Cuestiones de exámenes MSQA

Tema 1. Introducción a las separaciones cromatográficas

1. Definiciones:
a- Cromatografía: Es una técnica que agrupa a un conjunto importante de técnicas que
persiguen separar compuestos de mezclas homogéneas aprovechando la diferente
distribución de los componentes de la mezcla entre una fase móvil (formada por un fluido
que arrastra la muestra) y una fase estacionaria (que está en contacto íntimo con la fase
móvil). Los componentes que se unan más a la fase estacionaria tardarán más en ser
arrastrados y saldrán más tarde que aquellos componentes que se unan menos a la fase
estacionaria, separando así la mezcla.
b- Tiempo de retención: Es el tiempo que
transcurre desde que se inyecta la muestra
hasta que el pico de concentración del
analito alcanza el detector. Las especies
que no se retienen por la fase estacionaria
recorren la columna en el mismo tiempo
que la fase móvil, y al tiempo que emplean
se le llama tiempo muerto.
c- Eficiencia de una columna cromatográfica: Es una medida de la estrechez de los picos
cromatográficos. Una cromatografía es tanto más eficiente cuanto más estrechos sean los
picos. Para describir la eficiencia de una columna hay dos parámetros que son el número de
platos (que es directamente proporcional a la eficiencia) y la altura del plato (que es
inversamente proporcional a la eficiencia).
d- Difusión en remolino: Es el incremento de la longitud de la trayectoria que
siguen las moléculas cuando atraviesan la fase estacionaria debido a que
tienen que sortear las partículas de esta.
e- Resolución de una columna cromatográfica: Es una medida de la optimización de la
separación. Una separación es óptima cuando se produce una separación completa en el
menor tiempo posible. Por lo tanto, la
resolución es el conjunto de
eficacia y selectividad. Para
calcular la resolución a partir de un
cromatograma se usa la expresión:
2 [ ( t R ) B −( t R ) A ]
Rs=
W A +W B
f- Patrón interno: Es una disolución (de concentración exactamente conocida) de los
mismos componentes que tiene la muestra problema que queremos separar. Comparando la
señal producida por el patrón interno y la señal producida por la muestra problema se puede
conocer la concentración de la misma.
g- Derivatización: Es el proceso que consiste en modificar químicamente un compuesto
para formar un derivado con nuevas propiedades que permitan o faciliten su análisis. La
modificación que se hace en el compuesto puede hacer, por ejemplo, que sea más volátil,
que varíe su interacción con la fase estacionaria, que origine un grupo cromóforo o, en caso
de compuestos quirales, originar diastereómeros que presentan diferentes propiedades
físicas.

2. Preguntas de verdadero o falso:
Cuando la fase móvil es un gas y la fase
estacionaria es un líquido adsorbido sobre un
sólido, se trata de una cromatografía gas-líquido.
En cromatografía, un cromatograma se define como
la representación de la señal del detector frente al
tiempo de retención o al volumen de fase móvil
añadido.
La velocidad promedio del movimiento de las
moléculas de la fase móvil en una separación
cromatográfica coincide con la velocidad de
migración de la especie no retenida.
La velocidad promedio del movimiento de las
moléculas de la fase móvil en una separación
cromatográfica coincide con la velocidad de
migración de la especie más débilmente retenida.
Al aumentar el caudal de elución de la fase móvil
disminuye el tiempo de retención de todos los picos
del cromatograma.
En un cromatograma, la identificación de los picos
se basa únicamente en el tiempo de retención.
En un cromatograma, la relación entre la altura de
un pico y el ruido de la línea base se utiliza para
determinar el límite de detección.
La velocidad de migración de los solutos en una
columna cromatográfica se describe mediante el
factor de retención o factor de capacidad.
La medida cuantitativa de la eficacia de una
columna cromatográfica se realiza mediante la
altura de plato teórico y el factor de capacidad.
La medida cuantitativa de la eficacia de una
columna cromatográfica se realiza mediante el
factor de selectividad y el número de platos
teóricos.
Que un plato teórico sea mayor en una columna
cromatográfica que en otra, significa que la eficacia
de la primera columna es mayor.
La viscosidad de un disolvente, así como la
velocidad de difusión de un soluto en dicho
disolvente influyen en la velocidad de transferencia
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Verdadero. En este caso el
equilibrio es la distribución entre
un gas y un líquido.
Verdadero. Es la definición de
cromatograma.
Verdadero. Si una especie no se
retiene tarda lo mismo en eluir que
la fase móvil.
Falso. Coincide con la de la
especie no retenida, no con la que
está más débilmente retenida.
Verdadero. La contribución de la
difusión longitudinal (B) es
inversamente proporcional a la
velocidad de la fase móvil, ya que
cuanto más alto es el caudal, más
breve es el periodo que el analito
reside en la columna.
Falsa. Se basa en el tiempo de
retención y en la confirmación
espectral
Verdadero. Con estos dos
parámetros se puede determinar la
altura espectral.
Verdadero. El parámetro k´
describe las velocidades de
migración de los solutos.
Falso. Se realiza mediante la
altura de plato teórico y el número
de platos teóricos.
Falso. Se realiza mediante la
altura de plato teórico y el número
de platos teóricos
Falso. La altura de plato es
inversamente proporcional a la
eficacia.
Verdadero. La viscosidad influye
cuando la fase móvil es líquida y la
velocidad de difusión influye
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de masa entre la matriz, la muestra y el fluido. cuando la fase móvil es gaseosa.

El problema general de la elución en LC se puede
solucionar mediante la variación de la composición
de la fase móvil durante la elución.
El problema general de la elución en GC se puede
solucionar mediante el uso de un patrón interno.
Verdadero. Es lo que se conoce
como elución con gradiente (o
programación del disolvente).
Falso. Se consigue mediante el
incremento de la temperatura.

Tema 2. Cromatografía de gases

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1. Definiciones
a- Volumen de retención neto en GC: Es el volumen de retención (volumen de gas que es
necesario que fluya desde que se inyecta la muestra hasta que sale el soluto) multiplicado
por un factor de corrección de caída de presión (j) debido a que dentro de la columna la
presión no es función lineal del cociente P i/P. El volumen de retención neto corresponde a la
presión promedio de la columna:
0 0
V R= j· t R · F V M = j· t M · F
b- Factor de corrección de caída de presión: Es un parámetro que se debe incluir para
calcular el volumen de retención neto debido a que debido a que dentro de la columna la
presión no es función lineal del cociente Pi/P. De esta forma el volumen de retención neto
corresponde a la presión promedio de la columna:
2
3 [ ( P i / P ) −1 ]
j= 3
2 [ ( P i / P ) −1 ]
c- Volumen de retención específico en GC: Es el volumen neto de eluyente a 0 ºC
necesario para transferir la mitad del soluto en un sistema normalizado a 1 gramo de fase
estacionaria y sin presión en la gota. Se calcula mediante la expresión:
0 0
V R −V M 273 jF ( t R−t M ) 273 K 273
V g= · = · = ·
W TC W TC ρS T C
W = masa de la fase estacionaria
K = coeficiente de distribución
d- Gas portador: Es el gas que sirve como fase móvil en GC. Debe ser químicamente inerte
por lo que se suele usar He, N2 o H2 dependiendo del tipo de detector que se utilice. Antes de
introducirse en la columna debe atravesar un regulador de presión y un regulador de caudal
para mantener una determinada presión. También puede llevar un tamiz molecular para
eliminar agua e impurezas.
e- Tamiz molecular: Es un filtro de carbón activo que se coloca antes de la columna en GC
y que sirve para eliminar agua e impurezas que pueda arrastrar el gas portador.
f- Detector de ionización en llama (FID) empleado en GC: Es el más
usado de los detectores. En un quemador se mezcla el efluente de la
columna con hidrógeno y aire para luego encenderse eléctricamente
produciendo iones y electrones. Al aplicar una diferencia de potencial
entre el quemador y un electrodo colector la corriente se pude medir. Es
un detector sensible, con un amplio intervalo de respuesta y un bajo
ruido. Es resistente y fácil de utilizar, pero es destructivo de la muestra.
g- Detector de captura de electrones (ECD) empleado en GC: Es el más usado en el
análisis de muestras medioambientales por su selectividad para detectar halógenos. El
efluente de la columna pasa por un emisor β que ioniza el gas portador (generalmente N 2) y
genera electrones. Si no hay especies orgánicas la
corriente es constante pero esta corriente disminuye con la
presencia de especies orgánicas que capturan electrones.
Es un detector selectivo a determinados grupos
(halógenos, peróxidos, quinonas y grupos nitro), es
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altamente sensible, no altera la muestra, pero el intervalo de respuesta se limita a uno o dos
órdenes de magnitud.
h- Índice de retención de Kovats: Se define como cien veces el
número de carbonos de un compuesto sin considerar el relleno de la
columna, la temperatura u otras condiciones cromatográficas. Se
determina representando en una serie homóloga el logaritmo del
tiempo de retención ajustado frente al número de átomos de carbono
(exceptuando el miembro de la serie con menor número de
carbonos) e interpolando el soluto de interés.

2. Preguntas de verdadero o falso:

El caudal promedio en el interior de una columna Falso: El medidor de pompas de
en cromatografía de gases se puede medir jabón se coloca al final de la
fácilmente en cabeza de columna con un medidor columna
de pompas de jabón.
En cromatografía de gases, la inyección lenta de Verdadero: Debido a eso la
muestras demasiado grandes provoca un muestra debe inyectarse de un solo
ensanchamiento de las bandas y una mala golpe.
resolución.
La cámara de vaporización de la muestra debe estar Falso: Debe estar por encima de
a 10 ºC por encima del punto de ebullición del los 50 ºC.
compuesto volátil de la muestra.
En cromatografía de gases, las columnas capilares Falso: Las columnas capilares
necesitan muestras mayores que las columnas exigen muestras menores que en
empaquetadas. las ordinarias
Las columnas tubulares abiertas de pared Falso: Las columnas SCOT son
recubierta, WCOT, utilizadas en cromatografía de menos eficaces que las columnas
gases, presentan menor eficacia que las columnas WCOT
abiertas recubiertas con soporte, SCOT.
En una separación cromatográfica de cinco analitos Falso: La resolución óptima se
por cromatografía de gases, en régimen isotérmico, asocia con una temperatura
el aumento de la temperatura de trabajo de la mínima. Si se reduce la
columna implica un aumento del tiempo de elución temperatura se aumenta el tiempo
de los analitos. de elución.
Incrementar la temperatura de una columna de Falso: La resolución óptima se
cromatografía de gases aumenta el tiempo de asocia con una temperatura
retención. mínima. Si se reduce la
temperatura se aumenta el tiempo
de elución.
En una separación cromatográfica de cinco analitos Verdadero: La resolución óptima
por cromatografía de gases, en régimen isotérmico, se asocia con una temperatura
el aumento de la temperatura de trabajo de la mínima. Si se reduce la
columna implica una reducción del tiempo de temperatura se aumenta el tiempo
elución de los analitos. de elución.
La fase estacionaria de una columna Verdadero: Además debe tener
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cromatográfica, en cromatografía de gases, ha de estabilidad térmica y valores de k´

ser inerte químicamente y de baja volatilidad. y de α apropiados.
El detector de ionización en llama es sensible a Verdadero: Estos grupos producen
compuestos orgánicos con excepción de pocos iones o prácticamente
compuestos carbonílicos y carboxilos. ninguno.

3. Preguntas de desarrollo:

a- Explicar brevemente el fundamento básico de la cromatografía de gases. Dibujar un

diagrama esquemático de un equipo de cromatografía de gases indicando cada uno de sus
componentes.
La cromatografía de gases es una técnica analítica de separación de mezclas que se basa
en el diferente reparto de las moléculas de la mezcla entre una fase móvil (gas) y una fase
estacionaria (líquido o sólido).
Presenta como ventajas una gran capacidad de resolución, un análisis rápido, la necesidad
de un volumen de muestra pequeño, que se puede hacer un análisis cuantitativo y que hay
detectores muy sensibles. Sin embargo, tiene como inconvenientes que solo es aplicable a
compuestos volátiles no termolábiles.
Por lo general la utilización de la cromatografía de gases está restringida a la separación
de compuestos con un peso molecular menor de 1000 a una temperatura máxima de trabajo
de aproximadamente 400 ºC. Dentro de esos límites, la única limitación será la estabilidad
térmica de la muestra.
Para realizar una separación mediante cromatografía de gases, se inyecta una pequeña
cantidad de la muestra a separar en una corriente de un gas inerte a elevada temperatura; esta
corriente de gas atraviesa una columna cromatográfica que separará los componentes de la
mezcla por medio de un mecanismo de partición (cromatografía gas-líquido), de adsorción
(cromatografía gas-sólido) o, en muchos casos, por medio de una mezcla de ambos. Los
componentes separados emergerán de la columna a intervalos discretos y pasarán a través de
algún sistema de detección adecuado, o bien serán dirigidos hacia un dispositivo de recogida
de muestras. Un equipo de cromatografía de gases tiene consta de las siguientes partes:

1. Fuente de gas
2. Sistema de inyección
3. Horno y columna
4. Sistema de detección
5. Sistema de registro
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b.1- Dibujar y describir una válvula de inyección de 6 vías,

así como su funcionamiento.
b.2- Observe el esquema de la figura adjunta. Comente de
lo que se trata.

Una válvula de 6 vías es un sistema de inyección de muestra en cromatografía que sirve

para análisis cuantitativos. Consta de un bucle de carga con una capacidad perfectamente
conocida y una válvula rotatoria que tiene dos posiciones:
- En la posición de carga el bucle y el
conducto que se dirige a la columna no se
pueden poner en contacto. Se llena el
bucle con la mezcla a separar quedando
cargado.
- En la posición de inyección la válvula se
gira de manera que se ponen en contacto
el bucle y el conducto que se dirige a la
columna. De esta manera el eluyente
empuja al contenido del bucle hacia la columna y como se conoce exactamente el
volumen de muestra que se ha introducido, se puede llevar a cabo un análisis
cuantitativo.

c- Comentar brevemente los tipos de columnas y fases estacionarias que se emplean en

cromatografía de gases.
Con respecto a las columnas, pueden ser de dos tipos:
- Columnas abiertas o columnas capilares: Es un tubo de vidrio o de sílice fundida en
cuyo interior se dispone la fase estacionaria. Pueden ser de dos tipos:
o Columnas WCOT: Son las más frecuentes
porque son las más eficaces. En ellas la fase
estacionaria se encuentra depositada formando
una película líquida directamente sobre la
pared del tubo. Las nuevas columnas WCOT
son las FSOT que contienen sílice fundida
o Columnas PLOT: En estas columnas la pared interna del tubo está recubierta por
una capa de un soporte adsorbente. Si a su vez el soporte está impregnado con una
fase estacionaria líquida, las columnas se denominan SCOT. Generalmente el
material de soporte es tierra de diatomeas
- Columnas rellenas: Están cada vez más en desuso. Son tubos de vidrio, de metal o de
teflón que se rellenan con un material sólido finamente dividido y homogéneo que se
recubre con una fina capa de fase estacionaria líquida.
Con respecto a la fase estacionaria, las fases estacionarias más usadas son:
- Polisiloxanos o siliconas: Son los más usados debido a su estabilidad térmica y a que
pueden modificar químicamente la estructura de su base para obtener fases con
diferentes polaridades y selectividades. La estructura química de los polisiloxanos es:
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Los grupos R pueden ser grupos metilo, fenilo o

trifluorometilpropilo, resultando así una gran cantidad de
fases estacionarias de distinta selectividad.

- Polietilenglicoles: Son muy útiles para separar compuestos polares y con posibilidad de
formar puentes de hidrógeno. Las características de retención de esta fase estacionaria
están en la concentración de -OH mientras que la estabilidad reside en el peso
molecular.

Estas fases estacionarias se pueden mejorar:

- Fases estacionarias enlazadas y con enlaces entrecruzados: Las columnas
comerciales tienen fases estacionarias con enlaces entrecruzados para originar una fase
estacionaria de larga duración a la que no le afecte el sangrado (pérdida de una pequeña
cantidad de líquido estacionario durante el proceso de la elución).
- Fases estacionarias quirales: Sirven para la separación de enantiómeros mediante
cromatografía de gases. Hay dos procesos: El primero se basa en la formación de
compuestos derivados del analito con un reactivo ópticamente activo, originando un par
de diastereoisómeros, ópticamente activos. El segundo utiliza un líquido quiral como
fase estacionaria.

d- Describir brevemente cinco de las características que debe poseer un detector ideal en
cromatografía de gases.
1. Adecuada sensibilidad
2. Buena estabilidad y reproducibilidad
3. Respuesta lineal para los solutos que se extiende a varios órdenes de magnitud.
4. Intervalo de temperatura de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente
hasta al menos 400 ºC.
5. Tiempo de respuesta corto que sea independiente del caudal.
6. Alta fiabilidad y manejo sencillo.
7. Respuesta semejante para todos los solutos o, por el contrario, una respuesta
selectiva y altamente predecible para uno o más tipos de solutos.
8. Ser un detector no destructivo de la muestra.

e- Enumerar cinco detectores de los más empleados en GC y comentar las características

de uno de ellos.
Los detectores más empleados en cromatografía de gases son:
- Detector de ionización en llama (FID):
- Detectores de conductividad térmica (TCD) o catarómetros:
- Detectores de quimioluminiscencia de azufre (SCID):
- Detectores de captura de electrones (ECD):
- Detectores de emisión atómica (AED):
- Detectores termoiónicos (TID):
- Detectores fotométricos de llama (FPD):
- Detectores de fotoionización
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f- Describir brevemente el detector de llama en cromatografía de gases.

El detector de ionización de llama es, tal vez, el más
ampliamente utilizado en cromatografía de gases. Este tipo
de detector es en la práctica de respuesta universal, ya que
es selectivo hacia los compuestos que presenten enlaces C-
H, por lo que son muy pocos los compuestos que no dan
señal en él.
En un detector de ionización de llama, el gas procedente
de la columna se mezcla con hidrógeno y esta mezcla se
quema en una cámara con exceso de aire. Por encima de la
llama, se dispone un colector cilíndrico polarizado con el
fin de recoger los iones generados; sobre este dispositivo,
se mide la corriente iónica que se establece entre la punta
del quemador y el electrodo colector.
El mecanismo de generación de iones en este detector es complejo, pero se cree que son
generados por medio de un proceso de ionización química, en el que la energía liberada por
reacciones fuertemente exotérmicas es retenida por las moléculas orgánicas, generándose
iones a partir de las moléculas excitadas.
La ionización en llama de los compuestos que contienen carbono es más compleja,
aunque se sabe que el número de iones producidos es directamente proporcional al número
átomos de carbono reducidos. En este caso el detector responde al número de átomos de
carbono que entran en el detector, por lo que es más un detector sensible a la masa que
sensible a la concentración.
Por otra parte, los grupos carbonilo, alcohol, halógenos y aminas no originan iones y
además es insensible a los gases no combustibles como agua, CO 2, SO2 y NOx por lo que es
muy útil para el análisis de compuestos orgánicos y también sirve para la detección de
contaminantes en muestras de agua.
Es un detector sensible, con un amplio intervalo de respuesta y un bajo ruido. Es
resistente y fácil de utilizar, pero tiene el inconveniente que es destructivo de la muestra.

g- Explicar el fundamento de la cromatografía gas-sólido y comentar los distintos tipos de

adsorbentes que se utilizan.
Se basa en la adsorción de sustancias gaseosas sobre superficies sólidas. Los coeficientes
de distribución son generalmente mucho mayores por lo que es u´til para la separación de
especies que no se retienen en columnas de gas-líquido (componentes del aire, H 2S, CS2,
NOx, CO, CO2 y gases nobles).
Se lleva a cabo tanto en columnas de relleno como en columnas abiertas. En estas últimas
se fija en las paredes del capilar una delgada capa de adsorbente (y se les denomina
columnas abiertas de pared porosa o columnas PLOT). Los adsorbentes pueden ser de dos
tipos:
- Tamices moleculares: Son intercambiadores de iones de silicato de aluminio.
- Polímeros porosos: A partir de estireno polimerizado con divinilbenceno.
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Tema 3. Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC)

1. Definiciones:
a- Constante de distribución en LC: Un soluto establece un equilibrio entre la fase móvil y
la fase estacionaria, con una constante denominada constante, coeficiente o razón de
distribución:
[ A ] estacionaria c s
A móvil ⇄ A estacionaria K = =
[ A ] móvil cm
A aquellas cromatografías donde el valor de K es constante en un amplio intervalo de
concentraciones se les denomina cromatografías lineales y en ellas los picos son gaussianas
simétricas características y los tiempos de retención son independientes de la cantidad del
analito inyectado.
b- Plato teórico en LC: Es un parámetro relativo que se usa para cuantificar la eficacia de
una columna cromatográfica y que relaciona el tiempo de retención y la anchura de banda.
El número de platos teóricos de una columna se puede calcular como:
2
tR
N =16 ( )W
c- Ensanchamiento de banda extracolumna en LC: Es un ensanchamiento de banda no
provocado por la propia columna o su relleno que tiene lugar cuando se transporta la
muestra a través de tubos como los que se utilizan en los sistemas de inyección, en los
detectores y en los tubos que conectan los distintos componentes de cualquier instrumental
de cromatografía HPLC. Se debe a las diferencias en las velocidades en el interior del fluido
porque las capas centrales se mueven más rápidamente que las capas adyacentes a las
paredes del tubo.
d- Elución en gradiente: Es una cromatografía HPLC en la que se usan dos o más
disolventes y se cambia la proporción de los mismos a lo largo del proceso.
e- Elución isocrática: Es una cromatografía HPLC en la que se usa un solo disolvente, por
lo que la composición del disolvente es constante a lo largo de toda la elución.
f- Bomba recíproca en HPLC: Es una
pequeña cámara donde el disolvente es
impelido por el movimiento de vaivén de un
pistón accionado por un motor de arrastre. Dos
válvulas con cierre de bola, que se abren y se
cierran alternativamente, controlan el flujo del
disolvente hacia dentro y hacia afuera de un
cilindro. Tienen la desventaja de producir un
flujo pulsado.
g- Cromatografía de pares iónicos: Es un tipo de cromatografía de reparto inversa que se
usa para la determinación de especies iónicas cuya fase móvil es un tampón acuoso con un
disolvente orgánico y un compuesto iónico que aporta un contraión al analito para formar
una especie neutra que es retenida por el relleno de la fase inversa. Se usa para la separación
de iones clorato y nitrato.

2. Preguntas de verdadero o falso:
La elución isocrática se produce por un cambio
continuo de la composición del disolvente.
La elución en gradiente en una columna por
cromatografía de líquidos consiste en eluir
cambiando la concentración de los componentes de
la fase móvil.
Muestras y eluyentes, en HPLC, deben filtrarse a
través de membranas y tamaño de poro pequeño
para eliminar partículas no solubles.
Las precolumnas analíticas se utilizan para
aumentar la vida de la columna analítica y se
colocan justo antes de la entrada al detector.
El acoplamiento de un espectrómetro de masas a un
cromatógrafo de líquidos necesita una interfase
debido a las elevadas condiciones de presión que
requiere el detector.
La eficacia, número de platos teóricos de un sistema
HPLC depende del caudal de trabajo.
En HPLC la identificación de los picos se basa solo
en el tiempo de retención.
La eficacia de una columna de HPLC aumenta
cuando aumenta el tamaño de partícula del relleno.
La cromatografía en la que se utiliza una fase
estacionaria apolar y un disolvente polar se
denomina cromatografía en fase inversa o reversa.
Los compuestos orgánicos polares no pueden ser
analizados por fase reversa.
En fase reversa el orden de elución es de menos
polar a más polar.
En la cromatografía de exclusión molecular, cuanto
mayor sea el tamaño de las moléculas de un soluto,
mayor será el tiempo de permanencia en la
columna.
En la cromatografía en capa fina la fase móvil Falso. La fase móvil siempre es
puede ser un líquido o un gas. líquida
En cromatografía en capa fina el flujo de la fase Falso. La fase móvil fluye por
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Falso. Es aquella en la que la fase
móvil tiene un solo disolvente.
Verdadero. Se usan dos o más
disolventes y se va cambiando su
relación de forma programada.
Falso. A veces se filtra el eluyente,
pero no es un proceso
imprescindible.
Falso. Se coloca delante de la
columna cromatográfica, como su
propio nombre indica.
Falso. La interfase se debe colocar
porque en la columna hay un
volumen grande mientras que en el
detector se necesita vacío.
Verdadero. La altura de plato es
proporcional al caudal.
Falso. Se basa en el tiempo de
retención y la confirmación
espectral.
Falso. La eficacia aumenta cuando
disminuye el tamaño de partícula.
Verdadero. En fase reversa la fase
estacionaria es apolar
(hidrocarburo) y la fase móvil es
relativamente polar (agua o
metanol)
Verdadero. Los solutos tienen que
tener polaridad semejante a la fase
estacionaria y en fase reversa esta
fase es apolar.
Falso: Es al revés, de más polar a
menos polar.
Falso. Las moléculas grandes no
se retienen por los poros y por lo
tanto no se retienen.
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móvil se puede producir por capilaridad y por capilaridad o por un potencial

gravedad.
La detección y localización de las manchas en la
placa de TLC se hace inicialmente observando el
color inherente de los componentes.
eléctrico.
Falso. Se hace nebulizando sobre
la placa una disolución de yodo o
ácido sulfúrico que reaccionan con
los compuestos orgánicos para dar
productos oscuros.

3. Preguntas de desarrollo:
a - Cromatografía de líquidos de alta
eficacia. Fundamentos, instrumentación y
aplicaciones.
Fundamentos de la HPLC y aplicaciones: La
cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC,
del inglés High Performance Liquid
Chromatography). es la técnica analítica de
separación más ampliamente utilizada por su
sensibilidad, versatilidad y su gran
aplicabilidad a infinidad de sustancias.
La HPLC agrupa a cuatro tipos diferentes de
cromatografía: de reparto, de adsorción, iónica
y de exclusión por tamaño. El uso de una u
otra técnica depende del peso molecular y de la
polaridad de la sustancia a separar. Para solutos de masa molecular superior a 10.000, a
menudo se usa la cromatografía de exclusión por tamaño o la cromatografía de reparto en
fase inversa. Para especies iónicas de masa molecular más pequeña, se utiliza con frecuencia
la cromatografía de intercambio iónico. Los métodos de reparto se aplican a las especies
poco polares pero no iónicas y para la separación de integrantes de una serie homóloga. La
cromatografía de adsorción se elige para separar especies no polares, isómeros estructurales
y grupos de compuestos como por ejemplo, los hidrocarburos alifáticos de los alcoholes
alifáticos.
Instrumentación: Ver siguiente pregunta.

b- Dibujar un dibujo esquemático de un equipo de cromatografía de líquidos indicando

cada uno de sus componentes.
Los componentes básicos para la HPLC se muestran en la siguiente figura:
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Recipiente para la fase móvil y sistemas para el tratamiento de los disolventes: Un aparato
de HPLC contiene uno o más recipientes con un disolvente. Si se usa un solo disolvente se
denomina elución isocrática; si se usan dos o más disolventes se denomina elución con
gradiente.
Además, también se equipan con dos sistemas adicionales:
- Sistema para eliminar los gases disueltos (O2 y N2): Las burbujas que producen estos
gases pueden provocar un ensanchamiento de banda e interfieren en el funcionamiento
del detector. El desgasificador puede ser un sistema de destilación, un agitador de
disolventes o un sistema de purga que arrastra los gases disueltos mediante burbujas de
un gas inerte de baja solubilidad.
- Sistema de filtración de polvo y de partículas en suspensión: Para evitar que se dañe
la bomba, los sistemas de inyección y la columna.
Estos dos sistemas no son imprescindibles si el disolvente se filtra con un filtro millipore
previamente a la introducción en el recipiente.
Sistema de bombeo:
Se utilizan tres tipos de bombas:
- Bombas recíprocas: Es una pequeña cámara
donde el disolvente es impelido por el
movimiento de vaivén de un pistón accionado
por un motor de arrastre. Dos válvulas con
cierre de bola, que se abren y se cierran
alternativamente, controlan el flujo del
disolvente hacia dentro y hacia afuera de un
cilindro. Tienen la desventaja de producir un
flujo pulsado.
- Bombas de desplazamiento: Son grandes cámaras, como una jeringa, equipadas con
un émbolo que se activa mediante un mecanismo de tornillo accionado mediante un
motor paso a paso. El flujo está libre de pulsaciones, pero tiene una capacidad de
disolvente limitada y es incómodo el cambio de disolvente.
- Bombas neumáticas: La fase móvil se coloca en un recipiente plegable colocado en
una vasija que se puede presurizar mediante gas comprimido. Estas bombas están
exentas de impulsos, pero tienen una capacidad limitada y una baja presión de salida.
Sistemas de inyección de la muestra: Para evitar el ensanchamiento de banda, los volúmenes
de muestra han de ser muy pequeños
(de unas décimas de microlitros hasta
los 500 μl). El mecanismo más simple
es con una jeringa a través de un
elastómero que cierra herméticamente.
El mecanismo más utilizado es el de
válvula rotatoria (bucles de muestra)
igual que en la cromatografía de gases.
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Columnas para cromatografías de líquidos: Se construyen con un tubo de acero inoxidable

de diámetro interno uniforme. Si la presión es menor de 600 psi se pueden utilizar también
tubos de vidrio de paredes resistentes.
Sistemas de detección: En cromatografía de líquidos no hay detectores universales ni tan
fiables como en cromatografía de gases. Un detector ideal para cromatografía de líquidos
debe presentar las mismas características que un detector para cromatografía de gases (ver
tema 2) excepto que no es necesario que sea sensible en un amplio intervalo de
temperaturas. Además, debe tener un volumen mínimo para reducir el ensanchamiento de
banda.
Los detectores en HPLC pueden detectar una propiedad de la disolución que es inherente
al efluente (índice de refracción, constante dieléctrica o densidad) o una propiedad del soluto
que es inherente a la fase móvil (absorbancia en UV, fluorescencia o corriente límite).

c- Comentar los posibles sistemas de bombeo que se emplean en HPLC.

Para que un sistema de bombeo de HPLC sea eficaz debe cumplir cinco requisitos:
-Presiones por encima de los 6000 psi.
- Flujo libre de pulsaciones.
- Intervalo de caudales de 0,1 a 10 mL/min.
- Control y reproducibilidad del caudal mejor del 0,5 %.
- Componentes resistentes a la corrosión (teflón o acero inoxidable).
Se utilizan tres tipos de bombas:
- Bombas recíprocas: Es una pequeña cámara
donde el disolvente es impelido por el
movimiento de vaivén de un pistón accionado
por un motor de arrastre. Dos válvulas con
cierre de bola, que se abren y se cierran
alternativamente, controlan el flujo del
disolvente hacia dentro y hacia afuera de un
cilindro. Tienen la desventaja de producir un
flujo pulsado.
- Bombas de desplazamiento: Son grandes cámaras, como una jeringa, equipadas con
un émbolo que se activa mediante un mecanismo de tornillo accionado mediante un
motor paso a paso. El flujo está libre de pulsaciones, pero tiene una capacidad de
disolvente limitada y es incómodo el cambio de disolvente.
- Bombas neumáticas: La fase móvil se coloca en un recipiente plegable colocado en
una vasija que se puede presurizar mediante gas comprimido. Estas bombas están
exentas de impulsos, pero tienen una capacidad limitada y una baja presión de salida.
A veces muchos instrumentos comerciales se equipan con dispositivos que permiten
medir el caudal a través de un restrictor colocado a la salida de la bomba. Cuando hay una
diferencia de señal se aumenta o se disminuye la velocidad del motor de la bomba.

d- Nombrar qué tipos de detectores se utilizan en LC y explicar el fundamento de uno de

ellos.
En cromatografía de líquidos no hay detectores universales ni tan fiables como en
cromatografía de gases. Un detector ideal para cromatografía de líquidos debe presentar las
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mismas características que un detector para cromatografía de gases (ver tema 2) excepto que
no es necesario que sea sensible en un amplio intervalo de temperaturas. Además, debe tener
un volumen mínimo para reducir el ensanchamiento de banda.
Los detectores en HPLC pueden detectar una propiedad de la disolución que es inherente
al efluente (índice de refracción, constante dieléctrica o
densidad) o una propiedad del soluto que es inherente a
la fase móvil (absorbancia en UV, fluorescencia o
corriente límite).
- Detectores de absorbancia: El esquema del
detector se muestra en la figura adjunta. Para
minimizar el ensanchamiento de banda
extracolumna, el volumen de estas cubetas debe ser
mínimo.
 Detectores de absorbancia UV con filtros: Se
trata de un detector UV con un filtro que aísla
una línea de una determinada longitud de
onda. El soluto debe absorber a esta longitud de onda aislada. Estos dispositivos
son útiles cuando se hacen análisis cuantitativos conociendo la composición
cualitativa de la muestra ya que se puede elegir una secuencia de filtros apropiados.
 Detectores de absorbancia UV con monocromadores: Consisten en un
espectrofotómetro de barrido con una red entre sus componentes ópticos.
 Detectores de absorbancia en el IR: Las cubetas son semejantes a las de UV
excepto que las ventanas tienen que ser de cloruro de sodio o de fluoruro de calcio.
Uno de sus mayores inconvenientes es la baja transparencia de muchos disolventes
al IR.
 Detectores de fluorescencia: La fluorescencia se detecta por medio de un detector
fotoeléctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de excitación de
mercurio y uno o más filtros para aislar la radiación emitida. Tienen la ventaja de su
alta sensibilidad.
- Detectores de índice de refracción: En estos detectores, el disolvente en su camino
hacia la columna pasa a través de una mitad de la cubeta y el eluyente de la columna
pasa por la otra mitad. Los dos compartimentos están separados por una placa de vidrio
montada a un ángulo tal que si las dos disoluciones difieren en el índice de refracción se
produce una desviación del haz incidente. El desplazamiento resultante del haz con
respecto a la superficie fotosensible del detector provoca una variación de la señal de
salida, la cual, una vez amplificada y registrada, proporciona el cromatograma.
Estos detectores son universales, fiables y no dependen del caudal, pero son muy
sensibles a los cambios de temperatura.
- Detectores de luz dispersada tras evaporación: El efluente se pasa a un nebulizador
donde se convierte en
una fina niebla mediante
un flujo de nitrógeno o
de aire. La nube de
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partículas de analito pasa a través de un láser cuya dispersión se detecta mediante un

fotodiodo.
- Detectores electroquímicos: Se basan en la amperometría, la voltamperometría, la
culombimetría y la conductimetría. Son métodos sencillos, sensibles y con una extensa
aplicabilidad.
- Detectores por espectrometría de masas (HPLC/MS): Un problema fundamental
para acoplar cromatografía de líquidos y espectrometría de masas es que en la primera
hay un volumen relativamente grande de disolvente y en la segunda se necesita vacío.
Por eso es necesario una interfase que adapte el pase de una técnica a otra. La más
moderna se denomina termovaporización. En ella el líquido se vaporiza en un tubo
capilar de acero inoxidable calentado y se forma un chorro de aerosol constituido por
moléculas de analito y de disolvente. El analito se ioniza por intercambio de carga con
acetato de amonio y va al espectrómetro.

e- Explicar el fundamento de la cromatografía de pares iónicos.

Es un tipo de cromatografía de reparto inversa que se usa para la determinación de especies
iónicas cuya fase móvil es un tampón acuoso con un disolvente orgánico y un compuesto
iónico que aporta un contraión al analito para formar una especie neutra que es retenida por
el relleno de la fase inversa. Se usa para la separación de iones clorato y nitrato.

f- Se dispone de una mezcla de tres compuestos A, B y C, de polaridad decreciente

(polaridad de los compuestos A > B > C), y dos columnas para HPLC de diferente relleno.
La columna 1 posee un relleno de alúmina (relleno de fase normal) y la columna 2 posee
un relleno de C-18 (relleno de fase inversa). Discutir el orden de elución de estos tres
solutos en cada caso. (Ayúdese de un esquema gráfico).
En fase normal el orden de elución es de menos a más polar, por lo tanto, el orden de elución
será C-B-A
En fase reversa el orden de elución es de más a menos polar, por lo tanto, el orden de
elución será A-B-C

g- Se desea separar n-hexano, metanol y cloroformo en una mezcla utilizando la

cromatografía de adsorción en fase normal. Indicar de forma razonada el correcto orden
de elución de estas tres especies.
En fase normal el orden de elución es de menos a más polar, por lo tanto, será n-hexano el
primero, luego ira el cloroformo y finalmente el metanol.

h- Sugerir un tipo de cromatografía líquida adecuado para la separación de los

compuestos que se indican. Además, comente en pocas palabras (no más de 3 líneas) el
fundamento en el que se basa este tipo de cromatografía.
a) Cromatografía de adsorción (o líquido-sólido)
porque puede separar compuestos isómeros.
b) Cromatografía de reparto.
c) Cromatografía de intercambio iónico
(cromatografía iónica) porque está separando dos
cationes.
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d) Cromatografía de exclusión por tamaño (porque se usa para compuestos de alto peso
molecular.

i- Explicar el fundamento de la cromatografía de exclusión por tamaño.

También se le llama cromatografía de penetrabilidad sobre geles o de filtración sobre
geles y se usa fundamentalmente para especies de alto peso molecular. Su característica es
que, a diferencia de otras cromatografías, no implica una interacción física o química entre
los analitos y la fase estacionaria.
El fundamento de esta cromatografía se basa en que la columna contiene una red de poros
uniforme en los que se pueden difundir las moléculas del soluto y del disolvente. Las
moléculas son atrapadas en los poros y el tiempo de residencia depende del tamaño efectivo
de las moléculas:
- Si son más grandes que el tamaño medio de los poros, no se retienen.
- Si son más pequeñas pueden penetrar a través del laberinto de poros y están atrapadas
más tiempo, teniendo en cuenta que la penetración media en los poros depende del
diámetro de las moléculas.
Teoría de la cromatografía de exclusión por tamaño: El coeficiente de distribución del
soluto se puede determinar mediante la expresión:
V −V o c
K= e = S
Vi cM
V e =Volumen de elución
V o =Volumen libre exterior a las partículas de gel
V i =Volumen del disolvente retenido
Los valores de K oscilan entre 0 (para las moléculas muy grandes que no se retienen) y 1
para el caso de moléculas muy pequeñas.
El intervalo útil de pesos moleculares para un determinado relleno se obtiene a partir de
una curva de calibrado. Aquí podemos definir tres partes:
- Límite de exclusión: Es el peso molecular de
una especie por encima del cual no existe
retención. Todas las moléculas de pesos
moleculares superiores no se retienen y eluyen
conjuntamente (formando el pico A de la figura
adjunta).
- Límite de penetración: Es el peso molecular
por debajo del cual las moléculas pueden
penetrar completamente. Por debajo de este
límite las moléculas son tan pequeñas que
eluyen dando lugar a una sola banda (Banda D
de la figura adjunta.
- Región de penetración selectiva: Esta
comprendida entre los dos límites anteriores y
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en ella tiene lugar el fraccionamiento dando lugar a picos de solutos individuales

(Bandas B y C de la figura adjunta).

j.1- Explicar brevemente el fundamento de la cromatografía en capa fina, así como el

desarrollo de la placa y localización de los analitos en la misma (ayúdese de un esquema
gráfico).
j.2- Describir brevemente cómo se realizan las separaciones en capa fina. Ayúdese de un
dibujo.
j.3- Cromatografía en capa fina: Fundamento de la separación y aplicaciones.
Se emplea una fina capa plana y delgada de un material que a la vez es el soporte, o bien
recubre una superficie. La fase móvil se mueve a través de la fase estacionaria por
capilaridad o ayudada de un potencial eléctrico.
Proceso de separación en capa fina: Hay que partir de una placa que constituye la fase
estacionaria. Las placas comerciales se presentan en dos categorías: la convencional y la de
alta eficacia. siendo las primeras más delgadas que las segundas. Las de alta eficacia
permiten separaciones mejores y más rápidas, pero tienen menor capacidad de carga. Sobre
esta capa se aplica la muestra con un capilar o con un aplicador mecánico y se marca su
posición mediante una marca.
A continuación, se va a producir el desarrollo de la placa introduciéndola en un recipiente
cerrado y saturado con los vapores del disolvente con el que se efectuará el desarrollo. Un
extremo de la placa se introduce en el recipiente (sin que la muestra lo toque) y se espera a
que el eluyente ascienda por capilaridad. Cuando se pone en contacto con la muestra, la
disuelve y la arrastra por la placa distribuyéndose entre el disolvente que la desplaza y la
fase estacionaria.
El paso final consiste en determinar los analitos de la placa. Para ello se rocía la placa con
una disolución de yodo o de ácido sulfúrico ya que ambos reaccionan con los compuestos
orgánicos para dar productos oscuros. A veces se pueden emplear reactivos específicos,
como la ninhidrina. Otro método de revelado usa la fluorescencia, incorporando a toda la
placa un compuesto fluorescente. Cuando se termina la cromatografía, se examina la placa
bajo luz ultravioleta y los componentes de la muestra han amortiguado la fluorescencia, de
manera que se ve toda la placa fluorescente
excepto en los puntos donde se han
quedado los compuestos que se estaban
separando.
Eficacia de las placas de capa fina: La
mayoría de los parámetros de la
cromatografía en columna se usan, con
ligeras modificaciones, para la
cromatografía en capa fina aunque es
necesaria la aparición de un nuevo
parámetro que es el factor de retardo, R F.
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Es el cociente entre la distancia alcanzada por el compuesto y la distancia alcanzada por el

frente del disolvente.
d
R F= R
dM
Los valores de RF pueden variar desde 0 hasta 1 (para solutos que no se retrasan).

Tema 4. Otros métodos de separación

1. Definiciones:
a- Fluido supercrítico: Es una sustancia que se encuentra por encima de la temperatura y la
presión crítica. Los fluidos supercríticos tienen las siguientes características: difusividad más
alta que en los líquidos, viscosidades más bajas que en los líquidos, alta capacidad para
disolver moléculas grandes no volátiles y los analitos disueltos en ellos pueden ser
fácilmente recuperados permitiendo que las disoluciones se equilibren con la atmósfera a
temperaturas bajas. Un ejemplo de sustancia con la que se puede trabajar como fluido
supercrítico es el dióxido de carbono que es barato e inocuo.
b- Temperatura y presión supercrítica: La temperatura crítica de una sustancia es la
temperatura por encima de la cual no puede existir en fase líquida independientemente de la
presión. La presión de vapor a esa temperatura es la presión crítica.
c- Extracción con fluidos supercríticos: Es un método para separar los componentes de
una mezcla usando para ello fluidos supercríticos que presenta varias ventajas:
- Es un método rápido porque la velocidad de difusión en el fluido es alta y la viscosidad
es baja.
- El poder disolvente puede modificarse por los cambios en la presión y la temperatura.
- Muchos de los fluidos supercríticos son gases a temperatura ambiente por lo que la
recuperación del analito es sencilla.
- Son baratos, no tóxicos e inertes por lo que se pueden eliminar fácilmente.
d- Movilidad electroforética(μ): Es la velocidad que adquiere la partícula por unidad de
campo eléctrico aplicado, por lo tanto, es el cociente entre la velocidad de la partícula y el
campo eléctrico aplicado. Es directamente proporcional a la carga eléctrica del analito e
inversamente proporcional a los factores de retardo por rozamiento.
e- Velocidad de migración de un ion en electroforesis capilar: Es el producto de la
intensidad de campo aplicada por la movilidad electroforética.
V
v =μ e E= μe
L
f- Electroforesis capilar en gel: Es un método de separación que se basa en la diferente
velocidad de migración de las especies cargadas en una disolución amortiguadora a la que se
aplica un campo eléctrico constante y que permite separaciones con volúmenes pequeños y
con una elevada resolución. Se lleva a cabo inyectando una muestra en una matriz
polimérica con estructura de gel poroso (poliacrilamida) cuyos poros contienen un tampón
en el que se lleva a cabo la separación. Para que se produzca la separación es imprescindible
que el analito tenga carga. La migración dependerá del tamaño y de la forma del ion y de la
viscosidad del medio. Se usa para separar proteínas, fragmentos de ADN y oligonucleótidos
que tienen la misma carga, pero distinto tamaño.
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g- Isotacoforesis capilar: Es un tipo de electroforesis capilar en la que las bandas de todos

los analitos migran a la misma velocidad y sirve para separar cationes o aniones, pero no
ambos a la vez. La muestra se inyecta entre dos tampones con diferente movilidad por lo que
al proporcional el potencial inicial los iones migran a una velocidad característica hasta
separarse en las distintas bandas adyacentes. Una vez separados todos migran a la misma
velocidad porque el potencial es menor para las bandas más móviles y mayor para las
bandas menos móviles por lo que la corriente es la misma en todas las zonas del tampón.

h- Isoelectroenfoque capilar: Se utiliza para la separación de especies anfóteras como

aminoácidos o proteínas que tienen un grupo amino y un grupo ácido.
Los compuestos anfóteros pueden aceptar o ceder un protón y pueden estar en un estado con
una carga positiva y una negativa (estructura de zwitterion). Si las condiciones de pH del
medio son tales que las formas catiónicas son idénticas a las formas aniónicas no se produce
migración, lo cual ocurre en el punto isoleéctrico. En cambio, si el pH cambia se producirá
la migración.
La separación se lleva a cabo en una mezcla de tampones cuyo pH varía a lo largo del
sistema de separación. Una vez realizada la separación es necesario movilizar el contenido
del capilar. Esto se consigue aplicando una diferencia de presión o mediante el cambio de la
disolución del compartimento del electrodo.

i- Electroferograma: Es un gráfico realizado con los resultados de un análisis por

electroforesis que muestra la secuencia de datos producidos por una máquina automática de
secuenciación de ADN.
j- Concentración micelar crítica: Es la concentración mínima de surfactante a partir de la
cual se forman micelas espontáneamente en una disolución. Es un punto definido con
precisión para cada compuesto y se puede conocer mediante RMN.
k- Electrocromatografía capilar: Es una mezcla de la electroforesis capilar y la HPLC. Al
igual que en la electroforesis capilar, proporciona una alta eficacia en las separaciones; al
igual que en la HPLC se utiliza para la separación de especies no cargadas. La fase móvil se
transporta a través de la fase estacionaria por bombeo ejercido por el flujoelectroosmótico y
no por bombeo mecánico, lo que simplifica el equipo y además provoca un perfil de flujo
plano que mejora la eficacia de la separación. Hay dos tipos: electrocromatografía en
columna rellena y cromatografía capilar electrocinética micelar.
l -Cromatografía micelar electrocinética: Sirve para separar solutos no cargados de bajo
peso molecular. En esta técnica se introduce un tensioactivo (dodecil sulfato de sodio) en el
que se forman micelas que son una fase estable que es capaz de alojar compuestos no
polares en el interior solubilizando así compuestos apolares.
Cuando se introduce una muestra los distintos componentes se distribuyen entre la fase
acuosa y el interior de la micela en función de la polaridad: si la polaridad del soluto es alta
se queda en la fase acuosa y si es baja se queda en la micela.
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2. Preguntas de verdadero o falso:

Los fluidos supercríticos son capaces de disolver Falso. Se debe a las altas
moléculas grandes no volátiles, dada su baja densidades de los fluidos
densidad. supercríticos.
EL CO2 y el metanol no pueden emplearse Falso. De hecho, es muy frecuente
conjuntamente como fluidos supercríticos. que se empleen conjuntamente.
La presión en cromatografía de fluidos supercríticos Falso. La presión influye en el
no tiene apenas efecto sobre el factor de retención o factor de retención debido al
de capacidad. incremento de la fase móvil a
medida que aumenta la presión,
aumentando la capacidad
disolvente de la fase móvil y
acortando los tiempos de elución.
En SFC, la presión tiene un efecto muy marcado Falso. El efecto de la presión sobre
sobre el factor de capacidad, debido a la el factor de capacidad se debe a
disminución de la densidad de la fase móvil a que aumenta la capacidad
medida que aumenta la presión. disolvente de la fase móvil.
EN SFC la adición de un modificador orgánico a la Falso. Aumenta la solubilidad de
fase móvil aumenta la solubilidad de los los compuestos de elevada
compuestos no polares. polaridad.
La fase móvil en SFC se encuentra en una bala de Falsa. No se encuentra en una bala
gas a presión. a presión.
En modo dinámico, el fluido supercrítico llega Verdadero. Es la característica de
continuamente fresco a la muestra y la sustancia la extracción en modo dinámico.
extraída fluye continuamente hacia el recipiente
donde se recoge y tiene lugar la despresurización.
En modo estático, la cubeta de extracción se Verdadero. Es la característica de
encuentra presurizada en condiciones estáticas. la extracción estática.
Después del tiempo adecuado, un flujo dinámico de
fluido arrastra el contenido de la cubeta.
El detector de ionización de llama se emplea en Falso. Se usa solo en
cromatografía de gases, de líquidos y de fluidos cromatografía de gases.
supercríticos.
La movilidad electroforética depende de las Falso. Es directamente
características del medio y no de los analitos a proporiconal a la carga eléctrica
separar. del analito e inversamente
proporcional a los factores de
retardo por rozamiento.
La movilidad electroosmótica depende de las Falso. Depende de la carga de las
características del medio y no de los analitos a especies a separar.
separar.
En electroforesis, la separación de iones se produce Verdadero. La masa no influye en
exclusivamente en función de su carga. la electroforesis.
En electroforesis capilar si se aumenta la Falso. No aumenta la velocidad
concentración del electrolito aumenta la velocidad
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electrostática.
En una separación electroforética, son necesarios Falso. Para que aumente la
potenciales muy pequeños para obtener una buena resolución hay que aumentar el
resolución. potencial
En electroforesis capilar si se aumenta el campo Verdadero. Son directamente
eléctrico, aumenta el flujo electroosmótico. proporcionales.

3. Preguntas de desarrollo:

a.1- Dibujar y comentar un diagrama esquemático de un equipo de cromatografía de

fluidos supercríticos, indicando sus componentes, así como la utilidad de cada uno de
ellos.
a.2. Cromatografía de fluidos supercríticos: Fundamento de la técnica, instrumentación y
variables de operación.
Los equipos instrumentales para la SFC son bastante parecidos a los de HPLC aunque se
necesitan añadir dos instrumentos:
- Un horno como el de la cromatografía de gases para mantener la temperatura
termostatizada y mantener la temperatura de la fase móvil.
- Un restrictor o dispositivo de contrapresión para mantener la presión en la columna en
un nivel deseado y para convertir el eluyente de fluido supercrítico a gas y poder
arrastrarlo al detector. Un restrictor típico es un capilar directamente unido al extremo
final de la columna. A veces puede ser una parte integrante de la columna.

Microprocesadores: Un instrumento de SFC está equipado con uno o más

microprocesadores que permiten el control de una serie de variables instrumentales:
Efectos de la presión: Influye en el factor de retención, k´, debido al incremento de la
densidad de la fase móvil a medida que aumenta la presión. Esto se traduce en un
aumento de la capacidad disolvente de la fase móvil, lo que acorta los tiempos de
elución.
Fases estacionarias: La SFC se emplea en columnas abiertas más que en columnas
rellenas. Las columnas abiertas son semejantes a las columnas de sílice fundida.
Fases móviles: La más usada es el dióxido de carbono porque disuelve moléculas
orgánicas no polares, es transparente al UV, inolora, no tóxica, de fácil disponibilidad y
barata. Su temperatura crítica es de 31 ºC y su presión crítica es 72,9 atmósferas.
- Detectores: La principal ventaja de la SFC frente a la HPLC es que se pueden usar
detectores de ionización de llama que es de respuesta universal a compuestos orgánicos,
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de elevada sensibilidad y exento de problemas. También se pueden usar espectrómetros

de masas y muchos detectores usados en HPLC como detector de absorción en el UV,
en el IR, de emisión de fluorescencia, termoiónico y fotométrico de llama.

b- Describir brevemente en qué consiste la extracción con fluidos supercríticos e indicar

las ventajas de esta técnica.
Los análisis de materiales complejos a veces requieren la separación del analito. Un
método de separación debe ser rápido, sencillo, barato, sin pérdidas ni degradaciones y no
producir deshechos.
Los fluidos supercríticos presentan se pueden usar para separaciones porque presentan las
siguientes ventajas:
- Es un método rápido porque la velocidad de difusión en el fluido es alta y la viscosidad
es baja.
- El poder disolvente puede modificarse por los cambios en la presión y la temperatura.
- Muchos de los fluidos supercríticos son gases a temperatura ambiente por lo que la
recuperación del analito es sencilla.
- Son baratos, no tóxicos e inertes por lo que se pueden eliminar fácilmente.

c- Describir la diferencia entre electroforesis convencional y electroforesis capilar.

La electroforesis se puede dar en dos versiones. Electroforesis convencional y electroforesis
capilar. La convencional se lleva a cabo sobre un gel semisólido y poroso donde se disponen
las muestras y tras el paso de la corriente se tiñe. Es muy usada en el campo de la
bioquímica, pero es lenta y difícil de automatizar. La electroforesis capilar permite
separaciones con volúmenes pequeños y con una elevada resolución.

d- Definir flujo electroosmótico y la distribución de cargas en la superficie de un capilar.

Ayúdese de un esquema gráfico.
Al aplicar un potencial elevado a un capilar con un tampón se produce un flujo
electroosmótico por el que el disolvente migra también hacia los electrodos. La causa es la
doble capa eléctrica que se forma en la interfase sílice/disolución. A pH superiores a 3, los
grupos silanol (Si-OH) están ionizados presentando carga negativa por lo que los cationes
del tampón se agrupan sobre la superficie de sílice formando una doble capa eléctrica. Por el
contrario, los cationes son atraídos hacia el cátodo (electrodo -) y como están solvatados
arrastran al resto de la disolución con ellos.
La electroósmosis produce un perfil plano en la disolución, a diferencia del perfil
parabólico del flujo en LC cuyo
origen es la presión. Debido a esto,
el flujo electroosmótico no
contribuye de manera significativa
al ensanchamiento de banda.
La velocidad de flujo electroosmótico es, en general, mayor que las velocidades de
migración de los iones individuales y llega a ser el mecanismo de bombeo de la fase móvil
que arrastra a todas las partículas, tanto las cargadas positiva y negativamente como las
neutras hacia el mismo extremo del capilar de modo que todas pueden detectarse al pasar
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por un punto común. De esta forma, la velocidad de un ion es la suma de la velocidad de

migración y de la velocidad de flujo electroosmótico:
v=( μe + μeo ) E
De esta forma el orden de elución es el siguiente: Primero
los cationes rápidos, después los cationes lentos, todas las
especies neutras en una única zona seguidos de los aniones
lentos; finalmente aparecen los aniones más rápidos. Sin
embargo, es posible que a veces la velocidad del fluo
electroosmótico no sea lo bastante grande como para superar
la velocidad a la que se mueven los aniones hacia el ánodo y
en este caso, estas especies se desplazarán hacia el ánodo y
no hacia el cátodo, como se puede observar en la figura
adjunta.

El flujo electroosmótico se puede invertir añadiendo un

tensoactivo catiónico al tampón para que se absorba sobre la
pared capilar y quede cargada positivamente. Esto se usa para acelerar la separación de los
aniones.
Si se desea evitar el flujo electroosmótico se recubre la pared del capilar con un reactivo
como el trimetilclorosilano, para eliminar los grupos silanol de la superficie.

e- En el siguiente dibujo, correspondiente a un capilar de electroforesis, sitúe los iones

que se indican en el sentido lógico de la migración hacia el cátodo, explicando
brevemente el fundamento de esta técnica.
La técnica es la electroforesis capilar
que es una técnica que se basa en la
diferente velocidad de migración de
las especies cargas en una disolución
amortiguadora a la que se aplica un
campo eléctrico constante.
Debido a la suma de la velocidad de migración y el flujo electroosmótico los cationes
emigran hacia el cátodo (polo -) de una forma más rápida que las especies neutras (que
aparecen todas juntas) y estas más rápido que los aniones, siempre teniendo en cuenta la
relación q/m. Por lo tanto, la primera especie será el catión de pequeño tamaño, luego el
catión mayor, luego la especie neutra, a continuación el anión de menor tamaño y finalmente
el anión de mayor tamaño.

f.1- Explicar brevemente el funcionamiento de la electroforesis capilar. Dibujar un

diagrama esquemático de un equipo de electroforesis capilar de zona, indicando sus
componentes.
f.2- Electroforesis capilar. Fundamentos, instrumentación y aplicaciones.
Fundamento: Es un método de separación que se basa en la diferente velocidad de
migración de las especies cargadas en una disolución amortiguadora a la que se aplica un
campo eléctrico constante. Se lleva a cabo inyectando una muestra en una disolución tampón
alojada en un tubo estrecho o en un medio soporte poroso y plano. El potencial eléctrico que
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se aplica a continuación a la disolución tampón impulsa a los iones de la muestra a migrar

hacia un electrodo u otro. Para que se produzca la separación es imprescindible que el
analito tenga carga y la migración dependerá del tamaño y de la forma del ion y de la
viscosidad del medio por lo que las separaciones se basan en la relación q/m de los analitos.
La electroforesis se puede dar en dos versiones. Electroforesis convencional y electroforesis
capilar. La convencional se lleva a cabo sobre un gel semisólido y poroso donde se disponen
las muestras y tras el paso de la corriente se tiñe. Es muy usada en el campo de la
bioquímica, pero es lenta y difícil de automatizar. La electroforesis capilar permite
separaciones con volúmenes pequeños y con una elevada resolución.
Instrumentación: La instrumentación es sencilla: Un capilar de sílice fundida relleno de un
tampón conecta dos recipientes con el mismo tampón y dos electrodos de platino. La
introducción se lleva a cabo por un extremo y la detección por el otro extremo. Sin embargo,
como los volúmenes de muestra son pequeños hay dificultades en la introducción de la
muestra y en la detección.
- Introducción de la muestra: Los métodos más frecuentes son la inyección
electrocinética y la inyección por presión.
- Inyección electrocinética: Uno de los extremos del capilar se coloca en un
recipiente con la muestra y se aplica un potencial durante un tiempo determinado,
entrando la muestra en el capilar debido a los fenómenos de migración iónica y de
flujo electroosmótico. A continuación, el electrodo se introduce en la disolución
tampón. El problema de esta técnica es que introduce una mayor cantidad de los
iones más móviles.
- Inyección por presión: El extremo del capilar se coloca momentáneamente en un
recipiente con la muestra y se introduce esta por diferencia de presión. Se
introducen todos los iones por igual
pero no puede utilizarse en capilares
rellenos de gel.
- Detección: Los detectores son semejantes
a los de HPLC, aunque hay que tener en
cuenta que, debido a la diferente velocidad
de migración, las bandas atraviesan el
detector a diferentes velocidades por lo que
las áreas de los picos dependen de los
tiempos de retención.
- Métodos de absorbancia: para mejorar
la sensibilidad de las medidas de
absorbancia se han diseñado varios
métodos. Por ejemplo doblar el extremo del capilar en z, formar una burbuja cerca
del extremo del capilar o depositar en el extremo del capilar un recubrimiento de
plata reflectante.
- Detección indirecta: Se usa en especies que debido a su pequeña absortividad
molar, resultan difíciles de detectar sin derivatización. Se incorpora un ion
cromóforo al tampón de la electroforesis haciendo que el detector reciba una señal
constante. Cuando el analito desplaza a estos iones la señal desciende y se puede
cuantificar.
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- Detección por fluorescencia: Incrementa la sensibilidad y la selectividad para los

analitos fluorescentes.
- Detección electroquímica: Puede ser conductimétrica y amperométrica.
- Detección por espectrometría de masas: Los procesos más empleados son la
electronebulización y el bombardeo por átomos rápidos. Se usa mucho para la
separación de proteínas y fragmentos de ADN.
Aplicaciones: Se puede llevar a cabo de cuatro maneras diferentes:
- Electroforesis capilar de zona (CZE): Se pueden separar iones pequeños o moléculas:
Iones pequeños: En las separaciones de cationes estos se mueven hacia el cátodo
mientras que en las separaciones de aniones se invierte el flujo electroosmótico
tratando las paredes del capilar con una sal de alquilamonio.Esta es la técnica más
usada en la actualidad para separar iones pequeños.
Moléculas: Se pueden separar moléculas de pequeño tamaño siempre que sean
cargadas o puedan derivatizarse para dar un ion.
- Electroforesis capilar en gel (CGE): Para separar proteínas, fragmentos de ADN y
oligonucleótidos que tienen la misma carga pero diferente tamaño.
- Isotacoforesis capilar (CITP) Sirve para separar cationes o aniones, pero no ambos a la
vez.
- Isoelectroenfoque capilar: Para separar especies anfóteras como aminoácidos.

g- Explicar brevemente el fundamento de la cromatografía capilar electrocinética

micelar.
Sirve para separar solutos no cargados de bajo peso molecular. En esta técnica se introduce
un tensioactivo (dodecil sulfato de sodio) en el que se forman micelas que son una fase
estable que es capaz de alojar compuestos no polares en el interior solubilizando así
compuestos apolares.
Cuando se introduce una muestra los distintos componentes se distribuyen entre la fase
acuosa y el interior de la micela en función de la polaridad: si la polaridad del soluto es alta
se queda en la fase acuosa y si es baja se queda en la micela.

Tema 5. Métodos automatizados de análisis
1. Preguntas de verdadero o falso:
Los análisis automáticos de análisis, al ser más
rápidos, posibilitan el control continuo de la
composición de los productos mientras se van
fabricando y así modificar las condiciones para
mejorar la calidad o el rendimiento.
En el procedimiento FIA el tiempo de la operación
debe ser reproducible porque pequeñas variaciones
en el mismo pueden producir graves alteraciones en
el resultado.
En el procedimiento FIA las medidas se realizan en
condiciones de estabilidad.
En el procedimiento FIA cuando se detecta la señal,
no se ha alcanzado el equilibrio físico ni químico.
En los métodos FIA, ningún tipo de separación
llega a ser completa, pero esto no tiene importancia
porque los patrones y las muestras se tratan
exactamente igual.
En un sistema FIA, la dispersión está influenciada
por la velocidad de bombeo.
La dispersión en FIA se ve incrementada con la
disminución del volumen de la muestra.
El analizador centrífugo usa una centrífuga para
mezclar las muestras con un reactivo, y luego
transferirlas a las cubetas para las correspondientes
medidas por conductividad térmica.
En las tiras reactivas multicapa, la capa difusora
refleja la radiación procedente de una fuente, que
atraviesa las capas de reactivo y el soporte, hasta el
detector de un fotómetro.
2. Preguntas de desarrollo:
Cuestiones de exámenes MSQA
Verdadero. Es una de las ventajas
de los métodos de análisis
automáticos junto con ahorrar
costes laborables y dar resultados
más reproducibles.
Falso. No es necesario que los
tiempos de operación sean
reproducibles.
Falso. No es necesario que se haya
alcanzado el equilibrio porque los
intervalos de tiempo son muy
reproducibles.
Verdadero. No importa que se
haya alcanzado el equilibrio
Verdadero. Solo es importante
controlar la temperatura y los
caudales de la muestra y de los
patrones que mantengan.
Verdadero. Otros parámetros que
influyen son el volumen de muestra
y la longitud del tubo.
Verdadero. Un aumento en el
volumen de muestra favorece la
dispersión limitada (de 1 a 3).
Falso. Las medidas son por
fotometría.
Verdadero. Es una de las tres
funciones de la capa difusora. Las
otras dos son esparcir la muestra y
retener células y partículas.
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a-Describir las ventajas e inconvenientes de los métodos de análisis automáticos.

Los métodos de análisis automáticos tienen tres ventajas, que llevan asociados
inconvenientes:
1- Importante ventaja económica al ahorrar costes laborales, aunque para ello se requiere
que el volumen de trabajo sea grande como para compensar la inversión de capital y el
gran esfuerzo que hay que hacer para que trabaje a pleno rendimiento. Como
consecuencia se necesita mucho menos personal cualificado, aunque se necesitan
supervisores con una preparación mucho mayor.
2- Su velocidad es mayor que en los dispositivos manuales, lo que posibilita el control
continuo de la composición de los productos mientras se van fabricando, y a su vez, esta
información permite modificar las condiciones para mejorar la calidad o el rendimiento.
Esto es muy útil en medicina, donde el control continuo puede servir para establecer las
condiciones normales de los pacientes y su respuesta a la terapia.
3- Con un buen analizador se pueden conseguir resultados, durante largos periodos de
tiempo, más reproducibles que con un instrumento manual. El aumento en la precisión se
debe, en primer lugar, a que las máquinas no se fatigan, y en segundo lugar a la elevada
reproducibilidad de las medidas de los tiempos en las sucesivas operaciones de los
instrumentos automatizados, que hace que no sea necesario que la reacción sea completa
siempre que las muestras y los patrones se traten por igual.

b-Análisis por inyección de flujo. Fundamento, instrumentación y aplicaciones.

Es un método de análisis derivado de los métodos de flujo segmentado.
Instrumentación: El esquema más simple es el sistema para detección de iones cloruro.
Consiste en una bomba peristáltica que impulsa un reactivo colorimétrico hasta una válvula
que permite la inyección de la muestra.
A continuación, se pasa por un reactor
en forma de serpentín donde se origina
un compuesto coloreado que atraviesa
un fotómetro.
- Sistema de transporte de muestras y reactivos: Habitualmente la disolución circula a
través del sistema por medio de una
bomba peristáltica que es un dispositivo
que comprime por medio de unos
rodillos un fluido que se encuentra en el
interior de un tubo logrando una
corriente permanente de fluido a través
del tubo. Este diseño produce un flujo
relativamente libre de impulsos
- Inyectores de muestra y detectores: Son similares a los de HPLC. Es vital que la
inyección de la muestra sea rápida, en bolus, y que no alteren el flujo de la corriente
portadora. La forma más normal de introducir la muestra es por una válvula de
inyección que se gira permitiendo el paso de fluido o de la muestra alternativamente.
- Separaciones en FIA: En las separaciones FIA no se consigue la separación completa,
pero como los patrones y las muestras se tratan por igual, no importa. Solo es
importante controlar que la temperatura y los caudales de las muestras y de los patrones
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se mantengan. Se pueden realizar tres tipos de separaciones: Diálisis, difusión de gases

y extracción.
Fundamento: Inmediatamente después de inyectar la muestra, la zona de muestra tiene un
perfil de concentración rectangular, pero al ir circulando en el interior del tubo tiene lugar la
dispersión o ensanchamiento de la zona. La dispersión se mide fácilmente inyectando un
patrón y calibrando mediante la ley de Lamer-Beer. En la dispersión influyen tres variables:
El volumen de muestra (para volúmenes grandes la dispersión es la unidad porque no se
mezclan suficientemente la muestra y el portador), la longitud del tubo y la velocidad de
bombeo.
Aplicaciones: Dependen del tipo de dispersión:
- Aplicaciones de la dispersión limitada: Se refieren a dispersiones de 1 a 3. Han tenido
aplicación como sistemas de introducción de la muestra a alta velocidad en sistemas que
usan como sistemas de detección la absorción y la emisión atómicas y el plasma de
acoplamiento inductivo. La inyección con dispersión limitada también se usa con
detectores electroquímicos como los selectivos a iones y los microelectrodos
voltamperométricos.
- Aplicaciones de la dispersión media: Se refieren a dispersiones de 3 a 10. Un ejemplo
es un sistema de dispersión para la determinación colorimétrica de calcio.
- Métodos de flujo detenido: La dispersión es casi nula cuando el flujo se detiene. Se usan
para medidas cinéticas. En este caso el flujo se detiene cuando la mezcla de reacción
está en la cubeta de flujo.
- Variaciones por inyección en flujo: En este caso la mezcla inyectada se mezcla con el
portador en un cámara de mezcla que da lugar a una gran dispersión. A continuación, se
mezcla con el reactivo que contiene un indicador.

c.1- Describa brevemente los tres tipos de separaciones que se pueden llevar a cabo en
sistemas de inyección en flujo.
c.2- Explicar brevemente la separación por diálisis y difusión de gases.
En las separaciones FIA no se consigue la separación completa, pero como los patrones y
las muestras se tratan por igual, no importa. Solo es importante controlar que la temperatura
y los caudales de las muestras y de los patrones se mantengan. Se pueden realizar tres tipos
de separaciones:
- Diálisis: Sirve para separar iones inorgánicos como cloruro y sodio o pequeñas
moléculas orgánicas como la glucosa (proceso que suele preceder a la determinación de
estas moléculas en sangre o en suero) ya
que estas difunden rápidamente a través
de membranas hidrofílicas de acetato o
nitrato de celulosa. Las moléculas
difunden hacia una corriente aceptora
que tiene un reactivo que reacciona con
el analito formando un compuesto
colorimétrico que se detecta
fotométricamente.
- Difusión de gases: Es una técnica muy selectiva para analitos gaseosos. Es parecida a la
diálisis, pero la membrana es de un material hidrofóbico microporoso como el teflón.
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Un ejemplo es la determinación de carbonato total en una disolución. La muestra se

inyecta en una corriente de ácido sulfúrico y el dióxido de carbono liberado difunde
hasta la corriente aceptora que tiene un indicador ácido/base que se detecta
colorimétricamente.
- Extracción: Sirve para separar cationes. Se mezcla la muestra con un líquido orgánico
que contiene un agente complejante que se mezclan en un serpentín. A continuación, se
separan los dos líquidos inmiscibles. La fase orgánica va al detector y la acuosa se
desecha.

d- Definir el término de la dispersión en FIA, así como las variables que influyen en la
misma.
Inmediatamente después de inyectar la muestra, la zona de muestra tiene un perfil de
concentración rectangular, pero al ir circulando en el interior del tubo tiene lugar la
dispersión o ensanchamiento de la zona. El perfil resultante depende de dos fenómenos:
- La convección asociada al flujo laminar ya que el centro del fluido avanza más
rápidamente que el líquido de las paredes.
- La difusión. Puede ser de dos tipos: radial o perpendicular a la dirección del flujo y
longitudinal o paralela al flujo (que no es importante en los tubos estrechos). Debido a
la difusión, la muestra termina adquiriendo una distribución simétrica.

La dispersión se define como:

c
D= 0
c
donde c0 es la concentración inyectada y c es la concentración que llega al detector. La
dispersión se mide fácilmente inyectando un patrón y calibrando mediante la ley de Lamer-
Beer. En la dispersión influyen tres variables: El volumen de muestra (para volúmenes
grandes la dispersión es la unidad porque no se mezclan suficientemente la muestra y el
portador), la longitud del tubo y la velocidad de bombeo.

e- Realice un esquema de un sistema de flujo (indicando columnas, detectores, válvulas y

demás elementos necesarios) diseñado para la determinación de calcio en muestras de
leche y basado en medidas de fotometría de llama. Explique el fundamento y
funcionamiento de este sistema FIA. Dato: El calcio forma un complejo coloreado con o-
cresoftaleína complexona a pH 10.
Se utilizaría un sistema de dispersión media que tendría el siguiente esquema:
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En
él, se usa un tampón de bórax (pH = 10) y un reactivo cromogénico (o-cresoftaleína) que se
mezclan antes de la inyección de la muestra en un serpentín para mezcla (A en la figura). A
continuación, se inyecta la muestra mediante una válvula y se mezcla con la fase móvil en
otra columna (B) que va al detector fotométrico.

f- La determinación de trazas de hierro en alúmina se llevó a cabo admitiendo la

absorbancia del complejo hierro-sulfocianuro, Fe(SCN)63-, en medio ácido empleando un
sistema de análisis por inyección de flujo (FIA). Las figuras siguientes muestran el
sistema FIA utilizado y las señales obtenidas para el calibrado y dos muestras. Explicar
las partes del sistema FIA y calcular la concentración de hierro en las muestras
analizadas.

Hay dos disoluciones. La primera contiene sulfocianuro, que es el agente complejante que se
va a mezclar con la muestra problema en el inyector. Por otro lado, viene una disolución
tampón que mantiene un pH ácido. Ambas disoluciones se unen y atraviesan un reactor en
serpentín que lleva finalmente al detector.
Para determinar la cantidad de hierro de cada una de las dos muestras problemas se hace una
recta de regresión y se interpola en esta.
Absorbancia Hierro
(ppm)
[Fe] 0,45 1 = -0,18333 + 2,6666· Abs
0,275 0,6
0,225 0,4
0,15 0,2
Por lo tanto, la muestra 1 contiene 0,683 ppm de hierro y la muestra 2 contiene 0,4 ppm de
hierro.

g.1- Dado el siguiente esquema FIA, análisis por inyección en flujo, indicar cuáles son
las partes A, B, C y D y para qué se emplean dichas partes.
g.2- Proponga un sistema FIA para la determinación de una muestra M por reacción
química con dos reactivos R1 y R2 que no pueden permanecer mezclados por razones de
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inestabilidad. Indique los canales, serpentines y puntos de confluencia necesarios y

comente brevemente el proceso.
A: Bomba peristáltica: Impulsa los
reactivos.
B: Inyector de muestra
C: Punto de mezcla
D: Reactor en serpentín

h- Observe los esquemas de montaje FIA de la figura adjunta. Ordénelos, de forma

razonada, en sentido creciente de dispersión de la muestra inyectada.
La dispersión será menor reduciendo la distancia entre
inyector y detector, disminuyendo la velocidad y
aumentando el volumen de muestra.
Por lo tanto, en orden creciente, de menor a mayor dispersión
será:
d<a<b<c

i- Explique brevemente el fundamento del análisis con tiras reactivas, así como su
utilidad. Ayúdese de un dibujo esquemático.
Es un método para realizar las distintas etapas de un análisis cuantitativo de forma
automática en tiras individuales formadas por varias capas de reactivos colocadas sobre unas
placas transparentes desechables. Se coloca una gota de la muestra en la parte superior de la
tira haciendo que difundan los componentes y el analito interacciona con los reactivos dando
productos coloreados que se cuantifican por fotometría de reflectancia. Se usa en la
determinación de distintos metabolitos de la sangre.
- Estructura de las tiras: Constan de un soporte transparente, una o varias capas de
reacción, una capa reflectora y una capa difusora o medidora. Un esquema es la tira para
la determinación de glucosa en suero. La tira tiene tres
capas:
La capa difusora o medidora: Sobre ella se coloca la
muestra. Tiene tres funciones: Reflejar la radiación
procedente de una fuente, esparcir la muestra formando
una capa uniforme y retener células, cristales y partículas.
La capa de reactivo: Contiene un indicador redox, la
enzima glucosa oxidasa, peroxidasa y un tampón a pH = 5.
El colorante oxidado absorbe a 495 nm.
Soporte transparente: Es una placa rígida de plástico.
- Instrumentación: La medida se basa en la fotometría de reflectancia, la potenciaometría
selectiva de iones y la fluorescencia.
Fotómetro de reflectancia: Mide la reflectancia difusa de una tira reactiva. La muestra
se ilumina por una radiación de una longitud de onda que absorba el analito formando
un ángulo de 45º con la tira (para minimizar la reflexión frontal de la superficie). Los
datos se expresan como porcentaje de reflectancia.
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Potenciometría: Son sistemas

desechables, para la realización de un
único ensayo, que contienen
membranas selectivas a iones y que
sirven para la determinación de iones.
La concentración se obtiene mediante
la diferencia de potencial entre la celda
de la muestra y la celda del patrón que
se encuentran conectadas mediante un
puente salino.