleh Ala mengurangi aktivitas enzim
Untuk batas tertentu, bahwa oleh Gln mengurangi aktivitas lebih banyak

GAMBAR 7: analisis Immunobloiting jenis liar dan mutan dari DNA


polimerase p. Sampel fl dimurnikan DNA polimerase mengandung 0,2-0,5
pg protein dipisahkan secara elektroforesis dan dikosongkan
membran nitroselulosa. Polipeptida antigenik dideteksi dengan
anti-tikus rekombinan DNA polimerase p (A) atau DNA anti-cewek
polimerase p (B) antibodi sebagai antibodi primer.
secara ekstensif. Karena molekul enzim dengan substitusi
Arg-182 oleh Gln memiliki afinitas yang jauh lebih tinggi untuk single-
DNA yang terdampar daripada enzim tipe liar tapi hampir identik
K, nilai-nilai untuk primer dan dTTP dengan orang-orang dari tipe liar,
Arg-182 mungkin terlibat di wilayah yang memodulasi
aktivitas pengikatan template Mekanisme reaksi DNA
polimerase 6 sangat distributif (Wang & Kom, 1980, 1982;
Mosbough & Linn, 1983; Matsukage et al., 1983). Karena itu,
Setelah menyelesaikan polimerisasi satu nukleotida, enzim ini
dilepaskan dari situs perpanjangan DNA dan rebinds untuk
situs primer berikutnya secara acak. Terlalu kuat

GAMBAR 8: Hubungan antara jumlah protein dan po- DNA


kegiatan lymerase dalam persiapan enzim liar dan mutan. Protein
konsentrasi dalam persiapan enzim setelah didenaturasi
Kromatografi DNA-selulosa ditentukan, dan sesuai
volume enzim ini digunakan untuk penentuan aktivitas.
Dalam reaksi RA183 dan RQ182 / 183, substrat radioaktif dengan
aktivitas spesifik yang tinggi ditambahkan untuk mendapatkan sensitivitas tinggi. Itu
Aktivitas enzim diplot terhadap jumlah protein. (A) liar;
(0) RQ182; (A) RQ183; (0) RA183; (V) RQ182 / 183

GAMBAR 9: Ketergantungan pada konsentrasi dTTP liar dan mutan


jenis DNA polimerase j3. Di hadapan 40 pg / mL poli (rA)
dan 20 pg / mL oligo (dT), konsentrasi dTTP bervariasi sebagai
ditunjukkan (A). Lineweaver-Burk plot ditunjukkan pada (B). (A) liar;
(0) RQ182; (A) RQ183; (0) RA183.
Pengikatan pada template mungkin menghasilkan omset reaksi rendah.
Di sisi lain, Arg-183, meski terlokalisasi sangat dekat
ke Arga- 182, dianggap terutama terlibat dalam pengikatan
Primer, karena substitusi dari situs ini oleh glutamine
atau alanin diinduksi peningkatan dramatis dalam K, untuk

GAMBAR 10: Ketergantungan pada oligo (dT) konsentrasi liar dan mutan
jenis DNA polimerase j3. Konsentrasi oligo (dT) adalah
bervariasi seperti yang ditunjukkan di hadapan dari konsentrasi konstan
poli (rA) (40 pg / mL) (A) .- The Lineweaver-Burk plot ditampilkan di
(B). (A) liar; (0) RQ182; (A) RQ183; (0) RA183.
primer. Penafsiran ini dibayangkan mengingat sebelumnya
menemukan bahwa mekanisme reaksi polimerase DNA , L?
adalah mekanisme Bi-Bi memerintahkan di mana mengikat enzim
primer pertama dan kemudian deoxyribonucleoside trifosfat
(Tanabe et al., 1979). afinitas diturunkan untuk primer
mungkin menyebabkan persyaratan untuk konsentrasi yang lebih tinggi dari de-
trifosfat oxyribonucleoside untuk mengkompensasi
efisiensi reaksi.
Situs deoxyribonucleoside trifosfat mengikat tampaknya
untuk berada di daerah yang berbeda dari yang dibahas dalam ini
pekerjaan, karena Km ini untuk trifosfat deoxyribonucleoside
DNA mutan polimerase p ini dalam pekerjaan ini tidak
secara signifikan berbeda dari enzim tipe liar.
Baru-baru ini, dua makalah yang diterbitkan berurusan dengan situs ini,
meskipun pengamatan dari mereka masih contraversial. Dengan a
Metode photoaffinity pelabelan Evans dan Coleman (1989)
menetapkan bahwa wilayah posisi 209-233 dari terminal
transferase @ subunit berisi situs untuk deoxyribonucleoside
trifosfat mengikat. Wilayah ini sesuai dengan posisi
188-217 dari DNA polimerase p. Karena wilayah ini dari
dua enzim memiliki struktur sekunder yang sama serta
struktur primer (Matsukage et al., 1987), bahwa dari DNA
polimerase 0 mungkin bertanggung jawab atas deoxyribonucleoside yang
trifosfat mengikat. Di sisi lain, Basu et al. (1989)
menyimpulkan, dari modifikasi dengan piridoksal 5'-fosfat, yang
yang Lys di posisi 71 dari polimerase DNA tikus P penting
di trifosfat deoxyribonucleoside mengikat saku. Di
Untuk mendapatkan organisasi akhir dari situs aktif
DNA polimerase 6, informasi tentang analisis difraksi sinar-X
enzim mengkristal diperlukan. Kita sekarang mengejar

GAMBAR 11: Ketergantungan pada konsentrasi dTTP liar dan RAI 83


DNA polimerase p di hadapan konsentrasi tinggi dari
primer. Percobaan dilakukan seperti yang dijelaskan pada Gambar 8 kecuali
untuk konsentrasi oligo (dT) dari 120 wg / mL (A). The Lineweav-
er-Burk petak yang ditunjukkan dalam (B). (A) liar; (0) RA183.