VALIDASI METODE MICROBIOLOGI ALTERNATIF

PENGANTAR

Tujuan bab ini adalah memberikan panduan untuk memvalidasi metode untuk digunakan sebagai
alternatif metode mikrobiologi kompendial resmi. Untuk pemulihan dan identifikasi mikroba,
laboratorium pengujian mikrobiologi terkadang menggunakan metode uji alternatif untuk yang
dijelaskan dalam bab umum karena berbagai alasan, seperti ekonomi, throughput, dan kenyamanan.
Validasi metode ini diperlukan. Beberapa panduan tentang validasi penggunaan metode alternatif
disediakan di bagian Pengujian dan Pengujian di Pemberitahuan Umum dan Persyaratan. Bagian ini
juga mencatat bahwa jika terjadi perselisihan, hanya hasil yang diperoleh dengan tes pendahuluan
yang pasti.

Studi validasi metode mikrobiologi alternatif harus memperhitungkan variabilitas yang besar. Saat
melakukan pengujian mikrobiologi dengan jumlah lempeng konvensional, misalnya, seseorang sering
menemukan serangkaian hasil yang lebih luas (% RSD 15 sampai 35) daripada rentang uji kimia yang
umum digunakan (% RSD 1 sampai 3). Banyak metode mikrobiologi konvensional dikenai kesalahan
sampling, kesalahan pengenceran, kesalahan pelapisan, kesalahan inkubasi, dan kesalahan operator.

mendefinisikan karakteristik seperti akurasi, presisi, spesifisitas, batas deteksi, batas kuantifikasi,
linieritas, jangkauan, kekasaran, dan ketahanan dalam penerapannya terhadap metode analisis.
Definisi ini kurang sesuai untuk validasi metode mikrobiologi alternatif sebagai "paling tidak setara
dengan metode kompendial" dengan sifat komparatif pertanyaan (lihat Bagian Pengujian dan
Pengujian dalam Persyaratan dan Persyaratan Umum). Pertanyaan kritisnya adalah apakah metode
alternatif tersebut akan menghasilkan hasil yang setara dengan, atau lebih baik daripada, hasil yang
dihasilkan oleh metode konvensional.

Organisasi industri lainnya telah memberikan panduan untuk validasi metode mikrobiologi alternatif.
Kesesuaian metode baru atau yang dimodifikasi harus ditunjukkan dalam studi perbandingan antara
metode pendahuluan USP dan metode alternatif. Karakteristik yang didefinisikan dalam bab ini
dapat digunakan untuk menetapkan perbandingan ini.

JENIS UJIAN MICROBIOLOGI

Sangat penting untuk upaya validasi untuk mengidentifikasi bagian dari pengujian yang ditangani
oleh teknologi alternatif. Misalnya, ada beragam teknologi yang tersedia untuk mendeteksi
keberadaan sel yang layak. Teknik ini mungkin memiliki penerapan dalam berbagai tes (mis.,
Bioburden, uji sterilitas) namun mungkin sebenarnya tidak menggantikan aspek kritis pengujian
seluruhnya. Misalnya, tes sterilitas dengan filtrasi membran dapat dilakukan sesuai prosedur
kompendial sampai titik menggabungkan saringan olahan dengan media pemulihan, dan setelah itu
kehadiran sel yang layak kemudian dapat ditunjukkan dengan penggunaan beberapa komponen
yang tersedia. teknologi. Validasi aplikasi ini akan, oleh karena itu, memerlukan validasi sistem
pemulihan yang digunakan alih-alih keseluruhan pengujian.
Ada tiga jenis determinasi utama yang spesifik untuk tes mikrobiologi. Ini termasuk tes untuk
menentukan apakah mikroorganisme ada dalam sampel, tes untuk mengukur jumlah
mikroorganisme (atau untuk menghitung subpopulasi sampel tertentu), dan tes yang dirancang
untuk mengidentifikasi mikroorganisme. Bab ini tidak membahas identifikasi mikroba.

EMERIKSAAN MICROBIOLOGI PRODUK NONSTERILE: UJI UNTUK MIKROORGANISME KHUSUS

PENGANTAR

Pengujian yang dijelaskan selanjutnya akan memungkinkan penentuan tidak adanya atau
terbatasnya kejadian mikroorganisme tertentu yang dapat dideteksi pada kondisi yang dijelaskan.

Tes dirancang terutama untuk menentukan apakah suatu zat atau persiapan sesuai dengan
spesifikasi yang ditetapkan untuk kualitas mikrobiologi. Bila digunakan untuk tujuan tersebut, ikuti
petunjuk yang diberikan di bawah ini, termasuk jumlah sampel yang akan diambil, dan tafsirkan
hasilnya seperti yang dinyatakan di bawah ini.

Prosedur mikrobiologi alternatif, termasuk metode otomatis, dapat digunakan, asalkan kesetaraan
dengan metode Pharmacopeial telah ditunjukkan.Jenis uji ini ditandai dengan penggunaan
kekeruhan dalam media pertumbuhan cair sebagai bukti adanya mikroorganisme yang layak dalam
sampel uji. Contoh paling umum dari tes ini adalah tes sterilitas. Contoh lain dari jenis pengujian ini
adalah pengujian yang dirancang untuk mengevaluasi ada atau tidaknya jenis mikroorganisme
tertentu dalam sampel (mis., Coliform dalam air minum dan E. coli dalam bentuk sediaan oral).

Tes Kuantitatif untuk Mikroorganisme

Metode perhitungan lempeng adalah contoh paling umum dari kelas tes ini yang digunakan untuk
memperkirakan jumlah mikroorganisme yang layak yang ada dalam sampel. Metode penyemprotan
membran dan Most Probable Number (MPN) adalah contoh lain dari pengujian ini. Yang terakhir
dikembangkan sebagai alat untuk memperkirakan jumlah mikroorganisme yang layak yang ada
dalam sampel yang tidak dapat diterima untuk penyepuhan langsung atau filtrasi membran.

Masalah umum

Validasi metode mikrobiologi adalah proses dimana ditetapkan secara eksperimen bahwa
karakteristik kinerja metode memenuhi persyaratan untuk aplikasi yang dimaksud, dibandingkan
dengan metode tradisional. Sebagai contoh, mungkin tidak perlu untuk sepenuhnya memvalidasi
kesetaraan metode kuantitatif baru untuk digunakan dalam uji kemanjuran antimikroba oleh studi
perbandingan, karena perbandingan kritisnya adalah antara metode pencacahan dan metode
penghitungan lempeng yang baru (metode saat ini untuk pencacahan). Sebagai tes kuantitatif,
berdasarkan sifatnya, menghasilkan data numerik, mereka memungkinkan penggunaan teknik
statistik parametrik. Sebaliknya, uji mikroba kualitatif, misalnya, uji sterilitas pada contoh di atas,
mungkin memerlukan analisis dengan metode statistik nonparametrik. Validasi metode analisis
untuk uji kimia mengikuti parameter yang telah mapan seperti yang dijelaskan dalam Validasi
Prosedur Kompensasi 1225. Validasi metode mikrobiologi berbagi beberapa masalah yang sama,
walaupun pertimbangan harus diberikan pada sifat unik tes mikrobiologi (lihat Tabel 1) .

Tabel 1. Parameter Validasi menurut Jenis Uji Mikrobiologi

Parameter Pengujian Kualitatif Pengujian Kuantitatif

Akurasi Tidak Ya
Presisi Tidak Ya
Spesifisitas Ya Ya
Batas deteksi Ya Ya
Batas Kuantifikasi Tidak Ya
Linearitas Tidak Ya
Rentang operasional Tidak Ya
Kekokohan Ya Ya
Repeatability Ya Ya
Ketukan Ya Ya

VALIDASI UJIAN KUALITATIF UNTUK DEMONSTRASI MIKROORGANISME YANG VIABLE DALAM

SAMPEL

Kekhususan

Spesifisitas metode mikrobiologi kualitatif alternatif adalah kemampuannya untuk mendeteksi

berbagai mikroorganisme yang mungkin ada dalam artikel uji. Perhatian ini ditangani secara
memadai oleh promosi pertumbuhan media untuk metode kualitatif yang mengandalkan
pertumbuhan untuk menunjukkan adanya atau tidak adanya mikroorganisme. Namun, untuk
metode yang tidak memerlukan pertumbuhan sebagai indikator kehadiran mikroba, spesifisitas uji
untuk mikroba memastikan bahwa materi asing dalam sistem uji tidak mengganggu pengujian.

Batas Deteksi

Batas deteksi adalah jumlah mikroorganisme terendah dalam sampel yang dapat dideteksi pada
kondisi percobaan yang dinyatakan. Uji batas mikrobiologi menentukan ada tidaknya
mikroorganisme, misalnya, tidak adanya Salmonella spp. dalam 10 g. Karena sifat mikrobiologi, batas
deteksi mengacu pada jumlah organisme yang ada dalam sampel asli sebelum langkah pengenceran
atau inkubasi; Ini tidak mengacu pada jumlah organisme yang hadir pada titik pengujian.

Salah satu metode untuk mendemonstrasikan batas deteksi untuk uji kuantitatif adalah dengan
mengevaluasi dua metode (alternatif dan kompendial) dengan inokulasi dengan sejumlah kecil
mikroorganisme tantangan (tidak lebih dari 5 cfu per unit) diikuti dengan pengukuran pemulihan.
Tingkat inokulasi harus disesuaikan sampai setidaknya 50% sampel menunjukkan pertumbuhan
dalam uji kompendial. Hal ini diperlukan untuk mengulang penentuan ini beberapa kali, karena batas
deteksi uji ditentukan dari sejumlah ulangan (tidak kurang dari 5). Kemampuan kedua metode untuk
mendeteksi keberadaan sejumlah kecil mikroorganisme dapat ditunjukkan dengan uji Chi Square.
Metode kedua untuk menunjukkan kesetaraan antara dua metode kuantitatif bisa melalui
penggunaan teknik Most Probable Number. Dalam metode ini, desain 5 tabung dalam rangkaian
dilusi sepuluh kali lipat dapat digunakan untuk kedua metode. Ini kemudian akan ditantang dengan
inokulum setara (misalnya pengenceran 10-1, 10-2, dan 10-3 dari suspensi stok kira-kira 50 cfu per
mL untuk menghasilkan inokulum target 5, 0,5, dan 0,05 cfu per tabung ) dan MPN dari stock asli
ditentukan oleh masing-masing metode. Jika interval kepercayaan 95% tumpang tindih, maka
metode akan dianggap setara.

Kekesaran

Kekasaran metode mikrobiologi kualitatif adalah tingkat presisi hasil uji yang diperoleh dengan
analisis sampel yang sama di bawah berbagai kondisi uji normal, seperti analis, instrumen, lotere,
dan laboratorium yang berbeda. Ketangguhan dapat didefinisikan sebagai resistensi intrinsik
terhadap pengaruh yang diberikan oleh variabel operasional dan lingkungan terhadap hasil metode
mikrobiologi. Ketangguhan adalah parameter validasi yang paling sesuai untuk penentuan oleh
pemasok metode uji yang memiliki akses mudah ke beberapa instrumen dan kumpulan komponen.

Kekokohan

Ketahanan metode mikrobiologi kualitatif adalah ukuran kapasitasnya untuk tetap tidak terpengaruh
oleh variasi metode parameter yang kecil namun disengaja, dan memberikan indikasi keandalannya
selama penggunaan normal. Robustness adalah parameter validasi yang paling sesuai untuk
penentuan oleh pemasok metode uji. Karena tidak ada standar yang disepakati untuk metode saat
ini, kriteria penerimaan bermasalah dan harus disesuaikan dengan teknik spesifiknya. Namun,
penting untuk diingat bahwa kekasaran prosedur alternatif dikembangkan. Ukuran ketahanan belum
tentu merupakan perbandingan antara metode alternatif dan komponen tradisional, namun
merupakan komponen yang diperlukan untuk validasi metode alternatif sehingga pengguna
mengetahui parameter operasi dari metode ini.

VALIDASI ESTIMASI KUANTITATIF MIKROORGANISME YANG VIABLE DALAM SAMPEL

Sebagai unit pembentuk koloni mengikuti distribusi Poisson, penggunaan alat statistik yang sesuai
dengan Poisson daripada yang digunakan untuk menganalisis distribusi normal dianjurkan. Jika
pengguna lebih nyaman menggunakan alat yang diarahkan pada data terdistribusi normal,
penggunaan transformasi data sering berguna. Dua teknik yang tersedia dan nyaman untuk data
mikrobiologi. Hitungan mentah dapat diubah menjadi data terdistribusi normal baik dengan
mengambil nilai unit log10 untuk jumlah tersebut, atau dengan mengambil akar kuadrat dari
hitungan +1. Transformasi yang terakhir sangat membantu jika data mengandung angka nol.

Ketepatan

Keakuratan metode mikrobiologi jenis ini adalah kedekatan hasil uji yang diperoleh dengan cara uji
alternatif terhadap nilai yang diperoleh dengan metode tradisional. Ini harus ditunjukkan di berbagai
uji operasional. Akurasi biasanya dinyatakan sebagai persentase pemulihan mikroorganisme dengan
metode uji.

Akurasi dalam uji mikrobiologi kuantitatif dapat ditunjukkan dengan menyiapkan suspensi
mikroorganisme pada ujung atas kisaran pengujian, yang telah diencerkan secara berurutan sampai
ke ujung bawah kisaran pengujian. Rentang operasional dari metode alternatif harus tumpang tindih
dengan metode tradisional. Misalnya, jika metode alternatif dimaksudkan untuk mengganti metode
hitungan lempeng tradisional untuk menghitung layak, maka rentang yang masuk akal mungkin dari
100 sampai 106 cfu per mL. Setidaknya 5 suspensi di kisaran tes harus dianalisis untuk setiap
organisme tantangan. Metode alternatif harus memberikan perkiraan mikroorganisme yang layak
tidak kurang dari 70% dari perkiraan yang diberikan oleh metode tradisional, atau metode baru
harus ditunjukkan untuk memulihkan setidaknya sebanyak organisme sebagai metode tradisional
dengan analisis statistik yang tepat, contoh yang sebuah analisis ANOVA dari unit log10 mengubah
titik data. Perhatikan bahwa ada kemungkinan bahwa metode alternatif dapat memulihkan sejumlah
mikroorganisme yang lebih jelas jika tidak bergantung pada pertumbuhan mikroorganisme untuk
membentuk koloni atau mengembangkan kekeruhan. Hal ini ditentukan dalam evaluasi Spesifisitas.

Presisi

Ketepatan metode mikrobiologi kuantitatif adalah tingkat kesepakatan antara hasil uji individual bila
prosedur diterapkan berulang kali untuk beberapa sampel suspensi mikroorganisme laboratorium di
kisaran pengujian. Ketepatan metode mikrobiologi biasanya dinyatakan sebagai standar deviasi atau
standar deviasi relatif (koefisien variasi). Namun, tindakan lain yang tepat dapat diterapkan.

Salah satu metode untuk menunjukkan presisi menggunakan suspensi mikroorganisme pada ujung
atas kisaran pengujian yang telah dilarutkan secara berurutan sampai ke ujung bawah kisaran
pengujian. Setidaknya 5 suspensi di seluruh rentang pengujian harus dianalisis. Untuk setiap
suspensi sekurang-kurangnya 10 ulangan harus diuji agar bisa menghitung taksiran statistik standar
deviasi standar atau standar deviasi standar (koefisien variasi). Umumnya, RSD dalam kisaran 15%
sampai 35% akan dapat diterima. Terlepas dari hasil spesifiknya, metode alternatif harus memiliki
koefisien variasi yang tidak lebih besar dari pada metode tradisional. Sebagai contoh, metode
hitungan piring mungkin memiliki rentang RSD seperti ditunjukkan pada tabel berikut.

Kekhususan

Spesifisitas metode mikrobiologi kuantitatif adalah kemampuannya untuk mendeteksi panel

mikroorganisme yang sesuai untuk menunjukkan bahwa metode ini sesuai untuk tujuan yang telah
ditetapkan. Hal ini ditunjukkan dengan menggunakan organisme yang sesuai untuk tujuan metode
alternatif. Penting untuk menantang teknologi alternatif dengan cara yang akan mendorong hasil
positif palsu (khusus untuk teknologi alternatif itu) untuk menunjukkan kesesuaian metode alternatif
dibandingkan dengan metode tradisional. Hal ini sangat penting dengan metode alternatif yang tidak
memerlukan pertumbuhan untuk pencacahan mikroba (misalnya, zat yang tidak memerlukan
pengayaan atau dapat menghitung mikroorganisme ke dalam kisaran sel 1-50).

Batasan Kuantifikasi

Batas kuantifikasi adalah jumlah mikroorganisme terendah yang dapat dihitung secara akurat.
Karena tidak mungkin mendapatkan sampel yang dapat dipercaya yang mengandung sejumlah
mikroorganisme yang diketahui, penting bahwa batas kuantifikasi pengujian ditentukan dari
sejumlah ulangan (n> 5) pada masing-masing paling sedikit 5 titik berbeda di seluruh jangkauan
operasional pengujian. Batas kuantifikasi seharusnya tidak lebih besar dari pada metode tradisional.
Perhatikan bahwa ini mungkin memiliki batas yang melekat karena sifat pencacahan bakteri dan
distribusi Poisson jumlah bakteri (lihat Validasi Pemulihan Mikroba dari Pharmacopeial Articles
1227). Oleh karena itu, metode alternatif hanya perlu menunjukkan bahwa metode ini setidaknya
sama sensitifnya dengan metode tradisional dengan batasan yang sama.

Linearitas

Linieritas uji mikrobiologi kuantitatif adalah kemampuannya untuk menghasilkan hasil yang
sebanding dengan konsentrasi mikroorganisme yang ada dalam sampel dalam kisaran tertentu.
Linieritas harus ditentukan selama rentang pengujian. Metode untuk menentukan ini adalah memilih
setidaknya 5 konsentrasi setiap mikroorganisme tantangan standar dan melakukan setidaknya 5 kali
pembacaan ulang setiap konsentrasi. Ukuran yang tepat adalah menghitung kuadrat koefisien
korelasi, r2, dari analisis regresi linier dari data yang dihasilkan di atas. Sementara koefisien korelasi
tidak memberikan perkiraan linearitas, ini adalah ukuran yang mudah dan umum diterapkan untuk
mendekati hubungan. Metode alternatif tidak boleh memiliki nilai r2 kurang dari 0,95.

Batas Deteksi

Lihat Batasan Deteksi dalam Validasi Tes Kualitatif untuk Demonstrasi Mikroorganisme yang Layak
dalam Sampel.

Jarak

Rentang operasional metode mikrobiologi kuantitatif adalah interval antara tingkat atas dan bawah
mikroorganisme yang telah ditunjukkan dapat ditentukan dengan presisi, akurasi, dan linieritas.

Kekasaran

Lihat Ketidakadilan dalam Validasi Tes Kualitatif untuk Demonstrasi Mikroorganisme yang Layak
dalam Sampel.

Kekokohan

Lihat Robustness di bawah Validasi Tes Kualitatif untuk Demonstrasi Mikroorganisme yang Layak
dalam Sampel.