Anda di halaman 1dari 12

Efek suplementasi Bifi dobacterium pada komposisi mikrobiota usus dan respon imun

pada bayi sehat

Latar Belakang: Mikrobiotase usus dianggap sebagai sumber rangsangan maturasional yang
paling penting untuk pengembangan sistem kekebalan tubuh. Namun, beberapa penelitian
telah berfokus pada pengembangan T helper (Th) 1 respon imun dan respon antibodi terhadap
vaksinasi pada bayi yang sehat, terutama dalam kelompok besar. Melalui uji coba double-
blind secara acak, kami meneliti efek suplemen Bifidobacterium longum BB536 (BB536)
pada komposisi mikrobiota usus dan respon imun pada bayi cukup bulan.

Metode: Secara keseluruhan, 300 bayi baru lahir yang sehat direkrut acak, susu formula dan
diberi suplemen BB536 atau tanpa suplementasi. Sitokin perwakilan untuk sel sekresi Th1
[interferon-γ (IFN-γ)] dan Th2 [interleukin-4 (IL-4)] diukur dengan menggunakan enzyme-
linked immunospot assay pada 4 dan 7 bulan. Respon antibodi terhadap vaksin diukur pada
bulan ke 7 dan 11.

Hasil: Sebanyak 264 bayi di ambil untuk penelitian. Jumlah bifidobakteri dan rasio
bifidobacteria / Enterobacteriaceae (B / E) secara signifikan lebih tinggi pada kelompok
suplemen BB536 pada bulan ke 2 dan 4. Jumlah sel sekresi IFN-γ dan rasio IFN-γ / IL-4 sel
sekresi yang meningkat pada kelompok suplementasi BB536 pada 7 bulan. Selain itu, nilai B
/ E yang lebih tinggi pada tahap awal nampaknya terkait dengan respons Th1 yang
meningkat. Tidak ada perbedaan yang di amati antara kelompok dalam respon antibodi
setelah vaksinasi.

Kesimpulan: BB536 memiliki efek positif pada pembentukan mikrobiota usus sehat di awal
kehidupan, dan ini juga berperan penting dalam meningkatkan respons imun Th1.

Kata kunci: mikrobiota usus; suplementasi probiotik; bayi yang berumur pendek; T helper 1
/ T helper 2 keseimbangan; vaksinasi

Pengantar
Saluran pencernaan adalah organ kekebalan terbesar dalam tubuh manusia. [1]
Dengan jumlah sel imun tertinggi dan konsentrasi bakteri tertinggi dalam tubuh, usus
merupakan tempat utama terbentuknya kekebalan tubuh. [2,3] Telah dilaporkan bahwa
kegagalan untuk membangun mikrobiota usus berfungsi normal pada awal kehidupan
dikaitkan dengan perkembangan penyakit alergi dan gangguan kekebalan tubuh lainnya di
kemudian hari. [4-6] Hal ini diketahui bahwa sistem kekebalan tubuh bayi yang baru lahir
adalah T helper (Th) 2 biasanya selama kehamilan. Setelah lahir, pematangan sistem
kekebalan tubuh bergantung pada usia, dan perkembangan respons imun Th1 dapat mengatur
ulang keseimbangan Th1 / Th2. Paparan komponen mikroba lingkungan disarankan untuk
memainkan peran penting dalam proses pematangan. Probiotik adalah mikroorganisme hidup
yang, bila diberikan secara oral dalam jumlah yang memadai, memberi efek menguntungkan
pada host. [7] Modulasi microbiota usus bayi dengan probiotik telah diusulkan sebagai
pendekatan potensial untuk pengobatan dan pencegahan penyakit yang dimediasi oleh
kekebalan tubuh. Baru-baru ini, beberapa penelitian kohort telah menyelidiki efek modulogen
imun dari suplementasi probiotik pada bayi dan wanita hamil dan mengamati bahwa
suplementasi probiotik dapat mengurangi risiko penyakit atopik. [8-10] Namun, subjek
penelitian untuk sebagian besar penelitian di atas adalah anak-anak dengan risiko tinggi
penyakit alergi, dan beberapa penelitian telah dilakukan pada bayi baru lahir yang sehat,
terutama dalam kelompok besar. Selain itu, probiotik telah terbukti bersifat imunomodulator
dan dapat mempengaruhi respon antibodi setelah vaksinasi. Tidak ada laporan yang tersedia
mengenai efek suplementasi probiotik terhadap tanggapan kekebalan bayi China setelah
pemberian vaksinasi rutin secara lengkap.

Bifidobacterium longum BB536 (BB536) adalah anggota keluarga bifi dobacteria dan
merupakan komponen mikrobiota usus. Dilaporkan bahwa BB536 memiliki efek kesehatan
yang menguntungkan [13,14] dan telah banyak ditambahkan ke makanan yang tersedia secara
komersial untuk konsumsi manusia. [15]

Untuk menunjukkan efek BB536 pada pengembangan respons kekebalan pada bayi
sehat, kami menerima uji intervensi double-blind, acak, plasebo untuk menentukan apakah
suplementasi dengan BB536 dapat mempengaruhi komposisi mikrobiota usus, meningkatkan
respon imun terhadap vaksinasi pada bayi sehat dan memberi efek menguntungkan pada
keseimbangan kekebalan respon Th1 / Th2.

Metode

Desain penelitian

Studi percobaan intervensi acak, double blind, terkontrol plasebo ini dilakukan di
Rumah Sakit Anak Universitas Fudan. Protokol ini disetujui oleh komite etika Rumah Sakit
Anak Universitas Fudan. Bayi yang sehat dan cukup bulan masa kehamilan tidak mengikuti
penyakit sebelum dan sesudah melahirkan didaftarkan dari hari ke 0 sampai hari ke 7 setelah
kelahiran jika ibu mereka memutuskan untuk tidak memberi ASI setelah hari ke 7. Hidup
persetujuan tertulis ditandatangani oleh seorang perwakilan hukum.

Bayi baru lahir yang terdaftar secara acak ke salah satu dari dua kelompok: rumus
normal (tersedia secara komersial) atau formula yang normal dilengkapi dengan BB536 1 ×
107 koloni unit / g. Alokasi kelompok susu formula dilakukan oleh blok-pengacakan dengan
stratifikasi berdasarkan jenis kelamin menggunakan program komputer. Kelompok-kelompok
ini dimanfaatkan dari pendaftaran untuk usia 6 bulan. Selanjutnya, subjek menerima standar
komersial Formula tindak lanjut sampai selesainya penelitian pada 12 bulan. Satu-satunya
perbedaan dalam penampilan produk adalah huruf yang tercetak di label. Dua huruf yang
berbeda digunakan untuk setiap jenis formula, menghasilkan total empat huruf. Identitas
produk spesifik itu bias terhadap subyek dan penyidik. Sampel tinja dikumpulkan pada umur
2, 4 dan 11 bulan untuk menganalisis komposisi mikrobiota usus. Sebuah subkelompok anak
dipilih untuk koleksi setidaknya 250 L sampel darah dari jari pada umur 4, 7 dan 11 bulan.
Interferon - γ (IFN - γ) / interleukin - 4 (IL - 4) sel sitokin - sekresi terdeteksi pada 4 dan 7
bulan menggunakan enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay. Tingkat antibodi diukur
pada 7 dan 11 bulan dengan alat uji imunosorbent enzyme linked (ELISA).

Tujuan utama dari percobaan ini adalah untuk menentukan efek dari suplementasi
probiotik BB536 pada pengembangan kekebalan tubuh dan respon imun terhadap vaksinasi
rutin pada bayi yang sehat. Hasil utama adalah untuk mengevaluasi perkembangan kekebalan
dengan mengukur sitokin perwakilan untuk sel sekresi Th1 (IFN-γ) dan Th2 (IL-4) dan
tingkat serum antibodi spesifik setelah hepatitis B (HepB), poliomielitis (Polio), difteri,
tetanus toksoid dan pertusis (DTP) - vaksinasi. Tujuan sekunder dari penelitian ini adalah
untuk membandingkan komposisi mikrobiologis tinja antara kedua kelompok dengan
mendeteksi beberapa keluarga bakteri utama.

Analisis sampel tinja

Untuk penentuan mikrobiota usus, sampel segar tinja 1-5 g segera diobservasi setelah
emisi. Sampel tinja encer ditempatkan pada media Eugon tomat (Difco, USA) [16] untuk
menghitung bifidobacteria total, pada MRS ditambah antibiotik agar (Difco, USA) [17] untuk
menghitung lactobacilli dan pada media Drigalski (Pasteur, Paris, Perancis) untuk
menghitung Enterobacteriaceae. Medium tomat Eugon dan piring agar MRS diinkubasi
secara anaerob pada suhu 37 ° C selama 48 jam, dan pelat medium Drigalski diinkubasi
secara aerobik pada suhu 37 ° C selama 24 jam. Morfologi setiap jenis koloni yang tumbuh di
piring tomat Eugon dan piring agar MRS diperiksa dengan pengamatan mikroskopik. Bakteri
bercabang atau balon Y diidentifikasi menjadi bifidobakteri dengan urutan primer PCR F: 5'-
GGGTGGTAATGCCGGATG-3 ', R: 5'-CCACCGTTACACCGGGAA-3'.

ELISPOT assay

Untuk mengevaluasi keseimbangan respon imun Th1 dan Th2, sel IFN-γ (sitokin
perwakilan untuk Th1) atau IL-4 (sitokin perwakilan untuk Th2) sel sitokinat dideteksi
dengan menggunakan uji ELISPOT, sesuai petunjuk pabrik pembuatnya (U-CyTech
biosciences, Belanda). Sel mononuklear darah perifer diisolasi dari sampel darah jari akhir
dengan menggunakan metode sedimentasi dekstran, dan sel-sel kemudian dihentikan di
RPMI 1640 medium dengan 10% serum janin anak sapi dengan kepadatan 1 × 106 sel / mL.
100 uL suspensi sel dan 10 ug / mL phytohemagglutinin (Sigma, USA) ditambahkan ke
masing-masing dengan baik dari piring 96-baik dan diinkubasi selama 20 jam pada suhu 37 °
C dalam lembab 5% CO2 inkubator. Jumlah titik dipisahkan dengan mengguanakan
mikroskop.

Deteksi antibodi

Plasma diperoleh setelah sentrifugasi dan disimpan pada suhu -70 ° C sampai
dianalisis. Respon antibodi terhadap vaksin HepB (XinBo Biological Technology, China),
Polio, dan DTP (Hycor Biomedical, USA) diukur dengan kit ELISA, sesuai instruksi pabrik
pembuatnya.

Analisis statistik

Ukuran sampel untuk tes darah dihitung berdasarkan persentase bayi yang
menanggapi vaksinasi. Menurut sebuah studi yang dilakukan oleh Pickering et al, [18] kami
membutuhkan 70 bayi di setiap kelompok untuk mendeteksi perbedaan konsentrasi antibodi
50% pada alpha = 0,05 dan kekuatan 80%. Linear efek campuran pemodelan digunakan
untuk memperkirakan efek probiotik suplementasi pada komposisi mikrobiota usus, sel
sitokin Th1 dan Th2 yang mensekresikan dan respon antibodi terhadap vaksin. Korelasi
Pearson digunakan untuk menganalisis hubungan antara rasio bifidobacteria /
Enterobacteriaceae (B / E) dan jumlah sel yang mensekresi sitokin. Uji Chi-squaret
digunakan untuk menganalisis perbedaan dalam kedua kelompok. Analisis statistik dilakukan
dengan sistem SAS untuk windows V8 dan SPSS versi 16.0. Nilai P <0,05 dianggap
signifikan secara statistik.
Tabel 1. Demografi dan karakteristik dasar bayi pada saat pendaftaran

Tabel 2. Perubahan pada bifi dobacteria dan Enterobacteriaceae dengan usia dan
perbandingan kedua kelompok
Tabel 3. Perubahan IFN-γ, sel sekresi IL-4 (jumlah log) dan rasio IFN-γ / IL-4 pada kedua
kelompok pada usia 4 bulan dan 7 bulan
Tabel 4. Tanggapan antibodi terhadap vaksin DTP, Polio dan Hep B pada usia 7 bulan dan 11
bulan dan perbandingan kedua kelompok

Hasil

Ukuran sampel dan karakteristik demografi

Sebanyak 300 bayi baru lahir sehat terdaftar dari hari ke 0 sampai hari ke 7 setelah
kelahiran, dan 264 bayi menyelesaikan penelitian ini. Di antara 264 bayi, 129 bayi (58
perempuan dan 71 laki-laki) berada dalam kelompok kontrol, dan 135 bayi (64 perempuan
dan 71 laki-laki) berada di kelompok suplemen BB 536. Tidak ada perbedaan yang signifikan
secara statistik antara kelompok berkenaan dengan jenis kelamin, berat lahir dan panjang
lahir (Tabel 1). Alasan untuk dikeluarkan satu bayi dengan diare yang ibunya yang mengubah
susu formula, satu bayi dengan malformasi jantung bawaan, dua bayi yang hilang untuk
menindaklanjuti dan 32 bayi yang ditarik oleh orang tua mereka (Gbr. 1).

Efek suplementasi BB 536 pada mikrobiota mikroba usus

Pada kelompok kontrol, jumlah bifidobakteri total pada sampel tinja meningkat
seiring bertambahnya usia, sementara jumlah Enterobacteriaceae menurun. Jumlah
bifidobacteria pada 4 bulan secara signifikan lebih besar daripada pada 2 bulan, P <0,05.
Jumlah Enterobacteriaceae pada usia 11 bulan secara signifikan lebih rendah dari pada 2
bulan dan 4 bulan (Tabel 2).
Pada kelompok suplementasi BB536, jumlah total bifidobacteria dan tingkat B / E
secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok kontrol pada usia 2 dan 4 bulan
(Tabel 2). Selanjutnya, kemampuan mendeteksi lactobacilli adalah 81,5%, 79,3% dan 74,1%
pada kelompok suplemen BB 536 pada usia 2, 4 dan 11 bulan, masing-masing, yang sedikit
lebih tinggi dari pada kelompok kontrol (72,1%, 73,6% dan 69% , masing-masing), termasuk
perbedaan ini tidak signifikan secara statistik. Tidak ada pengaruh yang jelas dari suplemen
BB 536 pada penghitungan Enterobacteriaceae pada usia 2, 4 dan 11 bulan.

Pengaruh suplementasi BB 536 pada sekresi sitokin Th 1 dan Th 2

Kami memeriksa keseimbangan Th1 dan Th2 pada sel sekresi IFN - γ dan IL - 4 pada
4 dan 7 bulan dan rasionya menggunakan teknik ELISPOT (Gambar 2). Kami menemukan
bahwa jumlah sel sekresi IFN-γ dan rasio IFN-γ / IL-4 meningkat secara signifikan pada usia
7 bulan pada kelompok suplementasi BB536 dibandingkan pada kelompok kontrol. Namun,
tidak ada perbedaan signifikan yang diamati antara kedua kelompok untuk jumlah IL-4 sel
sekresi (Tabel 3).

Analisis korelatif menunjukkan bahwa ada hubungan yang lemah positif antara rasio
B / E pada 2 bulan dan rasio IFN-γ / IL-4 pada 4 bulan (R = 0,195, P = 0,013), serta antara
rasio B / E pada 4 bulan dan rasio IFN-γ / IL-4 pada 7 bulan (R = 0,238, P = 0,004).

Pengaruh suplementasi BB536 pada respon imun terhadap vaksinasi

Respon antibodi terhadap vaksin DTP, Polio dan HepB di bulan 7 dan 11 diukur
dengan menggunakan teknik ELISA. Namun, tidak ada perbedaan yang signifikan secara
statistik yang diamati antara kedua kelompok (Tabel 4).

Diskusi

Komunikasi antara host dan bakteri pada antarmuka mukosa usus memainkan peran
penting dalam membangun sistem kekebalan tubuh yang kompeten. [19] Karakteristik
perkembangan komposisi bakteri usus pada bayi baru lahir yang sehat dapat meningkatkan
pemahaman kita tentang interaksi antara host dan mikroba. Dalam studi saat ini, kami
mengamati bahwa apakah BB536 ini dilengkapi atau tidak, jumlah total bifidobacteria dalam
sampel tinja meningkat seiring bertambahnya usia, sementara jumlah Enterobacteriaceae
menurun. Hasil ini menunjukkan bahwa prebiotik yang diwakili oleh bifidebakteria yang
terus bermanfaat dalam usus bayi yang baru lahir dengan usia cukup bulan.
Dilaporkan bahwa suplementasi probiotik berpengaruh positif terhadap komposisi
mikrobiota yang sudah ada di dalam usus. Hasil kami konsisten dengan temuan penelitian
sebelumnya. Dalam penelitian ini, kami mengamati bahwa jumlah bifi dobacteria secara
signifikan lebih tinggi pada kelompok suplemen BB 536 pada bulan ke 2 dan 4 dibandingkan
pada kelompok kontrol. Selain itu, rasio B / E, yang mungkin mencerminkan kemampuan
penghalang usus untuk melawan invasi patogen, lebih tinggi pada kelompok BB 536 daripada
pada kelompok kontrol pada 2 dan 4 bulan. Hal ini diketahui bahwa pada bayi ASI yang
sehat, mikrobiota usus yang dominan adalah bifidobacteria, [20] dan ini telah memberikan
kontribusi pemikiran untuk banyak manfaat kesehatan dari menyusui. Temuan kami
menunjukkan bahwa intervensi BB 536 dapat membantu pembentukan kolonisasi mikroba
yang sehat sejak dini yang mendekati bayi yang disusui, yang mungkin memainkan peran
penting dalam membangun penghalang usus yang seimbang selama masa bayi.

Waktu yang optimal di mana untuk memberikan probiotik intervensi adalah diskusi
yang sedang berlangsung. Menurut penelitian kami, suplementasi probiotik sebelum usia 4
bulan akan memiliki efek yang lebih baik. Setelah 4 bulan, pengenalan menyapih makanan
dan tren alami komposisi mikrobiota usus dapat melemahkan efek dari intervensi probiotik.

Karena sistem imun adaptif belum matang dan berpengalaman selama periode
neonatal, tidak dapat menghasilkan respon imun yang tepat. [21] Mikrobiota usus dianggap
sumber yang paling penting dari rangsangan pematangan untuk pengembangan sistem
kekebalan tubuh. Dalam studi ini, kami menggunakan IFN-γ dan IL-4 sebagai sitokin wakil
dari sel Th1 dan Th2, masing-masing, dan tingkat IFN - γ / IL - 4 digunakan untuk
menyelidiki keseimbangan tanggapan Th 1 dan Th 2. Hasil penelitian kami menunjukkan
bahwa IFN-γ mensekresi sel dan rasio IFN-γ / IL-4 sel mensekresi meningkat pada kelompok
suplementasi BB536 dibandingkan dengan kelompok kontrol pada 7 bulan. Kami juga
mengamati bahwa nilai-nilai yang lebih tinggi dari B / E terkait dengan peningkatan IFN-γ
mensekresi sel dan IFN-γ / IL-4 di kemudian hari. Hasil ini menunjukkan bahwa BB 536
memiliki efek positif pada peningkatan respon Th 1.

Pasca kelahiran, sistem kekebalan bayi condong ke respons Th2. [22] Pembentukan
respons imun Th1 / Th2 yang seimbang adalah peristiwa kunci perkembangan kekebalan
tubuh di awal kehidupan. Menurut "hipotesis kebersihan", [23] perbaikan dalam kesehatan
masyarakat dan kebersihan dapat berpotensi mendukung respons Th2, yang dapat
menyebabkan sensitisasi atopik dengan peningkatan produksi imunoglobulin E. Paparan
mikrobiota dianggap sebagai peran penting dalam peningkatan respons Th 1, yang pada
gilirannya terkait dengan penurunan kecenderungan penyakit alergi. Penelitian kami
sebelumnya, kami memberi makan antibiotika Sprague-Dawley tikus neonatus yang cukup
untuk menghasilkan tikus minimisasi bifidobakteria menunjukkan bahwa respons Th2 yang
ada sebelumnya pada tikus ini diperkuat dengan meningkatkan kadar protein IL-4 dalam
plasma. Namun, setelah suplementasi bifi dobacteria, respon imun diubah menjadi tipe Th1.
[24] Peneliti lain juga hasil positif dari intervensi probiotik dalam memodulasi keseimbangan
Th1 / Th2 dengan mengukur sitokin terkait melalui mRNA [25] dan tingkat protein. [26]
Dalam penelitian ini, kami menggunakan teknik ELISPOT untuk mengukur sel sitokin Th 1
dan Th 2 secara rahasia. Kejadian lebih lanjut dari respon imun seimbang terjadi pada 1 / Th
2 di awal kehidupan, yang dapat memperbaiki kekebalan anti-infeksi dan mencegah
terjadinya penyakit alergi di kemudian hari.

Respon antibodi spesifik adalah parameter penting lainnya yang digunakan untuk
mengevaluasi status pematangan sistem kekebalan pada masa bayi. Mengumpulkan bukti
telah menunjukkan bahwa beberapa probiotik tertentu dapat meningkatkan respons antibodi
terhadap vaksin. [27] Dalam penelitian ini, kami juga mengevaluasi efek suplementasi BB
536 pada tanggapan vaksin HepB, Polio dan DTP. Namun, kami tidak melihat perbedaan
kelompok kelompok suplemen BB 536 dan kelompok kontrol. Dibandingkan dengan
penelitian lain yang mengamati efek positif dari intervensi probiotik terhadap tanggapan
vaksin, mungkin ada beberapa kemungkinan penjelasan untuk hasil yang tidak konsisten.
Pertama, strain probiotik yang berbeda mungkin memiliki fungsi imunomodulator yang
sangat berbeda. Kedua, intervensi probiotik untuk bayi di negara berkembang mungkin
memiliki tanggapan antibodi yang berbeda setelah vaksinasi dibandingkan dengan bayi dari
negara-negara berkembang. Perez dkk [28] menyelidiki efek suplementasi probiotik terhadap
respons antibodi pada anak-anak dengan status sosial ekonomi rendah dan tidak
memperhatikan manfaat intervensi probiotik. Mereka menyimpulkan bahwa tingkat paparan
alami yang tinggi terhadap agen infeksi dalam populasi mereka mungkin menyebabkan tidak
adanya rangsangan tambahan oleh probiotik tambahan. Youngster et al [29] tidak mengamati
efek positif suplementasi probiotik pada respon kekebalan tubuh bayi yang sehat untuk hidup
vaksin baik. Tampaknya bahwa ketika ada respon imun yang memadai, probiotik tidak
memiliki efek lebih lanjut pada kuantitas antibodi yang dihasilkan.

Singkatnya, penelitian ini mengevaluasi efek dari suplementasi BB536 pada fungsi
barrier usus, keseimbangan respon imun Th1 / Th2 dan generasi antibodi pada bayi cukup
bulan yang sehat setelah vaksinasi. Kami menemukan bahwa BB 536 dapat membantu
membangun mikrobiota usus sehat di awal kehidupan dan memperbaiki respons imun Th1
melalui peningkatan sekresi sitokin IFN-γ. Namun, tidak ada efek signifikan suplementasi
BB 536 yang diamati dalam hal meningkatkan titer antibodi setelah vaksinasi dengan HepB,
Polio dan DTP.