LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

PEWARNAAN TUNGGAL DAN PEWARNAAN MAJEMUK

Diajukan untuk memenuhi tugas terstruktur pada mata kuliah Mikrobiologi

Dosen Pengampu 1 : Milla Listiawati, M.Pd
Dosen Pengampu 2 : Ukit, M.Si
Dosen Pengampu 3 : Tri Wahyu Agustina, M.Pd

Oleh kelompok 7:

Shenny Arianthy 1152060097

Siti Rohmah Fadilah 1152060107

Yuli Sopianti 1152060130

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI / V C

JURUSAN PENDIDIKAN MIPA
FAKULTAS TARBIYAH DAN KEGURUAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SUNAN GUNUNG DJATI
BANDUNG
2017
Judul Praktikum : Pewarnaan Tunggal dan Pewarnaan Majemuk
Tanggal Praktikum : Rabu, 22 November 2017
Tujuan Praktikum :
1. Pewarnaan tunggal
a. Mampu membuat pertanyaan penelitian (rumusan masalah) mengenai pewarnaan
tunggal dengan menggunakan berbagai zat warna.
b. Mampu menjawab pertanyaan penelitian (hipotesis) mengenai pewarnaan tunggal
dengan menggunakan berbagai zat warna.
c. Mampu menentukan variabel bebas dan variabel terikat mengenai pewarnaan tunggal
dengan menggunakan berbagai zat warna.
d. Mampu melakukan pewarnaan tunggal dengan menggunakan berbagai zat warna.
e. Mampu mengkomunikasikan dalam bentuk gambar cara-cara pewarnaan tunggal dan
hasil praktikum dalam bentuk tabel pengamatan dan gambar.
f. Mampu mencari dua persamaa dan dua perbedaan berdasarkan cara-cara kerja dan hasil
pengamatan pewarnaan tunggal.
g. Mampu menginterpretasi (membuat kesimpulan) dari data pengamatan.

2. Pewarnaan majemuk
a. Mampu membuat pertanyaan penelitian (rumusan masalah) mengenai perbedaan warna
antara bakteri Gram + dan Gram –.
b. Mampu menjawab pertanyaan penelitian (hipotesis) mngenai perbedaan warna antara
bakteri Gram + dan Gram –.
c. Mampu menentukkan variabel bebas dan variabel terikat mengenai perbedaan warna
antara bakteri Gram + dan Gram –.
d. Mampu melakukan pewarnaan majemuk untuk membedakan warna antara bakteri Gram
+ dan gram –.
e. Mampu mengkomunikasikan dalam bentuk gambar cara-cara pewarnaan majemuk dan
hasil praktikum dengan tabel pengamatan dan gambar.
f. Mampu mencari dua persamaan dan dua perbedaan berdasarkan cara-cara kerja
perwarnaan majemuk dan hasil pengamatan.
g. Mampu menginterpretasi (membuat kesimpulan) dari data pengamatan.
Rumusan Masalah Pewarnaan Tunggal

Apa pengaruh penggunaan warna zat warna fuchsin, methilen blue, dan gentian violet
terhadap warna bakteri Staphylococcus sp, Bacillus subtilis, Escherchia coli, Proteus vulgaris,
dan Sarcina lutea ?

Hipotesis Pewarnaan Tunggal

H0 = Tidak terdapat pengaruh penggunaan warna zat warna fuchsin, methilen blue dan gentian
violet terhadap warna bakteri Staphylococcus sp, Bacillus subtilis, Escherchia coli, Proteus
vulgaris, dan Sarcina lutea

H1 = Terdapat pengaruh penggunaan warna zat warna fuchsin, methilen blue dan gentian violet
terhadap warna bakteri Staphylococcus sp, Bacillus subtilis, Escherchia coli, Proteus
vulgaris, dan Sarcina lutea

Variabel Penelitian Pewarnaan Tunggal

1. Variabel bebas : Zat warna fuchsin, methilen blue, dan gentian violet
2. Variabel terikat : Terlihatnya morfologi bakteri Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,
Escherchia coli, Proteus vulgaris, dan Sarcina lutea

Rumusan Masalah Pewarnaan Majemuk (Gram)

Apa pengaruh pewarnaan majemuk terhadap perbedaan warna bakteri Gram + dan Gram –.?

Hipotesis Pewarnaan Majemuk (Gram)

H0= Tidak terdapat pengaruh pewarnaan majemuk terhadap perbedaan warna bakteri Gram +
dan Gram –
H1= Terdapat pengaruh pewarnaan majemuk terhadap perbedaan warna bakteri Gram + dan
Gram –
Variabel Penelitian Pewarnaan Majemuk (Gram)
1. Variabel bebas : Pewarnaan majemuk
2. Variabel terikat : Teridentifikasinya jenis bakteri Gram + dan Gram –
A. LANDASAN TEORI
Metode pewarnaan merupakan metode pengecatan yang pertama kali ditemukan oleh
Cristian gram pada tahun 1884. Dengan metode ini bakteri dapat dikelompokkan menjadi 2
yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif, yang didasarkan dari reaksi atau sifat
bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi
dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang
tidak mempunyai dinding selnya seperti Mycoplasma sp (Waluyo, 2004: 3).
Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi
karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat
tiga macam metode pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial, dan
pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial
memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen (Volk dan Wheeler, 1984 : 156).
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan
kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim, prosedur pewarnaan ini
menggunakan zat warna basa seperti cristal violet, biru metilen, karbol fuchin basa, safranin
atau hijau malakit. Terkadang digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan sederhana : zat
warna asam yang sering digunakan adalah nigrosine dan merah kongo. Prosedur pewarnaan
sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk melihat bentuk
ukuran dan penataan pada mikroorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentuk yang bulat
(coccus), batang (basil), dan spiral. Pewarnaan sederhana dapat juga terlihat penataan bakteri.
Pada coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai (streptococcus), buah anggur
(stafilococcus), pasangan (diplococcus), bentuk kubus yang terdiri dari 4 atau 8 (sarane) (Lay,
1994 : 98).
Suatu pewarnaan dapat dikatakan berhasil tidaknya sangat ditentukan oleh waktu
pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam).
Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang
bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna
dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa, jika ion yang
mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut berwarna basa dan bila ion
yang mengandung warna adalah ion negatif zat warna tersebut disebut pewarna negatif
(Hadiutomo, 1990 : 89).
Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan bakteri
Gram positif dan Gram negatif. Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat warna cristal
violet dan akan tampak berwarna ungu tua dibawah mikroskop. Adapun bakteri Gram negatif
akan kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat
pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan zat warna ini
disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Pewarna yang digunakan
dalam pewarnaan Gram antara lain : cristal violet, alkohol, safranin, dan iodine (Lay,1994 :
145).
Perbedaan struktur dinding sel bakteri Gram positif dan Gram negatif sehingga
menyebabkan perbedaan reaksi dalam permeabilitas zat warna dan penambahan larutan
pemucat. Sebagian besar dinding sel bakteri gram positif terdiri dari peptidoglikan, sedangkan
dinding sel bakteri Gram negatif mempunyai kandungan lipida yang tinggi dibandingkan
dinding sel bakteri gram negatif (Dwidjoseputro, 1998: 149).
Ciri-ciri bakteri Gram negatif menurut Hadiotomo (1990: 167), yaitu :
1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan  terdapat
didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak
mengandung asam tekoat.
3. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
4. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
Ciri-ciri bakteri Gram positif yaitu :
1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang
sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat
ringan. Mengandung asam tekoat.
3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
Sebagian besar dari genus anaerobik Clostridium dan Desulfotomaculum dan genus
anaerobic Bacillus adalah contoh-contoh organisme yang mempunyai kapasitas untuk
pertahanan, salah satunya adalah sel vegetatif yang aktif secara metabolik disebut spora.
Kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan untuk keberlangsungan aktivitas sel vegetatif,
biasanya pada saat kurangnya sumber nutrisi karbon, sel ini mempunyai kapasitas untuk
mengalami sporogenesis dan memberikan reaksi untuk pembentukan struktur intraseluler baru
(endospora) yang dilindungi oleh lapisan yang tidak dapat ditembus air (tahan penetrasi)
dikenaal sebagai jaket spora (Wartono, et all., 2015 : 781).
Pewarnaan Gram/diferensial memerlukan sekurang-kurangnya tiga macam reagen bahan
kimia yang dipakai pada film bakteri yang sudah difiksasi. Zat kimia pertama disebut zat
warna utama. Fungsi zat ini adalah untuk memberikan warna pada semua sel bakteri. Agar
diperoleh warna yang kontras, zat kimia kedua yang dipakai adalah zat penghilang warna
(decolourizing agent). Berdasarkan komposisi kimia komponen sel bakteri, maka zat kimia
yang kedua tersebut dapat atau tidak dapat menghilangkan zat warna yang pertama dari semua
bagian sel atau hanya dapat menghilangkan zat warna yang pertama dari bagian sel tertentu
dalam struktur bakteri. Zat kimia yang terakhir, yaitu lawan warna (counterstain) memiliki
sifat warna yang kontras dengan zat warna yang pertama (Subandi, 2010 :78).

Bakteri umumnya mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena

sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa). Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena
tidak membiaskan cahaya hal tersebut menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme. Zat warna dapat mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras
mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Mengamati bakteri dalam kehidupan sangat
sulit sehingga dikembangkan teknik pewarnaan sel bakteri agar sel dapat terlihat jelas dan
mudah diamati. Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, pelunturan
warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat pewarna penutup (Karmana,
2007: 89).
Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negative menurut Manurung (2010:
90) adalah sebagai berikut :
 Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-)
Kandungan lipid rendah (1-
Komposisi dinding sel 4%) Kandungan lipid tinggi
Ketahanan terhadap penisilin Lebih sensitive Lebih tahan
Penghambatan oleh pewarna
basa (VK) Lebih dihambat Kurang dihambat
Kebanyakan spesies relatif
Kebutuhan nutrisi kompleks Relatif sederhana
Ketahanaa terhadap
perlakuan fisik Lebih tahan Kurang tahan

B. ALAT DAN BAHAN

1. Alat dan bahan untuk pewarnaan tunggal
No. Alat Jumlah Bahan Jumlah
1. Kertas saring 1 buah Alkohol 70% Secukupnya
2. Kaca objek 1 buah Aquades Secukupnya
3. Bunsen spirtus 1 buah Zat warna Fuchsin, Secukupnya
methilen blue, gentian
violet
4. Jarum ose 1 buah NaCl Fisiologis Secukupnya
5. Tisu Secukupnya Bakteri Bacillus Secukupnya
subtilis dan Sarcina
lutea
2. Alat dan bahan untuk pewarnaan majemuk
No. Alat Jumlah Bahan Jumlah
1. Kertas saring 1 buah Alkohol 95% Secukupnya
2. Kaca objek 1 buah Aquades Secukupnya
3. Bunsen spirtus 1 buah Zat warna Fuchsin Secukupnya
atau safranin, gentian
violet
4. Jarum ose 1 buah Larutan iodium/lugol Secukupnya
5. Tisu Secukupnya Bakteri Bacillus Secukupnya
subtilis dan Sarcina
C. PROSEDUR KERJA
PEWARNAAN TUNGGAL

Bersihkan kaca objek dengan alkohol 70% dan panaskan

Bahan preparat padat disuspensikan dengan NaCl

Teteskan NaCl fisiologi steril pada kaca objek

Keringkan dengan hawa api

Fiksasi diatas nyala api sebanyak 3x, dinginkan

Teteskan zat warna diatas preparat diamkan 1-2 menit

Tuangkan zat warna dari preparat dan cuci dibawah kran

Keringkan preparat

Teteskan minyak imersi

Periksa dengan mikroskop

 PEWARNAAN MAJEMUK

Preparat bakteri dibuat

Keringkan dan fiksasi

Tambahkan gentian violet selama 30 detik

Bilas dengan aquades

Tambahkna lugol dan iodium

Bilas dengan aquades tambahkan alkohol 95% selama 15 detik sampai warna
menghilang

Preparat diwarnai dengan safrain /fuchsin selama 30 detik

Bilas dengan aquades

Hilangkan kelebihan air dengan tisu

Amati dibawah mikroskop majemuk, perbesaran 100x

Tetesi minyak imersi

 D. TABEL HASIL PENGAMATAN

Tabel 1. Hasil Praktikum Pewarnaan Tunggal

No Nama Bakteri Dokumentasi Literatur Klasifikasi Keterangan

Staphylococcus Kingdom : Bacteria Perbesaran : 40 x 10

aureus
Filum : Firmicutes Jenis Gram :

Kelas : Bacilli Gram positif

Ordo : Bacillales Bentuk bakteri :

1 NaCl
Sumber:
https://upload.wikimedia.org/
wikiedia/commons/thumb/0/08/
Staphylococcus_aureus_Gram.jpg
/250pxStaphylococcus
_aureus_Gram.jpg
Diakses 5 Desember 2017 pukul
23.09 WIB
Coccus
Famili : Staphylococcaceae
Reagen: Alkohol 70%,
Genus : Staphylococcus
Spesies : Staphylococcus aureus
Sumber :
Ciri-ciri :
https://www.itis.gov/servlet/Single
Rpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search 1. Hidup berkoloni,
ditanah
_value=369#null. Diakses pada 05
Desember 2017 pukul 23:10 WIB 2. Tidak berflagel
3. Tidak membentuk
spora
 Tabel 2. Hasil Praktikum Pewarnaan Majemuk
Nama Keterangan
No Dokumentasi Literatur Klasifikasi
Bakteri
Proteus Kingdom : Bacteria Pembesaran : 40 x 10
vulgaris
Filum : Proteobacteria Jenis gram :

Kelas : Gamma Proteobacteria Gram negatif

Ordo : Enterobacteriales Bentuk bakteri :

Batang
Famili : Enterobacteriaceae
Reagen:
Genus : Proteus
Gentian violet, lugol,
Spesies : Proteus vulgaris fuschin.
1
Sumber:

http://fce-study.netdna-
Sumber :
ssl.com/2/images/upload-
flashcards/67/12/26/20671 http://taxonomicon.taxonomy.nl/Taxon
226_m.png Ciri-ciri :
Tree.aspx?id=476&tree=0.1&syn=1
Diakses 5 Desember 2017 pukul
Diakses pada 04 Desember 2017 pukul 13:05
1. Hidup ditanah, air
23:25 WIB
WIB
dan di usus
manusia
2. Tidak
membentuk spora
 Sarcina lutea Kingdom : Bacteria Pembesaran : 40 x 10

Filum : Firmicutes Jenis gram :

Kelas : Clostridia Gram positif

Ordo : Clostridiales Bentuk bakteri

:coccus
Famili : Clostridiaceae
Reagen:
Genus : Sarcina
Gentian violet, lugol,
Spesies : Sarcina lutea fuschin.
Sumber:

http://www.
2 media.gettyimages.com

Diakses pada 5 desember 2017

pukul 13.29 WIB
Ciri-ciri :
Diakses pada 5 Desember 2017
pukul 23: 12 WIB Sumber: 1. Hidup berkoloni
2. Hidup pada tanah,
http://www.wikiwand.com/en
air dan permukaan
/Sarcina_(genus) Diakses pada 04 Desember
tanah
2017 pukul 14:05 WIB
3. Tidak memiliki
flagel
4. Tidak membentuk
spora
 Tabel 3. Hasil dari Sumber Literatur
Nama Keterangan
No Dokumentasi Literatur Klasifikasi
Bakteri
Escherichia Kingdom : Bacteria Jenis gram :
coli
Filum : Proteobacteria Gram negatif

Kelas : Gamma Proteobacteria Bentuk bakteri :

Ordo : Enterovacteriales Batang

Famili : Enterobacteriaceae
Sumber: Ciri-ciri :
http://www.google.co.id/search?
Genus : Escherichia
1
client=ms.android=Escheria_coli. 1. Terdapat di usus
Spesies : Escherichia coli
Html 2. Rantai tunggal,
Diakses 5 Desember 2017 pukul memanjang
23:15 WIB dalam rantai
Sumber: pendek
3. Tidak berspora
http://informasikesling.blogspot.
co.id/2015/04/klasifikasi-dan-jenis-
bakteri.html.
Diakses 5 Desember 2017. 18.43 WIB
Bacillus Klasifikasi Bacillus subtilis Jenis gram :
subtilis Kingdom : Bacteria
Gram positif
Phylum : Firmicutes
Class : Bacilli Bentuk bakteri :
2.
Order : Bacillales
Batang
Family : Bacillaceae
Genus : Bacillus
Species : Bacillus subtilis
Sumber: Sumber:
http://ikanurmasruroh.blogspot. https://lordbroken.wordpress
co.id/2013/06/laporan- com/2013/04/28/mengenal-karakteristik- Ciri-ciri :
mikrobiologi-identifikasi.html bacillussubtilis/. Diakses 4 Desember 2017.
Diakses 5 Desember 2017 23:11 15:21 WIB 1. Hidup berkoloni
WIB dan ditanah
2. Dapat
membentuk
endospora
3. Memiliki flagel
E. PEMBAHASAN
Pewarnaan tunggal disebut juga dengan pewarnaan sederhana merupakan pewarna yang
paling umum digunakan. Hal ini karena hanya digunakan satu jenis pewarna untuk mewarnai
organisme. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena
sitoplasmanya bersifat basofil atau suka akan basa. Zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin. Pewarnaan sederhana ini dimungkinkan
untuk dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (kokus, ibrio, basilus
dan sebagainya) dari bahan-bahan lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai (Hadietomo,
1990).

Pewarnaan majemuk menurut Pelczar (2006 :85) menyatakan bahwa merupakan

pewarnaan suatu bakteri atau organisme dengan lebih dari satu zat warna warna. Pewarnaan
majemuk terbagi menjadi dua macam yaitu pewarnaan Gram positif dan pewarnaan Gram
negatif. Pewarnaan Gram termasuk pewarnaan dierensial yang digunakan untuk membedakan
bakteri Gram negatif dan bakteri Gram positif. Pewarnaan Gram positif yaitu terdapat satu sel
dan memiliki peptidoglikan sehingga tetap mempertahankan warnanya yaitu ungu, karena
kandungan lemak nya sedikit. Jenis bakteri yang termasuk Gram positif, yaitu :
Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, dan Sarcina lutea.

Pewarnaan Gram negatif terjadi perubahan warna menjadi merah karena memiliki tiga lapis
dinding sel dan terdapat lipopolisakarida yang kandungan lemaknya banyak sehingga jika
diberi alkohol maka akan luruh lemaknya lalu berubah warna menjadi warna merah. Bakteri
yang termasuk kedalam pewarnaan gram negatif yaitu: Proteus vulgaris dan Escherchia coli.
Ciri-ciri bakteri Gram negatif menurut Hadiotomo (1990:89), yaitu :
1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat
didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak
mengandung asam tekoat.
3. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
4. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
 Perbedaan utama bakteri gram positif dan gram negatif adalah bakteri gram positif
mengandung dinding sel peptidoglikan yang tebal bersama dengan asam teichoic, yang
memungkinkan bakteri tersebut memberikan warna ungu selama pewarnaan gram. Sedangkan
bakteri gram negatif mengandung dinding sel peptidoglikan yang tipis tanpa asam teichoic,
yang memungkinkan dinding sel menjadi berwarna merah muda selama pewarnaan (Lay,1994
: 152).

1.Bakteri yang termasuk Gram positif

a. Staphylococcus aureus
Dalam pengamatan bakteri menggunakan perbesaran 40x10 menemukan Staphylococcus
aureus, jenis reagen yang digunakan adalah alkohol 70%, dan NaCl. Staphylococcus aureus adalah
jenis bakteri gram positif yang memiliki bentuk kokus atau bulat bergerombol, berbentuk
seperti anggur memiki diameter 0,5 – 1,5 µm, memiliki flagel atau disebut juga dengan
bakteri non-motil serta tidak membentuk spora membentuk fakultatif anaerob yang tumbuh
dengan respirasi aerob dan fermentasi (Harris,2002:39). Bakteri ini kebanyakan hidup
berkoloni ditanah. Klasifikasi Staphylococcus aureus menurut Lay (1994: 76), yaitu :
Kingdom : Bacteria
Filum : Firmicutes
Kelas : Bacilli
Ordo : Bacillales
Famili : Staphylococcaceae
Genus : Staphylococcus
Spesies : Staphylococcus aureus
Dinding sel dari Staphylococcus aureus merupakan lapisan pelindung yang kuat, yang
relatif amorphous dalam penampilan, memiliki tebal sekitar 20- 40 nm. Dibawah dinding sel
terdapat sitoplasma yang tertutup oleh membran cytplasmic. Peptidoglikan merupakan
komponen dasar dari dinding sel, dan membentuk 50% massa dinding sel. Konstituen
dinding sel lainnya adalah kelompok dari polimer yang mengandung fosfat yang disebut
asam teichoic, yang menyumbang sekitar 40% massa dinding sel. Terdapat dua jenis adam
teichoic, yakni sel dinding asam teichoic dan membran sel yang terkait asam lipoteichoic;
terikat secara kovalen ke peptidoglikan atau dimasukkan ke dalam membran lipid bakteri
(Knox, 1973).

b. Bacillus subtilis
Pada pewarnaan tunggal mendapatkan bakteri Bacillus subtilis. Menurut (Lay.1994),
pada pewarnaan sederhana atau tunggal hanya digunakan satu macam zat warna untuk
meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Dari hasil pengamatan
yang didapatkan pada praktikum pewarnaan tunggal bakteri Bacillus subtilis ini dengan
pembesaran 10x40 bentuknya batang atau bacil, berwarna ungu, hal tersebut dikarenakan
bakteri tersebut dapat mempertahankan warna kristal violet pada saat proses pewarnaan
terjadi, sehingga akan berwarna biru atau ungu jika diamati dibawah mikroskop. Bakteri
Bacillus subtilis termasuk pada bakteri Gram positif yakni bakteri yang memiliki banyak
peptidoglikan pada dinidng selnya. Selain itu terlihat dari warna yang dihasilkan pada saat
pewarnaan yakni warna yang dihasilkan yaitu warna ungu.

Bacillus subtilis ini merupakan jenis bakteri yang memiliki bentuk batang (basal). Selain
itu bakteri ini hidupnya berkoloni dan dapat ditemukan di tanah. Bakteri Bacillus subtilis
ini memiliki alat gerak atau disebut juga dengan motil. Memiliki klasifikasi :

Kingdom : Bacteria
Phylum : Firmicutes
Class : Bacilli
Order : Bacillales
Family : Bacillaceae
Genus : Bacillus
Species : Bacillus subtilis
Jenis bakteri ini dapat membentuk spora. Spora dihasilkan di dalam tubuh vegetatif
bakteri tersebut, dapat berada di bagian tengah, ujung ataupun tepian sel. Pelczar (1986)
menyatakan bahwa spora merupakan tubuh bakteri yang secara metabolik mengalami
dormansi, dihasilkan pada fase lanjut dalam pertumbuhan sel bakteri yang sama seperti
asalnya, yaitu sel vegetatif. Spora bersifat tahan terhadap tekanan fisik maupun kimiawi.
Struktur spora yang terbentuk dalam tubuh vegetatif bakteri disebut dengan endospora
 yaitu spora yang terbentuk di dalam tubuh. Secara sederhana, dapat dikatakan bahwa
endospora merupakan sel yang mengalami dehidrasi dengan dinding yang mengalami
penebalan serta memilii beberapa lapisan tambahan.

c. Sarcina lutea
Sarcina lutea merupakan jenis bakteri kokus yang bergerombol membentuk kubus
kokus. Bakteri ini ada yang berbentuk tunggal, berpasangan, dalam paket atau gerombol.
Bakteri Sarcina lutea juga merupakan jenis bakteri nonmotil, dimana bakteri tersebut tidak
mempunyai alat gerak, untuk bakteri yang tidak mempunyai alat gerak ini, umumnya
pergerakannya dilakukan dengan cara menggelinding (meluncur) dan akan bergerak bila
ada kontak terhadap benda padat (Dakuni,2001).
Sarcina lutea merupakan bakteri yang berbentuk bulat dengan diameter 1-1,5 mikron,
termasuk ke dalam jenis bakteri gram positif, aerobik, nonmotil. Bakteri ini ditemui hidup
pada tanah, air, udara, dan permukaan kulit. Bakteri ini memiliki sifat parasit fakultatif
yang hidup secara saprofit. Koloni bakteri Sarcina lutea terdiri dari 8 -16 sel yang
berbentuk paket kubus dan berwarna kuning. S.lutea dapat tumbuh dengan baik pada suhu
25ºC (Huston, 1964:425). Memiliki Klasifikasi, yaitu :
Kingdom : Bacteria
Filum : Firmicutes
Kelas : Clostridia
Ordo : Clostridiales
Famili : Clostridiaceae
Genus : Sarcina
Spesies : Sarcina lutea
Berdasarkan praktikum pewarnaan, Sarcina lutea merupakan jenis bakteri Gram positif,
karena bakteri ini mampu mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses
pewarnaan gram, sehingga menghasilkan warna biru atau ungu di bawah mikroskop. Alasan
lain nya karena bakteri ini hanya memiliki membran plasma tunggal yang dikelilingi dinding
sel tebal berupa peptidoglikan. Sekitar 90 % dari dinding sel tersebut tersusun atas
peptidoglikan sedangkan sisanya berupa molekul lain benama asam teichoat. Dalam
pewarnaan majemuk, pada saat bakteri gram positif ditambahkan dengan kristal violet maka
gram positif akan mengabsorbsi larutan tersebut hanya pada dinding sel. Dengan pemberian
larutan lugol/iodine, maka kristal violet akan masuk sampai ke inti sel. Pemberian alkohol
menyebabkan pori-pori dinding sel mengecil sehingga warna ungu tertahan di dalam sel
yang disebabkan oleh rendahnya kandungan lipid.

2. Bakteri yang termasuk Gram negatif

a. Proteus vulgaris
Dengan pembesaran 10 x 40 ditemukan Proteus vulgaris termasuk dalam famili
enterobakteriaceae, tidak memiliki spora, tidak berkapsul, flagel peritrik, ada yang
cocobacili, polymorph, berpasangan atau berbentuk rantai, berukuran 0,4-0,8 x 1.0-0,3mm.
Bakteri Proteus vulgaris berwarna merah muda, yang menunjukkan bahwa bakteri tersebut
merupakan bakteri gram negatif. Hal ini sesuai dengan literatur yang didapat pada jurnal
(Ghaidaa, dkk, 2013:8), yang menyatakan bahwa Proteus vulgaris merupakan bakteri
kemoheterotrof, berbentuk batang, dan termasuk kedalam bakteri jenis gram-negatif.
Memiliki ciri-ciri berbentuk bulat, pendek, tidak membentuk spora, bergerak sangat
aktif dengan bulu cambuk yang ada diseluruh tubuhnya, mudah tumbuh pada berbagai
pembenihan dalam keadaan anaerob, dapat menghasilkan urease, yang mempercepat
hidrolisis dari urea dengan melepas amonia, sebagian besar hidup bebas dalam air, tanah,
sampah, dan di usus manusia. Memiliki Klasifikasi :
Kingdom : Bacteria
Filum : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria
Ordo : Enterobacteriales
Famili : Enterobacteriaceae
Genus : Proteus
Spesies : Proteus vulgaris
Proteus vulgaris memiliki ekstra membran luar sitoplasma. Membran luarnya
mengandung lipid bilayer, lipoprotein, polisakarida, dan lipopolisakarida. Tidak ada spora
atau kapsul yang terbentuk. Bakteri ini mendapatkan energi dan elektron dari molekul
organik. Bakteri ini juga dapat memfermentasi glukosa, sukrosa, galaktosa, gliserol, dan
terkadang maltosa dengan produksi gas, namun tidak pernah memfermentasi laktosa.
 Bakteri ini tidak terbatas pada kisaran suhu tertentu, namun pertumbuhan yang baik
terjadi pada suhu 20ºC - 30ºC, sementara pertumbuhan yang buruk terjadi pada suhu 37ºC.
Proteus vulgaris memiliki dua fitur menarik, dimana sel-selnya sangat motil dan
berkerumun di permukaan piring agar-agar membentuk lapisan bakteri yang sangat tipis.
Fitur yang menarik lainnya bahwa Proteus vulgaris dapat menghasilkan urease yang
memecah urea menjadi amonia.

b. Escherchia coli

Menurut (Kusuma:2010) Eschericia coli adalah bakteri yang merupakan bagian dari
mikroflora yang secara umum ada dalam saluran pencernaan manusia dan hewan berdarah
panas dengan alat gerak berupa flagellata sehingga termasuk kedalam bakteri motil. E.coli
juga merupakan bakteri indikator kualitas air karena keberadaannya didalam air
mengindikasikan bahwa air tersebut terkontaminasi oleh feses, yang kemungkinan juga
mengandung mikroorganisme enterik patogen lainnya. Bakteri Escherichia coli umumnya
memiliki ukuran panjang 2,0-6,0 mm dan lebar 1,1-1,5 mm, dengan bentuk batang. Bakteri
ini tumbuh pada suhu antara 10-40 °C, dengan suhu optimum 37 ºC. pH optimum untuk
pertumbuhan adalah pada 7,0-7,5, pH minimum pada pH 9,0. Bakteri ini relatif sangat
sensitif terhadap panas dan dapat dinonktifkan pada suhu pasteurisasi makanan (50-100°C)
atau selama pemasakan makanan.

Eschericia coli termasuk kedalam bakteri Gram negatif, dimana E.coli ini tidak dapat
mempertahankan zat warna kristal violet pada saat proses pewarnaaan Gram, sehingga akan
berwarna merah bila diamati dibawah mikroskop. Adapun bentuk dari bakteri Eschericia
coli yaitu termasuk kedalam bentuk basil. Bentuk ini seperti batang atau silindris, ujung sel
bervariasi seperti persegi, bundar, meruncing dan sebagainya. Pada bentuk basil ini, E.coli
mempunyai bentuk yang lebih spesifik yaitu monobasil yaitu hanya terdiri atas satu bakteri
bentuk basil yang hidupnya sendiri-sendiri (soliter). Memiliki Klasifikasi :

Kingdom : Bacteria
Filum : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria
Ordo : Enterovacteriales
 Famili : Enterobacteriaceae
Genus : Escherichia
Spesies : Escherichia coli

Berdasarkan literatur bakteri Escherichia coli ini termasuk kedalam gram negatif. Bakteri
gram negatif, seperti halnya Escherichia coli ini ialah bakteri yang tidak dapat
mempertahankan zat warna kristal violet pada saat dilakukannya pewarnaan sehingga akan
berwarna merah atau merah muda apabila diamati dibawah mikroskop, hal tersebut terjadi
karena bakteri Escherichia coli memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis. Menurut (Strohl,
2001: 3) bakteri gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis, hanya 1-2
lapisan dan susunan dinding selnya tidak kompak. Permeabilitas dinding sel lebih besar
sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks kristal yodium. Bakteri Escherichia
coli berada di dalam usus manusia yang brfungsi untuk membusukan sisa makanan.

F. PERTANYAAN DAN JAWABAN

Pertanyan Pewarnaan Tunggal

1. Menurut saudara dengan menggunakan kata-kata sendiri, jelaskan yang dimaksud
dengan pewarnaan tunggal?
Jawab :
Pewarnaan tunggal adalah proses memberikan warna pada organisme dan digunakan
satu jenis zat pewarna, bersifat basofil (suka akan basa) umumnya bersifat alkalin
(komponen kromofornya bersifat positif).
2. Sebutkan manfaat NaCl fisiologis?
Jawab :
Untuk pengenceran konsentrasi mikroba, untuk mempermudah perhitungan jumlah
mikroba
3. Jelaskan alasan pencucian dengan air mengalir?
Jawab :
Agar tidak ada lagi zat warna yang mengalir diatas kaca preparat
4. Perubahan warna apakah yang terjadi pada sel bakteri setelah saudara amati? Mengapa
menjadi demikian?
 Jawab :
Pada pengecatan Bacilus subtilis terlihat berbentuk batang memanjang, berwarna ungu,
pada bakteri lebih pekat daripada warna background, karena berikatan dengan tekhnik
pengecatan sederhana, maka sesuai dengan tujuan pengecatan positif yaitu untuk
mengetahui bentuk dasar sel yang diwarnai.
5. Berikan dua perbedaan dan persamaan berdasarkan cara-cara kerja pewarnaan tunggal
dan hasil pengamatan pewarnaan tunggal?
Jawab :
Persamaannya bakteri Bacillus subtilis dan Sarcina sama-sama menggunakan zat warna
karbon fuchsin, Kristal violet, dan metilene blue dan digunakan untuk melihat bentuk
ukuran dan penataan pada mikroorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentuk yang
bulat (coccus), batang (basil), dan spiral. Adapun perbedaannya, yaitu Sarcina lutea
merupakan jenis bakteri kokus yang bergerombol membentuk kubus kokus, sedangkan
Bacillus subtilis merupakan jenis bakteri yang memiliki bentuk batang (basal) dan
Bacillus subtilis memiliki flagel sendangkan Sarcina lutea tidak memiliki flagel.

Pertanyan Pewarnaan Majemuk (Gram)

1. Menurut saudara dengan menggunakan kata-kata sendiri, jelaskan yang dimaksud
pewarnaan majemuk?
Jawab :
Suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar,
gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka.
2. Mengapa perlu dilakukan pencucian dengan alkohol?
Jawab :
Sesuai dengan fungsinya alkohol dapat digunakan untuk menghilangkan zat warna yang
pertama. Alkohol dapat menghilangkan zat warna tersebut karena alkohol larut dalam
lemak dan bersifat semipolar.
3. Setelah saudara amati, warna apa yang muncul dari bakteri gram positif dan gram negatif,
apakah terjadi perbedaan warna? Apabila tidak terdapat perbedaan warna berikan
penjelasan? Dan apabila terjadi perbedaan warna berikan pula penjelasan?
Jawab :
 Ya, terdapat perbedaan warna. Bakteri gram positif berubah menjadi warna ungu dan
baktei gram negatif berubah menjadi warna merah, hasil warna tersebut ditentukan oleh
sifat- sifat fisik dan kimia dinding dan membran selnya
4. Berikan dua persamaan dan dua perbedaan berdasarkan cara-cara pewarnaan majemuk
pada bakteri gram positif dan gram negatif dan hasil pengamatan?
Jawab :
Persamaannya menggunakan zat warna awal gentian violet selama 30 menit baik bakteri
gram positif maupun gram negatif juga sama-sama menggunakan larutan iodium/lugol.
Adapun perbedaanya dari hasil yang didapatkan gram positif berubah menjadi warna
ungu dan baktei gram negatif berubah menjadi warna merah dan juga komposisi dinding
sel pada bakteri gram positif kandungan lipid rendah (1-4%) dan bakteri gram negatif
kandungan lipid tinggi.

G. KESIMPULAN

Berdasarkan praktikum pewarnaan Gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk

mengelompokan bakteri Gram negatif dan Gram positif. Bakteri gram negatif adalah bakteri
yang tidak mempertahankan zat metil ungu pada metode pewarnaan metode gram sedangkan
bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan
gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu dibawah mikroskop, sedangkan bakteri
gram negatif akan berwarna merah muda. Bakteri gram negatif dalam praktikum ini, yaitu
Proteus vulgaris, dan Escherichia coli. Sedangkan bakteri yang termasuk bakteri gram
positif pada praktikum ini yakni Sarcina lutea, Bacillus substilis, dan Staphylococcus
aureus.
H. DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-dasar Mikrobiologi. Malang: Penerbit Djambatan

Ghaidaa, M. 2013. The effect of p-nitrophenylglycerol of swarming and the production of
some virulence factors in Proteus vulgaris. New York Science Journal, Vol 6, No. 1, pp
8-14.
Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga
Harris, L., dkk. 2002. An Introduction to Staphylococcus aureus, and Techniques For
Identifying and Quantifying S.Aureus Adhesins In Relation To Adhesion to Biomaterials
: Review. European Cells and Materials, Vol. 4: 36-60.
Lay, Bibiana. W.1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : Rajawali Pers
Subandi. 2010. Mikrobiologi. Bandung : PT Remaja Rosda Karya

Volk & Wheecler. 1984. Mikrobiologi Dasar Edisi Kelima Jilid I. Jakarta : Erlangga
Waluyo, lud. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang: UMM Press.
Wartono, et all. 2015. Efektivitas Formulasi Spora Bacillus subtilis B12 sebagai Agen
Pengendali Hayati Penyakit Hawar Daun Bakteri pada Tanaman Padi. Penelitian
Pertanian Tanaman Pangan. Vol. 34 No. 1