Anda di halaman 1dari 39

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang


Masalah infertilitas atau kemandulan cenderung disebut sebagai
permasalahan wanita. Kenyataannya tidak demikian. Baik pria dan wanita
masing-masing dapat memiliki permasalahan pada organ reproduksi yang dapat
memengaruhi fertilitas atau kesuburan mereka.
Sekitar 30 persen kasus infertilitas yang terjadi melibatkan gangguan pada
sisi pria. Ada dua kemungkinan, yaitu infertilitas pria jadi masalah utama
pasangannya untuk hamil. Kemungkinan kedua adalah infertilitas sebagai
kombinasi penghambat kehamilan, sebab dari sisi wanita juga memiliki masalah
kesuburan.
Pemeriksaan kesuburan bagi pria sama pentingnya dengan pemeriksaan
kesuburan wanita. Meski sebagian besar pria merasa enggan untuk memeriksakan
diri, terutama karena malu, namun nyatanya penting untuk dilakukan secepatnya
untuk memastikan letak permasalahan.
Berdasarkan laporan yang disusun oleh American Society of Reproductive
Medicine, pria dan wanita memiliki potensi yang sama besarnya mengalami
kemandulan. Kesuburan pria tergantung pada kualitas sperma dan kemampuan
sistem reproduksi pria berejakulasi ke dalam vagina wanita (Wein et al., 2012)
Manurut Mayo Clinic, terdapat beberapa hal yang menyebabkan terjadinya
kemandulan atau infertilitas pada pria yaitu: 1) Jika sistem reproduksi pria hanya
menghasilkan sedikit sperma, 2) Sel sperma tidak normal, 3) Sperma kurang
lincah bergerak atau, 4) Jika terjadi penyumbatan di saluran reproduksi pria yang
mencegah sperma keluar.
Sisanya, karena banyak hal lain seperti faktor panas, hormon, gangguan
ereksi dan ejakulasi, racun, radiasi dan lain-lain. Penyebab terbanyak dari
infertilitas pada pria adalah adanya pelebaran pembuluh vena (pembuluh darah
balik) yang terletak pada buah zakar, biasanya pada buah zakar bagian kiri.
Perubahan gaya hidup dan paparan berbagai faktor yang merugikan di
lingkungan mengakibatkan meningkatnya disfungsi reproduksi laki-laki. Untuk

1
mengungkapkan penyebab infertilitas pada pria, analisis semen klasik dilakukan
sesuai dengan pedoman Organisasi Kesehatan Dunia (WHO). Parameter semen,
konsentrasi sperma, motalitas, viabilitas, dan morfologi dinilai dan
dikelompokkan menjadi empat kategori dasar; normozoospermia,
oligozoospermia, asthenozoospermia, dan/atau teratozoospermia dan
kombinasinya, misalnya oligoasthenozoospermia, oligoasthenoteratozoospermia
(Capkova et al., 2016).
Proses pematangan sperma, kapasitasi dan fertilisasi terjadi di lingkungan
molekul yang berbeda yang disediakan oleh epididimis dan saluran reproduksi
wanita termasuk saluran telur. Kapasitasi membutuhkan transmembran signaling
dan transduksi sinyal intraseluler. kapasitasi ditampilkan untuk diatur dengan jalur
sinyal transduksi yang melibatkan cAMP, protein kinase A (PKA), dan tirosin
kinase.
Tirosin kinase signaling mengarah pada fosforilasi residu tirosin beberapa
protein. Fosforilasi tirosin (TP) berkorelasi dengan timbulnya kapasitasi
fungsional, operasional ditentukan oleh kemampuan sperma untuk membuahi
telur. Kolesterol dari spermatozoal membran mendestabilkan membran. Kalsium
dan Bikarbonat Ion mengalir ke spermatozoan mengaktifkan adenilat Adenyl
yang mengaktifkan cAMP inturn tergantung protein kinase (AMPK) (Sheriff,
2010). Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui apakah
fosforilasi tirosin sperma yang berkapasitas tinggi merupakan penanda yang
berguna untuk kemampuan sperma untuk mengikat zona pelucida dan juga pada
reaksi akrosom. Fosforilasi tirosin sperma dinilai dengan menggunakan
imunofluoresensi dengan antibodi monoklonal anti-fosfotinosin (Liu, 2006).

1.2 Rumusan Masalah


Bagaimana proses tirosin fosforilasi (TP) pada sperma berperan serta dalam
pengikatan dengan zona pelucida dan reaksi akrosom?

2
1.3 Tujuan
Untuk mengetahui proses tirosin fosforilasi (TP) pada sperma yang berperan
serta dalam pengikatan dengan zona pelucida dan reaksi akrosom.

1.4 Manfaat
Makalah ini dapat menjadi referensi tambahan guna menambah ilmu
pengetahuan tentang proses tirosin fosforilasi pada sperma.

3
BAB 2
TINAJUAN PUSTAKA

2.1 Infertilitas pada Pria


2.1.1 Definisi Infertilitas
Menurut the Practice Committee of the American Society for Reproductive
Medicine (ASRM), infertilitas didefinisikan sebagai suatu kegagalan untuk
mencapai kehamilan setelah satu tahun melakukan hubungan seksual secara
regular tanpa menggunakan alat kontrasepsi (Wein et al., 2012). Sedangkan
menurut The International Committee for Monitoring Assisted Reproductive
Technology (ICMART) dan World Health Organization (WHO) tahun 2009
menyebutkan definisi infertilitas secara klinis bahwa infertilitas merupakan suatu
penyakit sistem reproduksi yang ditetapkan dengan adanya kegagalan mencapai
kehamilan klinis setelah 12 bulan atau lebih melakukan hubungan seksual secara
regular tanpa menggunakan alat kontrasepsi (Zegers et al., 2009). Definisi klinis
ini didesain sedemikian rupa untuk dapat mendeteksi sejak dini dan melakukan
penatalaksanaan yang tepat pada kejadian infertilitas (Mascarenhas et al., 2012).

2.1.2 Tipe Infertilitas Pria


Secara garis besar infertilitas dapat dibagi dua yaitu ( Al-Haija, 2011) :
1. Infertilitas primer: merupakan suatu keadaan dimana pria (suami) tidak pernah
menghamili wanita (istri) meskipun telah melakukan hubungan seksual secara
teratur selama >12 bulan secara teratur tanpa kontrasepsi.
2. Infertilitas sekunder: merupakan suatu keadaan dimana pria (suami) pernah
menghamili wanita (istri) tetapi kemudian tidak mampu menghamili lagi
wanita (istri) meskipun telah melakukan hubungan seksual secara teratur
selama >12 bulan secara teratur tanpa kontrasepsi.

2.1.3 Faktor Penyebab Infertilitas Pria


Penyebab yang mendasari infertilitas pria dikelompokkan menjadi 3 faktor
yaitu level pre testikular, testikular, dan post testikular (Tanagho dan Jack, 2008):

4
1. Faktor pre testikular
Yaitu kondisi-kondisi di luar testis dan mempengaruhi proses
spermatogenesis. Kelainan endokrin (hormonal). Kurang lebih 2% dari
infertilitas pria disebabkan karena adanya kelainan endokrin antara lain berupa:
a. Kelainan hipotalamus: defisiensi gonadotropin (Sindrom Kallmann),
defisiensi LH, defisiensi FSH, sindrom hipogonadotropik kongenital.
Adanya kelainan pada hipotalamus menyebabkan tidak adanya sekresi
hormonal yang berperan penting dalam spermatogenesis sehingga
menginduksi keadaan infertil.
b. Kelainan hipofisis: insufisiensi hipofisis (tumor, proses infiltrat, operasi,
radiasi), hiperprolaktinemia, hormon eksogen (kelebihan estrogen-androgen,
kelebihan glukokortikoid, hipertirod dan hipotiroid) dan defisiensi hormon
pertumbuhan (growth hormone) menyebabkan gangguan spermatogenesis.
2. Faktor testikular
a. Kelainan kromosom. Sebagai contoh pada penderita sindroma Klinefelter,
terjadi penambahan kromosom X, testis tidak berfungsi dengan baik,
sehingga spermatogenesis tidak terjadi.
b. Varikokel, yaitu terjadinya dilatasi dari pleksus pampiriformis vena skrotum
yang mengakibatkan terjadinya gangguan vaskularisasi testis yang akan
mengganggu proses spermatogenesis.
c. Gonadotoksin (radiasi, obat)
d. Adanya trauma, torsi, peradangan
e. Penyakit sistemik ( gagal ginjal, gagal hati, dan anemia sel sabit)
f. Tumor
g. Kriptorkismus. Hampir 9% infertilitas pria disebabkan karena
kriptorkismus (testis tidak turun pada skrotum).
h. Idiopatik. Hampir 25%-50% infertilitas pria tidak teridentifikasi
penyebabnya.
3. Faktor post testikular
Merupakan kelainan pada jalur reproduksi termasuk epididimis, vas
deferens, dan duktus ejakulatorius.

5
a. Obstruksi traktus ejakulatorius: disebabkan karena adanya blokade
kongenital, ketiadaan vas deferens kongenital (CAVD), obstruksi epididimis
idiopatik, penyakit ginjal polikistik, blokade didapat (vasektomi, infeksi),
blokade fungsional (perlukaan saraf simpatis, farmakologi)
b. Gangguan fungsi sperma atau motilitas: sindrom immotil silia, defek
maturasi, infertilitas imunologik, infeksi). Pada reaksi imunologi, dapat
ditemukan antibodi sperma pada semen pria fertil dan infertil. Imunologi
didiagnosis menyebabkan infertilitas pria saat 50% atau lebih spermatozoa
yang motil yang dilapisi oleh antibodi sperma. Antibodi sperma ditemukan
pada 3-7% pria infertil dan antibodi ini dapat merusak fungsi sperma dan
menyebabkan infertilitas pada beberapa pria (Al-Haija, 2011).
c. Gangguan koitus: impotensi, hipospadia, waktu dan frekuensi koitus.

2.1.4 Faktor Resiko Infertilitas Pria


Berbagai hal telah diketahui menjadi faktor resiko infertilitas pria, yaitu:
1. Usia
Usia memegang peranan penting dalam fertilitas. Puncak umur kehamilan
terjadi pada usia 34 tahun untuk pria dan wanita dan kemudian setelah usia 35
tahun akan menurun secara signifikan. Penelitian telah menunjukkan bahwa
level testosteron darah akan menurun seiring bertambahnya usia dan resiko pria
untuk menjadi infertil 2 kali lipat lebih besar pada usia di atas 35 tahun
dibandingkan dengan pria di bawah 25 tahun dan 5 kali lipat pada usia di atas
45 tahun. Produksi hormon testosteron mulai menurun sekitar usia 40 tahun,
perubahan kualitas sperma seiring dengan bertambahnya usia juga menurunkan
volume semen, motilitas dan morfologi sperma normal (Al-Haija, 2011).
2. Obesitas
Beberapa studi menyebutkan bahwa terjadi penurunan fertilitas pada pria
gemuk. Sebuah studi di Amerika Serikat menginvestigasi petani dan istri
mereka menunjukkan bahwa peningkatan 10 kg berat badan dapat menurunkan
fertilitas sekitar 10% dan efek terbesar pada pria dengan indeks massa tubuh
(IMT) lebih dari 32. Hal ini disebabkan karena terjadi penurunan jumlah
sperma motil normal secara signifikan pada pria tersebut (Al-Haija, 2011).

6
3. Alkohol
Alkohol merupakan substansi adiktif yang sangat berpengaruh pada fertilitas.
Konsumsi alkohol dengan rentang antara konsumsi alkohol yang jarang hingga
yang berat sangat berdampak pada kesehatan termasuk kegagalan fertilitas.
Konsumsi alkohol dapat merusak aksi HPG dan berpengaruh pada
spermatogenesis sehingga menurunkan kualitas sperma (Carrell ed., 2013).
4. Paparan dalam pekerjaan
Studi di Lebanon menunjukkan bahwa paparan lingkungan pekerjaan sangat
berbahaya terhadap fisik dan bahan kimianya yang dihubungkan dengan
peningkatan resiko infertilitas pria.
5. Olahraga
Terdapat banyak keuntungan yang didapat dari berolahraga secara teratur.
Namun, studi terbaru menunjukkan bahwa olahraga berat jangka panjang dapat
mempengaruhi kualitas parameter semen dan dapat menurunkan jumlah
testosteron total (Al-Haija, 2011).
6. Merokok
Banyak penelitian yang menyelidiki pengaruh merokok terhadap infertilitas
pria. Hasil penelitiannya masih kontroversial; beberapa penelitian
menunjukkan bahwa merokok menyebabkan efek samping pada perburukan
kualitas sperma terutama pada perokok berat, perbedaan itu didasarkan pada
begitu besarnya level stress oksidatif semen pada perokok berat dibandingkan
dengan perokok ringan maupun perokok pasif (Saleh et al., 2001).
7. Laptop dan telepon seluler
Pemaparan jangka panjang pada laptop dapat meningkatkan suhu skrotum dan
berdampak negatif pada parameter sperma. Lebih lanjut, penggunaan telepon
seluler juga berdampak negatif pada infertilitas pria yaitu menurunkan jumlah
sperma yang hidup secara paralel pada setiap kali terpapar telepon seluler dan
juga berhubungan dengan durasi menggunakan telepon seluler tersebut (Al-
Haija, 2011). Studi terbaru juga menunjukkan hal yang serupa yaitu
spermatozoa manusia bila terpapar oleh radiasi gelombang elektormagnetik
dari telepon seluler selain dapat menurunkan jumlah sperma juga dapat

7
menurunkan motilitas sperma dan meningkatkan stress oksidatif sperma
(Vignera et al., 2012).
8. Stres
Hubungan antara stres dengan infertilitas juga diperhitungkan. Pria di bawah
tekanan stres pada hasil pemeriksaan analisa semen menunjukkan terjadi
penurunan yang signifikan pada parameter sperma (Al-Haija, 2011). Hal ini
dikaitkan dengan penurunan level testosteron yang menyebabkan kegagalan
spermatogenesis dan akhirnya berpengaruh pada jumlah, motilitas, dan
morfologi sperma (Carrell, 2013).
2.1.5 Diagnosis Infertilitas Pria
Langkah yang paling penting dalam mendiagnosis pria infertil adalah
melalui anamnesis dan pemeriksaan fisik yang baik. Anamnesis mengenai
riwayat infertilitas (durasi, kehamilan sebelumnya, evaluasi dan pengobatan
fertilitas sebelumnya). Riwayat seksual juga sangat penting ditanyakan seperti
fungsi ereksi, frekuensi dan waktu melakukan hubungan seksual dengan
pasangannya. Riwayat intervensi medis sebelumnya juga tak kalah penting
ditanyakan karena hal tersebut berkontribusi dalam penegakan diagnosis dari
seperempat kasus infertilitas (Al-Haija, 2011).
Rekomendasi terbaru dalam menegakkan diagnosis infertilitas menurut
Practice Committees of the American Urological Association and the American
Society for Reproductive Medicine menyebutkan bahwa perlu dilakukannya
evaluasi infertilitas sebelum 1 tahun jika terdapat faktor resiko infertilitas pria
seperti memiliki riwayat kriptorkrismus bilateral (Wein et al., 2012). Anamnesis
juga mengenai riwayat peradangan seperti orchitis, waktu pubertas, riwayat
keluarga yang mengalami infertilitas dan penyakit sistemik lainnya (Al-Haija,
2011). Pemeriksaan fisik merupakan langkah yang kedua dalam mendiagnosis
abnormalitas yang menyebabkan infertilitas pada pria, terdiri dari pemeriksaan
fisik secara umum dan pemeriksaan genitalia.
Pemeriksaan fisik secara umum seperti pengukuran tinggi, berat badan, dan
tekanan darah yang akan memberikan informasi tentang penyakit sistemik.
Distribusi rambut di tubuh juga memberikan indikasi produksi androgen, ukuran
payudara juga perlu diinspeksi untuk mendeteksi ginekomasti (Al-Haija,2011).

8
Hepatomegali pada pemeriksaan abdomen meningkatkan kecurigaan kejadian
perubahan metabolisme hormon seks steroid (Wein et al., 2012).
Pemeriksaan genitalia dimulai dengan pemeriksaan yang cermat, seperti
pemeriksaan isi skrotum yang merupakan bagian yang paling kritis dalam
pemeriksaan ini. Palpasi permukaan testis harus benar-benar dilakukan dengan
hati-hati untuk menilai konsistensi dan ada atau tidaknya massa dalam testis untuk
menyingkirkan diagnosis infertilitas akibat karsinoma testikular. Ukuran testis
juga merupakan hal yang potensial diperiksa dalam kasus infertilitas. Ukuran
testis normal adalah 4 x 3 cm atau volumenya 20 mL. Palpasi epididimis, korda
spermatika penting dilakukan untuk menentukan apakah terdapat peradangan atau
kelainan lain seperti varikokel yang juga merupakan salah satu bagian dari
etiologi infertilitas pada pria. Pemeriksaan rektal juga sebaiknya dilakukan, untuk
mengevaluasi prostat, apakah terdapat peradangan ataupun kista yang dapat
menyumbat duktus ejakulatorius (Wein et al., 2012).
Setelah melakukan anamnesis dan pemeriksaan fisik maka perlu dilakukan
evaluasi lebih lanjut dalam menegakkan diagnosis infertilitas pada pria melalui
pemeriksaan analisis semen. Analisis semen merupakan prediktor yang sangat
penting dalam menentukan fertilitas pria. Analisis semen berguna untuk
mengevaluasi variasi dari parameter termasuk karakteristik spermatozoa, plasma
semen dan sel non-sperma (Wein et al., 2012).

2.2 Spermatogenesis
Spermatogenesis merupakan proses pembentukan spermatozoa.
Spermatozoa merupakan sel yang dihasilkan oleh fungsi reproduksi pria
(Junqueira dan Jose, 2007). Spermatozoa merupakan sel hasil maturasi dari sel
germinal primordial yang disebut dengan spermatogonia. Spermatogonia berada
pada dua atau tiga lapisan permukaan dalam tubulus seminiferus. Spermatogonia
mulai mengalami pembelahan mitosis, yang dimulai saat pubertas, dan terus
berproliferasi dan berdiferensiasi melalui berbagai tahap perkembangan untuk
membentuk sperma (Guyton dan Hall, 2007).

9
Gambar 2.1 Spermatogenesis (Guyton dan Hall, 2007)
Spermatogenesis terjadi di tubulus seminiferus selama masa seksual aktif
akibat stimulasi oleh hormon gonadotropin yang dihasilkan di hipofisis anterior,
yang dimulai rata-rata pada umur 13 tahun dan terus berlanjut hampir di seluruh
sisa kehidupan, namun sangat menurun pada usia tua (Guyton dan Hall, 2007).
Pada tahap pertama spermatogenesis, spermatogonia bermigrasi di antara
sel- sel sertoli menuju lumen sentral tubulus seminiferus. Sel-sel sertoli ini sangat
besar, dengan pembungkus sitoplasma yang berlebihan yang mengelilingi
spermatogonia yang sedang berkembang sampai menuju bagian tengah lumen
tubulus (Guyton dan Hall, 2007).
Proses berikutnya adalah pembelahan secara meiosis. Pada tahap ini
spermatogonia yang melewati lapisan pertahanan masuk ke dalam lapisan sel
Sertoli akan dimodifikasi secara berangsur-angsur dan membesar untuk
membentuk spermatosit primer yang besar. Setiap spermatosit tersebut,
selanjutnya mengalami pembelahan mitosis untuk membentuk dua spermatosit
sekunder. Setelah beberapa hari, spermatosit sekunder ini juga membelah menjadi
spermatid yang akhirnya dimodifikasi menjadi spermatozoa (sperma) (Guyton dan
Hall, 2007).

10
Selama masa pergantian dari tahap spermatosit ke tahap spermatid, 46
kromosom spermatozoa (23 pasang kromosom) dibagi sehingga 23 kromosom
diberikan ke satu spermatid dan 23 lainnya ke spermatid yang kedua (Sherwood,
2012). Keadaaan ini juga membagi gen kromosom sehingga hanya setengah
karakteristik genetik bayi yang berasal dari ayah, sedangkan setengah sisanya
diturunkan dari oosit yang berasal dari ibu. Keseluruhan proses spermatogenesis,
dari spermatogonia menjadi spermatozoa, membutuhkan waktu sekitar 74 hari
(Guyton dan Hall, 2007).
Proses selanjutnya adalah pembentukan sperma. Ketika spermatid dibentuk
pertama kali, spermatid tetap memiliki sifat-sifat yang lazim dari sel-sel epiteloid,
tetapi spermatid tersebut segera berdiferensiasi dan memanjang menjadi
spermatozoa. Masing-masing spermatozoa terdiri atas kepala dan ekor. Kepala
terdiri atas inti sel yang padat dengan hanya sedikit sitoplasma dan lapisan
membran sel di sekeliling permukaannya. Di bagian luar, dua pertiga anterior
kepala terdapat selubung tebal yang disebut akrosom yang terutama dibentuk oleh
apparatus Golgi. Selubung ini mengandung sejumlah enzim yang serupa dengan
enzim yang ditemukan pada lisosom dari sel-sel yang khas, meliputi hialuronidase
(yang dapat mencerna filamen proteoglikan jaringan) dan enzim proteolitik yang
sangat kuat (yang dapat mencerna protein). Enzim ini memainkan peranan penting
sehingga memungkinkan sperma untuk memasuki ovum dan membuahinya
(Guyton dan Hall, 2007).
Ekor sperma, yang disebut flagellum, memiliki tiga komponen utama yaitu
(1) kerangka pusat yang secara keseluruhan disebut aksonema, yang memiliki
struktur yang serupa dengan struktur silia yang terdapat pada permukaan sel tipe
lain; (2) membran sel tipis yang menutupi aksonema; dan (3) sekelompok
mitokondria yang mengelilngi aksonema di bagian proksimal ekor ( badan ekor)
(Guyton dan Hall, 2007).
Gerakan maju-mundur ekor (gerakan flagella) memberikan motilitas
sperma. Gerakan ini disebabkan oleh gerakan meluncur longitudinal secara ritmis
di antara tubulus posterior dan anterior yang membentuk aksonema. Sperma yang
normal bergerak dalam medium cair dengan kecepatan 1 sampai 4 mm/menit.

11
Kecepatan ini akan memungkinkan sperma untuk bergerak melalui traktus
genitalia wanita untuk mencapai ovum (Guyton dan Hall, 2007).
Proses selanjutnya setelah pembentukan sperma adalah pematangan sperma
di epididimis. Setelah terbentuk di tubulus seminiferus, sperma membutuhkan
waktu beberapa hari untuk melewati tubulus epididimis yang panjangnya 6 meter.
Sperma yang bergerak dari tubulus seminiferus dan dari bagian awal epididimis
adalah sperma yang belum motil, dan tidak dapat membuahi ovum. Akan tetapi,
setelah sperma berada dalam epididimis selama 18-24 jam, sperma akan memiliki
kemampuan motilitas (Guyton dan Hall, 2007).
Kemampuan bergerak maju (motilitas progresif) yang diperoleh di
epididimis, melibatkan aktivasi suatu protein unik yang disebut CatSper, yang
berada di bagian utama ekor sperma. Protein ini tampaknya adalah suatu kanal
Ca2+ yang memungkinkan influx Ca2+ generalisata c-AMP. Selain itu,
spermatozoa mengekspresikan reseptor olfaktorius, dan ovarium menghasilkan
molekul mirip odoran. Bukti-bukti terkini mengisyaratkan bahwa berbagai
molekul ini dan reseptornya saling berinteraksi, yang memperkuat gerakan
spermatozoa ke arah ovarium (Ganong, 2008).

2.3 Analisa Sperma


2.3.1 Analisa Sperma Secara Makroskopis
1) Pengukuran Volume
Sperma ditampung seluruhnya dalam botol penampung yang bermulut
lebar untuk sekali ejakulasi. Volume diukur dengan gelas ukur yang
mempunyai skala volume 0,1 ml, kemudian baca hasil. Volume yang
normal menurut WHO > 1,5 ml. WHO merekomendasikan untuk
menentukan volume dengan menimbang botol sebelum dan setelah
pengumpulan sperma. Spesifik berat semen lebih kurang 1 g per ml.
Volume yang lebih dari 8 ml disebut Hyperspermia, Sedangkan yang kurang
dari 1 ml disebut Hypospermia. Kesan volume ini menggambarkan kerja
kelenjar prostat dan vesika seminalis.

12
2) pH
pH sperma yang normal tidak banyak berbeda dengan pH darah, untuk
mengukur pH dapat dengan menggunakan kertas pH atau pH meter. Sperma
yang normal menunjukan pH yang bersifat basa yaitu 7,2 –7,8. pH yang
rendah terjadi karena peradangan yang kronis dari kelenjar prostat,
Epididimis, vesika seminalis atau kelenjar vesika seminalis kecil, buntu
maupun rusak.
3) Bau Sperma
Spermatozoa yang baru keluar mempunyai bau yang khas atau
spesifik. Bau Sperma yang khas tersebut disebabkan oleh oksidasi spermin
(suatu poliamin alifatik) yang dikeluarkan oleh kelenjar prostat.
4) Warna Sperma
Memeriksa warna sperma sekaligus memeriksa kekeruhan. Sperma
yang normal biasanya berwarna putih keruh seperti air kanji kadang-kadang
agak keabu-abuan.
Adanya leukosit yang disebabkan oleh infeksi traktus genitalia dapat
menyebabkan warna sperma menjadi putih kekuningan. Adanya perdarahan
menyebabkan sperma berwarna kemerahan.
5) Likuifaksi
Likuifaksi diperiksa 20 menit setelah ejakulasi (setelah dikeluarkan).
Dapat dilihat dengan jalan melihat koagulumnya. Bila setelah 20 menit
belum homogen kemungkinan ada gangguan pada kelenjar prostat. Bila
sperma yang baru diterima langsung encer tidak mempunyai koagulum
mungkin karena saluran pada kelenjar vesica seminalis buntu atau memang
tidak mempunyai vesika seminalis.
6) Viskositas (Kekentalan)
Kekentalan atau viskositas sperma dapat diukur setelah likuifaksi
sperma sempurna. Semakin kental sperma tersebut semakin besar
viskositasnya. Hal ini mungkin disebabkan karena :
a. Spermatozoa terlalu banyak
b. Cairannya sedikit
c. Gangguan likuifaksi

13
d. Perubahan komposisi plasma sperma
e. Pengaruh obat-obatan tertentu
7) Fruktosa Kualitatif
Fruktosa sperma diproduksi oleh vesica seminalis. Bila tidak didapati
fruktosa dalam sperma, hal ini dapat disebabkan karena :
a. Azospermia yang disebabkan oleh agenesis vas deferens.
b. Bila kedua duktus ejakulatorius tersumbat.
c. Kelainan pada kelenjar vesika seminalis.
Tabel 1. Gambaran Makroskopik Analisis Semen (WHO, 2010)

2.3.2 Analisa Sperma Secara Mikroskopik


1) Motilitas/ Pergerakan Sperma
Penilaian motilitas sperma dilakukan segera setelah likuifaksi semen
sempurna. Motilitas sperma diperiksa dengan pembesaran 200-400 x.
Sebanyak 200 spermatozoa dinilai dan diklasifikasikan menjadi :
a. Progressive motility (PR) : Gerakan aktif kedepan atau sedikit
melengkung
b. Non-progressive motility (NP) : Tidak ada gerakan maju atau gerak maju
melingkar
a. Immotility (IM) : Tidak ada gerakan yang terlihat.

14
Setidaknya dua slide dengan 200 spermatozoa di klasifikasikan
menggunakan kriteria diatas harus mempunyai nilai sebanding. Hasil kedua
penghitungan dirata ratakan dan dinyatakan dalam persentase. Nilai acuan
untuk motilitas adalah >40% sperma motil (PR+NP), >32% motilitas
progresif (PR).
Asthenozoospermia adalah istilah dimana persentase motilitas sperma
yang motil progresif di bawah 32%. Asthenozoospermia dapat terjadi akibat
likuifaksi yang tidak sempurna, autoantibodi, peradangan dan gangguan dari
ekor sperma. False-negative asthenozoospermia dapat terjadi bila sperma
dingin, sperma tua atau kontaminasi pada saat pengumpulan sperma
(misalnya kontaminasi dengan sabun).
2) Menilai Vitalitas
Bila lebih dari 40% spermatozoa tidak bergerak maka harus dilakukan
pewarnaan dengan eosin. Jika banyak sperma immobile yang hidup (>
58%), kemungkinan ini suatu cacat flagela. Bila banyak sperma yang mati
(necrozoospermia) lebih dari 42% ini merupakan indikator penyakit
epididimis.
3) Perhitungan Jumlah Sperma
Perhitungan konsentrasi spermatozoa dapat ditentukan dengan
mengunakan metode hemositometer atau ”electronic coulter counter”.
Metode hemositometer lebih sering digunakan untuk sperma yang
mempunyai perkiraan spermatozoa yang sangat rendah (misalnya 10
juta/ml) atau bila pemeriksaan sperma yang memerlukan penentuan jumlah
dengan segera.
Sperma yang telah diaduk dengan baik diencerkan 1:10, 1:20 Sebagai
pengencer berisi 50 gr NaHCO3, 10 ml formalin 35 %, 5 ml cairan gentian
violet pekat dan aquadestilita sampai 1000 ml. Sperma yang diencerkan
harus diaduk lebih dahulu dan segera dipindahkan ke kamar hitung/ inprove
Neubauer yang telah ditutup dengan kaca penutup (deck glass).
Inprove Neubauer ini diletakkan di kamar lembab selama 15 menit
agar semua sel mengendap, kemudian dihitung dibawah mikroskop cahaya
atau mikroskop fase kontras dengan lensa objektip 10 (pembesaran 100x),

15
spermatozoa (sel benih) yang matang dan mempunyai ekor yang dihitung.
Konsentrasi sperma adalah jumlah spermatozoa/ ml semen. Sedangkan
jumlah spermatozoa total ialah jumlah spermatozoa dalam ejakulat.
Perhitungan :
Luas = 1 mm2
Tinggi = 0,1 mm
Vol = 0,1 mm3
Jumlah sperma dlm 1 mm3 = 1/0,1 x N x pengenceran
= 10 x N x pengenceran
= 10 x N x pengenceran/mm3
Jumlah spermatozoa/cc = 10 N x Pengenceran x 1000
Keterangan :
N = Jumlah sperma yang dihitung dalam kotak kamar
hitung.
4) Morfologi Sperma
Penilaian morfologi sperma dilakukan dengan sediaan hapus sperma
yang diwarnai dengan giemsa di baca dengan pembesaran 1000 ×. Kriteria
untuk klasifikasi morfologi normal dan patologis dapat dilihat pada tabel
kriteria morfologi sperma.
Table 2. Kriteria normal dan abnormal Morfologi sperma (WHO, 2010)

16
Gambar 2.2 Struktur Morfologi Sperma Normal ( Guyton dan Hall, 2007)

Morfologi normal spermatozoa biasanya kurang dari 25%. Dikatakan


sebagai Teratozoospermia bila dijumpai spermatozoa dengan morfologi
normal kurang dari 4% .
Tabel 3. Batas referensi terendah untuk karakteristik semen (WHO, 2010)

PR = progressive; NP = non-progressive; MAR = Mixed antiglobulin


reaction.
Sumber :Guidelines on Male Infertility. European Association of Urology
update

17
Pemeriksaan Andrologi yang komprehensif diindikasikan jika analisis
semen menunjukkan kelainan dibandingkan dengan nilai acuan (Tabel 2.3).
WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human
Semen (edisi ke-5) merupakan konsensus yang enjadi panduan yang harus
di ikuti oleh spermatology modern.

2.4 Kapasitasi dan Reaksi Akrosom


Kapasitasi adalah suatu masa penyesuaian di dalam saluran reproduksi
wanita, yang pada manusia berlangsung kira-kira 7 jam. Selama waktu ini, suatu
selubung dari glikoprotein dari protein-protein plasma segmen dibuang dari
selaput plasma, yang membungkus daerah akrosom spermatozoa. Hanya sperma
yang menjalani kapasitasi yang dapat melewati sel korona dan mengalami reaksi
akrosom (Langman, 1994).
Reaksi akrosom terjadi setelah penempelan ke zona pelusida dan diinduksi
oleh protein-protein zona. Reaksi ini berpuncak pada pelepasan enzim-enzim yang
diperlukan untuk menembus zona pelusida, antara lain akrosin dan zat-zat serupa
tripsin (Langman,1994).
Fase fertilisasi mencakup fase 3 fase:
1) Penembusan korona radiata.
Spermatozoa-spermatozoa yang mengalami kapasitasi tidak akan sulit
untuk menembusnya (Langman, 1994).
2) Penembusan zona pelusida.
Zona pelusida adalah sebuah perisai glikoprotein yang mempertahankan
pengikatan sperma dan menginduksi reaksi kromosom. Hanya 1
spermatozoa diantara 200-300 juta spermatozoa yang ada di saluran
kelamin yang berhasil menembus zona pelusida. Saat spermatozoa masuk
ke dalam membrane oosit, spermatozoa lain tidak akan bisa masuk lagi
karena aktifasi dari enzim oosit sendiri (Langman, 1994)
3) Fusi oosit dan membran plasma.
Spermatozoa bergerak masuk ke membrane oosit dan mencapai inti oosit.
Perlu diketahui bahwa spermatozoa dan oosit masing-masing memiliki 23
kromosom (haploid), selama masa penyatuan masing-masing pronukleus

18
melakukan sintesis DNA. Segera setelah sintesis DNA, kromosom
tersusun dalam gelendong untuk melakukan pembelahan secara mitosis
yang normal. Dua puluh tiga kromosom dari ibu dan dua puluh tiga
kromosom dari ayah membelah sepanjang sentromer, dan kromatid-
kromatid yang berpasangan tersebut saling bergerak ke kutub yang
berlawanan, sehingga menyiapkan sel zigot yang masing-masing
mempunyai jumlah kromosom yang normal (Langman,1994).

2.5 Tirosin Fosforilasi (TP)


Tirosin fosforilasi (TP) terjadi selama pembuatan spermatozoa manusia.
Meskipun mekanisme kapasitas sperma saat ini belum sepenuhnya dipahami,
diketahui melibatkan kompleks kejadian molekuler dan biokimia seperti eflux
kolesterol membran, masuknya kalsium, peningkatan serapan bikarbonat,
peningkatan fluiditas membran, motilitas yang diaktivasi dan aktivasi adenosin
monofosfat siklik. (CAMP) yang menghasilkan protein TP. TP diatur oleh protein
kinase A (PKA), dan inkubasi sperma dengan dibutyryl cAMP (dbcAMP) secara
in vitro secara signifikan meningkatkan TP.

2.6 Immunofluorescence
Imunofluoresen adalah metode imunologi untuk mendeteksi antibodi dari
berbagai kelas immunoglobulin dalam serum, cairan ludah, cairan otak dengan
cara mereaksikan antibody dan antigen spesifik dan anti-antibodi yang dilabel
denagan Fluoresence Isothiocyanat (FITC), sehingga terpancar sinar warna hijau
atau merah jika di label dengan Rodhamin. Tetapi dalam perkembangan sekarang
imunofluoresen banyak digunakan dalam penelitian untuk mendeteksi antigen antigen
atau antibody dalam mukosa usus, mukosa mulut, dan dalam jaringan, urine, cairan mata.
Immunofluorescence adalah sebuah teknik untuk mendeteksi molekul
menggunakan antibodi label dengan pewarna neon. Antibodi neon terikat dapat
dideteksi dengan mikroskop, atau dengan sitometri aliran arus tergantung pada
aplikasi yang digunakan. Immunofluorescence tidak langsung menggunakan
antibodi label dengan pewarna neon untuk mendeteksi pengikatan antibodi
spesifik.

19
Antibodi adalah alat penting untuk menunjukkan kehadiran dan lokalisasi
subselular antigen. Teknik pewarnaan sel, jika antigennya sangat terlokalisir,
dapat mendeteksi seribu molekul antigen dalam sel. Dalam beberapa keadaan,
pewarnaan sel dapat digunakan untuk menentukan perkiraan konsentrasi antigen,
terutama oleh penganalisis gambar. Pewarnaan sel dapat dibagi menjadi empat
tahap yaitu persiapan sel, fiksasi, penerapan antibodi, dan evaluasi.
Antibodi Fluorescent Teknik (FAT) adalah alat diagnostik di mana pewarna
fluorescent ditambahkan ke jaringan yang mengandung anti gen. Hasilnya
menyebabkan wilayah yang ditargetkan bersinar dengan sinar ultraviolet bila
dilihat dengan mikroskop fluorescent.
Fluoresensi merupakan pemancaran sinar oleh atom atau molekul setelah
terlebih dahulu disinari. Zat warna yang dapat befluoesensi disebut fluorokrom.
Pada dasarnya teknik fluoresen antibodi ini merupakan kombinasi cara-cara
imunologis dan pewarnaan. Adanya antigen akan diperlihatkan dengan
perantaraan antibodi yang telah disenyawakan dengan fluorkrom.
Pendeteksi antibody dan antigen yang perlu diperhatikan adalah fiksasi
protein spesifik dengan bahan kimia, sehingga diperlukan pemilihan yang tepat
bahan kima yang terbaik seperti Formaldehyde, aceton, methanol, dan alcohol.
Sehingga tidak merusak epitop dan paratope pada saat direaksikan untuk ikatan
komplek antigen dan antibody.

Gambar 2.3 Mikroskop Fluoresensi

20
2.5.1 Teknik Immunofluorescence
Ada 2 tipe teknik imunoflueresensi Mohan et al., 2008) :
1) Imunofluoresensi langsung (direk), prosedur pewarisan histologis satu
langkah untuk mengidentifikasi antibodi in vivo yang terikat pada
jaringan antigen
2) Immunofluorescence tidak langsung (indirek), menggunakan antibodi
label dengan pewarna neon untuk mendeteksi pengikatan antibodi
spesifik.
2.5.2 Regensia serta Alat dan Bahan yang digunakan dalam Metode
Fluorecent Antibody Technique (FAT / IFA)
Deckglass, objek glas, serum sampel, antigen dari sel kultur atau antigen
dari jaringan, Aceton, Feotal Calf Serum (FCS), Phospat Buffer Saline (PBS).
Pinset, Gelas Inkubator, Kotak inkubator, Inkubator 37oC, Konjugat Fragmen
immunoglobulin, Mikroskop Fluorescent, Rhodamin.
2.5.3 Macam-macam Pemeriksaan Pemeriksaan FAT (IFA)
Metode FAT (IFA) dikenal ada 2 macam pemeriksaan yaitu
1) Antibodi Fluorescent Teknik, Langsung
Suatu bentuk teknik antibodi fluorescent memanfaatkan terkonjugasi
fluorochrome ke antibodi, yang ditambahkan secara langsung ke jaringan atau
suspensi sel untuk mendeteksi antigen tertentu. Atau dengan cara melabel
langsung antibodinya.
2) Antibodi Fluorescent Teknik, Tidak Langsung
Suatu bentuk teknik antibodi fluorescent yang biasa digunakan untuk
mendeteksi antibodi serum dan kompleks imun pada jaringan dan
mikroorganisme dalam spesimen dari pasien dengan penyakit menular.
Teknik ini melibatkan pembentukan sebuah kompleks antigen-antibodi yang
diberi label dengan fluorescein-conjugated anti-antibodi immunoglobulin.
Atau melalui perantara antibody yang kedua dalam produk pasar dikenal
dengan Konjugat Imunoglobulin Fragment.
Teknik pewarnaan secara immunofluorescence berprinsipkan atas ikatan
antigen antibody yang dilabel dengan fluorochrome (pewarna fluorescence).
Protokol immunofluorescence sama dengan protocol IHC hanya pelabelnya yang

21
berbeda. Teknik immunofluorescence juga dapat dibedakan menjadi direct
immunofluorescence dan indirect immunofluorescence. Direct
immunofluorescence menggunakan antibody yang terkonjugasi dengan
fluorochrome (fluorochrome-conjugated antibody) sedangkan indirect
immunofluorescence menggunakan antibody sekunder (antibody yang bersifat
anti dari antibody primer). Antibody sekunder yang digunakan adalah antibody
yang terkonjugasi dengan fluorochrome (fluorochrome-conjugated secondary
antibody) ataupun antibody yang terbiotinilasi (biotin-conjugated secondary
antibody). Pada penggunaan biotin-conjugated secondary antibody, fluorochrome
akan berikatan avidin maupun streptavidin dimana avidin atau streptavidin ini
akan berikatan dengan biotin pada antibody sekunder. Keuntungan teknik indirect
immunofluorescence adalah kita dapat meningkatkan jumlah fluorophore.

Gambar 2.4 Teknik immunofluorescence. A: direct immunofluorescence, B:


indirect immunofluorescence (fluorochrome-conjugated secondary
antibody), C: indirect immunofluorescence (biotin-
conjugated secondary antibody + avidin / streptavidin-flourescein)
(Zola, 1998).

Berikut adalah fluorophore beserta data absorpsi dan emisi pada fluorescence.

22
Tabel 4. Fluorophore beserta data absorpsi dan emisi pada fluorescence

Prosedur immunofluorescence memiliki kelebihan pada prosedur multi-


labelling. Dalam satu jaringan dengan satu prosedur pewarnaan kita dapat melabel
2 atau lebih antigen. Double labelling dapat dilakukan dengan syarat spesies
antibody primer yang digunakan adalah berbeda, misalnya antibody A tikus dan
antibody B kelinci.

23
Gambar 2.5 Pewarnaan double immunofluorescence. Pada teknik double labelling
di atas menggunakan polyclonal anti-P antibody virus rabies (P)
kelinci, Mab 62B5 anti-N antibody virus rabies (N) dan polyclonal
anti-M antibody virus rabies (M). DAPI (biru) digunakan untuk
mewarnai nuclei (merge). Colocalization bewarna kuning (merge).
Pengamatan menggunakan confocal laser microscopy (Lahaye et al.,
2009).

24
BAB 3
BAHAN DAN METODE

3.1 BAHAN
3.1.1 Manusia berejakulasi
Usia rata-rata pria berusia 38 tahun pada kelompok normospermia (kisaran
30-45 tahun) dan 35 tahun pada kelompok asthenospermic (kisaran 25-42 tahun).
Sampel semen dikumpulkan dari pria setelah 48-72 jam pantang seksual dan
dinilai sesuai peraturan WHO. Ejakulasi tiga puluh normozoospermic (N) dan tiga
puluh asthenozoospermic (A) digunakan untuk pemeriksaan. Percobaan hanya
mencakup pria yang sperminogramnya berulang-ulang (dalam tiga tes berturut-
turut) menunjukkan karakteristik normospermik atau astenospermic dan yang
ejakulasi (s) mengandung <1 × 10 6 ml -1 lymphocytes.
Kelangsungan hidup sperma dinilai dua kali: setelah ejakulasi, dan sebelum
analisis sitometri dan imunofluoresensi. Nilai rata-rata sebelum pengukuran
sitometri, dan imunofluoresensi adalah: 78% sel hidup dalam normospermik dan
75% sel hidup pada astenospermik.
Pengumpulan semen dilakukan dengan :
1) Tidak melakukan hubungan suami istri selama 2-6 hari
2) Setelah berkemih
3) Cuci tangan dengan sabun, keringkan
4) Tampung sampel yang ada kedalam wadah berpermukaan lebar yang steril,
70% sperma diperoleh pada ejakulasi awal
5) Simpan pada suhu tubuh, tidak boleh terkena sinar matahari
6) Kirim sampel antara satu jam pasca ejakulasi
3.1.2 Beberapa cara memperoleh sperma
1) Masturbasi / Onani
Cara ini merupakan methode yang paling dianjurkan untuk memperoleh
sperma, biasanya dengan tangan (baik tangan sendiri maupun tangan
istrinya) atau dengan suatu alat tertentu. Kebaikan cara ini menghindari

25
kemungkinan tumpah ketika menampung sperma, menghindari dari
pencemaran sperma dengan zat-zat yang lain.
2) Coitus Interuptus (CI)
Adalah melakukan persetubuhan secara terputus, hal ini kurang dianjurkan
sebab :
 Memungkinkan sperma dapat tercampur dengan cairan vagina,
sehingga banyak mengandung epitel, leukosit, eritrosit, bakteri,
parasit, jamur, dan lain-lain.
 Dalam jumlah penampungannya kurang, karena sperma sebagian
dapat masuk ke vagina. Disamping itu terjadi kesalahan pada
pemeriksaan pH dan konsentrasi.
3) Coitus Condomatosus
Pengeluaran sperma dengan cara ini dilarang dan sangat tidak
diperkenankan. Karena sebagian besar karet kondom mengandung bahan
spermiacidal, yaitu bahan yang dapat mematikan sperma.
4) Reflux Poscital
Adalah suatu cara Coitus dimana setelah sperma keluar dan masuk kevagina,
sperma tersebut dibilas dengan pz atau cairan lainnya. Hal ini akan timbul
kekeliruan dalam volume konsentrasi dan viskositas
5) Massage prostat
Adalah suatu cara pengeluaran dengan cara memijat kelenjar prostat lewat
rectum, disini jelas akan timbul kekeliruan dalam penafsiran pH, konsentrasi
dan sebagainya yang keluar adalah sairan prostat.
3.1.3 Tempat penampungan sperma
Sebenarnya semua alat boleh dipakai asalkan tempat tersebut tidak
mengandung spermatotoxic.
Sperma sangat tidak dianjurkan ditampung pada tempat-tempat yang terbuat dari:
1) Logam, sebab logam bisa mengganggu muatan listrik dan sperma, sehingga
pergerakan terganggu.
2) Plastik, sebab plastik umumnya mengandung gugus fenol (C6H5OH)
sehingga sperma akan rusak.

26
3) Pada umumnya tempat yang digunakan menampung sperma terbuat dari gelas
yang bersih, tidak mengandung spermatotoxic.
Tetapi sperma dilarang ditempat yang terbuat dari:
 Tempat penampungan sperma dianjurkan ditampung pada tempat yang
terbuat dari bahan yang tidak bereaksi apa-apa.
 Tempat penampung sperma harus bermulut lebar supaya muat pada penis.
 Tempat diberi penutup agar tidak terkontaminasi
 Ukuran tempat penampung sperma 50 ml – 100 ml.
3.1.4 Medium kultur dan kimiawi
Cairan tuba manusia (HTF, Irvine Scientific, Irvine, CA, USA) dilengkapi
dengan serum manusia 10% (v/v) yang tidak aktif digunakan sebagai media kultur
untuk semua eksperimen. Serat manusia dan antibodi monoklonal anti-fosfotirosia
[PY20, tikus imunoglobulin (Ig) G] yang diberi label dengan fluorescein
isothiocyanate (FITC) diperoleh dari ICN Pharmaceuticals (Costa Mesa, CA,
USA). Dynabeads dilapisi dengan anti-mouse IgG (anti-mIgG). Phorbol 12-
miristat 13-asetat (PMA), dbcAMP, dimethylsulphoxide, inhibitor antibodi
phosphotyrosine, larutan O- phosphosfile-tirosin yang dikonjugasikan ke albumin
serum sapi (BSA) (inhibitor spesifik dari reaktivitas antibodi anti-fosfotirosin) dan
Pisum sativum aglutinin yang terkonjugasi dengan FITC (PSA-FITC) dari Sigma
Chemical Company (Liu, 2006).
3.1.5 Oosit manusia
Oosit untuk tes interaksi ZP diperoleh dari program IVF klinis yang tidak
menunjukkan bukti adanya dua atau tiga pronuklei atau pembelahan pada 48-60
jam setelah inseminasi atau belum menghasilkan (dengan vesikel germinal). Oosit
dengan sisa sel kumulus dan korona atau sperma yang terikat ke ZP dari
inseminasi IVF telah dihapus dengan aspirasi oosit berulang kali dengan
menggunakan pipet kaca halus dengan diameter dalam (120 μm) sedikit lebih
kecil dari diameter oosit. Degenerasi, aktifasi atau morfologi abnormal oocytes
serta oocytes dengan lebih dari 10 sperma yang menembus ZP tidak digunakan
untuk pengujian. Semua oosit diperoleh pada hari ke 3 inseminasi, dan oosit
dikumpulkan dari beberapa pasien dan digunakan untuk pengujian pada hari yang
sama atau disimpan dalam inkubator CO 2 5% dan digunakan dalam 3 hari.

27
3.1.6 Sampel dan sediaan sperma
Sampel semen diperoleh dari pria dengan masturbasi setelah 3-5 hari
berpantang yang memiliki jumlah sperma ≥20 × 10 6 / ml, motilitas ≥ 25% dengan
motilitas progresif> 20% dan morfologi sperma normal. Jumlah sperma dan
motilitas dilakukan setelah pencairan dalam 1 jam pengumpulan air mani sesuai
dengan WHO (1999). Morfologi sperma normal dinilai berdasarkan apusan Shorr
di bawah perendaman cairan dengan pembesaran × 1000 dan iluminasi medan
terang (Liu, 2006).
Sperma motil dipilih dengan teknik sebagai berikut: 0,3 ml air mani
ditambahkan dengan hati-hati ke dasar tabung reaksi (12 x 75 mm) yang
mengandung 0,7 ml HTF yang dilengkapi dengan serum manusia 10%. Perawatan
dilakukan untuk menghindari gelembung dan tidak mengganggu antar muka
antara air mani dan media. Setelah inkubasi selama 1 jam, 0,5 ml lapisan atas
medium yang mengandung sperma motil disedot. Suspensi sperma motil
kemudian disentrifugasi pada 1000 g selama 5 menit, supernatan dibuang dan
pelet sperma dicuci kembali dengan 1 ml HTF segar dengan sentrifugasi pada
1000 g selama 5 menit. Pelet sperma yang telah dicuci diganti kembali dengan
HTF standar dengan suplemen motil 20 × 10 6 / ml untuk percobaan selanjutnya.
Karena sampel sperma berasal dari pria dengan konsentrasi sperma normal dan
motilitas yang masuk akal, motilitas sperma progresif setelah persiapan berenang
adalah> 90% untuk semua sampel yang digunakan dalam penelitian ini.
Semua pasien menandatangani formulir persetujuan yang memungkinkan
penggunaan gamet mereka (oosit dan sampel sperma yang tidak dibuahi) untuk
penelitian. Komite Penelitian dan Etika Rumah Sakit menyetujui proyek tersebut.

3.2 Metode
3.2.1 Teknik pemeriksaan secara Umum pada Imunofluoresen
A. Reagen
4) Fosfat Buffered Saline (PBS)
5) Formaldehida : 16% bebas metanol, polysciences
6) Buffer

28
7) Antibodi Dilimer
8) Fluorochrome, Antibodi sekunder
9) Prolong, gold antifade reagent
B. Spesimen preparat
1) Kultur sel
a) Cairan aspirat, sel ditutup hingga kedalaman 2-3 mm dengan
formaldehida 4% diencerkan dalam PBS hangat.
b) Biarkan sel selama 15 menit pada suhu kamar
c) Aspirasi fiksatif, bilas 3 x dalam PBS masing-masing 5 menit
d) Lanjutkan dengan Imunostaining
2) Cryostat Section (IF-F)
a) Untuk jaringan beku dilanjutkan dengan Immunostaining
b) Untuk jaringan beku segar dan tidak diolah, segera perbaiki
sebagai berikut :
 Tutup dengan formaldehida 4% diencerkan dalam PBS
1x yang hangat
 Biarkan selama 15 menit pada suhu kamar
 Bilas 3x dengan PBS selama 5 menit
 Lanjutkn dengan immunostaining
C. Imunostaining
1) Blok spesimen dalam buffer selama 60 menit
2) Sementara pemblokiran siapkan antibodi primer
3) Larutkan penghambat aspirasi, oleskan anti bodi primer yang
diencerkan
4) Inkubasi semalaman pada suhu 4oC
5) Bilas 3x dalam PBS masing-masing 5 menit
Jika menggunakan antibodi primer terkonjugasi fluorochrome, lanjut
ke bagian C langkah 8.
6) Spesimen inkubasi pada antibodi sekunder terkonjugasi
fluorochhrome diencerkan dalam buffer penngencer selama 1-2 jam
pada suhu kamar
7) Bilas 3x dalam PBS masing-masing 5 menit

29
8) Coverslip dengan Prolong Gold Antifade Reagen atau Prolong Gold
Antifade Reagen
9) Biarkan semalam pada suhu kamar
3.2.2 Pengikatan sperma-ZP
Sperma motil (2 × 106 dalam medium 1 ml) yang dipilih dengan berenang
diinkubasi dengan empat oosit di piring kultur 4-sumur selama 2 jam pada suhu
37° C dalam 5% CO2 di udara. Setelah inkubasi 2 jam, masing-masing kelompok
dari empat oosit dipindahkan ke fosfat-buffered saline (PBS) yang mengandung
BSA 2 mg/ml. Setelah inkubasi, oosit tersebut dimerah beberapa kali untuk
melepaskan sperma yang menempel secara longgar dengan menggunakan pipet
kira-kira dua kali diameter oosit (250 μm) dalam tiga sumur terpisah yang
mengandung 0,5 ml PBS dengan BSA 0,2%. Jumlah sperma yang terikat pada
masing-masing dari empat oosit dihitung menggunakan mikroskop kontras
terbalik, dan jumlah rata-rata jumlah sperma per ZP digunakan sebagai titik akhir.
Di bawah kondisi eksperimental ini, jumlah rata-rata sperma yang terikat ≤40 / ZP
dianggap sebagai sperma miskin-ZP yang mengikat karena sperma dari pria subur
bisa memiliki> 100 sperma terikat per ZP ( Liu et al ., 2001 ).
3.2.3 Zp-diinduksi reaksi akrosom (AR)
Untuk sampel sperma dengan pengikatan ZP normal (rata-rata> 40 sperma /
ZP), semua sperma yang terikat ke permukaan dari empat ZP dikeluarkan dengan
aspirasi berulang dengan pipet gauge sempit dengan diameter dalam (kira-kira
120 μm) sedikit lebih kecil dari pada Oocyte. Ini dilakukan pada slide kaca
dengan sekitar 5 μl PBS yang mengandung BSA 0,2%, dan sperma terikat ZP
yang dibuang diolesi di area terbatas (sekitar 16 mm2) yang ditandai di bagian
slide dengan kaca melihat sperma di bawah mikroskop. Prosedur pipetting untuk
menghilangkan sperma dari permukaan ZP tidak mempengaruhi motilitas sperma,
morfologi dan status akrosom (Liu et al., 2006).
3.2.4 Penilaian akrosom sperma yang terikat pada ZP
Penelitian yang dilakukan oleh Liu et al (2006), reaksi akrososm (AR)
dinilai menggunakan PSA-FITC. Sperma dicelupkan ke dalam etanol 95% selama
30 menit setelah pengeringan udara dan kemudian diwarnai dengan menggunakan
25 μg/ml PSA-FITC di PBS selama 2 jam pada suhu 4°C. Dicuci dan disuling,

30
dan 200 sperma per sampel dihitung dengan mikroskop fluoresensi dengan
menggunakan panjang gelombang eksitasi 450-490 nm dan pembesaran ×400.
Bila lebih dari separuh kepala sperma berwarna terang dan seragam fluorescing,
akrosom dianggap utuh. Sperma dengan pita fluorescing pada segmen
khatulistiwa atau tanpa fluoresensi di daerah akrosom dianggap bereaksi.
Tyrosine Phosphorylation (TP) pada sperma manusia
Sperma motil (2 × 106 dalam medium 1 ml) yang dipilih dengan berenang
diinkubasi selama 2 jam (beberapa sampel diinkubasi selama 4 dan 20 jam) pada
suhu 37° C dalam 5% CO2 di udara. Setelah inkubasi, sperma dicuci dengan 10
ml garam normal, dan pelet sperma kembali tersuspensi sekitar 20 μl saline dan 3
μl diolesi pada kaca geser. Setelah pengeringan di udara, smear dipatok pada
etanol 90% selama 30 menit untuk memungkinkan membran plasma. Slide tetap
disimpan dalam kotak pada suhu 4° C selama tidak lebih dari 5 hari. TP sperma
dinilai secara langsung Jika menggunakan antibodi monoklonal PY20 (ICN
Pharmaceuticals) yang diberi label FITC. Antibodi diencerkan 1: 300 dalam PBS
yang mengandung BSA 10 mg / ml. Setiap smear (kira-kira 10 × 10 mm) ditutupi
dengan 50 μl PY20 diencerkan dan diinkubasi selama 4 jam dalam kotak yang
lembab pada suhu 37 ° C. Setelah inkubasi, luncuran dicuci dan dipasang dengan
air suling dan ditutup dengan coverlip (22 × 22 mm). Sperma bereaksi dengan
antibodi PY20 memiliki fluoresensi terang pada bagian utama ekor. Persentase
sperma dengan noda positif (tirosin terfosforilasi sperma) ditentukan dengan
mencetak 400 sperma untuk setiap sampel menggunakan kombinasi mikroskop
cahaya dan fluoresen (Gambar 1 ). Tidak ada pelabelan fluoresen yang terdeteksi
pada kepala sperma dengan antibodi monoklonal anti-tirosin (PY20) (Liu et al.,
2006)..

31
Gambar 3.1 Tirosin fosforilasi dengan imunofluoresensi direct dengan antibodi
monoklonal PY20-fluoroscein isthiocynate pada sperma manusia. A dan C,
menggunakan mikroskop cahaya (pembesaran x400), B dan D, menggunakan
mikroskop fluoresensi (pembesaran x400). A dan B, sperma diinkubasi selama 2
jam, satu sperma menunjukkan tirosin fosforilase. C dan D, sperma diinkubasi
selama 20 jam dengan kebanyakan sperma menunjukkan tirosin fosforilasi (D).

Spesifisitas antibodi dikonfirmasi dengan tes kontrol yang menunjukkan


bahwa penghambat antibodi fosfotiroseptor (10 μg / ml) dapat menghalangi
pengikatan PY20-FITC ke ekor sperma. Selain itu, mIgG-FITC yang digunakan
sebagai kontrol ekstra untuk mengikat tidak spesifik tidak menunjukkan
fluoresensi pada salah satu sperma.
3.2.5 Deteksi TP pada permukaan sperma motil hidup
Baik IF maupun Dynabeads yang dilapisi dengan anti-mIgG (antibodi
kedua) digunakan untuk menyelidiki pengikatan antibodi anti-tirosin primer
(PY20) untuk menjalani sperma untuk menentukan apakah fosfosirosin terdeteksi
pada permukaan sperma motil yang tidak diobati setelah inkubasi. Untuk ini,
sperma tidak tetap dalam etanol 90% untuk memungkinkan membran plasma dan
memungkinkan akses antibodi anti-tirosin ke TP internal. Dynabeads dicuci dua
kali dengan media 5 ml HTF-BSA dan diganti kembali dalam medium yang sama
dengan konsentrasi sekitar 4 × 10 8 / ml sebelum digunakan (Liu et al., 2006). .
Untuk meningkatkan kemungkinan deteksi TP pada permukaan sperma
motil, sperma diinkubasi selama 2 jam dalam medium dengan 1 m M dbcAMP
untuk meningkatkan proporsi sperma TP, dan kemudian sperma selanjutnya
diinkubasi selama 1 jam setelah penambahan. Dari 10 μl (1: 100) PY20 (untuk uji

32
Dynabead) atau antibodi PY20-FITC (untuk uji IF). Pelet sperma kemudian
dipulihkan dan dicuci tiga kali dengan media HTF-BSA 10 ml untuk
menghilangkan antibodi primer yang berlebihan. Pelet sperma kembali
6
tersuspensi menjadi sekitar 40 × 10 / ml dengan media HTF-BSA. Untuk uji
Dynabead, suspensi sperma 5 μl dicampur dengan 5 μl Dynabeads dan ditutup
dengan coverlip (22 × 22 mm). Persentase motil sperma dengan satu atau lebih
manik-manik yang terikat pada kepala atau ekor dihitung dengan memberi skor
400 sperma motil menggunakan mikroskop kontras fase pada pembesaran × 400.
Untuk uji IF, 5 μl suspensi sperma ditambahkan pada slide kaca dan ditutup
dengan coverlip (22 × 22 mm). Proporsi sperma yang bereaksi dengan PY20-
FITC dinilai dengan skor 400 sperma dengan menggunakan mikroskop
fluoresens.
Untuk membandingkan hasil Dynabead dan IF pada sperma hidup yang
tidak diobati dengan hasil JIKA pada sperma tetap, suspensi sperma yang sama
diolesi pada kaca geser dan kemudian dipastikan dalam etanol 90% selama 30
menit untuk memungkinkan membran plasma, dan kemudian langsung IF
Dilakukan dengan menggunakan PY20-FITC seperti yang dijelaskan di atas.
3.2.6 Pengaruh waktu inkubasi, dbcAMP dan PMA pada sperma TP
Untuk menentukan apakah IF langsung cukup sensitif untuk mendeteksi
perubahan TP, sperma motil (1 × 10 6 ) diinkubasi untuk berbagai waktu (0, 2, 4, 6
dan 20 h) atau dengan berbagai konsentrasi PMA (0-15 Μ M ) atau dbcAMP (0-2
m M ) selama 2 jam. Setelah inkubasi, sperma dicuci dengan larutan garam 10 ml
normal, diolesi pada slide, fixed, dan TP dinilai oleh IF seperti dijelaskan di atas.
3.2.7 Analisis statistik
Pentingnya perbedaan persentase TP sperma pada berbagai waktu inkubasi,
atau konsentrasi dbcAMP dan PMA, diperiksa dengan uji varians nonparametrik
varians ( ANOVA ) (Friedman). Korelasi antara proporsi sperma motil dengan TP
dan karakteristik sperma lainnya diperiksa dengan uji nonparametrik (Spearman).
Analisis regresi dilakukan untuk mengetahui signifikansi hubungan antara hasil
uji sperma dan persentase sperma dengan TP.

33
BAB 4
HASIL

Pentingnya perbedaan persentase TP sperma pada berbagai waktu inkubasi,


atau konsentrasi dbcAMP dan PMA, diperiksa dengan uji varians nonparametrik
varians (ANOVA) (Friedman). Korelasi antara proporsi sperma motil dengan TP
dan karakteristik sperma lainnya diperiksa dengan uji nonparametrik (Spearman).
Analisis regresi dilakukan untuk mengetahui signifikansi hubungan antara hasil
uji sperma dan persentase sperma dengan TP.

4.1 Hasil uji sperma


Hasil pengujian Semen yang dilakukan oleh Liu et al (2006) dirangkum
dalam Tabel I. Ada berbagai macam hasil untuk semua tes termasuk TP. TP
sperma terdeteksi oleh JIKA hanya pada potongan utama ekor sperma yang tetap
dalam etanol 90% untuk memungkinkan membran plasma. Tidak ada TP
permukaan terdeteksi pada sperma motil dengan Dynabead (0%) atau IF (0%)
bahkan setelah inkubasi sperma dengan 1 m M dbcAMP untuk meningkatkan TP.
Sebaliknya, JIKA pada sperma tetap menunjukkan 45 ± 13% (rata-rata ± SD)
(kisaran 31-68%) positif seperti yang dinilai pada 10 sampel sperma dari pria
yang berbeda dengan analisis semen normal dan ikatan sperma-ZP normal.

Tabel 5. Hasil (mean ± SD dan range) analisis semen, pelepasan sperma-zona


pellucida (ZP), reaksi akrosom yang diinduksi ZP dan fosforilasi tirosin tiroid(TP)
pada berbagai waktu pra-inkubasi

34
Gambar 4.1 Hubungan antara waktu inkubasi dan fosforilasi tyrosin (TP) pada 10
pria dengan analisis semen normal dan spell-zona pellucida normal (ZP) mengikat
[analisis varian dua arah ( ANOVA ), P <0,001 untuk semua perbandingan antara
0, 2 , 4 dan 20 jam].

Gambar 4.2 Peningkatan fosfatilasi tirosin tiroid (TP) oleh dinatral adenosin
monoosfat aditif (dbcAMP) ( A , dua arah ANOVA , P <0,001) dan phorbol
miristate acetate (PMA) ( B , 0 atau 5 berbanding 10 atau 15, P <0,05) .

4.2 Hubungan antara Tirosin fosfatilasi (TP) dan karakteristik sperma


lainnya
Hasil penelitian yang dilakukan oleh Liu et al (2006), TP sperma pada
inkubasi 2 jam berkorelasi secara signifikan dengan ikatan sperma-ZP namun
tidak dengan AR yang diinduksi ZP (Gambar 4 ). Pada 44 sampel sperma, TP
dinilai setelah inkubasi sperma untuk 2, 4 dan 20 jam, dan hasil TP dari ketiga
kali inkubasi berkorelasi signifikan dengan pengikatan sperma-ZP (Spearman r =
0,771, 0,738 dan 0,519, semua P < 0,001). Namun, TP pada inkubasi 2 dan 4 jam
memberikan korelasi tertinggi.

35
Persentase sperma dengan morfologi normal pada kedua air mani ( n = 115,
Spearman r = 0,359, P <0,001) dan persiapan berenang ( n = 115, Spearman r =
0,298, P = 0,001) berkorelasi secara signifikan dengan TP sperma. Pada inkubasi
2 jam. Juga, morfologi sperma dalam air mani ( n = 79, Spearman r = 0,338, P =
0,003) dan berenang ( n = 79, Spearman r = 0,353, P = 0,002) juga berkorelasi
signifikan dengan AR yang diinduksi ZP. Karakteristik sperma lainnya termasuk
jumlah sperma, motilitas dan viabilitas tidak berkorelasi secara signifikan dengan
pengikatan sperma atau ZP sperma.
Bila semua data dianalisis dengan regresi berganda, hanya jumlah sperma
(P<0,05) dan TP sperma pada 2 atau 4 jam ( P <0,001) yang secara bermakna
terkait dengan pengikatan sperma-ZP.

4.3 Perbandingan hasil TP antara sperma normal dan abnormal pada ZP


Hasil penelitian yang dilakukan oleh Liu et al (2006), Sampel sperma
dengan ikatan sperma-ZP normal memiliki TP yang jauh lebih tinggi daripada
mereka yang memiliki ikatan sperma-ZP yang abnormal (11 ± 9 banding 2 ±
3,8%, P <0,001). Lebih dari 92% (49 dari 53) pria dengan TP ≥5% pada 2 jam
memiliki ikatan sperma-ZP yang normal. Sebaliknya, hanya 66% (41 dari 62) pria
dengan TP <5% memiliki ikatan sperma-ZP yang normal. Dengan demikian, 2 h
TP <5% memiliki sensitivitas yang masuk akal (84%) dan nilai prediksi negatif
(94%) namun spesifisitas rendah (54%) dan nilai prediksi positif (34%) untuk
kapasitas pengikatan sperma-ZP yang abnormal.

36
BAB 5
KESIMPULAN

5.1 Kesimpulan
1) Tyrosin phosphorilasi (TP) sangat berkorelasi dengan kemampuan
pengikatan sperma-ZP tetapi tidak dengan AR yang diinduksi ZP. Hasil ini
menunjukkan bahwa TP adalah indikator yang baik dari kemampuan sperma
untuk mengikat ZP.
2) Pada tes imunofluoresensi langsung antibodi dilabel langsung dengan label
fluoresen. Pada tes imunofluoresensi tidak langsung, anti-imunoglobulin
(AHG) yang bereaksi dengan antibodi primer dilabel. Uji langsung
mengidentifikasika antigen atau kompleks imun pada sel. Tes
imunofluoresinsi tak langsung mengidentifikasi antibodi pada serum.

37
DAFTAR PUSTAKA

Al-Haija, Rania Wasef Mostafa. 2011. Main Causes of Infertility among Men
Treated at Razan Centers in West Bank:Retrospective Study. Thesis , An-
Najah National University Faculty of Graduate Studies.
Barbonett, A. Vassallo Maria Rosaria C., Cordeschi Giuliana., Venetis Dimitrios.,
Carboni Andrea., Sperandio Alessandra., Felzani Giorgio., Francavilla
Sandro., Francavilla Felice. 2010. Protein tyrosine phosphorylation of the
human sperm head during capacitation: immunolocalization and relationship
with acquisition of sperm-fertilizing ability. Asian J of Andrologi. 12 (6) :
853-861
Carrel. Douglas T. ed. 2013. Paternal Influences on Human Reproductive
Success. New York. Cambridge University Press.
Cooper, Trevor G., Noonan, Elizabeth., Eckardstein, sigrid von., Auger, Jacques.,
Baker, H.W.Gordon., Behre, Hermann M., Haugen, Trine T., Kruger,
Thinus., Wang, Christina., Mbizvo, Michael T., Vogelsong, Kristen M.
2010. World Health Organization reference values for human semen
characteristics. Human Reproduction Update. 16 (3) : 231-245.
Capkova, Jana., Kubatova, Alena., Ded, Lukas., Tepla, Olina., Peknicova, Jana.
2016. Evaluation of the expression of sperm proteins in normozoospermic
and asthenozoospermic men using monoclonal antibodies. Asian Journal of
Andrology, 18: 108–113.
Sheerif, Dhastagir Sultan. Faraq, Elshaari. 2010. Perspektif pada Penghabisan
Kolesterol Plasma Membran dan Fungsi Spermatozoa. J Hum Reprod Sci. 3
(2).
Ganong, W.F. 2008. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran.Edisi 22. Jakarta. EGC
Guyton, AC. Hall JE. 2007. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran.Edisi 11.Jakarta.
EGC
Lahaye, X., Aurore, V., Carole, P., Linda, O., Francis, H., Yves, G., and Danielle,
B. 2009. Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies
Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription
and Replication, Journal of virology. : 7948–7958
Liu, D.Y., Clarke, G.N., and Baker, H. W. G., 2006. Tyrosine phosphorylation on
capacitated human sperm tail detected by immunofluorescence correlates
strongly with sperm–zona pellucida (ZP) binding but not with the ZP-
induced acrosome reaction. Human Reproduction. 21 (4) : 1002–1008

38
Mascarenhas. Maya N. et al.2012.National. Regional. and Global Trends in
Infertility Prevalence Since 1990: A Systematic Analysis of 277 Health
Surveys. PLOS Medicine.
Mohan. KH., Pai. Sathish., Rao. Raghvendra., Sripathi., Prabhu. Smitha. 2008.
Techniques of immunofluorescence and their significance. India J Dermatol
Venereol Leprol. 74.
Saleh. Ramadan A., Ashok Aqarwal., Rakesh K Sharma., David R Nelson. &
Anthony J Thomas. 2001.Effect of cigarette smoking on levels of seminal
oxidative stress in infertile men: a prospective study. Presented at the 57th
Annual Meeting of the American Society for Reproductive Medicine.
Orlando, Florida.
Tanagho, Emil A., Jack. & W. McAninch. 2008. Smith’s General Urology. New
York. The Mc. Graw-Hill Companies.
Wein, Kavoussi., Novick., Partin. & Peters. 2012. Campbell-Wash Urology. Ten
edition. United States of America. Elsevier Saunders.
Zegers-Hochschild F., Adamson GD.,de Mouzon J.Ishihara O.,Mansour R. et a.l.
2009.The International Committee for Monitoring Assisted Reproductive
Technology (ICMART) and the World Health Organization (WHO) revised
glossary on ART terminology. Hum Reprod. 24 : 2683–2687.

39